Autophagy, proses dimana sel cukai bagian dari nya sitoplasma dan

memberikan ke lisosom untuk degradasi, masih Iungsi seluler kurang

dipahami. Beberapa kotor morIologi (ultra) Iitur autophagy telah digariskan
(PIeiIer, 1987; Seglen, 1987; Holtzman, 1989), tetapi hanya relatiI baru-baru ini memiliki
pendekatan metodologis baru (Gordon & Seglen, 1986;. Seglen et
al, 1986a) memIasilitasi studi biokimia dan sel biologi karakteristik proses (H0yvik et
al, 1987;. Gordon & Seglen, 1988; Plomp et al, 1989.; Kopitz et al, 1990.). Jalur autophagic-
lisosomal dikenal untuk memainkan peran penting dalam perekonomian protein selular
(Mortimore, 1987), dan mungkin account sebanyak tiga perempat dari degradasi
protein secara keseluruhan, misalnya dalam hepatosit dalam kondisi kelaparan (Seglen et
al., 1979). autophagy adalah biologis dikontrol pada langkah pertama dengan asam amino
tertentu(Poso et al, 1982;. Seglen et al, 1980;. Seglen & Gordon, 1984), dan
dapat maksimal diaktiIkan oleh sel inkubasi dalam asam amino-bebas menengah.

Sedangkan autophagy probe standar seperti [31H] raffinose
(Seglen et al., 1986b) dan LDH (Kopitz et al, 1990.) Dapat
diukur secara langsung dalam sitosol sel-bebas sedimen mayat, disakarida seperti
['4 C]sukrosa (Gordon & Seglen, 1982) dan
['4 CJlactose (H0yvik et al., 1986) menumpuk di mitokondria sebagai
wel seperti dalam vakuola autophagic, dibutuhkan suatu ekstraksi detergen
dari mayat sel untuk memulihkan gula autophaged selektif
(Gordon dkk, 1985c.).
Gambar. 1 menggambarkan ekstraksi [14C] sukrosa dari hepatosit
sel mayat oleh digitonin deterjen pada berbagai konsentrasi.
Sekitar 50% dari sukrosa diekstraksi bawah 0,25 mg / ml; ini
tampaknya fraksi diwakili autophagy, seperti ditunjukkan oleh nya
kepekaan terhadap 3-methyladenine (3MA). Antara 0,25 dan
0,75 mg / ml ada wilayah dataran tinggi tanpa ekstraksi lebih lanjut,
tetapi pada 1 mg / ml dan ekstraksi sukrosa atas tambahan terjadi.
Yang terakhir ini bertepatan dengan ekstraksi enzim mitokondria
MDH, menunjukkan bahwa itu diwakili sukrosa berada di mitokondria.
Hanya 6% dari MDH diekstraksi bawah 1 mg
digitonin / ml, yaitu kontribusi mitokondria untuk digitonin yang
ekstrak sedikit, mungkin mencerminkan autophaged mitokondria.
Selektivitas ekstraksi digitonin lebih lanjut didukung oleh
tingkat autophagy yang serupa diperoleh untuk [3H] raffinose (yang
tidak diambil oleh mitokondria) dan [14C] sukrosa (Tabel 1, tidak
preincubation).

Preincubation hepatosit: efek pada autophagy berikutnya
pengukuran
Secara keseluruhan tingkat penyerapan autophagic tampaknya sebagian besar
berubah oleh preincubation h 2 pada suhu 37 C yang digunakan dalam banyak
eksperimen ini: kenaikan tarif kecil ditunjukkan oleh
LDH uji, tetapi tidak dengan alat tes gula (Tabel 1). para 3MAresistant
(non-autophagic) latar belakang akumulasi LDH
tidak secara signifikan dipengaruhi oleh preincubation, tetapi 3MAresistant
akumulasi gula meningkat menjadi 1,5-2,0% / jam, menunjukkan
preincubation yang mungkin telah memicu peningkatan non-spesifik
permeabilitas gula dan / atau ekstraksi. Karena baik alam
ini akumulasi non-spesifik maupun kepekaan terhadap berbagai
perlakuan eksperimen diketahui, kita telah memilih untuk tidak berusaha
koreksi apapun. Perlu diingat, bagaimanapun, bahwa
tingkat penyerapan diukur setelah preincubation mungkin artifisial
tinggi, khususnya 3MA-tahan tingkat latar belakang.

