Anda di halaman 1dari 45

LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN


LAPORAN LENGKAP FITOKIMIA 2
KLT 2 DIMENSI DAN MULTI ELUEN



OLEH :

NAMA : MERLIANA MANSYUR
NIM : N 111 09 104
KELOMPOK : 3 (TIGA)
GOLONGAN : KAMIS
ASISTEN : SAZIDHA F ABAY



MAKASSAR
2011


BAB I
PENDAHULUAN


I.1 Latar BeIakang
Porifera atau spons adalah hewan air yang hidup di laut. Hidupnva
selalu melekat pada substrat (sesil) dan tidak dapat berpindah tempat
secara bebas. (1)
Spons dikenal sebagai organisme yang kaya dengan kandungan
senyawa bioaktif. Spons merupakan biota laut yang paling banyak diteliti
kandungan senyawa bioaktifnya. Senyawa bioaktif dari spons sangat
beragam dan secar kimia memiliki struktur yang unik dan menarik untuk
dijadikan sebagai senyawa pemandu dalam sintesis obat-obat baru.
Hewan ini hidup dengan baik pada ekosistem terumbu karang dan
tersebar dibeberapa pulau dalam wilayah perairan. (2)
Karena sifat kimia dari senyawa bioaktif dari campuran kompleks
tidak diketahui, tidak mungkin untuk mengikuti setiap teknik khusus untuk
pemisahan unsur dari campuran kompleks. Namun, pemisahan campuran
luas dapat dicapai dengan fraksinasi dengan pelarut organik. Ekstrak
etanol / metanol adalah berturut-turut diekstraksi dengan heksana,
kloroform, etil asetat dan kemudian dibagi ke dalam air dan fraksi tidak
larut. Masing-masing fraksi ini kemudian mengalami uji biologis. jika
pemisahan yang baik aktivitas biologis dapat berkonsentrasi di sebagian
kecil tertentu. suatu aktivitas biologis mungkin di lebih dari satu fraksi.
(3:75)
Cara yang paling kurang dihargai tetapi penting untuk memperbaiki
pemisahan ialah pengembangan berganda. KLT 2 dimensi ialah cara yang
memungkinkan pemakaian lapisan penjerap yang lebih luas untuk
memisahkan campuran yang mengandung banyak komponen.
Sedangkan, kromatografi lapis tipis multi eluen pada prinsipnya sama
dengan kromatografi lapis tipis biasa. Metode ini digunakan untuk menguji
kemurnian hasil isolasi yang diperoleh. . Oleh karena itu, digunakan KLT 2
dimensi dan KLT multi eluen untuk menguji kemurnian hasil isolasi
senyawa yang terdapat pada sampel spons Aaptos sp. (4:14-15)

I.2 Maksud dan Tujuan Percobaan
I.2.1 Maksud Percobaan
Mengetahui dan memahami teknik untuk menguji kemurnian hasil
isolasi komponen kimia dari bahan alam, yaitu sampel laut dengan
menggunakan metode kromatografi lapis tipis dua dimensi dan
kromatografi lapis tipis multi eluen.

I.2.2 Tujuan Percobaan
Melakukan teknik pengujian kemurnian hasil isolasi komponen kimia
dari sampel laut Aaptos sp terhadap fraksi C2 dengan menggunakan
metode kromatografi lapis tipis dua dimensi dan kromatografi lapis tipis
multi eluen.
I.3 Prinsip Percobaan
1. Prinsip dari multi eluen yaitu adsorpsi dan partisi dengan
menggunakan lempeng GF 254 sebagai fase diam dengan beberapa
perbandingan eluen pada tingkat kepolaran tertentu untuk mempertegas
adanya senyawa tunggal yang terdapat pada sampel Aaptos sp.
2. Prinsip dari KLT dua dimensi adalah adsorpsi dan partisi dengan
menggunakan lempeng GF 254 sebagai fase diam dan perbandingan
eluen pada profil KLT dimana akan memperpanjang lintasan noda (Rf)
dengan menunjukkan senyawa tunggal yang terdapat pada sampel
Aaptos sp.













BAB II
TINJAUAN PUSTAKA


II.1 Uraian SampeI
II.1.1 KIasifikasi
omain : Eukariota
Kingdom : Animalia
Filum : Porifera
Kelas : emospongiae
Ordo : Hadromerida
Famili : Tethyidae
Genus : Aaptos
Spesies : Aaptos sp. (5)

II.1.2 Kandungan Senyawa
Secara umum pada spons ditemukan kelompok senyawa pada
fraksi non polar seperti senyawa terpenoid, senyawa steroid dan asam
lemak. (6)

II.1.3 MorfoIogi
Jenis spons ini mempunyai rangka yang menyebar dengan 3
ukuran kategori seperti berbentuk kecil, berdinding tebal, atau tidak
mikrosklera. Spons ini seperti kerang yang besar dengan permukaan
alasnya seperti akar yang memiliki tonjolan, reproduksinya aseksual dan
teksturnya halus dan licin. (5)

II.1.4 Kegunaan
Menurut Souza 0t al (2007), senyawa 4-metilaaptamin yang
diisolasi dari spons Aaptos aaptos dapat menghambat infeksi H07p0s
Simpl0 Vi7:s-1 (HSV-1). Nakamura 0t al. (1987) menemukan 2 senyawa
baru golongan alkaloid dari spons Aaptos aaptos yang berasal dari
perairan Okinawa yaitu dimetilaaptamin dan dimetil(oksi) aaptamin yang
memiliki aktivitas sitotoksik dan antimikrobial. Laporan lain menyebutkan
bahwa isoaaptamin dari Aaptos memiliki aktivitas untuk mencegah infeksi
Staphylococc:s a:70:s dengan menghambat enzim sortase A (SrtA)
(Jang 0t al., 2007). (5)

II.2 Teori Umum
Spons adalah biota multiseluler primitif yang bersifat 1ilt07 100/07,
menghisap air dan bahan-bahan lain di sekelilingnya melalui pori-pori
(ostia) kemudian dialirkan ke seluruh bagian tubuhnya melalui saluran
(chann0l) dan dikeluarkan melalui pori-pori yang terbuka (ost:la). Spons
termasuk hewan laut dalam filum porifera yang berarti memiliki pori-pori
dan saluran. Melalui pori-pori dan saluran-saluran inilah air diserap oleh
sel khusus yang dinamakan sel leher, yang dalam banyak hal menyerupai
cambuk. Jenis sel ini dinamakan koanosit (choanocyt0; Yunani=choan0:
cerobong, ytos=berongga). iduga hewan ini berasal dari jaman
paleozoik sekitar 1,6 milyar tahun yang lalu. (7)







