TUGAS KIMIA FISIKA III

KROMATOGRAFI
Oleh : Ingreat Richni br Ginting

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI MEDAN

2011

PENDAHULUAN
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Kromatografi adalah pemisahan campuran komponen-komponen didasarkan pada perbedaan tingkat interaksi terhadap dua fasa material pemisah. Campuran yang akan dipisahkan dibawa fasa gerak, yang kemudian dipaksa bergerak atau disaring melalui fasa diam karena pengaruh gaya berat atau gayagaya yang lain. Komponen-komponen dari campuran ditarik dan diperlambat oleh fasa diam pada tingkat yang berbeda-beda sehingga mereka bergerak bersama-sama dengan fasa gerak dalam waktu retensi (retention time) yang berbeda-beda dan dengan demikian mereka terpisah (Bambang, 2000) Kromatografi adalah Suatu metoda untuk separasi yang menyangkut komponen suatu contoh di mana komponen dibagi-bagikan antara dua tahap, salah satu yang mana adalah keperluan selagi gerak yang lain . Di dalam gas chromatography adalah gas mengangsur suatu cairan atau tahap keperluan padat. Di dalam cairan chromatography adalah campuran cairan pindah gerakkan melalui cairan yang lain , suatu padat, atau suatu 'gel' agar. Mekanisme separasi komponen mungkin adalah adsorpsi, daya larut diferensial, ionexchange, penyebaran/perembesan, atau mekanisme lain (David. 2001) Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia yang berdasarkan pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang terpisah pada fase diam dibawah pengaru pergerakan fase yang bergerak. Beberapa sifat fisika umum dari molekul yang dipakai sebagai asa teknik pemisahan kromatografi adalah : 1. Kecenrungan molekul untuk teradsorpsi oleh partikel-partikel padatan yang halus. 2. Kecenderungan mlekul untuk melarut pada fase cair. 3. Kecenderungan molekul untuk teratsir. 16
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

MATERI
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan dengan proses berlipat ganda, artinya selama proses berlangsung terjadi berulang kali kontak adsorbsi; atau partisi dari komponen-komponen yang dipisahkan. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa gerak yang melewati berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air dan melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak pada arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergeser sampai jarak yang cukup jauh atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau noda yang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksipereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawasenyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal. Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu pelarut, suhu, ukuran dari bejana, dan kertas. Perubahan suhu dapat merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran sedangkan ukuran tau volume dari bejana dapat mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.

17

Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fouriertransform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam kefarmasian dalam memisahkan suatu campuran senyawa. Dalam kromatografi, koponen-komponen terdistribusi dala dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi kedalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau didalam pori. Kromatografi adalah proses pemisahan yang digunakan untuk memisahkan campuran molekuler berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen dan distribusi molekulmolekul dalam dua fasa diam (adsorben) dan fasa bergerak (eluen). Dengan perkataan lain prinsip dasar dalam analisa kromatografi adalah berdasarkan pada prinsip distribusi fasa yakni suatu perpindahan komponen-komponen zat yang dianalisa dari suatu fasa yang bergerak (eluen) menuju ke fasa lain yang diam (adsorben) yang dilaluinya. Eluen adalah pelarut yang dipakai dalam proses migrasi/pergerakan dalam membawa komponenkomponen zat sampel atau fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponenkomponen senyawa yang akan dipisahkan. Sedangkan adsorben adalah fasa diam yang mengikuti/menyerap zat yang dianalisa, contohnya kertas, kanji, selulosa, silika gel, dll. fasa diam yang dilaluinya merupakan suatu proses kesetimbangan. Apabila tetapan kesetimbangan dari molekul komponen-komponen dari zat yang akan dianalisa terhadap ke dua fasa yang bergerak dan fasa diam yang dilaluinya berbeda, maka akan terjadi pemisahan komponen-komponen tersebut. Bila suatu komponen mempunyai daya ikat pada fasa diam yang dilaluinya lebih besar, maka komponen tersebut akan lebih dahulu terikat/diadsorbsi oleh fasa padat daripada komponen yang lainnya. Sebagai hasil analisa kromatografi, daerah pemisahan komponen pada fasa diam akan berupa pita lurus.
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