Degradasi sukrosa autophaged oleh invertase endocytosed
Lisosom mamalia yang tanpa sukrosa-merendahkan
enzim; sukrosa sehingga autophaged akumulasi terus-menerus
dalam hepatosit tikus terisolasi (Gambar 2). Namun, penambahan
ragi invertase, yang sebelumnya terbukti akan diambil ke dalam hepatosit
oleh reseptor-mediated endositosis (Tolleshaug et al., 1984) dan
harus mampu sukrosa kemudian endocytosed merendahkan
(Thirion et al., 1983), mencegah akumulasi autophaged
sukrosa. Setelah lag (20 menit) singkat tingkat sukrosa mulai
penurunan, dan dengan 2 jam jumlah sukrosa diasingkan hanya
sedikit di atas latar belakang awal.
Lag waktu dalam efek enzim akan tampak untuk berargumen melawan
kemungkinan bahwa invertase menurunkan sukrosa diasingkan
sekunder, yaitu setelah gangguan sel dan isolasi dari sedimentable
komponen. Pemeriksaan ketergantungan pH dari
Reaksi enzymic mengungkapkan suatu optimal sekitar pH 5 (hasil tidak
ditunjukkan), dan ada hampir tidak ada aktivitas di netral atau
nilai pH sedikit basa digunakan selama prosedur preparatif
(Yang, di samping itu, dilakukan pada 0 C). Efek
invertase setelah gangguan sel karena itu akan tampaknya tidak mungkin.
Selanjutnya, penambahan invertase pada akhir inkubasi
(Segera sebelum gangguan) tidak memiliki efek (hasil tidak ditunjukkan),
mendukung gagasan bahwa enzim hanya bisa mendapatkan akses ke
gula diasingkan oleh yang diambil endocytically oleh utuh
sel.
Ketika hepatosit yang preincubated dengan invertase selama 1 jam
sebelum pengukuran penyerapan dimulai, tidak ada penyerapan bersih
sukrosa dapat dideteksi (Tabel 2). Efek invertase
preincubation secara efektif ireversibel, menunjukkan bahwa pada
Konsentrasi enzim yang digunakan (4000 unit / ml) yang invertase tidak aktif endocytosed atau dihilangkan dari
autophagiclysosomal
vacuolar sistem, setidaknya untuk durasi
percobaan (90 menit).
Degradasi hampir lengkap sukrosa diasingkan oleh
invertase tampaknya menunjukkan bahwa semua bahan autophaged
akhirnya menjadi dicampur dengan bahan endocytosed. Data
sehingga menunjukkan bahwa benar-benar bifunctional lisosom, yaitu
umum digunakan perbedaan antara autolysosomes dan heterolysomes
(Pfeifer, 1987) mungkin tidak diperlukan.
nvertase tidak mempengaruhi langkah penyerapan autophagic
Untuk memastikan invertase yang tidak mencegah akumulasi sukrosa
dengan mengganggu dengan langkah penyerapan autophagic, kita
diuji pengaruhnya terhadap penyerapan yang ofelectroinjected [14C] laktosa,
gula yang tidak berfungsi sebagai substrat untuk enzim. Sej ak
laktosa, tidak seperti sukrosa, adalah hydrolysable intralysosomally, yang
akumulasi harus diukur dengan adanya vinblastine
untuk mencegah masuknya ke lisosom (H0yvik et al., 1986).
Vinblastine tidak mengganggu aktivitas invertase enzymic
(Hasil tidak ditampilkan). Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 3, vinblastine tergantung
akumulasi laktosa benar-benar tidak terpengaruh oleh invertase, yaitu
invertase sendiri tidak mempengaruhi penyerapan.

Subceliular situs tindakan invertase
Autophaged sukrosa terutama lokal dalam media-cahaya
wilayah metrizamide / sukrosa gradien kerapatan (Gambar 4), tumpang tindih
dengan distribusi aktif (cahaya) lisosom (Seglen
& Solheim, 1985; Tolleshaug & Seglen, 1985; Kindberg et al,.