Gambar Anatomi spons
Spons hidup secara heterotrof. Makanannya adalah bakteri dan
plankton. Makanan yang masuk ke tubuhnya dalam bentuk cairan
sehingga porifera disebut juga sebagai p0maan cai7an. Ukuran dan
bentuk spons bervariasi. Ukurannya mulai dari mikroskopis hingga
mencapai 2 meter. Sedangkan bentuknya merambat, bercabang, tegak
seperti cerobong atau pipa. (8)
Warna spons bervariasi, dari warna gelap hingga cerah. Warna
pada Spons disebabkan oleh pigmen karotenoid. Spesies spons tertentu
memiliki pigmen yang berwarna gelap setelah kontak dengan udara.
Sedangkan spons lainnya mampu menghasilkan pigmen yang dapat
menyebabkan iritasi pada kulit manusia.
Sepintas nampaknya spons memperlihatkan gejala seperti benda
mati yang diam tanpa aktivitas. Tetapi jika diamati secara seksama, di
dalam tubuhnya terjadi aktivitas yang luar biasa di mana air mengalir
melalui pori di dalam tubuhnya. Spons mampu memompa air secara aktif
sampai 10 kali volume tubuhnya setiap jam, sehingga membuatnya seperti
vakum pembersih laut yang sangat efisien. Spons menyaring air laut untuk
memperoleh makanan. Air laut tersebut dapat mengandung nutrisi berupa
mikroorganisme (diatomae, bakteri, protozoa), bahan-bahan organik yang
merupakan lapukan atau sisa-sisa tubuh organisme yang telah mati, serta
senyawa kimia toksik yang dihasilkan oleh tumbuhan atau hewan lain.
Senyawa kimia toksik ini kemudian dimodifikasi oleh spons di dalam
tubuhnya.(9)
Secara garis besar, spons dikelompokkan menjadi 4 kelas yaitu
0mospongia0 Calca70a, H0actin0lli/a dan Scl07ospongia0.
1. 0mospongia0
Umumnya hidup di laut, tetapi ada pula yang hidup di air tawar. Kelas
ini mendominasi lebih dari 90 % spesies Spons. Kerangka tubuhnya
ada yang terbuat dari silika, Sponsin, dan campuran keduanya.
Tingginya ada yang mencapai 1 meter dan memiliki warna yang
cemerlang. Contohnya Cliona, Spongilla dan Haliclona.
2. Calca70a atau Calcispongia0
Hidup di daerah pantai yang dangkal. Bentuk tubuhnya sederhana
dengan kerangka yang terbuat dari CaCO
3
. Tingginya kurang dari 10
cm dan umumnya hidup di air laut. Contohnya L0:cosol0nia, Clath7ina,
7antia, Scypha, dan Sycon.
3. H0actin0lli/a atau Hyalospongia0
Umumnya dikenal sebagai Spons kaca yang hidup di laut dalam.
Kerangka tubuhnya terbuat dari silika dan spikulanya berduri enam
(h0aon). Tingginya rata-rata 10-30 cm. Contohnya E:pl0ct0lla dan
Hyalon0ma.
4. Scl07ospongia0
Jumlah spesiesnya sangat terbatas. Umumnya ditemukan dalam gua dan
terowongan karang laut. Bentuknya mirip dengan 0mospongia0. (9)
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana
analit-analit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan
fase gerak. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porus dalm bentuk
molekul kecil, atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung
padat atau dilapiskan pada dinding kolom, fase gerak dapat berupa gas
atau cairan. alam kromatografi cair dan juga kromatografi lapis tipi, fase
gerak yang digunakan selalu cair. (10:1)
Ìstilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett
(1908), seorang ahli botani rusia. Ìa telah memisahkan klorofil dan
pigmen-pigmen lain dari ekstrak tanaman dengan cara ini. Nama
kromatografi diambil dari bahasa Yunani (chromato = penulisan, dan grafe
= warna). Kromatografi berarti penulisan dengan warna, saat ini telah
dikenal berbagai macam kromatografi, namun istilah kromatografi
sebenarnya sudah tidak tepat lagi, karena dengan kromatografi juga dapat
dipisahkan senyawa-senyawa yang tidak berwarna termasuk gas.
(11:193)
Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung
pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya,
kromatografi dibedakan menjadi : (a) kromatografi adsorbsi, (b)
kromatografi partisi, (c) kromatografi pasangan ion, (d) kromatografi
penukar ion, (e) kromatografi eksklusi ukuran, dan (f) kromatografi afinitas.
Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi
atas : (a) kromatografi kertas, (b) kromatografi lapis tipis, yang keduanya
sering disebut dengan kromatografi planar, (c) kromatografi cair kierja
tinggi (KCKT), dan (d) kromatografi gas (KG). (12:323-324).
Kromatografi lapis tipis (KLT) bersama-sama dengan kromatografi
kertas (KKr) dengan berbagai macam variasinya pada umumnya dirujuk
sebagai kromatografi planar. Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan
oleh Ìzmailoff dan Scharaiber pada tahun 1938. Pada kromatografi lapis
tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada
permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat
aluminium, atau pelat plastik. (10:45)
alam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari
berbagi macam komponen ditempatkan dalam situasi dinamis dalam
sistem yang terdiri dari fase diam dan fase bergerak. Semua pemisahan
pada kromatografi tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing
komponen diantara ke dua fase tersebut. Senyawa atau komponen yang
tertahan (terhambat) lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih
cepat daripada komponen yang tertahan lebih kuat. Perbedaan gerakan
(mobilitas) antara komponen yang satu dengan lainnya disebabkan oleh
perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, atau penguapan diantara
kedua fase. Jika perbedaan-perbedaan ini cukup besar, maka akan terjadi
pemisahan secara sempurna. Oleh karena itu, dalam kromatografi,
pemilihan terhadap fase bergerak maupun fase diam perlu dilakukan
sedemikian rupa sehingga semua komponen bisa bergerak dengan
kecepatan yang berbada-beda agar dapat terjadi proses pemisahan.
Secara umum, dapat dikatakan bahwa kromatografi adalah suatu
proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem dalam mana komponen-
komponen cuplikan ditahan secara selektif oleh fase diam. (11:194)
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan
lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. emikian juga
peralatan yang digunakan. alam kromatografi lapis tipis, peralatan yang
digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua
laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.
ibandingkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan
kromatografi gas (KG), KLT mempunyai beberapa keuntungan :
- KLT memberikan fleksibilitas yang lebih besar, dalam hal memilih
fase gerak.
- Berbagai macam teknik untuk optimasi pemisahan seperti
pengembangan 2 dimensi, pengembangan bertingkat, dan
pembaceman penjerap dapat dilakukan pada KLT
proses kromatografi dapat diikuti dengan mudah dan dapat
dihentikan kapan saja
- Semua komponen dalam sampel dapat dideteksi. (10:45-46)
- Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis
- Ìdentifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi
warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultra
violet
- apat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun
(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi
- Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang
akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. (12:353-
354)
- Waktu pemisahan lebih cepat
- Sensitif, artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat
dideteksi
- aya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna.
(11:209)
Peralatan yang dibutuhkan pada kromatografi lapis tipis dan
penyiapan pelat lapis tipis diberikan secara singkat dan jelas dalam
Ph.Eur Ì. Peralatan terdiri dari :
Suatu peralatan untuk membuat lapis tipis, dengan bantuan alat ini
bahan sorpsi (sorben) dapat dibuat rata pada pelat dan dapat dilapiskan d
engan ketebalan yang diingini. Pelat dengan panjang 200 mm dan
kelebaran yang memungkinkan sejumlah larutan yang diperiksa dan
larutan pembanding ditotolkan pada titik awal. Bejana (bejana
kromatografi) dari bahan tembus cahaya dengan tutup rapat. Ukuran
bejana harus disesuaikan dengan pelatnya. ari sorben dibuat suspensi
kental, yang dilapiskan pada pelat yang sudah dibersihkan dengan hati-
hati menggunakan alat untuk membuat lapisan dengan ketebalan 0,25
sampai 0,30 mm, jika dalam monografi tidak dikatakan lain. Pelat yang
sudah dilapisi mula-mula dikeringkan di udara, kemudian dikeringkan 1
jam dalam lemari pengering pada 100° sampai 105° C, jika tidak dikatakan
lain. Jika pelat tidak segera digunakan, maka disimpan dalam eksikator di
atas silika gel. Sebelum pengunaan pelat ini diaktivasi dengan
pengeringan kembali selama 1 jam pada 100° sampai 105° C. pada kedua
sisi panjang pelat segaris sorben dihilangkan. Bejana kromatografi dilapisi
kertas saring dan sejumlah besar fase mobil dituangkan untuk penjenuhan
kertas dan pada dasar bejana diisi dengan pelarut pengembang setinggi
1,5 cm. tutup ditutupkan rapat lagi dan jika tidak dikatakan lain didiamkan
selama 1 jam pada suhu kamar (penjenuhan bejana). (13:419)
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap
berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 pm. Semakin kecil
ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran
fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensinya dan
resolusinya. (12:354)
Adsorben yang paling banyak digunakan dalam kromatografi lapis
tipis adalah silika gel dan aluminium oksida. Silika gel umumnya
mengandung zat tambahan kalsium sulfat untuk mempertinggi daya
lekatnya. Zat ini digunakan sebagai adsorben universal untuk kromatografi
senyawa netral, asam dan basa. Aluminium oksida mempunyai
kemampuan koordinasi dan oleh karena itu sesuai untuk pemisahan
senyawa yang mengandung gugus fungsi berbeda. Aluminium oksida
mengandung ion alkali dan dengan demikian bereaksi basa dalam
suspensi air. isamping kedua adsorben yang sangat aktif ini dalam hal
tertentu dapat digunakan kieselgur yang kurang aktif sebagai lapis sorpsi.
(13:420).
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering
dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar.
Sistem yang palaing sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena
daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian
rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah
beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :
1) Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena
KLT merupakan teknik yang sensitif
2) aya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga
Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan
3) Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika
gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut
yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang
bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar
seperti metal benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
4) Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol
dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat
atau amonia masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang
bersifat basa dan asam. (12:359-360)
Bila sampel telah ditotolkan, maka tahap selanjutnya adalah
mengembangkan sampel tersebut dalam suatu bejana kromatografi yang
sebelumnnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah
lempeng lapis tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan ke dalam fase
gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus
dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.
Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin
volume fase gerak sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi
lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan). Untuk
melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan
kertas saring, jika fase gerak telah mencapai ujung atas kertas saring,
maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh. Selama proses elusi,
bejana kromatografi harus ditutup rapat, misalkan dengan lembar
aluminium dan sebagainya.
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang
tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika
maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan
mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi memlalui cara penyemprotan
sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk
menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan
fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi, membuat bercak akan terlihat
jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya
akan diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan
kelihatan hitam, sedang latar belakangnya akan kelihatn berfluoresensi.
Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :
a. Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan
bereaksi secar kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus
fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-
kadang lempeng dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat
reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak
b. Mengamati lempeng di bawah lampu ultra violet yang dipasang
panjang gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut
sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluotesensi terang
pada dasar yang berfluoresensi seragam. Lempeng yang
diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi
dengan senyawa fluoresen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam
fase diam untuk memberikan dasar fluoresensi atau dapat pula dengan
menyemprot lempeng dengan reagen fluoresensi setelah dilakukan
pengembangan.
c. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat
lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan
Nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklat-coklatan
d. Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup
e. Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer,
suatu instrumen yang dapat mengukur intensitas radiasi yang
direfleksikan dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV
atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar
akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatat (recorder).
(12:363)
Pemisahan kromatografi planar (kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kertas) pada umumnya dihentikan sebelum semua fase
gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua
kromatografi ini dicirikan dengan faktor retardasi atau jarak migrasi solut
terhadap jarak ujung fase geraknya. Faktor Retardasi Solut (Rf)
didefinisikan sebagai :
Rf =
]u¡uk ¡ung dìtcmpuh scn¡uwu
]u¡uk tcmpuh ]usc gc¡uk

Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai
perbandingan distribusi () dan faktor retensi (k) sama dengan 0 yang
berarti solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan kecepatan
fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan
pada posisi titik awal dipermukaan fase diam (tidak bergerak sama sekali
dari titk awal penotolan). (10:5)
Contoh soal perhitungan nilai Rf. Pemisahan suatu senyawa yang
tidak diketahui dengan KLT diperoleh nilai Rf 9,75. Tinggi permukaan
untuk senyawa standar X, Y, dan Z masing-masing adalah 12,1 ; 17,3,
dan 20,5 cm. Sedangkan untuk pelarutnya 23 cm. Tentukan senyawa
yang tidak diketahui. (11:214)
Penyelesai soal diatas adalh sebagai berikut:
iketahui : nilai Rf suatu senyawa yang tidak diketahui adalah 0,75
jarak yang ditempuh senyawa X, Y, dan Z adalah : 12,1
; 17,3; 20,5 cm.
Jarak tempuh fase gerak adalah 23 cm.
itanya : senyawa apa yang memiliki Rf 0,75 ?
Jawab :
Rf =
]u¡uk ¡ung dìtcmpuh scn¡uwu
]u¡uk tcmpuh ]usc gc¡uk