Distribusi fasa atau perpindahan molekul suatu komponen dari fasa yang bergerak menuju ke

16

Distribusi molekul dapat berupa distribusi fasa adsorbsi dan distribusi fasa partisi. Distribusi fasa adsorbsi yaitu distribusi fasa yang terjadi karena adanya perbedaan daya adsorbsi komponen-komponen pada fasa padat. Sedangkan distribusi fasa partisi yaitu distribusi fasa yang terjadi karena perbedaan kelarutan komponen-komponen dalam pelarutpelarut yang tidak saling melarutkan. Kromatografi dapat digunakan untuk sbb: 1. Menentukan konsentrasi suatu zat sampel. 2. Menentukan kemurnian zat sampel. 3. Memisahkan komponen-komponen yang terdapat dalam suatu zat. 4. Menentukan komponen-komponen yang terdapat dalam suatu zat sampel dengan menghitung harga Rf (Ratio formation) tiap komponen. Rf = Jarak titik awal ke titik noda dibagi Jarak titik awal ke titik akhir pergerakan eluen

Dengan demikian menurut gambar di atas, Rf = a/b. Harga Rf dipengaruhi oleh keadaan zat sampel, temperatur, dan jenis komponen. Keakuratan hasil pemisahan dengan kromatografi bergantung pada beberapa faktor sbb:
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

a. Pemilihan adsorben sebagai fasa diam. b. Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai dengan fasa gerak. c. Ukuran kolom (panjang dan diameter) relatif terhadap jumlah material yang akan dipisahkan. d. Laju elusi atau aliran fasa gerak.

Analisa kromatografi dapat dibagi menjadi kromatografi kertas, kromatografi gas, kromatografi lempeng tipis, dan kromatografi kolom.

17

Jenis Jenis Kromatografi

Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu gas chromatography dan liquid chromatography. KROMATOGRAFI : 1. Kromatografi Gas a. GLC b. GSC 2. Kromatogarafi Cair a. HPLC b. LLC-PC c. LSC-TLC, Kolom d. Ion Excange e. Ekslusi : - GP - GF Keterangan GLC = Gas Liquid Chromatography GSC = Gas Solid Chromatography LLC = Liquid Liquid Chromatography PC = Paper Chromatography TLC = Thin Layer Chromatography GP = Gel Permeation GF = Gel Filtration HPLC = High Performance Liguid Chromatography
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

LSC = Liquid Solid Chromatography

16

Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC)

Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa. Prinsip Dasar HPLC HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

Prinsip dari HPLC ini adalah dinamika dan migrasi dengan meggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahan semakin baik.

17

Penentuan Kualitatif HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Penentuan Kuantitatif Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah: o Parameter percobaan sama antara standar dan sampel o Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama o Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. - Berdasarkan area kromatogram - Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

16

KROMATOGRAFI | 10/25/2011

Rangkaian Alat HPLC 1. Kolom Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. 2. Komposisi Eluen Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol. Tempat Eluen berupa Botol yang tidak bereaksi dengan pelarut, dilengkapi penyaring. Eluen harus disaring dengan saringan membran 3. Volume Injeksi Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 500 L). Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik),
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

step-flow injection, dan sampling value. 4. Detektor Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan.

17

Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu: 1. Detektor spektrofotometrik Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sampel yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detektor yang sangat mahal. Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri. 2. Detektor Fluorometrik Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. 3. Detektor Elektrokimia Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solute yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. 16
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

4. Desain detector Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa mikroliter. 5. Pemilihan detektor Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut : 6. Analisis Kuantitatif Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu menghasilkan sinyal yang mempunyai korelasi linier dengan konsentrasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut, konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitas sinyal yang ditunjukkan dalam kromatogram. Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitu dengan mengukur peak height dan peak area. Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak height atau peak area dari suatu kromatogram menjadi konsentrasi dari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

membuat kurva baku dengan cara-cara external standard, internal standard dan standard addition.

Fase HPLC HPLC adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair, dapat digunakan untuk pemisahan sekaligus untuk analisis.