1987). Amphisomes, sementara diidentifikasi sebagai vakuola yang
gula menumpuk di hadapan inhibitor pengiriman lisosomal
seperti vinblastine, yang juga ditemukan di wilayah ini (Seglen et
al, 1986a)., sedangkan distribusi kepadatan autophagosomes
tidak diketahui.
Sukrosa juga diambil oleh mitokondria, yang membentuk
tajam puncak (M) di wilayah terberat gradien (Gambar 4a).


Namun, langkah-ekstraksi deterj en dalam prosedur uji
(Lih. Gambar. 1) memastikan bahwa ini tidak sukrosa mitokondria
mengganggu pengukuran kami penyerapan autophagic (Gordon
et al., 1985c).
Dalam hepatosit diizinkan untuk endocytose invertase selama autophagy,
[14C] sukrosa dalam lisosom yang mengandung pecahan itu
sebagian besar dihilangkan, sedangkan mitokondria [14C] sukrosa adalah
terpengaruh (Gambar 4b). Hasil ini mendukung pernyataan bahwa
keuntungan invertase akses hanya untuk sukrosa hadir dalam autophagiclysosomal
vakuola. Dukungan tambahan ini disediakan oleh
ketidakmampuan invertase untuk mempengaruhi jumlah sel-terkait radioaktivitas
melampaui batas akuntabel oleh hidrolisis diasingkan
sukrosa (hasil tidak ditampilkan).
Autophagy-independen degradasi sukrosa lisosomal oleh
endocytosed invertase
Autophaged gula dengan cepat translokasi ke lisosom, sebagai
ditunjukkan oleh akumulasi laktosa diabaikan dalam ketiadaan
vinblastine (Gambar 3). Lisosom sehingga bisa diisi dengan
[14C] sukrosa (yang tidak terdegradasi) dengan memungkinkan hepatosit untuk
melakukan autophagy untuk beberapa waktu sebelum penambahan invertase.
Hepatosit preincubated karena aku jam terus berakumulasi
[14C] sukrosa selama inkubasi berikutnya, kecuali inhibitor
ditambahkan. Jika, di sisi lain, penyerapan tambahan
dicegah oleh penghambat autophagy sukrosa, 3MA lisosomal
dipertahankan kira-kira pada tingkat dicapai selama
preincubation (Gambar 5). Penambahan invertase menyebabkan hilangnya
pra-diasingkan sukrosa baik kehadiran dan
adanya 3MA, yaitu independen dari autophagy yang sedang berlangsung. Para
kurva peluruhan berjalan secara paralel, menunjukkan adanya suatu
invertase-kompartemen dapat diakses (mungkin autophagosomes)
mampu mempertahankan tingkat kondisi mapan rendah autophaged
sukrosa dalam ketiadaan 3MA. Perbedaan hampir konstan
antara kurva berhubungan dengan sekitar 1% dari volume sel,
yang dekat dengan volume kompartemen autophagosome
sebelumnya diperkirakan oleh morfometri bawah kondisi yang sama
(Kovacs et al., 1981).
Perlu dicatat bahwa, di hadapan 3MA, degradasi
pra-diasingkan sukrosa dapat diamati hampir segera
setelah penambahan invertase (Gambar 5), menunjukkan bahwa endocytoced.

invertase mencapai beberapa sukrosa-load lisosom yang sangat
cepat. Namun, dalam of3MA ketiadaan, keseimbangan antara
penyerapan dan hidrolisis sukrosa rupanya dipertahankan
untuk beberapa waktu, mungkin mencerminkan waktu yang dibutuhkan untuk
invertase untuk menjadi didistribusikan ke seluruh intercommunicating
populasi vakuola lisosomal (Ferris et al., 1987).
