QBQ 0316 Farmcia Noturno

Objetivo do curso

Extrao, purificao e caracterizao da enzima -glicosidase (maltase) de levedura.

Objetivo do curso
Tautomerismo da glicose

Amido, malte, aucares de cerais.

Modelo experimental
Levedura (Saccharomyces cerevisiae) Tambm conhecida como levedura do po

Levedura + bactria

Levedura (5m)

Planejamento das aulas prticas 1, 2 e 3

Fracionamento celular e preparao de homogeneizados. Dosagem de protenas e determinao da atividade enzimtica.

Estrutura celular da levedura

Estrutura celular da levedura

Protocolo de lise celular

Protocolo de lise celular

Rompimento mecnico da parede celular

Tampo para manuteno do pH e PMSF para inibir proteases

Volume final ~12 ml

Espectroscopia visvel e UV
Espectroscopia:

Log(I/Io) = -.c.L Sendo = coeficiente de absoro molar c = concentrao L = caminho percorrido (1 cm) A = - Log(I/Io) A = .c.L

Principais componentes de uma clula...

gua, sais minerais Pequenas molculas (p.ex., vitaminas) Aminocidos e protenas DNA e RNA Aucares e polissacardeos Lipdeos

Mtodos especficos de dosagem: protenas

Coomassie brillant blue

COMPLEXO COLORIDO

Como calcular a concentrao de protena? A curva padro

Log(I/Io) = -.c.L
A = - Log(I/Io)

1cm= A/c
concentrao

Como 1cm constante, ento: A = c . 1cm

Curva padro Procedimento A (pg. 4)

tubos branco 1 2 3 4 5 6 7 8 Tabela 1 albumina gua 0,2 g/L (L) (L) 0 100 10 90 20 80 30 70 40 60 50 50 60 40 70 30 80 20 Tabela 2 massa de protena (mg) reagente de Bradford (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

tubos 1 2 3 4 5 6 7 8

A595

Curva padro Procedimento A (pg. 4)

Tubo Branco

Regio linear A = 0,1 - 0,8 Regio no linear (saturao)

Dosagem de protena no lisado de levedura

tubos branco A1 A2 A3 A4

Tabela 3 L100X H2O reagente de (L) (L) Bradford (mL) 100 1,0 100 1,0 50 50 1,0 30 70 1,0 20 80 1,0 tubos A1 A2 A3 A4 A595

Dosagem de protena no lisado de levedura

tubos branco A1 A2 A3 A4

Tabela 3 L100X H2O reagente de (L) (L) Bradford (mL) 100 1,0 100 1,0 50 50 1,0 30 70 1,0 20 80 1,0 tubos A1 A2 A3 A4 A595

Concentrao de protena no lisado Usar a equao da reta!! (y=ax+b)

Mtodos especficos de dosagem: a -glicosidase.

Enzimas so catalisadores de reaes biolgicas Calculo da atividade enzimtica
k

E+S

E+P Se [S] constante, ento:

v = k[E].[S]

v = ~[E]

p-Nitrofenil--glicosdeo
Sem cor (no absorve no visvel)

COLORIDO

-glicosidase + H2O

p-nitrofenil--glicosdeo

glicose p-nitrofenilato

Mtodos especficos de dosagem: a -glicosidase.

Determinao da atividade especfica da -glicosidase.

tubos

Lisados 10X 50X e 500X

NPGlc 4 mM (mL)
0,2 0,2 0,2 0,2 ---

lisado diludo (mL)

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

1 2 3 4 Branco de Enzima

Tempo de incubao a 30C (min) 5 10 15 20 20

Basta preparar este tubo apenas uma nica vez, mesmo quando se trabalha com diferentes diluies do lisado
tubo Branco de Substrato NPGlc 4 mM (mL) 0,2 lisado diludo (mL) --Tempo de incubao a 30C (min) 20 A420

Tabela 2

Tabela 3
tubos 1 2 3 4 Branco de Enzima Branco de Substrato

L10x A420

L50X A420

L500x A420

Determinao da atividade especfica da -glicosidase.

1 U = 1 mol de P / min

Tratamentodos dados e anlisedos resultados(Relatrio1)

tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 Equao de reta: y = ax + b coeficiente angular = a Intercepto no eixo y = b TABELA PARA O CLCULO DACONCENTRAO DE PROTENAS NO LISADO DO SACCHAROMYCES CEREVISIAE
tubos A595 Massa de protena calculdada utilizando a curvapadro (mg) Volume da amostra (mL) 0,10 0,05 0,03 0,02 concentrao (mg/mL) Diluio prvia (x) concentrao do lisado original (sem diluio) (mg/mL)

TABELA PARA O MONTAGEM DA CURVA-PADRO DE PROTENA massa de protena Abs595 (mg) ---

A1 A2 A3 A4

TABELA PARA O CLCULO DA ATIVIDADE ENZIMTICA

tubos Tempo (min) L10x A420 produto (nmol) L50X A420 produto (nmol)

L500x A420 produto (nmol)

1 2 3 4

5 10 15 20

U/ml e U/mg

QBQ 0316 Farmcia Noturno

O pipetadorGilson

Como ajustar uma pipeta

Como utilizar a pipeta

Como aspirar e dispensar o lquido corretamente

Correto
Utilizar a Parede to tubo

Errado

Ponteiras

Segurana em laboratrio

AVENTAL OBRIGATRIO SEM AVENTAL NO ENTRA NO LABORATRIO, NO FAZ A PROVA DE PROTOCOLO E NO PARTICIPA DA PRTICA

Segurana em laboratrio

NO SER PERMITIDO O USO DE SAPATO ABERTO DENTRO DO LABORATRIO

Segurana em laboratrio

VAMOS PREVENIR ACIDENTES!

Bibliografia
Principles and Techniques of Practical Biochemistry, editado por Keith Wilson and John Walker.