17

Aplikasi HPLC didalam Kehidupan sehari - hari A. Keunggulan dan Kerugian HPLC / KCKT KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan koefisien kolom dan kecepatan analisis. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Beberapa keunggulan HPLC dibanding alat lain: a). HPLC dilengkapi dengan adanya pompa, Pompa ini menghasilkan tekanan sekitar 400 atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan sehingga memperingan kerja kolom dan juga pemisahan sehingga waktu lebih sedikit. pada pompa dikenal dua sistem dalam teknik pemisahan yaitu isokratik dan gradient,namun gradient lebih bersifat akurat karena masingmasing pompa mengatur laju alir larutan yang berbeda. b). HPLC memiliki keunggulan kolom, Dimana kolom HPLC ini lebih pendek dan lebih kecil dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom HPLC 4.6 mm sehingga dapat memberikan permukaan kontak yang lebih luas diman mempengaruhi sempurnanya pemisahan yang semakin baik. Dan panjang kolom HPLC adalah 150-250 mm. dan yang perlu diingat adalah kolom HPLC dapat digunakan kembali dengan cara direnerasi dengan mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang sesuai. c). HPLC mempunyai detektor yang amat sangat sensitif dan peka. HPLC memiliki beberapa detector misalnya: Detektor ultraviolet, detektor fluorometrik, dan detektor elektrokimia. d). Waktu retensi, waktu yang dibutuhkan senyawa untuk melalui kolom hingga ke detektor disebut waktu retensi yang diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.biasanya dipengaruhi oleh : tekanan yang digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi pelarut yang tepat, dan temperatur kolom.

16

KROMATOGRAFI | 10/25/2011

e).

Kromatogram,

kromatogram

menunjukkan

hasil

yang

didapat.

Kromatogram yang diinginkan adalah kromatogram yang lurus tinggi dengan lebar sekecil mungkin. Bukan dengan bentuk lainnya,karena bentuk tersebut menandakan pemisahan dilakukan dengan sangat baik. Namun dalam kromatogram kita menemukan beberapa puncak kecil atau yang mengganggu dan disebut denga noise. Noise muncul jika sampel kita ataupun pelarut yang kita gunakan belum pure,belum murni dari pengotor-pengotor yang mungkin tidak sengaja masuk kedalamnya. Fasa gerak dalam HPLC memegang peranan penting karena sangat akan mempengaruhi kepada pemisahan,jadi ada beberapa kriteria yang harus dipenuhi fasa gerak : B. Kelemahan dari penggunaan HPLC Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 m dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal. Kromatografi Cair Tekanan Tinggi, HPLC merupakan bentuk kromatografi kolom yang sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan memanjang. HPLC memanfaatkan kolom yang memegang chromatographic bahan kemasan (tahap tak berubah), sebuah pompa yang bergerak selular fase (s) melalui kolom, dan detektor yang menunjukkan ingatan waktu Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung pada interaksi antara keadilan tahap, yang Molecules yang dianalisis, dan larutan (s) yang digunakan.

17

Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan. Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan : 1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. 2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. 3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori. 4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX. 5. Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air. 6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia
7. Analisis Anion Nitrat (NO3-)

8. Analisis Vitamin C 9. Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae 10. Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis Tanaman Obat
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

11. Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa

16

Kromatografi Kolom ( Culomn Chromatography , CC )

Bagian ini menunjukkan bagaimana prinsip yang sama yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis yang dapat diterapkan pada skala besar untuk pemisahan campuran dalam kromatografi kolom. Kolom kromatografi seringkali digunakan untuk memurnikan senyawa di laboratorium. Pelaksanaan kromatografi kolom Kolom Dalam kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan tipis jel silika atau alumina pada sebuah lempengan gelas, logam atau plastik. Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal. Berbagai ukuran kolom kromatografi digunakan dan jika anda membuka link pada halaman Kimia Organik dari situs Universitas Colorado, anda akan menemukan foto dari bermacam-macam kolom. Dalam laboratorium sekolah, seringkali dengan mudah digunakan buret biasa sebagai kromatografi kolom.