Rf X =
12,1
23
= 0,52
Rf Y =
17,3
23
= 0,75
Rf Z =
20,5
23
= 0,89
Jadi, senyawa yang memiliki nilai Rf 0,75 adalah senyawa Y.
Faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Rf dari KLT, yaitu :
1) Struktur kimia dari senyawa yang akan dipisahkan
2) Sifat dari penjerap dan derajat aktivitasnya
3) Tebal dan kerataan lapisan penjerap. Ketidakrataan akan
menyebabkan aliran pelarut menjadi tidak rata
4) Pelarut dan derajat kemurniannya
5) erajat kemurnian dari uap dalam mana bejana pengembangan yang
digunakan
6) Jumlah cuplikan yang digunakan
7) Panjang trayek migrasi
8) Adanya zat asing atau pencemar
9) Kelembaban udara
10) Suhu. (14:19)
Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase
diam, sementara itu proses sebaliknya (pemindahan solut dari fase diam
dan fase gerak) disebut dengan desorpsi. Kedua proses ini (sorpsi dan
desorpsi) terjadi secara terus-menerus selama pemisahan kromatografi
karenanya sistem kromatografi berada dalam keadaan kesetimbangan
dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fase yang bersesuaian
dengan perbandingan distribusinya () untuk menjaga keadaan
kesetimbangan ini. (12:329)
Adsopsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja dan
jangan sekali-kali dikacaukan dengan proses absorbsi yang berarti
penyerapan keseluruhan. Adsorpsi pada permukaan melibatkan interaksi-
interaksi elektrostatik seperti ikatan hydrogen, penarikan dipol-dipol, dan
penarikan yang diinduksi oleh dipol. Solut akan bersaing dengan fase
gerak untuk berikatan dengan sisi-sisi polar pada permukaan adsorben.
Silika gel merupakan jenis adsorben (fase diam) yang
penggunaannya paling luas. Permukaan silika gel terdiri atas gugus atau
gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol bersifat sedikit
asam dan polar karenanya gugus ini mampu membentuk ikatan hydrogen
dengan solut-solut yang agak polar sampai sangat polar.
Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel
mampu mendeaktifkan permukaan silika gel karena ai akan menutup sisi
aktif silika gel. Hal seperti ini dapat diatasi dengan memanaskan pada
suhu 105° C, meskipun demikian reprodusibilitasnya sulit dicapai kecuali
jika suhu dan kelembapan benar-benar dijaga secara hati-hati.
Semakin polar solut makan semakin tertgahan kuat ke dalam
adsorben silika gel ini. Solut-solut non polar tidak mempunyai afinitas atau
mempunyai sedikit afinitas terhadap adsorben polar, sementara solut-solut
yang terpolarisasi mempunyai afinitas yang kecil terhadap adsorben polar
disebabkan adanya interaksi dipole atau interaksi-interaksi yang diinduksi
oleh dipole. Solut-solut polar, terutama yang mampu membentuk ikatan
hydrogen akan terikat kuat pada adsorben karenanya butuh fase gerak
yang cukup polar untuk mengelusinya.
Partisi merupakan proses sorpsi yang analog dengan ekstraksi
pelarut. alam partisi yang sebenarnya, solut akan terdistribusi diantara
fase gerak dan fase diam sesuai dengan kelarutan relatif diantara
keduanya.(12:329-331).
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan
diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil
dan sesempit mungkin. (10:50)
Mengenai pelaksanaan kromatografi lapis tipis Ph.Eur Ì, juga
memberikan penjelasan eksak dan singkat :
Larutan uji ditotolkan 2,5 cm dari bawah dan minimum 2 cm dari sisi
pelat sedemikian rupa hingga terjadi noda teratur yang maksimum
berdiameter 6 mm, jika larutan uji digunakan untuk lebih dari satu
kromatogram, maka noda paling sedikit harus terpisah 1,5 cm satu dari
yang lain dan terletak parallel terhadap bagian bawah pelat. Setelah
penguapan pelarut larutan uji, pelat diletakkan vertical dalam bejana
kromatogafi dan titik awal harus tetap berada di sebelah atas permukaan
fase mobil. Bejana ditutup dan disimpan pada suhu 20 sampai 25° C. Jika
fase mobil sudah melewati trayek yang diberikan dalam monografi, pelat
dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di udara. Selain itu berlaku teknik
penotolan dan konsentrasi larutan yang diperikasa seperti pada
kromatografi kertas, cara pengembangan kroamtaografi lapis tipis adalha
menaik. Seperti pada kromatograf kertas, dalam hal ini jauga mungkin
dilakukan kroamtografi dua dimensi. isamping itu, masih ada cara
pengembangn lainnya, antara lain teknik ganda, kromatografi fungsional,
dan teknik gradien. (13:421-422)
Kromatografi planar adalah satu-satunya teknik kromatografi
dimana kromatografi dua dimensi dapat dilakukan. Ìni merupakan alat
pemisahan yang baik dan cukup sering dilirik sebagai suatu prosedur
untuk dilakukan. Sayangnya kebanyakan pemisahan dua dimensi
dahulunya telah melibatkan pemisahan kurang lebih 20 jenis asam amino
pada selulosa atau silika gel, dimana prosedurnya memakan waktu
seharian untuk dilakukan dan hanya satu sampel per lempeng yang bisa
di analisa dalam satu waktu. Hasilnya adalah suatu kromatogram seperti
cetakan jari, mengidentifikasi noda dengan membandingkannya dengan
standar sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada
kondisi eluen yang sama . Bagaimanapun juga, suatu metode telah
dikembangkan. ulunya asam amino telah dipisahkan dengan cara ini
selama berabad-abad.
alam hal untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk
memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan
pelarut yang sama ini cukup sulit tetapi penting. (15:115)

Gambar mekanisme KLT 2 dimensi
KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi
sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia
yang hamper sama, sebagaimana dalam sampel asam-asam amino.
Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan
secara berurutan pada campuran tertentu sehingga memungkinkan untik
melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang
hamper sama.
KLT dua dimensi dilakukan dengan melakukan penotolan sampel di
salah satu sudut lapisan lempeng tipis dan mengembangkannya
sebagaimana biasa dengan eluen pertama. Lempeng kromatografi
selanjutnya dipindahkan dari chamber pengembang dan eluen dibiarkan
menguap dari lempeng. Selanjutnya, lempeng dimasukkan dalam
chamber yang menggunakan eluen kedua sehingga pengembangan dapat
terjadi pada aeah kedua sehingga pengembangn dapat terjadi pada arah
kedua yang tegak lurus dengan arah pengembangn yang pertama.
Suksesnyapemisahan tergantung pada kemampuan untuk memodifikasi
selektifitas eluen kedua dibandingkan dengan selektifitas eluen. (10:51)
Pada teknik ganda, setelah pengembangan dan pengeringan pelat
kromatografi dilakukan pengembangan kedua, dan untuk ini dapat
digunakan pelarut pengembang yang sama atau berbeda. Seteleh itu
dilakukan proses pengembangan selanjutnya dan seterusnya. Melalui
pengembangan ganda dengan fase mobil sama atau berbeda ini dalam
hal ekstrim akan dicapai hasil pemisahan yang lebih baik. (4:422)
KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan
resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai
karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir
sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase
gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan sehingga
memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai
tingkat polaritas yang berbeda.
Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satu
sistem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar
dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90°,
dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua,
sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak
dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi. (12:364-365)
Untuk kromatografi lapis tipis dua dimensi, sampel ditotolkan pada
sudut lempeng dan dikembangkan sepanjang salah satu tepi piring.
pelarut ini kemudian menguap, lempeng diputar 90° dalam arah
orhtogonal. jika pelarut yang sama digunakan untuk kedua
perkembangan, kemudian sampel tersebut akan didistribusikan di
sepanjang garis dari sudut di mana lempeng itu terlihat ke sudut diagonal
berlawanan. (16:536-537)
alam kromatografi dua dimensi, pengembangan sampel adalah
dengan melihat pada sudut pelat kromatografi dan dikembangkan dengan
eluen pertama (dalam arah pertama). Setelah perkembangan ini, eluen
diuapkan dari lempeng tempat diposisikan sepanjang tepi dari pelat
kromatografi. Pelat ini kemudian diputar melalui 90° dan perkembangan
selanjutnya dilakukan dengan eluen kedua dari tepi dengan bintik-bintik
yang dipisahkan pada eluen pertama menuju tepi berlawanan. campuran
yang dapat didistribusikan pada seluruh permukaan pelat jika kedua eluen
(atau sistem kromatografi) menunjukkan perubahan dramatis dalam
selektivitas. (17:749)
Kromatografi dua dimensi. metode ini didasarkan pada
pengembangan beberapa eluen yang analog dengan yang sebelumnya,
tetapi dengan perbedaan bahwa lapisan kuadrat digunakan, sampel
diterapkan dekat salah satu sudut, dan pengembangan kedua dilakukan
dalam arah tegak lurus dengan yang pertama . Metode ini cocok terutama
untuk pemisahan campuran kompleks dari senyawa. alam pengaturan
biasa, berbagai jenis sistem pelarut yang digunakan dalam masing-masing
dari dua arah. Misalnya seseorang dapat menggunakan fase gerak asam
pada yang pertama dan untuk fase gerak kedua dapat menggunakan
pelarut yang akseptor elektron dan donor elektron atau bahkan dapat
memilih untuk menggunakan mekanisme pemisahan yang berbeda dalam
dua arah (misalnya partisi dan adsorpsi) . Sifat interaksi dapat diubah
dengan mengubah komposisi fase diam.
Kasus khusus dari dua dimensi kromatografi adalah teknik
diagonal. alam teknik ini, kromatogram dikembangkan dengan sistem
pelarut yang sama dalam kedua dimensi. Zat yang tidak mengalami
perubahan kimia selama kromatografi akan terletak pada diagonal dari
kromatogram. Metode ini terutama digunakan untuk karakterisasi lebih
lanjut dari tempat di kromatogram dengan melakukan uji kimia tertentu,
biologi, atau reaksi fotokimia antara dua perkembangan.(18:175-176)
Kadang-kadang, khususnya dalam kasus kelompok besar senyawa
kimia yang mirip struktur dan bersifat seperti asam amino, nilai-nilai Rf
terlalu dekat bersama-sama untuk memberikan pemisahan yang baik
menggunakan salah satu teknik pengembangan dimensi linier. alam hal
ini, resolusi lebih baik dapat diperoleh dengan pengembangan dua
dimensi, yaitu suatu teknik yang dikembangkan oleh Martin, yang
mempekerjakan sistem eluan kedua yang dijalankan pada sudut ketat
untuk yang pertama. Sampel dapat dilihat dengan cara yang normal dan
dikembangkan dengan tepi akhir dalam kontak dengan sistem pelarut
pertama. Pelat ini kemudian dibiarkan kering. Kemudian dikembangkan
dengan pelarut kedua pada sudut kanan ke tepi pertama dari pelat dalam
pelarut. imana komponen murni dari campuran tidak tersedia atau tidak
diketahui maka diperoleh kromatogram dapat berfungsi sebagai sidik jari
atau peta dalam mengidentifikasi dan karakterisasi sampel. (19:67-68)
Keuntungan dari KLT 2 di mensi adalah:
1. Akan meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen
solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, yang nilai
Rfnya juga hampir sama, karena digunakan kertas yang luas dan di
elusi lebih lanjut dengan membaliknya 90
o
.
2. Karena digunakan 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat
digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga
memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai
tingkat polaritas yang berbeda.
3. Memberikan fleksibilitas yang lebih besar, dalam hal memilih fase
gerak.
4. Proses kromatografi dapat diikuti dengan mudah dan daat dihentikan
kapan saja.
5. Semua komponen dalam sampel dapat dideteksi.
6. Karena menggunakan tekni k elusi lebih l anjut, maka hasil
prof il bi sa lebih di opti masi pemi sahannya. (20)
Pada multi eluen, pengembangan ini dilakukan dengan
menggunakan komposisi fase gerak yang berbeda-beda. Lempeng yang
berisi analit dapat dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang beisi
fase gerak tertentu lalu komponen fase gerak selanjutnya ditambahkan
seditik demi sedikit ke dalam bejana dan daduk sampai homogen.
Tujuan utama sistem ini adalah untuk mengubah polaritas fase
gerak. Meskipun demikian untuk memperoleh komposisi fase gerak yang
reprodusibel sangatlah sulit sehingga teknik kromatografi ini kurang begitu
popular. (12: 365-366)
Pada multi eluen, kromatogram berulang kali dikembangkan di arah
yang sama dan dengan demikian resolusi lengkap dari dua atau lebih zat
dengan nilai Rf yang sangat serupa dapat diperoleh. Sebagai fase gerak,
seseorang dapat menggunakan baik sistem pelarut yang sama atau
sistem pelarut yang berbeda. Modifikasi yang sering digunakan dari teknik
ini adalah prosedur yang bertahap, dimana perkembangan pertama
berjalan jarak pendek dari satu detik. Pengembangan pertama dengan
fase gerak lebih polar memisahkan zat-zat yang lebih polar, sedangkan
zat yang kurang polar bermigrasi dengan pelarut lainnya. Zat kurang polar
kemudian dipisahkan dalam pengembangan kedua dengan fase gerak
kurang polar. (18:175)
Alternatif prosedur elusi selanjutnya dapat diubah: misalnya, sistem
pelarut yang berbeda dapat dimanfaatkan dan pelarut diizinkan untuk
bermigrasi ke diperluas secara berbeda. Penggunaan sekuensial dari
serangkaian eluen dari perbedaan kekuatan elutropik dapat digunakan
untuk pemisahan campuran polaritas. Tergantung pada sifat campuran
baik seri meningkatkan atau menurunkan kekuatan pelarut dapat
digunakan. Pendekatan terakhir ini disebut pembangunan bertahap.
Kedua prosedur pengembangan melengkapi teknik gradien dan
menawarkan keuntungan sebagai berikut:
- Meningkatkan efisiensi karena memusatkan atau rekonsentrasi dari
tempat analit pada masing-masing berjalan
- eteksi ditingkatkan karena zona terpisah lebih kecil
- Pemisahan jangkauan yang lebih luas pada polaritas analit. (19:68)
KLT 2 dimensi biasanya dikombinasikan dengan pengembangan
multieluen agar memperoleh beberapa rute yang menjanjikan yang harus
mengarah pada perbaikan nyata dalam kromatografi planar dalam waktu
dekat. (21:183)
Kromatografi multi eluen diperlukan sebelum fraksi aktif dapat
terkonsentrasi ke keadaan kemurnian. Teknik lain seperti kromatografi
lapis tipis preparatif, kromatografi cair kinerja tinggi. Elektroporesis dan
kristalisasi mungkin diperlukan pada tahap akhir isolasi senyawa murni.
(2:77).
Tabel data elutropic pelarut. (3:72)

















