KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat Allah SWT, kegiatan penelitian program kompetitif sub program Pasca Genomic Molekular Farming dengan judul "Penemuan protein baru yang bersifat inhibitor terhadap enzim RNA helikase dari flavivirus" tahun anggaran 20052007 telah selesai dilaksanakan. Kegiatan ini merupakan kegiatan selama tiga tahun. Penelitian ini merupakan penelitian yang penting dan perlu dilakukan untuk mencari solusi permasalahan penyakit infeksi flavivirus yang menjadi masalah besar di Indonesia. Dari hasil skrining 2000 isolat aktinomisetes, telah didapatkan beberapa isolat yang menghasilkan inhibitor. Selanjutnya inhibitor, terutama inhibitor terhadap RNA helikase virus japanese encephalitis telah dipurifikasi. Hasil analisa SDS-PAGE menunjukan satu protein yang dominan, tetapi analisa HPLC masih menunjukan adanya protein lain, yang menunjukan inhibitor belum murni. Saat ini, kami term melakukan purifikasi inhibitor dari beberapa isolat aktiiomisetes. Kami dari tim peneliti mengucapkan terima kasih banyak kepada Program Kompetitif LIP1 yang telah mendanai kegiatan ini. Kami juga mengucapkan terima kasih kepada Koordiiator Sub Program, Prof. Dr. Endang Sukara d m Koordinator Harian Sub Program, Dr. Inez H.S. Loedin yang telah membantu terlaksananya kegiatan penelitian ini. Kami terus berharap agar bantuan dan bimbingan h i tetap dilanjutkan. Cibinong, 3 1 Desember 2007 Tim Peneliti
1. Dr. Andi Utarna 2. Dr. Puspita Lisdiyanti

3. Dr. Agus Haryono

4. A. Zaenal Mustopa, M.Si. 5. Shanti Ratnokomala

6 . Roni Ridwan

PENEMUAN PROTEIN BARU YANG BERSIFAT INHIBITOR TERHADAP ENZIM HELlKASE DARI FLAVIVIRUS
ABSTRAK

Infeksi flavivirus seperti virus hepatitis C (HCV) dan virus japanese encephalitis (JEV) menyebabkan penyakit yang fatal. Sampai saat ini belum ditemukan obat yang efektif untuk penanggulangan kedua penyakit ini. Sebagai salah satu pendekatan adalah mencari obat yang merupakan inhibitor dari enzim yang esensial untuk replikasi virus tersebut. Enzim RNA helikase adalah salah satu diantaranya. Karena selain aktivitas RNA helikase, enzim ini juga memiliki aktivitas ikatan RNA (RNA binding activity) dan ATPase, enzim ini merupakan target yang potensial untuk penemuan obat anti-HCV dan anti-JEV. Pada penelitian ini telah dilakukan skrining inhibitor RNA helikase virus HCV dan JEV menggunakan 2000 isolat aktinomisetes, dan didapatkan beberapa isolat penghasil inhibitor RNA helikase. Salah satu isolat, Streptomyces chartrerusis isolat 05-095, menunjukan aktivitas inhibitor terhadap RNA helikase virus HCV dan JEV. Isolat ini selanjutnya digunakan untuk optimasi kondisi pertumbuhan dan purifikasi inhibitor RNA helikase. Streptomyces chartrerusis isolat 05-095 diturnbuhkan selama 10 hari pada suhu ruang (berdasarkan hasil optimasi). Selanjutnya dilakukan fraksinasi terhadap kultur isolat 05-095 menggunakan ammonium sulfat 70% saturasi dan didapatkan protein dengan tingkat inhibisi 78,4%. Kemudian dia~likasikanke size exclussion column chromatography (Sephadex G-50). Fraksi yang aktif dikumpulkan dan diaplikasikan ke thin layer chromaptography (TLC). Hasil TLC kemudian dianalisa kemumiannya dengan SDS-PAGE dan high performance liquid chromatography (HPLC) menggunakan kolum Cosmosil 5C18 MS. Walaupun hasil analisa SDS-PAGE menunjukan satu pita utama, hasil HPLC menunjukkatl minimal ada dua peaks, menunjukan protein inhibitor belum murni. Sekarang usaha purifikasi inhibitor terus dilakukan.
Kata kunci : RNA helikase, flavivirus, virus hepatitis C (HCV), virus japanese encephalitis