KROMATOGRAFI | 10/25/2011

17

Penggunaan kolom Anggaplah anda akan memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau.Anda akan membuat larutan jenuh dari campuran dengan menggunakan pelarut yang lebih disukai dalam kolom. Pertama kita membuka kran penutup untuk membiarkan pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas, dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga campuran berwarna akan diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar dibawah ini:

Selanjutnya tambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, cegah sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut mengalir kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering. Gambar berikut menunjukkan perubahan yang mungkin terjadi sejalan dengan perubahan waktu.
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

16

Penjelasan tentang apa yang terjadi Ini mengasumsikan bahwa anda telah membaca penjelasan tentang apa yang terjadi pada kromatografi lapis tipis. Jika belum, ikuti link awal pada bagian atas halaman dan kembali pada bagian ini dan selanjutnya. Senyawa biru lebih polar daripada senyawa kuning dan memungkinkan mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen. Anda dapat mengatakan ini karena senyawa biru tidak bergerak secara sangat cepat melalui kolom. Itu berarti bahwa senyawa biru harus
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

dijerap secara kuat pada jel silika atau alumina dibanding dengan senyawa kuning. Karena kurang polar, senyawa kuning menghabiskan waktu dalam pelarut, sehingga keluar dari kolom lebih cepat. Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal sebagai elusi. Pelarut disebut sebagai eluen.

17

Kromatografi Lapis Tipis Thin Layer Chromatography TLC

Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponenkomponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponenkomponen yang terdapat dalam campuran. Komponenkomponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda Proses kromatografi juga digunakan dalam metode pemisahan komponen gula dari komponen non gula dan abu dalam tetes menjadi fraksi-fraksi terpisah yang diakibatkan oleh perbedaan adsorpsi, difusi dan eksklusi komponen gula dan non gula tersebut terhadap adsorbent dan eluent yang digunakan FASE DIAM Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet.Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. 16
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina. FASE GERAK Dalam kromatografi, eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (jel silika).

KROMATOGRAFI | 10/25/2011

17

Perhitungan nilai Rf Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah menjadi:

Analisis Sampel yang Tidak Berwarna

KROMATOGRAFI | 10/25/2011

1.Menggunakan pendarflour Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Ketika sinar UV diberikan pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi

16

yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Analisis sampel berearna 2. Penunjukkan bercak secara kimia Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

berwarna, umumnya coklat atau ungu. Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

17

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Ketika sinar UV diberikan pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap. .
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

16

Kromatografi Cair Cair Liquid Liquid Chromatography (LLC)

LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak. Umumnya sebagai fase diam digunakan air dan sebagai fase gerak adalah pelarut organik. Misalnya pada kromatografi kertas, sebagai fase diam adalah air yang terserap pada serat selulosa dari kertas. Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography, serta supercritical fluid chromatography. Reverse phase chromatography Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika. Metode ini biasa
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile). High performance liquid chromatography High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi. Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar.

17

Size exclusion chromatography Size exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein. Metode ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat. Perangkat kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil. Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori. Ada dua macam sistem penggunaan dalam kromatografi cair-cair : 1. kromatografi fasa normal fase gerak non polar ( ex: heksana, isopropil-eter) fase diam sangat polar (ex: air) digunakan untuk memisahkan senyawa polar, sebab senyawa polar akan tertahan lebih lama didalam kolom yang polar, sedangkan senyawa yang non-polar akan keluar lebih awal dari dalam kolom. 2. Kromatografi fasa terbalik fase gerak polar ( ex: air, metanol) fase diam non polar (ex: hidrokarbon oktadekana) digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa non polar. Analisis Kuantitatif
Metode pengukuran tinggi puncak
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada rumus pengukuran tinggi suatu segitiga, yaitu suatu garis tegak lurus dari titik tengah alas kromatogram sampai dengan perpotongan sisi segitiga kromatogram tersebut.

16

 Metode pengukuran luas puncak Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan dengan cara pengukuran tinggi puncak. Luas puncak diukur seperti menghitung luas segitiga yaitu :

Rumus tersebut memberikan hasil yang baik jika kromatogramnya berbentuk lancip. Cara lain menggunakan rumus :

Metode gunting dan timbang Kromatogram yang telah digambarkan pada kertas digunting sesuai bentuknya, kemudian guntingan-guntingan kertas kromatogram ini ditimbang. Berat
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

dari masing-masing guntingan kromatogram ini akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut. Metode Integrator Integrator adalah peralatan elektronik yang sering dijumpai pada peralatan kromatografi yang modern. Alat ini akan mengubah tanda-tanda listrik dari detektor menjadi suatu gambaran kromatogram sekaligus menghitung luas kromatogram yang dibentuk secara elektronik.