BAB III
METODE KERJA


III.1 AIat dan Bahan
III.1.1 AIat
Alat-alat yang digunakan antara lain batang pengaduk, botol coklat ,
chamber, gegep, gelas ukur, lampu UV 254 dan 366 nm, oven,
penyemprot KLT atau sprayer, penggaris, pensil, pinset, pipet tetes dan
pipet skala, dan serta vial.

III.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain aluminium foil, H
2
SO
4
,
hasil isolate pada fraksi C21 sampel laut spons Aaptos sp, lempeng silika
gel GF 254, pelarut etil asetat, kloroform, metanol, pipa kapiler, dan tissue.

III.2 Cara Kerja
1. KLT MuIti EIuen
a. isiapkan alat dan bahan.

b. itotolkan isolat pada 3 lempeng KLT yang berbeda (ukuran 2x8
cm).

c. Pada masing-masing lempeng dimasukkan ke dalam chamber
yang berisi eluen yang berbeda-beda.

d. ibiarkan lempeng terlelusi sempurna kemudian diangkat dan
dikeringkan.

e. iamati noda yang muncul dengan sinar UV 254 dan 366 nm
serta dengan penyemprotan H
2
SO
4

2. KLT 2 dimensi
a. isiapkan alat dan bahan.
b. itotolkan isolate pada salah satu sisi lempeng dengan ukuran
20x20 cm atau 10x10 cm.
c. dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan eluen
yang pertama.
d. ibiarkan lempeng terelusi sempurna kemudian diangkat dan
dikeringkan.
e. iputar 90° kemudian dimasukkan kembali ke dalam chamber
yang berisi eluen yang kedua.
f. ibiarkan lempeng terlelusi sempurna kemudian diangkat dan
dikeringkan. iamati noda yang muncul dengan sinar UV 254
dan 366 nm serta dengan penyemprotan H
2
SO
4
.







BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN


IV. 1 HasiI

























LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

MetanoI:EtiI Asetat (1:2)
UV 366 nm (Fraksi C22)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

MetanoI:EtiI Asetat (1:2)
Dragendorf (Fraksi C22)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

MetanoI:EtiI Asetat (1:1)
UV 254 nm(Fraksi C21 & C22)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

MetanoI:EtiI Asetat (1:2)
UV 366 nm (Fraksi C21)































LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

MetanoI:EtiI Asetat (1:2)
UV 254 nm (Fraksi C21)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

MetanoI:EtiI Asetat (1:1)
Dragendorf (Fraksi C21&C22)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

MetanoI:EtiI Asetat (1:1)
UV 366 nm (Fraksi C21&C22)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

MetanoI:EtiI Asetat (1:2)
UV 254 nm (Fraksi C22)






























LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

KLTP (UV 366 nm)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

KLTP (Proses EIusi)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

KLTP (UV 254 nm)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

KLTP (HasiI EIusi)























LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

KLTP (H
2
SO
4
)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

KLTP (UV 366 nm)

LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

KLTP (UV 254 nm)
LABORATORIUM
FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

KLTP (H
2
SO
4
dan Dragendorf)
IV.2 Pembahasan
KLT dua arah atau dua dimensi ialah cara yang memungkinkan
pemakaian lapisan penjerap yang lebih luas untuk memisahkan campuran
yang mengandung banyak komponen. Selain itu, dua sistem pelarut yang
sangat berbeda dapat dipakai secara berurutan pada campuran tertentu,
jadi memungkinkan pemisahan campuran yang mengandung komponen
yang kepolarannya sangat berbeda.
Sedangkan KLT multi eluen pada prinsipnya sama dengan
kromatografi lapis tipis biasa. Metode ini digunakan untuk menguji
kemurnian hasil isolasi yang diperoleh. Biasanya digunakan 3 jenis variasi
eluen yang berbeda.
Pada praktikum ini dilakukan percobaan KLT dua dimensi dan multi
eluen. Sampel yang digunakan adalah sampel laut Aaptos sp hasil dari
KLTP yang diperoleh hasil pita sebanyak 2, yang disebut ekstrak C21 dan
ekstrak C22.
Ekstrak yang ditotolkan pada lempeng dibuat dalam konsentrasi
yang rendah, karena jika konsentrasinya terlalu pekat, maka akan
diperoleh noda yang berekor atau yang bertumpuk. Selanjutnya lempeng
dielusi dalam chamber yang telah jenuh. Penjenuhan chamber ini
dimaksudkan agar proses elusi dari eluen hanya berasal dari eluen dari
dasar chamber dan bukan dari eluen yang menguap jika chamber tidak
jenuh. Chamber akan diketahui jenuh bila kertas saring yang dimasukkan
ke dalam chamber telah basah. Lempeng dimasukkan dalam chamber
dengan menggunakan pinset dengan posisi berdiri dengan kemiringan
kurang lebih 5
0

iusahakan tempat penotolan sampel tidak terendam
dengan eluen.
Setelah lempeng dielusi, dikeluarkan dari chamber kemudian
dibiarkan hingga mengering. Selanjutnya noda-noda pada lempeng
diamati dibawah lampu UV 366 nm dan kemudian disemprot dengan
H
2
SO
4
10 % dan kemudian dipanaskan di atas pemanas hingga tampak
noda pada lempeng. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah
karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor
yang terikat oleh ausokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi
cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh
komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi
dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian ke keadaan dasar
sambil melepaskan energi. Energi inilah yang menyebabkan perbedaan
fluoresensi warna yang dihasilkan oleh tiap noda. Sedangkan
penampakan noda oleh H
2
SO
4
10 % adalah karena asam sulfat ini bersifat
reduktor sehingga dapat memutuskan ikatan rangkap yang akan
mengakibatkan pergeseran panjang gelombang ke arah yang lebih
panjang sehingga dapat terlihat oleh mata
Konsentrasi asam sulfat yang digunakan adalah 10%, karena jika
konsentrasinya terlalu rendah maka kemampuan pemutusan ikatannya
tidak maksimal. Proses pemanasan dimaksudkan untuk membantu proses
pemutusan ikatan rangkap oleh asam sulfat.
Warna noda yang tampak dari hasil pengamatan dengan lampu UV
366 nm dengan H
2
SO
4
10 % berbeda walaupun dengan nilai Rf yang
sama. Hal ini dikarenakan oleh emisi yang dipancarkan berbeda pada
saat elektron tereksitasi ke keadaan dasar.
Mula-mula hasil kerokan dari lempeng KLTP direndam dengan
metanol dan kloroform P.A dengan perbandingan 1 : 1 selama 5 menit,
Perendaman dengan metanol dan kloroform P.A, karena pelarut ini
merupakan pelarut murni yang bebas dari air dan bahan pengotor,
sehingga tidak akan merusak atau mengganggu senyawa yang terdapat
pada sampel. Setelah itu disentrifuge selama 15 menit untuk memisahkan
silika dan ekstrak. Hasil dari sentrifuge ini kemudian ditampung dalam vial
dan diuapkan.
Pada percobaan ini, digunakan fase diam berupa silica gel dan
dengan menggunakan eluen metanol : etil asetat = 1:1 dan eluen etil
metanol : etanol, yaitu 1:2.
Untuk pengerjaan multi eluen, ekstrak yang telah disentrifius
kemudian dilarutkan dengan kloroform. igunakan kloroform karena
pelarut tersebut baik untuk penotolan pada lempeng sebab memenuhi
syarat pelarut yang bisa digunakan untuk melarutkan ekstrak dan mudah
menguap. Setelah ekstrak dilarutkan, kemudian ekstrak ditotokan pada
lempeng silica gel dan dimasukkan ke dalam chamber, yang sebelumnya
telah dibuat perbandingan eluen di tiap-tiap chamber dengan
menggunakan perbandingan eluen metanol : etil asetat, yaitu 1:1 dan 1:2
dan telah dijenuhkan. Pemilihan eluen ini mewakili perbandingan eluen
polar dan non polar yang perbedaan kepolarannya hanya berbeda sedikit
antara eluen yang satu dengan eluen yang lainnya.
igunakan tiga eluen yang perbedaan tingkat kepolarannya
berbeda sedikit ini agar bisa dilihat pergerakan noda atau hasil dari
elusinya, apakah noda yang ingin dibuktikan tunggal atau tidak bisa dilihat
kenaikannya sedikit demi sedikit sehingga jelas hasilnya. Eluen-eluen
yang digunakan tidak boleh memiliki tingkat kepolaran yang lebih tinggi
dari eluen yang digunakan pada saat proses KLTP. Namun, perbandingan
eluen yang satu dengan lainnya saling berdekatan.
Pada percobaan ini, eluen yang digunakan hanya dua, yang
mewakili senyawa non polar yaitu eluen metanol : etil asetat dengan
perbandingan 1:2 dan yang mewakili senyawa polar yaitu eluen metanol
dengan perbandingan 1:1.
Setelah terelusi dengan menggunakan eluen dari non polar hingga
polar, dilihat penampakan nodanya pada UV 254 dan 366 nm serta
dengan penyemprotan H
2
SO
4
.
Pada percobaan ini, hasil yang diperoleh pada masing-masing
ekstrak C21 dan C22, dengan perbandingan eluen metanol : etil asetat,
yaitu 1:1 dan 1:2 diperoleh hasil bahwa ekstrak C21 dan C22
mengandung satu noda.
Untuk KLT dua dimensi, disiapkan alat dan bahannya, dilarutkan
ekstrak dengan kloroform, lalu ditotolkan pada lempeng yang sudah
diaktifkan dan dibuat perbandingan eluen. Kemudian dielusi hingga batas
atas, setelah mencapai batas atas keluarkan dan keringkan. Setelah itu
putar 90° dan masukkan kembali lempeng kedalam chamber dengan
menggunakan perbandingan eluen kedua, setelah mencapai batas atas
keluarkan dan keringkan. Lihat noda yang tampak pada UV 254 dan 366
nm serta dengan penyemprotan H
2
SO
4
.
Fungsi dari diputarnya 90° agar pita pemisahan dari hasil elusi
pertama terletak pada bagian bawah lempeng dengan tujuan agar pada
saat elusi yang kedua diperoleh pemisahan pita dengan arah yang
berbeda dari pemisahan pertama. Fungsi lain dari diputarnya 90° agar
hasil elusi yang pertama menjadi titik awal pengelusian untuk yang kedua.
Jika pada pengamatan menunjukkan dari kedua kali proses elusi yang
dilakukan terdapat satu bercak tunggal, maka dapat dikatakan bahwa
bercak tersebut merupakan senyawa tunggal.


