Vinblastine melindungi sebagian sukrosa autophaged terhadap
endocytosed invertase
Mikrotubulus racun seperti vinblastin telah ditunjukkan untuk
mengganggu pengiriman bahan untuk lisosom hepatocytic
baik dari vakuola autophagic dan dari endosomes (Grinde &
Seglen, 1981; Kovdcs et al, 1982;. Ose et al, 1980).. Efek dari
vinblastin pada jalur autophagic tampaknya akan menj adi sangat
pasca-sequestrational (Grinde & Seglen, 1981; Kovaics et al,.
1982), langkah penyerapan yang dihambat oleh hanya sekitar 30%
di 50 UM-vinblastine (Gambar 6).
Degradasi sukrosa autophaged oleh invertase adalah
secara signifikan (- 60%) antagonized oleh vinblastine, dan sebagai gantinya
akumulasi bersih dari gula diasingkan terlihat (Gambar 6).
Vinblastine tidak berpengaruh pada reaksi enzymic itu sendiri (hasil
tidak ditampilkan).
Dalam upaya untuk menj elaskan bagaimana vinblastine mungkin mengganggu
aksi invertase, sukrosa autophaged diizinkan untuk preaccumulated
sebelum penambahan enzim, baik dalam tidak adanya
vinblastine, yaitu mungkin dalam lisosom, atau di hadapan
vinblastine, yaitu mungkin dalam vakuola autophagic prelysosomal.
Meskipun penghambatan autophagic-lisosomal pengiriman oleh
vinblastine tidak lengkap, telah menunjukkan bahwa kurang dari 15%
dari gula autophaged ditransfer ke lisosom selama 1 jam
preincubation dengan vinblastine (H0yvik et al., 1991).
['4 C] Sukrosa yang telah pra-akumulasi dalam ketiadaan
vinblastin secara ekstensif terdegradasi oleh invertase bersama dengan
baru diasingkan sukrosa, seperti ditunjukkan oleh kerugian bersih selama
akhir 2 jam inkubasi (Tabel 3, baris pertama). Bahkan kurang sukrosa
tetap setelah penindasan penyerapan autophagic tambahan
dengan 3MA (Gambar 7; Tabel 3, baris ketiga). Setelah penambahan
vinblastine, bagaimanapun, akumulasi sukrosa daripada kerugian yang
diamati bahkan di hadapan invertase, dan pra-diasingkan
sukrosa tetap baik jika 3MA juga hadir (Gambar 7 dan
Tabel 3). Sehingga pengiriman material dari invertase-containingendosomes untuk lisosom tampaknya akan
dihambat oleh
vinblastine.

Sukrosa yang telah pra-akumulasi di hadapan
vinblastine adalah juga dilindungi terhadap invertase endocytosed,
konstan atau meningkatkan tingkat gula yang diamati dalam kehadiran
dan tidak adanya 3MA masing-masing (Tabel 3). Apakah vinblastine
hadir atau tidak selama akhir inkubasi ada bedanya,
yang ternyata efeknya ireversibel. Perlindungan yang ditawarkan oleh
vinblastin terhadap invertase agak kurang lengkap
(79,2 2,6%; berarti + SEM untuk vinblastine yang mengandung enam
eksperimental kelompok ini termasuk dalam Tabel 3, kolom ketiga,
nilai dalam baris 1 dan 3 melayani sebagai kontrol untuk sel diperlakukan tanpa
atau dengan 3MA masing-masing). Perlu dicatat bahwa sukrosa
diyakini prelysosomal tidak menerima perlindungan lebih daripada
sukrosa diduga berada di lisosom (77% dan 83% masing-masing).
Jika autophagic-endocytic konvergensi yang terjadi hanya pada
lisosomal tingkat atau hanya pada vinblastine, tingkat prelysosomal
akan telah diharapkan untuk melindungi sukrosa dalam kompartemen
paling j auh dari titik masuknya invertase. Kenyataan bahwa
preaccumulated sukrosa sama-sama diakses invertase bawah
semua kondisi cenderung untuk mendukung dalil bahwa endosomes
mungkin memasuki jalur autophagic baik di prelysosomal dan
di tingkat lisosomal (Gordon & Seglen, 1988).