17

Analisa Kualitatif Dasarnya adalah waktu retensi atau volume retensi suatu senyawa. Membandingkan t atau V senyawa dalam sampel yang dianalisis dengan t atau V suatu senyawa standar (yang telah diketahui)

Kromatografi pertukaran ion (Ion Change Chromatography)

Kromatografi pertukaran ion merupakan metode kromatografi utama yang paling banyak digunakan dalam produksi makromolekul biologis. Dibandingkan dengan resin konvensional, maka tentakel penukar ion Merck Fractogel dan Fractoprep meningkatkan efisiensi proses pemisahan. Media tentakel memberikan sejumlah manfaat seperti kapasitas tinggi pada tingkat laju tinggi, selektivitas tinggi, efisiensi tinggi, dan pemulihan tinggi. Keduanya memertahankan aktivitas biologi selama pemurnian dan mendapatkan hasil yang tinggi. Semua penukar ion Merck menunjukkan kapasitas pengikat protein yang luar biasa pada tingkat laju tinggi dan menawarkan berbagai fitur yang bermanfaat untuk banyak proses produksi. Kromatografi pertukaran ion adalah salah satu teknik pemurnian senyawa spesifik di dalam larutan campuran. Prinsip utama dalam metode ini didasarkan pada interaksi muatan positif dan negatif antara molekul spesifik dengan matriks yang barada di dalam kolom kromatografi. Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama Thompson pada tahun 1850. Secara umum, teradapat dua jenis kromatografi pertukaran ion, yaitu:

Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan positif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan negatif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus karboksil (CH2-CH2-CH2SO3- dan -O-CH2COO-). Larutan penyangga (buffer) yang digunakan

16

KROMATOGRAFI | 10/25/2011

dalam sistem ini adalah asam sitrat, asam laktat, asam asetat, asam malonat, buffer MES dan fosfat.

kromatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan negatif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan positif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan N+(CH3)3. Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin.

Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekul protein (terutama enzim). Molekul lain yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion iniSuatu resin penukar ion yang ingin direaksikan dalam suatu sistem dapat dilakukan denagan memasuakn gugus-gugus dari suatu resing yang terionkan kedalam suatu matriks polimer organic yang paling lazim diantaranya ialah polisterina hubungan silang yang diatas diperiksasebagai absorben.Produk tersedia dalam berbagai derajat hubungan silang.Suatu resin umumnya yang lazim ialah resin 8 % terhubung silang yang berarti kandungan divinilbenzenanya 8%.Resin-resin itu dihasilkan dalam bentuk manic-manik bulat biasanya dengan 0,1-0,5mm,meskipun ukuran-ukuran lain juga tersedia(Svehla,1985) Resin merupakan bahan sintetik yang berasal dari aneka ragam bahan alamiah maupun sintetik,organic maupun anorganik,memperagakan perilaku pertukaran ion dalam analisis laboratorium dimana keseragaman dipentingkan dengan jalan penukaran dari suatu ion.pertukaran ion bersifat stokiometri,yaitu 1 H+ diganti oleh suatu Na+. Pertukaran ion adalah suatu proses kesetimbangan dan jarang berlangsung lengkap,namun tak peduli sejauh mana prose situ terjadi,stokiometri bersifst eksak dalam arti satu muatan positif
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

meninggalkan resin untuk setiap satu muatan yang masuk. Ion dapat ditukar yakni ion yang tidak terikat pada matriks polimer disebut ion lawan (Underwood,2001) Resin Pemisah Ion