BAB V
PENUTUP


V.1. KesimpuIan
ari hasil percobaan diperoleh hasil, yaitu, pada percobaan
kromatgrofi multi eluen diperoleh hasil bahwa noda yang didapatkan
adalah satu,

V.2. Saran
Asisten agar lebih sabar dan semangat dalam membimbing
praktikan












DAFTAR PUSTAKA


1. Anonim. 2000. !o7i107a. iakses dari
http://bebas.ui.ac.id/v12/sponsor/htm. iakses tanggal 30 November
2011

2. Munro, M., H., G., Blunt, J., W., umdei, E., J., Hickford s. J.H.,
Lill,R. E., Shangxiao, li, Battershill, C., N., and uckworth, A. R.,
1999, Th0 /iscov07y an/ /0v0lopm0nt o1 ma7in0 compo:n/s with
pha7mac0:tical pot0ntial Jo:7nal o1 biot0chnology, Elsevier,
Amsterdam.

3. Bhakuni and Rawat. 2005. Bioactiv0 Ma7in0 Nat:7al !7o/:cts. New
elhi : Anamaya Publisher

4. Alam, Gemini, dkk. 2011. !0n:nt:n !7ati:m Isolasi S0nyawa
Bioati1. Makassar : UNHAS

5. Proksch, P., 2005, Isolation an/ St7:ct:70 El:ci/ation o1 S0con/a7y
M0tabolit0s 17om Ma7in0 Spons an/ a Ma7in0/07iv0/ F:ng:s,
Qsseldorf

6. Anton Timur, 2008, Maalah: !07an Ilm: K0la:tan /alam
!0mbang:nan In/on0sia !ot0nsi Obat /a7i La:t N:santa7a,
Fakultas Perikanan dan Ìlmu Kelautan Universitas iponegoro,
Semarang.

7. Munifa, Ì.;Wikanta, T. dan Nursid, M., 2008, Spons:biota la:t
p0nghasil s0nyawa bioati1 yang pot0nsial, Laboratorium
Bioteknologi Kelautan, Pusat Riset Pengolahan Produk dan Sosial-
Ekonomi Kelautan dan Perikanan.

8. Bergquist, P.R., 1978 Spong0s, Hutchinson and Company, London

9. Hooper, J.N.A., 2002, Spong:i/0: g:i/0 to spons coll0ction an/
i/0nti1ication, Queensland Museum, South Brisbane.

10. Rohman, Abdul. 2009. K7omatog7a1i Unt: Analisis Obat. Yogyakarta
: Graha Ìlmu.

11. Yazid, Eisten. 2005. Kimia Fisia Unt: !a7am0/is. Yogyakarta :
Penerbit Andi

12. Ìbnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008. Kimia Fa7masi Analisis.
Pustaka Pelajar. Yogyakarta.

13. Roth, Hermann J. 1998. Analisis Fa7masi. Yogyakarta. Gadjah Mada
University Press

14. Rahim, Abdul, dkk. 2011. !0n:nt:n !7ati:m Fitoimia. Makassar :
UNHAS

15. Smith, R.M, dkk. Thin Lay07 Ch7omatog7aphy : A Mo/07n !7actical
App7oach

16. Poole, Colin F. 2003. Th0 Ess0nc0 o1 Ch7omatog7aphy. London :
British Library

17. Wilson, Ìan . 2009. Han/boo o1 M0tho/s an/ Inst7:m0ntation in
S0pa7ation Sci0nc0. New York : L Elsevier Ltd

18. Heftmann, E. 1983. Jo:7nal o1 Ch7omatog7aphy Lib7a7y Vol:m0 22A.
New York : L Elsevier Ltd

19. Braithwaite, A and Smith, F.J. 1999. Ch7omatog7aphic M0tho/s.
Netherlands : Kluwer Academic Publishers

20. Anoni m. K7omatog7a1i Lapi s Tipi s. i akses dari :
http://lansida. com/2010/06/ klt -kromatograf i-lapi s-tipi s-t l c-
thin.html. iakses pada tanggal 30 November 2011

21. Mondello, Lurgi, dkk. 2002. M:lti/im0nsional Ch7omatog7aphy.
London : Wiley

















SKEMA KERJA
a. M:lti El:0n
Ekstrak

ilarutkan dengan CHCl
3


isiapkan perbandingan eluen
metanol : etil asetat = 1 : 1
metanol : etil asetat = 1 : 2


itotolkan pada lempeng

ielusi dengan ketiga eluen yang telah disiapkan

ilihat pada UV 254 nm dan UV 366 nm











b. KLT :a im0nsi
Ekstrak

ilarutkan dalam CHCl
3


isiapkan eluen

itotolkan pada lempeng

ielusi hingga batas atas

iputar 90
o


ielusi lagi hingga batas atas dengan eluen yang berbeda tingkat
kepolarnnya dari eluen yang pertam

ikeluarkan dari chamber

ikeringkan

ilihat pada UV 254 nm dan UV 366 nm

 !&&     ,9,70,,3 !47107, ,9,: 85438 ,/,, 0,3 ,7 ,3 /:5 / ,:9  /:53;, 80,: 200,9 5,/, 8:-897,9 808  /,3 9/, /,5,9 -0753/, 9025,9 80.,7,-0-,8    $5438 /03, 80-,, 47,3820 ,3 ,, /03,3 ,3/:3,3 803,, -4,91  $5438 207:5,,3 -49, ,:9 ,35,3 -,3, /909 ,3/:3,3 803,, -4,913,  $03,, -4,91 /,7 85438 8,3,9 -07,,2 /,3 80.,7 2, 202 897:9:7 ,3 :3 /,3 203,7 :39: /,/,3 80-,, 803,, 502,3/: /,,2 839088 4-,9
4-,9 -,7:  0,3 3 /:5 /03,3 -, 5,/, 0488902 907:2-: ,7,3 /,3 90780-,7/-0-07,5,5:,:/,,2,,507,7,3    ,703, 81,9 2, /,7 803,, -4,91 /,7 .,25:7,3 42508 9/,/09,: 9/,2:33:39: 203:9809,5903 :8:8:39: 5028,,3:38:7/,7.,25:7,342508 ,2:3 5028,,3.,25:7,3 :,8 /,5,9 /.,5, /03,3 17,83,8 /03,3 50,7:9 47,3  897, 09,34

 209,34 ,/,, -079:7:9
9:7:9 /0897,8 /03,3 08,3,  4741472  09 ,809,9 /,3 02:/,3 /-, 0 /,,2 ,7 /,3 17,8 9/, ,7:9  ,83
2,83 17,8 3 02:/,3 203,,2 : -448  , 5028,,3 ,3 -, ,9;9,8 -448 /,5,9 -074380397,8 / 80-,,3 0. 9079039:  8:,9: ,9;9,8 -448 2:33 / 0- /,7 8,9: 17,8 

  ,7, ,3 5,3 :7,3 /,7, 909,5 50393 :39: 202507-, 5028,,3,,50302-,3,3-07,3/, %/2038,,.,7,,3 202:33,3 502,,,3 ,58,3 50307,5 ,3 0- :,8 :39: 2028,,3 .,25:7,3 ,3 203,3/:3 -,3, 4254303 

$0/,3,3  742,947,1 ,58 958 2:9 0:03 5,/, 573853, 8,2, /03,3742,947,1,58958-,8, 094/03/:3,,3:39:203: 02:73,3,884,8,3/50740   0,703,9: /:3,,3% /2038 /,3 % 2:9 0:03 :39: 203: 02:73,3 ,8 84,8 803,,,3907/,5,95,/,8,25085438,594885   
    ,8://,3%::,3!07.4-,,3    ,8:/!07.4-,,3  0309,: /,3 202,,2 903 :39: 203: 02:73,3 ,8 

84,8 4254303 2, /,7 -,,3 ,,2  ,9: 8,250 ,:9 /03,3 203:3,,3 2094/0 742,947,1 ,58 958 /:, /2038 /,3 742,947,1,589582:90:03      %::,3!07.4-,,3  0,:,3903503:,302:73,3,884,842543032,

/,7 8,250 ,:9 ,5948 85 907,/,5 17,8  /03,3 203:3,,3 2094/0 742,947,1 ,58 958 /:, /2038 /,3 742,947,1 ,58 958 2:90:03 

3 803.594885               .3 0:03 5..798 /03. #1  /03.3 5.3 39. ...3/3.798 /03./84758 /.9: .7.9 5.594885    !7385 /.80 /./84758 /./.3   !7385 /..250.3907/.5.. 1.3. 9:3././..7 2:9 0:03 .4-. 1.8 ./.7 % /:.9:3.3 02503   80-. 93.3.3 507-..803.95.2 /.8.3 0:03 5./.3 203:3:.5.3 -0-07.3 02503   80-.3/3. .3 5. 5741 % /2...3 907/./.3 9079039: :39: 20250790. 507-.  !7385!07.8.3 203:3.3 2025075.3. .5.2 /03.3 203:3. /2038 .9 054.3 34/.250 .80 /. 8..

 274807.8  7/4  .8 42.7 805079 803.2 02. 17. 0248543..3 5072:..  $5438 3 805079 07.5948 . 89074/ /.. 9075034/  803.  ./.2  03:8 $50808     .3 04254 803. %09/.8.3$.7. 7...3          :.0 .250    .594885    ::7.3 .7 /03.8 343 54.81.3..3 -08.3/:3.749. . !47107.3 3/42 :2  0. :2:2 5...        47144  038 85438 3 2025:3. $0.  -07/3/3 90-. 5.0 . %&!&$%     &7.3 .7 /03. 32./.9. 85438 /902:.9047 805079 -07-039: 0.3$03.3 .3 .3 2030-.: 9/./74207/.