Pengaruh asparagin pada degradasi sukrosa autophaged oleh
endocytosed invertase
Asparagin tidak terdeteksi mempengaruhi kemampuan endocytosed
invertase untuk menurunkan sukrosa autophaged (Tabel 4), menunjukkan
bahwa inhibitor autophagic-lisosomal pengiriman (H0yvik
et al., 1991) tidak menghambat masuknya bahan endocytosed
ke jalur autophagic. Kurangnya efek dari asparagin
kontras dengan vinblastine, yang nyata berkurang
efek invertase baik kehadiran dan tidak adanya
asparagin (Tabel 4). Karena gangguan fluks autophagic baik
pada langkah penyerapan (3MA; Tabel 3) atau di autophagiclysosomal
pengiriman langkah (asparagin; Tabel 4) rupanya adalah tidak ada
konsekuensi untuk degradasi sukrosa oleh invertase, yang
efek perlindungan dari vinblastine tampaknya disebabkan oleh penghambatan
fluks endocytic.
Kehadiran asparagin akan diharapkan untuk menyebabkan
utama bagian dari sukrosa autophaged untuk mengakumulasi prelysosomally.
Degradasi efektif sukrosa oleh invertase di bawah
kondisi (Tabel 4) Oleh karena itu tampaknya menunjukkan masuknya suatu
invertase endocytosed ke vakuola autophagic prelysosomal.
Untuk memeriksa kemungkinan dari sana menjadi, langsung tambahan,
endocytic-lisosomal rute, sukrosa autophaged diizinkan
pra-menumpuk selama 2 jam dalam kehadiran atau tidak adanya asparagin;
hepatosit kemudian diinkubasi untuk tambahan 1 jam (dalam
kehadiran 3MA untuk menekan autophagy lebih lanjut) dengan atau tanpa
asparagin atau vinblastin. Dengan tidak adanya invertase yang preaccumulated
sukrosa dengan baik dipertahankan di bawah semua kondisi
(Tabel 5, kolom pertama dan ketiga). Setelah penambahan invertase (Tabel
5, baris pertama) sukrosa preaccumulated menghilang dengan cepat
terlepas dari apakah asparagin telah ada atau tidak
selama preincubation tersebut. Sejak sukrosa sedikit kurang (15-20%)
telah pra-akumulasi di hadapan asparagin, mutlak
nilai tidak secara langsung sebanding, namun jumlah relatif
terdegradasi oleh invertase dalam 1 jam akan menjadi urutan 40 50%
dalam kedua kasus. Jika invertase telah memasuki jalur autophagic di
tingkat prelysosomal saj a, degradasi prelysosomal
sukrosa akan diharapkan akan lebih cepat daripada
degradasi sukrosa lisosomal, diberikan bahwa kondisi
untuk kegiatan enzymic adalah setara dalam dua jenis vakuola.
Data karena itu cenderung untuk mendukung gagasan langsung
endocytic rute ke lisosom serta rute konvergen
dengan autophagy prelysosomally.
Asparagin, ditambahkan selama inkubasi akhir, tidak bisa
mencegah penurunan akumulasi sukrosa pada pra-invertase
Selain itu, terlepas dari kondisi preincubation (Tabel 5,
kedua baris, kolom kedua dan keempat). Sebuah invertaseantagonist moderat
efek dari asparagin ditambahkan adalah ditunjukkan, mencapai
stastistical signifikansi dalam asparagin-sel pra-perawatan. Jika
masuknya endocytic (entri invertase) telah eksklusif prelysosomal,
penghambatan oleh asparagin fluks lebih lanjut (invertase
pengiriman) ke lisosom yang telah diharapkan untuk melindungi
lisosomal sukrosa dan (jika ada) untuk mempromosikan degradasi
sukrosa prelysosomal. Karena, bagaimanapun, dua jenis preaccumulated
sukrosa tampaknya sama-sama diakses endocytosed
invertase di hadapan asparagin, pengiriman endocytic
baik untuk lisosom dan vakuola autophagic prelysosomal
sepertinya akan ditunjukkan.

Berbeda dengan asparagin, vinblastine sangat ditekan
degradasi sukrosa oleh invertase setelah preincubation baik
dengan atau tanpa asparagin (Tabel 5). Dalam konfirmasi
hasil yang diberikan dalam Tabel 3, vinblastin demikian akan tampaknya menjadi
sama efektif inhibitor kedua dari dua dipostulatkan endocytic
rute masuk ke jalur autophagic-lisosomal.