(JEV), inhibitor, aktinomisetes

III. PROSEDUR DAN METODOLOGI

Ekspresi dan purifikasi RNA helikase HCV dan JEV Pada penelitian ini, konstruk yang telah dibuat sebelumnya akan digunakan untuk ekspresi dan purifikasi enzim RNA helikase dari HCV dan JEV. Adapun metoda ekspresi dan purifikasi sesuai dengan prosedur yang telah dikembangkan sebelumnya. Secara singkat, ekspresi RNA helikase di E. coli BL21(DE3)pLysS akan diinduksi dengan IPTG. RNA helikase dipurifikasi dengan kromatografi afinitas menggunakan resin Ni-NTA Agarose (Qiagen) atau TALON (Novagen), dan dianalisa kemurnianya dengan SDS-PAGE. Skrining inhibitor RNA heIikase dari aktinomisetes RNA helikase HCV dan JEV yang telah dipurifikasi digunakan untuk skrining inhibitor dari koleksi aktinomisetes. Sistem skrining telah dikembangkan melalui uji inhibitor aktivitas enzim ATPase dari RNA helikase HCV dan JEV menggunakan 96-well plate. Sistem skrining ini bisa menguji 30 isolat untuk satu kali uji. Sebanyak 1800 isolat aktinomisetes telah diuji. Optimasi kondisi kultur aktinomisetes Pada tahap awal dilakukan optimasi media dan lama kultur dari isolat aktinomisetes yang potensial. Isolat-isolat tersebut dikultwkan pada 75 ml media ISP2 (yeast extract, malt extract, dan glucose) atau medium produksi (MP) (soluble starch, glucose, soybean meal, dan CaCO,) pada suhu ruang dengan pengocokan 200 rpm selama 14 hari. Setiap hari media media kultur diarnbil 1 m dan disentrifugasi untuk memisahkan supernatan, yang selanjutnya digunakan l untuk uji ATPase. Sedangkan endapannya dikeringkan dan kemudian diukur beratnya. Optimasi dilakukan terhadap aktinomisetes penghasil inhibitor tinggi (Streptomyces sp. isolat 05-271 untuk HCV dan S. chartreusis isolat 05-095 untuk JEV). Tingginya pertumbuhan sel actinomycetes ini diharapkan dapat menghasilkan konsentrasi protein inhibitor yang tinggi pula. Uji ATPase Enzim RNA helikase, selain memiliki aktivitas RNA helikase (ATP-dependent helicase), . . . juga memilik-isaktivitas ikatan RNA; (RNA .binding) ,.den . A m s e (RNAZstinu~la&d ATPase), Karena aktivitas RNA helikase tergantung pada ATP dan assay ATPase dapat dilakukan dengan mudah, skrining RNA helikase akan dilakukan melalui uji ATPase. Secara sederhana, uji ATPase dilakukan dengan mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari ATP menjadi ADP dan P, yang dihasilkan dari reaksi enzim ATPase. Uji ATPase dilakukan
,,,,,....

....

Tabel 5. Hasil Assay ATPase tehadap emim RNA helikase JEV dari fraksi hasil pemurnian menggunakan TLC

~nalisa data Lihat pembahasan Abstrak publikasi ilmiahlmakalah di jurnal, dsb

Rencana tindak lanjut h a d akhir Melakuan optimasi dan purifikasi protein inhibitor dari isolat lain. Selain itu, tahun berikutnya, target inhibitor tidak hanya fokus pada protein, tetapi juga senyawa non-protein.