 489:.9: /209.2.3108 $9..3 8...8:39:203..3 202 .   20302:.3 .2. -49.83.9 3108 07508 $250'7:8  $'  ../.2-:  038 80 3 /3. 2:980:07 57291 .59.3 -.4..    803..7 .8: 0.3  70574/:83.  209.3 4.3489 .3/3.4/ /..59.5 40 80:8:8.9 1907 100/07  2038.90 :3.2-. /.7 85438 . 09 ...4.3 /.3 3.3 /209 48  .7..7 /.3 2030-:9.808:.39274-..7..23 .:9 /.09.7 507.59.: 547 547 489.7.20307:5.3 .547.7: 443.3 8. 805079 ..:7..2-.380007 .3 .8 /. .59.5948 .54.3 20..3.80  $79  .9 032 8479.: 547 547 /.5948 ..5 .3 -07.3 0 80:7: -. .23 . 20.84.3.9.3 .309.3 /0:.3... 20.9 203.330  /.3       0:3.  02:/... .4.9.. -.0.3  0.30 .8.3 202 9434.  $5438 9072.3 3.5. .79 202 547 547 /..2-.3 -07.3 /84.3 8.3 203.7 /807..3 -.5948 .3 9089:73.2:7.3 / 80033.5948202.34.3 .3/.: 8.:7.:70:8 /03.3 9:-:3.3803.:8 .:7.7 85438 .3 907-:.. .3 -.3 .8 894948 /.  ..9.:7..3  03:7:9 $4:.7.3 -0781.23 /.:8/.9.23/..: 547 547 .         %047&2:2 $5438 . /.5948 /.2 1:2 547107..

2-.3 /.94285438 $5438 /:5 80. 203.7.7 2.. 85438 -07.8  /.8  &:7. 0.9  -07. $5438 /80-.907 /.  20907  $0/.2. 805079 -03/. 502.  .  /:.7 .3..85.. 85438 202507..-.3 2.07..7.25.3 :/.33.7.5 8090.79.8: 0 9:-:3.074-43  948-0743.379.3943  .73.33. /.8. /./. -.3.3 .33.5 3.7.3 5203 ..3 -039: 85438 -07. /03.8.8 3../.3. /.044809.7. 805079.:           .3.-.73.73..    .3.3 85438 .3 40 5203 .73. 80-. .. 090749741  .3 -039:3..:3. /80-:9 :. 0.074-43.   $0539.3 803.9 2030-.3..3 5.749034/  $50808 85438 9079039: 202 5203 .3 .:92.:55.3  90.3:8.5.7.9..3 /. 2.3 5.7 .2 -039: .73. 207.5. 439.  $0/. 0.3 -07..7 2748458 3.9. 5. 2:.3  &:7./. .25: 203. .2-..-. 547107..3 0.3 3 -07.

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

3-07-.507-0/..80/.80 .3 /. /.947:2/.8 .7 2. -0/. 0/:.7.3 907. 0- . 802:..1 .3 0- :.3 80/02..3 .:5.. 0- 2:/. 2.3.-0-07.7..8 /107038.3.2-.980.:.3 /.. 4254303 .3907.39.3 -0793. /.3 907.7.3 0- 80/07./5748085028.798  0...7  /.9..1.3  /2038  50302-.. 93 %  /..380.9..9079.3 . /80-.1.33..-47. -0707.39.2 742..2 .80 /.3/3..920.9.5.3 :.. 2.3 /..80 /.1. 8025:73.947.1 442  02.3.3 742./.3 /03.3  % 202-07.3..2 742. 202 1.3. /3.3  .2 903 :39: 4592.9  0- 02..3 -. .9907.5.:5:3 1.05.05.5.947.3 0. 4254303 4254303.75.58..3809.   07-.7/..3 /03. 4254303 -8.58958 507..947.947.2 .3   $0. 507.2 50.1 ..947.9: 574808 27./ 5028.. 8:.3 80...5.9 /.3.8  ..3 07.1  502./.1 .. 9:  /..3 /:3..8007.3 805079 50302-.257 802:.3/9.: 503:.8.3..3 24-9..3 7:5.2     742. 4254303 ...3 742.703.3 108-9.33.9: /03.3 742.2 507: /.::5-08.2 . /-.3.58 958 /..3/:3.3 507-0/.9..33.9   -.7:9.80091401. . 40 1.2 2. :2:2  /.7.5.0:39:3.8 5028.28 /.947.5.2 88902 /.947.5 1.80 -0707.3 -.3 8.  0 .3 0- 2:7.7 307.9.7.3 -0707. 742.9./..3 0- -08.9 /.8...7. /03..3/3./84758  5.05.3 9079../..-.3 40 507-0/.3.9 /.9  !07-0/.8  %2025:3. 803..3  ..9  /..

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

 0 :2:23.9 93 ..1 803. 803.3 . 3097.3 447/3.8...3 8. 02. 8.3 . .9 2:/..3 /03.3 7:5..35028.5884758    .7:8 2025:3. /:3./847-03:3.9:7 80/02. 50.3 -070.2 8:85038 . 9: 808:.5.380-.3203:3.3/:3 ::8 1:38 -07-0/..8007...3.3. ..078.7...  :23:2 48/.3 80/07..3903.  .2 /.3 /02.50-8073 /03. 0:8 1.2 742..5.3 803.3.93/:3.2202/. 5028.82. . 4592.25:.9 :39: 20250793 /.3 5.2-. 2025:3.9/5/. .254./. /847-03 ..7  8.703. 909../847-03 ..9/:3. ./ 80.3.  07:9 .3/:3 .9 9.  :39:202. . 203.9180-.8 /. 02:73.509:3:/..93.8:2 8:1. .2 . 0:8 .3 203. 0 /. 203.79.3 .7  $8902 .7.9 907. 80-039.7:8 /..5.31.3  50.:39:742.7.25:7.3/:3 43 .3 40 .8 84:9 .3 /.5.3 /..7:9 47.25:7. ..703.  :23:2 48/.3 /507:.3803891   .3:7.. .   . ./..9..3 -.9:7 80/02.3   &39:5028.39. #190709.5.91 3 /..80/.8 1.3 0/:.947.3 27. 0  54. 803..3 -.8.80 07.80 07..3 5.8. /.3/03.... /.05.75:89. %207:5.8 -.3080:7. /..4-..1 .3.8007..703.703. 0. /..78050798.  $.3 7:5. .5.58 958 .3 8.4-.9 .947.81..7:9 3 /.32034592.3 203039:.3. -0-07../.3 0.%/.3 .3 .9: . 9079039:/.3 203.253 0/:.80 07.:23:2 48/.. :39: 5028.

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

7:9.5./..25.3 -. 18.9.3 0. .2:39:202-07.3 203.. 803.7..3 -071:4708038 807.409 ..9 02503 / -..2. -07.3.8.3 /-07 3/. /03.3 80.8./4.3 .3 /507/.8.. -.9:5070. .7 -0.3/2.8..8502-039:.8  . /.9.. .3 042-. .9.3390389.8:..503025749.: .7 :97. -07.:./ -07..  &39:503039:.:: :39: 202507.9/.3 -07.3/:3 ::8 1:3843.9 -07.05.3 5.8  .:  :39: 203.947 .3 -070./.3 50307.25.3.3 7.. % :2:23.3..71:4708038..8 202.39/.95:.3 9../.3 /02.33.5.3 -07.3-07.2 1..73./. . .7.  03025749 02503 % /03. . 9079039: 803..2.  ..73./. 207:5.: -07.3 1:4708038 83.-07.9 0.91 /.3 .2-039:02503..2  02503 .93 -071:4708038  07:9../... . 18.7.8.3 803.9/-0/. -  03./... .3 .3 503...9 -071:4708038 2..7 2.9.-07. 2.1:470803.53.3 028  .3 9070- /.30/....3 80:7: 84:9 ..2  80/.8 80. /:3.73.3 0./03...8.3 .3 .7.38:/.3 02503 /5./-07 /03.3/...3 /5. .409  :4708038  202-:. 203....9..5. 5028. -07.3 5.3.5.25: :97.:39:203/0908-07./ 0..3 -07..38:. ..07. .3 70./03.80/..3 0. ...3 2070.:5:3 -44  . /.33.3 84:9 80-...3 /.3 -071:4908038 907..3 9/.73. 203.3/.5 . /03.7 .7./. 2.5.9/./.9 /:3.3803..3 :39: 203..7.3 -071:4708038  /03. 2. . /03.3 5.3 907.03 742403 .9 70.:/.8.

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

:3..#1 .  /./.2  %039:..3   ./09...80/...947.2  9. .2  $0/.83 .7:3.3./5072:..:    !03008.39/./.#18:.3 8:.  ..947 1.-0707.7% .3202#1  ./.3 9/..: /03...799.3 803.80..7.7.3 ./09.83 2..803...31.9.3 3.:..8..3/./.3  2.3     4394 84.9: 803.2../.32023../.39/.3.548899./.9025:1.       /. #1    %3 5072:.9:   $97:9:72..3 :39: 803.3.5./..2 9/.3/9025:803.3.3/58.  . 803. 5079:3..9:803. 89.5.503494..7803..    .2  .#1/../ 803.. /09. .-07:9 09. /.84.7:93..  .8.3202503.7     /..8007.80-.3 :39: 50.../..3 % /50740 3.- #1          #1   #1    #1    . #1  !028.

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

3..03 $4:9 84:934354.3 907/897-:8 /.3/03.-.9.80/9.3 :..3 8..7:9  .8907.9./847-038.7.390754.0.3-03.139.3.3 1.9248107 .3 54.3 70574/:8-9..7.80 07. . 0.3 8. 8:9 /.3.3/7403 /03.3 5072:./847-03 1.7 /.954.9 /.80 /.703. .2025:3.703.9.9.8 .78.5.:39:-07. 0 207:5.91.7 84:9 2.73./847-0354.7 -03.3 -078.9. -:9: 1.34 -0781.5..::554.3 ::8 8. 5.54.8.5.3 9079.5 40 5072:.79/.354.::832./.5.7  907:9.25: 202-039: .3.  !.. 0 2.8.:.7/.798 207:5.3 /03.9  $02.9.9 0 /.3/3/:8 40 /540  $4:9 84:9 54. ..9 :. .25.3.0 907/7 ..3 038 ..2/..8. .139.8 3907.84:9 84:9 .384:9 84:9..703..: 2025:3.3 80-03.3 /3/:8 40 /54  $4:9 .  84:9 .4 /03..9.:3907.3 0897.907.3 2../847-0354.7  /.3.3.9 80/9 .2 . 0  .7 802039.3002-.: ::8 $ $ /.8::/.8  !072:.3.80 07.91 8./.30.7 .8 50.3 /7403 .139././847-03  $..3 /807.3..3 907.25:202-039:.9..75.2 5.7.5072:.3 203:9:5 88 .8 /03. ..9 ./.2  ..3 802.80.82025:3.3 574808 84758 .3 503:3.388 8854. .8 ::8 .3./. 805079 3 /.8/540.3 202./.798 .83../847-03 .7:39:2030:83.3.7.8.3 8.25: 203/0.3 :. 8::  S   2085:3 /02.9 5.33.2. .7.5.39.503.3907.78.3 5.3 ..3 .7 /80-.8.34 $   ::8 8..