Vakuola autophagic Prelysosomal (amphisomes) mungkin ada
independen dari masuknya autophagic dan endocytic
Fakta bahwa invertase terdegradasi sukrosa diduga berada di
prelysosomal vakuola bahkan di hadapan 3MA (Tabel 5)
mungkin menunjukkan bahwa masuknya endocytic ke autophagic prelysosomal
kompartemen (amphisome) dapat dilanjutkan secara mandiri
dari fluks autophagic terus-menerus. Ada juga beberapa bukti untuk
fenomena sebaliknya, yaitu endositosis-independen autophagic
masuknya ke amphisome tersebut. Hasil kami sebagai disajikan di atas
mengindikasikan vinblastin yang menghambat pengiriman autophagic untuk lisosom
serta semua endocytic entri ke dalam autophagic-lisosom
jalur; namun data pada Tabel 2 menunjukkan vinblastine yang
tidak mampu mencegah degradasi sukrosa autophaged oleh
pra-endocytosed invertase. tu akan terlihat bahwa baru
terbentuk mengandung sukrosa autophagosomes dapat memberikan mereka
isi untuk invertase penuh amphisomes independen ofongoing
endositosis. Karena amphisomes fungsional demikian ditunjukkan
baik dalam ketiadaan endositosis dan dalam ketiadaan
autophagy, kemungkinan harus dipertimbangkan bahwa mereka mungkin
memiliki tingkat tertentu fluks-independen eksistensi. Data
pada Tabel 2 selanjutnya dapat ditafsirkan untuk menunjukkan bahwa
autophagic pengiriman ke amphisomes mungkin berbeda secara mekanis
dari lebih vinblastine-sensitif (yaitu microtuble tergantung)
intercommunications vakuola.

PEMBAHASAN
Hasil penelitian ini memungkinkan dua kesimpulan utama
yang bisa ditarik. Pertama, karena semua sukrosa autophaged mengumpulkan
dalam lisosom adalah invertase endocytosed diakses, lengkap
mencampurkan bahan autophaged dan endocytosed akan
muncul untuk mengambil tempat di lisosom. Dengan demikian akan tampak seolah-olah semua
lisosom terlibat dalam autophagy adalah manusia yang mampu secara simultan
terlibat dalam endositosis. Apakah yang sebaliknya adalah benar
tidak diketahui, tetapi atas dasar bukti ini tampaknya
wajar untuk mengasumsikan, sebagai hipotesis kerja, bahwa semua lisosom
setidaknya berpotensi bifunctional. Beberapa penyelidikan sebelumnya
telah menawarkan bukti morfologis untuk localizationof autophaged dan endocytosed materi yang sama dalam
lisosom (Dickson et al, 1981;.. Glaumann et al, 1981; Gonatas
et al., 1984). Gradient fraksinasi studi (Kindberg et al.,
1987) telah lebih jauh menunjukkan bahwa, di bawah kondisi maksimal
autophagy, lisosom yang menurunkan materi endocytosed
karakteristik kepadatan menjalani pergeseran keterlibatan autophagic
(Seglen & Solheim, 1985). Tingkat kuantitatif autophagicendocytic
konvergensi tidak, bagaimanapun, telah diakui sebelumnya.
Sukrosa dan invertase, digunakan di tempat lain sebagai endocytic sekuensial
substrat (Thirion et al., 1983) dan untuk menunjukkan lisosom-lisosom
komunikasi (Ferris et al, 1987.), ditemukan untuk menjadi berguna sebagai
kompartemen terpisah penanda dalam demonstrasi
autophagic-endocytic konvergensi. Prinsip ini dapat diperpanjang
untuk lain enzim-substrat pasangan, lih. studi sebelumnya kita menggunakan
laktosa dan, J-galaktosidase (Gordon & Seglen, 1988). Sayangnya
penanda jalur tidak dapat diaktifkan, sebagai
electropermeabilization metodologi saat ini bekerja tidak
tidak memungkinkan pengenalan besar-molekul senyawa-massa
seperti enzim ke dalam sitosol (Gordon & Seglen,, 1982 1986).