17

Penukar ion adalah suatu metode yang mengikat suatu zat,senyawa,dan unsure yang kita inginkan dimana zat pengotornya tidak ikut terikat.Kemudian,zat yang telah kita inginkan yang telah terikat diresin dapat diambil dengan mengalirkan suatu pelarut yang berinteraksi kuat dengan Ca daripada Ca dengan resin(Pratam,2008). Kromatografi pertukaran ion merupakan metode kromatografi utama yang paling banyak digunakan dalam produksi makromolekul biologis.Dibandingkan dengan resin konvensional maka tentakel penukar ion meningkatkan efisiensi proses pemisahan.Media tentakel memberikan sejumlah manfaat seperti kapasitas tinggi,efisiensi tinggi,damn pemulihan tinggi.Keduanya mempertahankan aktifitas biologi selama pemurnian dan mendapatkan hasil yang tinggi.Semua penukar ion merck menunjukkan kapasitas pengikat protein yang luar biasa pada tingkat laju tinggi dan menawarkan berbagai fitur yang bermanfaat untuk banyak proses produksi(Anonim,2010). Sifat dan resin penukar ion yang digunakan ikut menentukan kesektifan penukaran terhadap berbagai ion,kut tidaknya suatu ion diserap pada resin penukar ion tergantung dari sifat gugus fungsional yang terdapat dalam resin.Hal lain yang ikut menentukan kekuatan digunakan.Semakin tinggi persen hubungan silang maka semakin selektif resin yang bersangkutan terhadap ion-ion yang ukurannya berbeda-beda(Seobargio,2001).
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

diserpnya suatu ion pada resin penukar ion adalah persen hubungan silang resin yang

Larutan yang melalui kolom disebut influent, sedangkan larutan yang keluar dari kolom disebut effluent.Proses pertukarannya adalah serapan dan proses pengeluaran ion adalah desorpsi atau elusi.Proses pengeluaran ion dari kolom dengan reagen yang sesui disebut elusi dan pereaksinya disebut eluen dan yang disebut dengan kapasitas pertukaran total adalah

16

jumlah-jumlah gugusan yang dapat dipertukarkan dalam kolom dinyatakan dalam miliekivalen(Khopkar,2003) Kapasitas penukar ion dari suatu resin penukar ion (anion/kation) adalah jumlah ion yang dapat ditukar untuk setiap 1 gram resin atau banyaknya ion yang yang dapat ditukar untuk setiap 1 ml resin basa.Kapasitas penukar ion biasanya dinyatakan dalam mgrek/g resin kering atau dalam mgrek ion/ml resin basah.semakin besar jumlah gugusan tersebut,semakin besar pula nilai kapasitas penukarnya(Tim Dosen Kimia Analitik,2010). antara lain senyawa alkohol, alkaloid, asam amino, dan nikotin .

KESIMPULAN
Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak/mobil. Fasa diam berupa padatan/cair yang dilapiskan pada padatan/gel. Pada pemisahan ini senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan dalam sistem yang bergerak mengalir melalui suatu sistem yang diam, dan selama pengaliran fasa mobil akan terjadi pelarutan, adsorpsi, dan penguapan. Pada prinsipnya semua cara pemisahan kromatografi mengalami proses yang sama yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fasa diam dan fasa gerak dengan memanfaatkan perbedaan-perbedaan sifat-sifat fisik komponen yang hendak dipisahkan

KROMATOGRAFI | 10/25/2011

Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fouriertransform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). Jenis kromatografi yang dapat digunakan untuk memisahkan campuran zat-zat kimia antara lain : kromatografi lapis tipis ( TLC , Thin Layer Chromatography )

17

kromatografi kolom ( CC , Column Chromatography ) kromatografi Cair cair ( LLC , Liquid Liquid Chromatography ) kromatografi cair kinerja tinggi ( HPLC , High Performance Liquid Chromatography Kromatografi Pertukaran Ion ( IEC , Ion Exchange Chromatography )

DAFTAR PUSTAKA
Achmad, hiskia. 1993. Penentuan dasar-dasr praktikum kimia. Bandung : FMIPA ITB Day dan underwood. 1998. Analisis kimia kuantitatif adisi keenam. Jakarta : Erlangga Sudjadi, 1986. Metode pemisahan . yogyakarta : kanisius Gandjar. Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta. Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publishers Limited, New York. Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Ed., John Wiley & Sons, New York. Web : http://www.chem-istry. org/?sect=belajar http://www.unej.ac.id/fakultas/mipa/jid/vol5no1/yahya.pdf http://www.malang.ac.id/jurnal/fmipa/kim/1996a.htm http://id.wikipedia.com/ Kromatograf.htm www.pdf.com/kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html 16
KROMATOGRAFI | 10/25/2011

http://www.chem-is-try.org/

KROMATOGRAFI | 10/25/2011

17