1  50.3 .8 .3 /.91 /.8024- 0.. 742. 2:33 /.3232:2.39.1 . 203.3 80/9 . 742.58 958 ..2 8.3 /.80 07.3 8.0 907.3 .7.80 /.2 808:.5 -.947.3 .2 24347. 50302-.947.2 .47.7:9.3 : /:3./.1 079../.3 2.250 /03.5-07.3 7:5...7:8 90758.3 /.3. 50302-.399.9: 742.9  $090.8.. . 907.947.3 4592. 5./.80 24- 8:/.2947.947..3.079.3 903 .94.3.8. /2038  8..9 .788 50. 50.3.3 4380397.9.3 :  50.8  .3 .35030. 1.3/. /.3 70.3/./. 503:.1 ..3 0.0 . 50.20907  22  ../. 907.1 /:. 742.9 /0:.7:9.383. $0.7-.253 9:  2.3 /50740 ./. 203494.947./.. /03. 3./.:.58 958 .1 079.2 -0.39037.    !028..3.33 .7.7.35../.3 1.3 74..7:9.2/.1.947. 34/. 742.3 /507.3 :39: 0- /.7:9 .8././9:9:5/.39:-07..3 742.3 -.3 /-07.1/.82:2 -07/.7.7 .7.3 ::7./80-0. 200.8 .7:8909.85072:.9 /09..  742.:903 503494..3.5. 3 .  . .9 80/02. 202-07.1 1:3843.7./. 800.3:/9494.7../03     .3 5.7:9.2/. .7:9.308. /.  /.3 74.33.   .2  2.3/073.3 -07.7 8.39..380802592:33     0303. . /.3 50.9:7 .29.25.9: /. 0/:.1 .  $05079 5.9 97.3 90709.3.8  /.3/:/.3/825..3 1./ 34/.8:: 8.:.58 958 ! :7   :.S . 5. .. 805079 5.7-0.

720.9: 2094/0 90.9 5028. 80:48.3 7084:8 .3 ..3 5028.9:  .3 -8.30:.234 5.3 -..3 /.2.3 . 8:.::3. 5..9.3 /:.9.3:7.947.2 8.5.550393     .947.3  ::3.3 50./. .2.9: 8.7.9:3. /03. 2085:3/03.2 .9: 57480/:7 :39: /..7 8.234 90.3. 742. 57480/:73. 8.:.-.3.350...3 .3 .::58:9909.3 8. /.7:9.3 90758.3.09.7.90..3.83.35028. 0-.  8:. /02-.7  203/0391.:./.3 . 202.9: .7:8 /.33. /58.9.3 . 8.742. /../..3  3 207:5.: 8. 3 80.7 .8.947.1 /:.947. .1 5.3:39: /.38..3 .::5 8073 /7 80-. / .3.8 34/.3 .3 -.9: /.2.  50393 :39: 202/:.9: 80.:.9 /.3/3.30- 038.3 .3-07-0/.3.5.2.2 805079 .3....3820%/2038 ..250 507 02503 .3..  .3...3 89.8.1 /2.3 /03. /03.-07. :39: 203/..25:7. 8:.9 202.9: 742. /2038 /.9. /2038 /.-.7:9.20-. 43/8 0:03 ..3 202-.33.2-.:. 0  /2.2 .5:3 :./  .9: 8.3./ ./. 903 742. .2.3  $.3/..8.

25:.: -07-0/.7 .8.8 800919.  02503 /2...7 02503  $0. /.  $0900 9: /...80 07.7..3 02503 958 /. .1 /.3 9:   88902 1.9 /:3..947.3 5028.3.: -07-0/.3/. -07:7:9.8 .2 .9 /:3./.30--.80 24- 8.350..3503073.250 / 8. 8090.3 0:03 /-.3/.3 0:03 5079.250 .2.5.  %/:.3 574808 50302-.3.3 /03.3 9079039: 803.7.3 50302-.2-07.  80-..3. .    . 50302-..25009.5.3 0/:..9 .3.9 742.3 :39: 2024/1.3203:3.947.3/3.3 80.3:39:2033.2.9 -07-0/.  02503 742. :7:8 /03.50302-..3/. 8.: 50302-. /.3 /.30:030/:.37084:8 8.80:030/:.33 .33.3 .  0.7.:.9 907.39:3 5.3 ./5.:.2 .3 . . /03.2507 8./.%..7. 202:33. . .3 :39 20.:/20383-079::.3 8. /03.3./-.3 :39: 3 /.3 8.3.50302-.9./5.803.3:93.3 .25078.3 . 3 /.5 /.3.79.3 503494.8.25:7..2..3 8.5. /.8.3 /.5.803..80:03      !.3 /.5.9.3800919.5028..2 .50302-.3. 0/:.3/.234  $0...3 80907:83..903.. 93. -.3 1.3..2 8.:.9907.:.:.3/03. /2038 /.907892.3 80. /53/.7.33/.2.2.58.2.3 90.3 50.4254303 425430384:902025:3.7.7:9 50302-.0/:.1 80.0./.8:.  $:8083.3 5.9 54..9.08972.3 .3 5079.2.85028.3.3:93.3.9.2 .3:93./.3 907.3 203:. 80-. .3/..  /.3 2025:3.3 20302-.. 02./.9: 8:/:9 .3 20.2.2-07 50302-.

7..3 5.2.25:7.7:9 . 7084:8 . 0/:.95.3 8..8. 5. /2038  50302-.947.250/9494.3 .947. /:3.257 8.3 /03./..3-.8:/:950..1/.703.947... 4254303 4254303 84:9 2025:3.35..3 805.3.3 803./.7 /03.250 09../2038 8.  803.3 203:.80 07.9  /073.3 /5:9.7.805. /-.7  S  /.3 //897-:8. %  .2.. 742.3.234  $0.1.:  /2038 3 -079::. /.947.3.257 8.3..1.908:/:9/.3 .3.3 8. 93.320.250 /9494. .2.3.2 .3 80.390758.3.250 . 202:33. 8.3 :39: 2033..3 8..2 .: /02-. 50302-.8. #1 :.9.3/02-.3 /02-.3 8.302503 .3.9: 889021. 50702-.5  02503 /5:9.3      .3 / 805.7  S /.3 /. 80-.:.1 /:.3-07-0/.3.3. .2 .954.:/742.3 8..3 2025:3. /03. -07. /..3.2 -0. 02503 .3 90758.5.7..2.   $./.78:/:9/2.3 8.79.7..78/.8.90789 2. .9: 905 573  50..3. .3 8.803.3 -078 1.025039:907.3.2. 3.3  02:/.3. 8.  .3 /.3 :39: 20.2.2 . 479443.7:9 3 02:/./. ..3 /09. 5079.2 .9: 88  02503 /.380.3.9742.3 :39: 0/:.9 /:3.2 742. 50702-.7.3.3.3 0:03 5079.  $090.9 -07-0/.3 5079.3/03.43. -07. -07:7:9..203:7:9.8007.3.58958/:..3 3  0:03 ./. 90709.2.80 07. /.3 9:   88902 1. 8:/:9 02503 /..9.947.:7.3 5028. 50.3 8.9 ..      &39: 742.3.250 90780-:9 .  .1 .

7 803.3 /58.4 /03.3.  ..3 507-0/.3  8.3 .3203:-.3 /0..2 5.3.3 42508 /.3 50302-.9 /5488. /. 203.:  S /.7 50.1 /:.35../. 0/:.:.22.808047.9.3/.805947 009743 /.3.3..7:9. /03.7:9 .:7:8/03.7.9 /:3..3. -07-.8     742.0/:..5.3 8.2.1 .9 .5.4../.43.31.3 80.8. .4907:9.90.9203:3.2  .8. /2038  2094/0 3 //.3 80-0:23.3 /03.3 /.3 /.2 /02-.9 742.  8.: 88902 742. 203:: 905 -07.5.7.4254881.: -.3. 28. 0:03 .38205028.3 5. /.2 503..7 /:.2 8009.58.9 202:39:203:3. 094/03.80 07.3 88902 50..8007.3 5..7. 903 /.9 203:3. /../:. /2038  .3 :..3.7 20..3 905 /. 0:03 5079.350. 5.250 /907.5.. 8.3 -0-07.0388890250.2.  909.947.3 :39: 1./7.3 -39 -39 .9 3 02:/.9: 8:/:9  /.3:93..7/:.3 /7.3 0/:.83 /../.3  .2 903 3  742.  .:./84758   $1.83 2.3 /../.798 /..3 .2 0/:. /2038 742..2.3/.5 /03.5.9:7...9//897-:8..7.2 . /.7 905 /03.80/.2 /:.3 ./.3 .3 /5:9.947..3.9..3/:3./.35079.7:9 ..9.3 -.5.3 507:-.1  203:3:.3.3 9/.947.9.3 /4347 009743 .320.3 50.3 805.9 /:-.2.3.3 .5.3 5079.2.8:8 :8:8 /.3 0:03 0/:. .2.9 3907..3.7 02503 9025.0:03 . :39: 5028. ...3 -. /.1  !0.. /.8 /.25:7.80:7:5072:.98 /.3 .8.3 /03..3-07-0/. 50302-.9 8.947.2.3 50702-.25:7.5.947.3/.

 3.3 88902 0:.3 2033.8:/:9.3 2./.2.9 805079 ..7.3. .. 8.507:-.2 . /.43....90780/.9 / 742.. 4  .7803.3 .3.7 742.3 90709.2.3 /:.7 .3 0/:.8.7 /.. 8/ .3 /02-.793  .9 -078.1 .7.3 50302-.250     0:39:3. 742.3 073  02:/..3/2038307 ..3 .39.2.3.3 40 .3 :39: ..9 /50740 /03. :. /2038  . /03..3 8.   . 8:/:9 09.3 -.3:9 /..3 5028. /:3.3 /-./.3 /03.9 :39: . .3:9/03.5./.9 3 02:/.7%/2038. /.2 50. .2 439.  .3 -0781.2.8.7 9025.3.3 /02-./.3 :.9./.309055079..250 09.9078.50702-.9.3 /.3    .:509..7.35079.2. 5.  .3 20. :39: 202-07.3 : 2.3 88902 50.257 8.9: 8:.9:90350302-.7 .9/.2 /03.3.8 /. 3  7084:8 0- -.3 275 897:9:7 /.8:804254-08..9 -071:38 80-.90789 2.2.5.2. 2. /:3.42543032:73/.88./..7.3 2025007.2./:.234  3.947.3202-.8/.8 0- ..3 :8:83.947. 4254303 4254303 84:9 2025:3.25:7. #13.3.:9/. /.. 80.814942.250 /.  $.5.:.9 /.3. .2  094/0 3 907:9.3 3472.703.7:9 5079.3. #1 907.3.3 7084:8 8.3/. /50740 742.7.750.:70.2203/0391.3 / 0:80-.7.2.2 /./.2.3 /03.947. 9079039:  -44 .5.3 079./.  !0.9... /.3.947.39/.9078.3 5.257 8. /09.3 .9.3 /02-.9: 903 ./. .3 .7:9 2. .8 .350.9 /03.: 2.3 3..7:90/:.2.3 905 . 203:3..3.: /0.