Kesimpulan utama kedua yang dapat ditarik dari sekarang
studi adalah bahwa autophagic-endocytic jalur konvergensi muncul
untuk mengambil tempat kedua di prelysosomal dan di tingkat lisosomal.
Kesimpulan ini sangat tergantung pada kemampuan asparagin untuk
selektif menghambat translokasi sukrosa autophaged dari
prelysosomal autophagic vakuola untuk lisosom. Kami sebelumnya telah
menunjukkan bahwa asparagin menghambat transfer autophaged
laktosa ke lisosom, sementara memiliki dasarnya tidak berpengaruh pada
autophagic penyerapan atau hidrolisis intralysosomal (H0yvik
et al., 1991). Kemampuan asparagin untuk menyebabkan akumulasi
autophaged laktosa dan autophagic vakuola (Gordon et al.,
1985a; Seglen, 1987) adalah sesuai dengan titik aksi di
langkah di mana pengiriman dari vakuola autophagic prelysosomal untuk
lisosom terjadi. Efek-hambat pengiriman tampaknya
khusus untuk jalur autophagic: meskipun asparagin adalah
inhibitor yang kuat degradasi protein autophagic (Seglen et al.,
1981) dan degradasi laktosa autophaged (H0yvik et al.,
1991), tidak memiliki efek pada degradasi endocytosed
asialoglycoprotein (Seglen et al., 1980). Ketidakmampuan relatif
asparagin (dalam kontras dengan vinblastin) untuk melindungi autophaged
sukrosa terhadap invertase endocytosed, ditunjukkan dalam
penelitian ini, selanjutnya mendukung pendapat bahwa ini
asam amino tidak mengganggu material dengan fluks dari
endosomes ke lisosom, atau dari endosomes untuk prelysosomal
autophagic vakuola.

Mengingat selektivitas tindakan asparagin, satu akan mengharapkan
sukrosa autophaged dalam kehadirannya menumpuk di prelysosomal
autophagic kompartemen. Seperti asparagin di dapat
mencegah degradasi sukrosa oleh invertase di bawah
kondisi, akan terlihat bahwa kompartemen prelysosomal di
Pertanyaan mampu menerima materi dari autophagy baik
dan endositosis. Karakter bifunctional dari kompartemen ini
telah membawa kita untuk mengajukan 'amphisome' nama untuk itu (Gordon &
Seglen, 1988).
Perlu dicatat bahwa invertase endocytosed muncul untuk mendapatkan
akses ke kedua amphisomes dan lisosom bahkan dalam kehadiran
dari 3MA, yaitu dalam ketiadaan virtual fluks autophagic. Para
amphisome Oleh karena itu tampaknya memiliki beberapa deraj at
permanen eksistensi yang terpisah dari autophagy. Kompartemen
tampaknya dipertahankan dalam ketiadaan endositosis
juga, seperti ditunjukkan oleh fakta bahwa hal itu dapat dimuat dengan
invertase dan selanjutnya mempertahankan kemampuan untuk menurunkan autophaged
sukrosa di hadapan vinblastine, penghambat yang
blok masuknya endocytic dan menekan amphisome-lisosom
pengiriman. Pengamatan bahwa sukrosa baru autophaged masuk
kompartemen yang mengandung invertase bahkan dalam kehadiran
vinblastin menunjukkan bahwa pengiriman bahan dari autophagosomes
untuk amphisomes adalah vinblastine-tahan, yaitu
mikrotubulus-independen. Langkah ini tampaknya juga akan asparagineresistant,
seperti yang disarankan oleh ketidakmampuan asparagin untuk melindungi
terhadap invertase dalam semua kondisi.
Keabadian ditunjukkan amphisome harus
secara teoritis memungkinkan endositosis untuk melanjutkan semua
cara untuk lisosom melalui persimpangan amphisome bahkan di
adanya autophagy, sehingga menghindarkan kebutuhan untuk langsung
autophagy-independen rute. Apakah seperti full-length
endocytic-amphisomal-lisosomal jalur memiliki memadai
kapasitas, atau dipertahankan untuk waktu yang lama dalam ketiadaan
autophagy, tetap merupakan pertanyaan terbuka. Dalam hal apapun ketidakmampuan
dari asparagin untuk melindungi lisosom-akumulasi sukrosa terhadap
endocytosed invertase menunjukkan bahwa rute endocytic langsung
operasi secara paralel dengan rute amphisomal.
Kedua enzim terbukti hydrolytically aktif dalam amphisomes,
invertase dan fl-galaktosidase, keduanya membutuhkan pH rendah untuk
kegiatan. Oleh karena itu kita ragu-ragu menyimpulkan bahwa amphisomes,
seperti lisosom, yang mungkin memiliki interior asam (Gordon
& Seglen, 1988). Menariknya, immunocytochemical / terakhir
studi ultrastruktural dari autophagy pada hati tikus (Dunn, 1990) atau
hamster pankreas (Tooze et al., 1990) telah mengidentifikasi jenis
autophagic vakuola yang berbeda dari autophagosomes baru dibentuk
dalam menjadi asam, dan dari lisosom dalam kurang
lisosomal penanda enzim. Menurut kriteria yang disaj ikan,
vakuola ini akan memenuhi syarat sebagai amphisomes.-The pankreas
amphisomes yang ditampilkan untuk menerima masukan endocytic di
bentuk penanda fase cairan endocytic, lobak peroksidase
(Tooze et al., 1990), sedangkan hepatocytic diduga
amphisomes gagal untuk mengambil pertumbuhan epidermal endocytosed
faktor (Dunn, 1990). Endocytosed asialofetuin sama tidak
tampaknya untuk masuk amphisomes hepatocytic sampai sejauh besar, karena
degradasi protein ini tidak dipengaruhi oleh asparagin (Seglen et
al, 1980).. Di sisi lain invertase dan fl-galaktosidase, baik
diambil oleh reseptor-mediated endositosis (Tolleshaug et al.,
1984;. Andersson et al, 1990), jelas masukkan hepatocytic
amphisomes (pekerjaan ini; Gordon & Seglen, 1988). ni
demikian akan tampak berbeda mungkin bahwa reseptor untuk endocytosed
ligan mungkin berbeda dalam preferensi mereka untuk versus amphisomal
rute (autophagy-independen) langsung ke lisosom.
Namun, harus ditekankan bahwa deteksi yang berbeda
teknik yang tidak selalu sebanding, dan bahwa, misalnya,
kuantitatif jalur yang sangat kecil dapat memberikan jumlah yang cukup
enzim untuk menghasilkan efek enzymic mencolok kualitatif.

Kation-independen manosa 6-fosfat reseptor (MPR)
telah disarankan sebagai penanda spesifik akhir endosomes, kelas
dari vakuola endocytic prelysosomal (Griffiths et al., 1988). Dunn
(1990) mengamati MPR dalam proporsi yang signifikan dari hati
autophagic vakuola, menunjukkan bahwa amphisomes dan akhir
endosomes mungkin identik. Di sisi lain, Tooze dkk.
(1990) menemukan amphisomes pankreas menjadi tidak memiliki MPR sementara
penanda itu seragam hadir dalam lisosom pankreas, yaitu
MPR-positif vakuola autophagic mungkin dapat mewakili lisosom
bahkan dalam hati. Meskipun banyak pertanyaan tentang
identitas dan biologi amphisomes karenanya tetap tak terjawab, yang
mempresentasikan hasil, bersama dengan orang-orang dari kelompok lain, sementara
menyarankan bahwa mungkin vakuola menempati posisi sentral di
titik antara autophagy dan endositosis.
Karya ini telah bermurah hati didukung oleh Kanker Norwegia
Masyarakat. Kami berterima kasih Mona Birkeland untuk memberikan teknis terampil
bantuan, dan Ruth Puntervold untuk mempersiapkan ramah elektron
mikrograf. Kami berterima kasih kepada Helge selanjutnya Tolleshaug dan
Trond Olav Berg untuk memungkinkan kita untuk memasukkan data dari analisis mereka
MDH dan LDH masing-masing.