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

3 /. 807 2033...3.9.: 203:7:3.54.3 54..9157480/:70:880.3 :39: 5028.3.8 0 /507:..5  /2.3203.3  !03/0.3.80 07.9.38073/:3.. 57480/:7 50302-.7 3 /80-:9 502-./.3-07-0/.30-:.3 50.7 9025.33.3 5079.9/:-. -07.3 .3 .3 -079.350.9.9 .354.83 2.7:9 /.3  0908/93.95. 4/1.3 .3 -07-0/.9 /:3.3.7 2028.9     %  /2038 -.9.2.-07:9  033.7903 3 .3 1.9.3.9./..202:8...3.2.3 0/:.3.5.3:93.3 2003.8 80.7:90. .5. 88902 50.3 .  !03:3.3 /./.3 /.3 0:03 /.3 /58./03 /.3:7.43.5. 50702-.9 203:3.. /03.9.9.9 .3 1.720250740 -0-07.354.30:39:3.8.8/.: 8890250. /42-3.8.7.3 .9 .5 903 7.. /03.:704380397. 81.9.79.380-..7 807.3 0:9745 /.3 2:90:03.5  0/:.8  %07.3 203..3./.7:9.7-0727.7..3 50302-.3 50.7 02:/.9 /:3.9.5.3.3 907. 503/0 /.3 8.5.7  80/.25:7.9.8/03.3 5079.5..79.9: /09  !0302-.3 :39: -0727.7 507-0/. 57480/:7 .3. 88902 50.3 .28.3018038.39:3 5.3.. /..2.3 -. 0- 54.3 0:.31.3.3 -079.3.3/. .25:7.3 0- 54..7:9 .808047.9.0-0. /.7.83-07.7 8..7:9 .3 /03.7:9.3.8.703.3.354.3:3.3.2.90758.3.7     9073..703.2 50302-. -07-0/.3 -.9:7.:.8.85.7:8 .3 0:./.9 /2..3..3 80:038.3.. :7.7:9 /3..  !028.9.80 07..

5 .9.203.3 5./. 9.7 84.3 805079 742..3 789.5.7 307./..7.33.91 /.947..2 742.9: /0.-0/.8 803..947..58 958 5705.947.3  %03 .3 02:73.7.2 ..1 .8 ./.3.0:9745.9     742.7:9    . 5. 2:73                      %.91  742.1 5.8 2:33 /507:.9./.8 0 0.50.1 2:9 0:03 /507:..1 .7 /.947. 507-.9 9074380397.8.3 80-0:2 17. 93  0974547088 /.

88.: 857.3-0780:03.83 02503 /2..      .3 84.2 .594885 025038.7. /.7:909./: -494.25: &'  /. ..3 .3-07-0/..3-.03  503025749 % .:23:2 14  $   .5..250..  02503% ... 8.3  32  4.. ::7.07..9 4741472 209.905.8:.2  .9/. -0/.7./.39.3/:3.3-..34 55.83 2.7.   %:9:03 .:985438./.3503.3988:0     .3 -.2-07  005  0.39.3 ..9  .3  .95.3  .8 ::7  .9/.78  5038  53809  5509 90908 /.2-07 ..  !.3. % #     ..3    .9.9  .38079.3  - 9494.3.3 0 /./..507 /.  . 2...3 -07-0/.07  503.. 0 50.3 .884.3 /:3.3 55098.4.809.9.9.17.9 .3.

3 /./.3 90.3 02503 9070:8 8025:73.: /03.3 83.9: 88 02503 /03.2-07 .3 /073.3  32 8079.35079.30/:.7 &'  /.3.3 02503 9070:8 8025:73..3 /073. 02:/.3  0 .3328079.90 5..3503025749.7  S 02:/.3 /.3  -  9494.7.  8.2-07 .2 . .7.5./03.3 83.3   .7 &'  /.  /  -.9 /.3 0 /.8:.9 /.9/.3 02-..3 0:03 . 8.3503025749.  1  -.:  ..2.2.7.8:.2  .  /2.9./03. 02:/.3 2:3.3 /2.: /03.3 84. /03:.3 2:3.2.9 34/.3$           ..3 /.3 /073.3.3-0780:03.3. 8.3  0  5:9.3::7.3 02503 9070:8 8025:73.3-../ -.9 /.3$    %/2038 ..3.3  . 02:/.2. 0 /. .9 34/.2 .

349809.349809.8    09.9   &'32 7.349809.9   &'32 7.8   #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&                 #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&                     09.9   7.349809.9   &'32 7.8   09.03/471 7.' $!$   '  .8  .8   #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&   #% #& #  $ %   &%$#$ &'#$%$$&                     09.

9   &'32 7.8  09.9   &'32 7.8  .8                     09.349809.9   7.8   09.9   &'32 7.03/471 7.349809.                                #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&   #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&   #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&   #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&                    09.349809.349809.

8:8       .    #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&                       #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&             %! &'32          %! !74808:8   #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&            #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&             %! &'32              %! .

03/471  .                         #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&  #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&   #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&  #% #& #  $ %  &%$#$ &'#$%$$&             %! $              %! &'32                %! &'32               %! $ /.37.

3.8.3 -079:25:  $0.2-07 90.8890250.3/2.3 203:.2 ././ 202:33.859.3 . .3203.3 /. 02503 /0:8 /..5.2-07..73./.25:7. . -07.3.8.83.. ..3 202:33.8:/..32:9 0:03  $.25:7./..9  2.7 0:03 /.3038.7 0:03 . /./2038/.3.7 .7.58.7 /.3 :39: 203: 02:73.9 /.2-07 .33.9:23/.9.2 4380397.079.3 5.2-07 .3.5 . 80.. /2038 ..8.3 ...250 .3 -:..8.3 5028.7 %!. 4380397.3...3/:3 4254303 .4254303 $0.  .3/50740 .7.9.'  !02-.1 . ..3 90.3 .8:.25:7..2-07 3 /2.8. /.58 958 -.9 -07-0/.:03:-.3 /5074034/.3 % 2:9 0:03 5.3 . .:9 .703./.3 /9494.7 574808 0:8 /. -07:7:9..3 /. 8.7.3 .3 703/.3 9079039:  .3/:3-.....80-.3 /:3.3.3 0 /.4-...3507. 03:  !0303:.947. -./. ..9 /5..8.39: /:. .5948 85 .9-07-0/.3 502. ./. 907.250 .7:9.8 0:03.2 .: 50.3054.8.3 .: .7.3.3 203.2-07 /.8.3-07-0/.8:39:2028..7 0:03 .3%/:.. 573853.3 8.3.7. 8.  02503 /2.88..3 -07047 ..3 0897.  !.2-07 9/.3.3/09. .8 .350307. ..8 /.2 .3:93.3/50740.30-:..3 742.: /:.  897.2.  094/0 3 /:3. . 02503 /-:.57.5...3/80-:90897.8:. 03: .3 5.3./:3.3 % /:. /03.:.  $0/.884.

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

  2.9.934/.5.5.30:03 02:/.7 5.. .8:.-.5.3803.3/.3 59..9:3. /...3 203:3.91.3 .5.9 /.3 .3 0:03 0/:. 203. -.7. /.3 328079. &'/..90780-:9207:5..7 ./. -.39.3 073.3 907/./.3/0:83.. 503. 203.3/-:.8 0:..  :38 .3 /.. 9:3.9.3$   :38 /./.8 .3 /.3 -.3 2. 90709.3 0/:.5.9: -07.8 0:8 5079./.3 -.7 .7 /5:9..3 507-.9.7. .9.2.9 8.3503025749./99..35079.8  8090.3  $090.3 /.5030:8.7 5028.25.7  S /.3/..3 /.3 02-. 5028.3 . 02503 /03.30/:.7 0/:.  S . /50740 5028.8 .3 9::.9..3:39:.9 0:8 . 9: 5:9...2-07 /03./03..  .. 02503 0/.  8090.3/3. 5..9./.3 5079.  S . 574808 0:8 .. 8.73.2. /03.9.                    .3 203:3:. -07. 5. -.7..203.9.3/3.2 .3 /.8 0:..7 59..2..:.9507-.3 -07-0/.3073.8 .2.80:8.7 /5:9.73.

./.5..9.3 .2 202-2-3 57. 507.4-.. .9741 2:9 0:03 /50740 .9 /.8.7.9.3.9:  5..3 /50740 .7 .3             .-.' !&%&!   '  0825:.7 /.9:   '  $.3 88903 ..8 507.8  .3 742.7 0- 8.3 ./.3 //.4-..3 802.8 -. 34/.

7 995.808 /.%#!&$%   3432    !47107.  .

.

.-0-.8 : . /.

..

8543847.

4    .943 41 $0.8 803..92  .2:     .730 $5438 .   .3.9 /.9 4..3 &3.  %  /.3/ .98  0 03.3.3 -/:   742..3 $48. 4.3. -4.3/425.79.40.3/.8 5430474  $02.  !0307-93/    -3:4-.79.72.  4:73.2..91 .2  023  /     !03:39:3 !7.07 . 41 -490.943 .:9.8 $03.147/ 8      #    $.0 .0:9.   4.. 43420.3  !:8. 549039.02-07      :374        :39      :2/0      .9..  .43/.72.943 ":0038.3/..947.3     076:89 ! #  $54308 :9.  ..30     #42.2 !02-.479    #    %0 /8.7.  !49038 -.7&$    !748.:3 .344  80.730 .39.9     4.3/ $97:.3/ :. .88 -.8 !07.20/8  4.3 2: 0.0/ :3:8  Q880/471     3943 %2:7     . 8.:9.3 549038.7 .:9.9:2 84.07  28907/.:9.  !     84.83.3 3/4308.3/ /0391.730 . !74/:.!:-807    .99078      .88. ..9:70 :.9:7.3/:80:2 $4:978-.9 #809 !034.2     .-47.943 . 7.7..3. !07.7 -/:#.3!07.3   2.:9.3 !74/: /..3843.3/ /0... &39: !.3 2: 0.808 9./  8903     2.-4908 1742 .2..947:2 490344 0.4254:3/8 9 5.0789.3     :31.4.:9 :8.3 /.3 :78/       $5438-49.3 43/43    44507         $543:/0 :/0 94 85438 .1&39:3.730 /07.39..3/ #../.:9 503.88    .3 /..3:3.0452039 41 2.7.91 .7 09.

03.0789!7088  #.                  !:89.!:-8078  3432  742.  !440  43      %0 8803./.7.943$. .88.!0..79.07 742...9..9.3      .947.72.943 3 $05.7 4.   #49 072.79.8 4.90   ..58 %58  .079/  0192.5-7.808 /.  .33   4:73.7'4:20  04780.0 41 742.3/ $29       742./02..1 .41742.7  843  .7 &$  $29  #   /  %3 .33  3...88.5   4/073 !7.947.3/-44 41 094/8 .2 -/: /   !03:39:3!7...079/  7. 094/8  0907.9:2942.7  995.947./.3/ 3897:2039.5.947. 5574.0 04780.5  43/43  798-7.3/8:07.947. &3.

.

42. ..38/.

  .

.

/.947. 4. 742.9 742.02-07   43/04  :7  /     :9/203843.58 958 9.9.80 85.3.5  43/430                  . 93 92 .947.1 .

3/03./.3/3.3507-./8.02503  0:8/03.3409.9   9494.390.35.0:03.9 209.95.  :9:03 897.5.  .30:03 209.309.3&'32            .809.3   8.5.7:9./.3  .&'32/.$# .809.3409.

9 054.7:9.2-07  073.2038 897.-  %:./.95.3&'32    ./.30:03  9494..2  0:.733.7.3  .2   8.35..&'32/.3/.3/.7 4  0:8.3-07-0/.9.8  5:9.9.02503  0:83.30:03.8.-.-.5.70:03.7.  .8/03.93.35079./.9.9.8.3.