Anda di halaman 1dari 30

Penetapan Kadar Parasetamol dalam Plasma dengan Metode Chafetz

A. Tujuan

1. Mahasiswa mampu menetapkan kadar parasetamol dalam darah dengan metode chafetz.

2. Mahasiswa dapat memahami parameter-parameter yang dibutuhkan untuk melakukan validasi suatu penelitian.

B. Dasar Teori Parasetamol atau asetaminofen adalah senyawa turunan para-aminofenol

yang memiliki rumus bangun seperti di bawah ini:

HO NHCOCH 3 N-(4-Hydroxy-phenyl)-acetamide
HO
NHCOCH 3
N-(4-Hydroxy-phenyl)-acetamide

Parasetamol berupa serbuk hablur atau serbuk putih yang tidak berbau dengan rasa agak pahit. Kelarutan parasetamol yakni larut dalam air mendidih dan dalam NaOH 1 N, serta mudah larut dalam etanol (Anonim, 1995). Parasetamol merupakan obat asam lemah dengan pKa 9,5 (Katzung, 1989). Parasetamol merupakan metabolit fenasetin dengan efek antipiretik yang sama dan digunakan sejak tahun 1893. Efek antipiretiknya ditimbulkan oleh gugus aminobnezen. Efek analgesik parasetamol serupa dengan asam salisilat, yaitu menghilangkan nyeri ringan sampai sedang dengan mekanisme yang diduga berdasarkan efek sentralnya. Parasetamol merupakan penghambat biosintesis prostaglandin yang lemah. Dalam plasma, 25 % parasetamol terikat pada protein plasma. Sebagai analgesik, parasetamol sebaiknya tidak diberikan terlalu lama karena kemungkinan menimbulkan nefropati analgesik (Wilmana, 1995). Plasma adalah bagian bening yang terdapat pada lapisan bagian atas darah yang telah diberi antikoagulan dan telah disentrifugasi. Jika sebelum

disentrifugasi, tidak dilakukan penambahan antikoagulan (darah dibiarkan membeku) maka bagian beningnya disebut serum. Pada darah normal, jumlah plasma mencapai 55% dari volume darah. Plasma tersebut mengandung 90% air dan 7% protein (albumin, globulin, fibrinogen), dan 3% zat terlarut yang lain (garam-garam, oksigen, gas, glukosa, hormon, metabolit, nutrient dan zat-zat lain) (Stalcup et al., 1995). Dalam plasma, protein yang terbanyak ditemukan adalah albumin (Montgomery et al., 1992). Dua fungsi utama albumin adalah untuk transport molekul kecil dalam plasma dasn cairan ekstraseluler, dan untuk mempertahankan tekanan osmotik dalam kapiler nonspesifik (Montgomery et al., 1992) yang memiliki 2 tempat ikatan pada setiap molekulnya (Rang et al., 2003). Pengikatan molekul kecil pada protein dapat dituliskan dengan persamaan umum sebagai berikut: [P] + [A] [PA], dimana [P] = protein yang tidak membentuk kompleks dengan molekul kecil, [A] = kadar molekul kecil yang tidak terikat, dan [PA] = kadar kompleks protein-molekul kecil (Montgomery et al.,

1992).

Spektrofotometri UV-Vis adalah salah satu teknik analisis fisika kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang 190-380 nm (UV) dan 380-780 nm (Vis) dengan memakai instrument spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995). Sedangkan kolorimetri mencakup pengubahan senyawa tidak berwarna menjadi senyawa berwarna dan penentuan fotometrinya dilakukan dalam daerah sinar tampak (400-800 nm) (Roth dan Blaschke, 1981). Metode Chafest sangat spesifik untuk parasetamol meskipun dipengaruhi oleh salisilat (Chamberlain, 1995). Asam salisilat akan memberikan reaksi yang mirip dengan parasetamol, tetapi di dalam plasma asam salisilat baru akan memberikan intensitas warna yang mirip dengan 20 µg/ml parasetamol jika kadar asam salisilat di dalam plasma 1000 µg/ mL. Sampel yang terkontaminasi oleh heparin yang mengandung kresol sebagai pengawet dapat memberikan hasil yang semu sebesar 200 µg/ mL (Widdop, 1986).

Cincin aromatis dari parasetamol akan dinitrasi oleh asam nitrit menjadi 2- nitro-4-asetamidofenol. Produk ini kemudian dilarutkan dalam natrium hidroksida sehingga suasananya menjadi basa. Dalam suasana inilah larutan akan memberikan kromofor yang kuat sehingga absorbansi dapat terbaca pada 430 nm (Chafetz et al., 1971).

OH OH HNO 2 [O] + H NHCOCH 3 NHCOCH 3
OH
OH
HNO 2 [O]
+
H
NHCOCH 3
NHCOCH 3

NO 2

OH OH - -H 2 O
OH
OH -
-H 2 O

NHCOCH 3

NO 2

Gambar Reaksi Parasetamol dengan Asam Nitrit

(Chafetz et al., 1971).

Namun, metode ini tidak dapat mengukur dengan tepat konsentrasi parasetamol dalam plasma di bawah 50 µg/ mL sehingga pada konsentrasi tersebut biasanya digunakan metode kromatografi (Widdop, 1986). Dalam klinik, metode ini biasanya digunakan untuk penetapan kadar parasetamol plasma pada kasus overdosis (Chambers dan Jones, 1976). Parameter kesahihan (validasi) metode analisis antara lain akurasi, presisi, spesivitas, linearitas, sensitivitas, dan ruggedness. Akurasi yang baik untuk bioanalisis rentang akurasi 80-120 % masih bisa diterima. Untuk bioanalisis CV= 15-20 % masih diterima. Linearitas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003). Sensitivity metode analisis adalah kemampuan metode analisis untuk memisahkan perbedaan kecil dalam konsentrasi analit. Ada dua faktor yang mempengaruhi sensitivitas yaitu slope kurva baku dan keterulangan (Skoog,

1994).

Ruggedness digunakan untuk melihat reprodusibilitas hasil analisis menggunakan sampel yang sama dengan berbagai macam kondisi percobaan seperti laboratorium, analisis, instrument, waktu yang berbeda dan lain-lain (Anonim b, 1995). Dalam penetapan kadar obat dalam darah (cairan tubuh), metode yang digunakan harus tepat dan dalam pengerjaannya diperlukan suatu ketelitian yang cukup tinggi agar diperoleh hasil yang akurat. Sehingga nantinya dapat menghindari kesalahan yang fatal. Dalam analisis ini, kesalahan hasil tidak boleh lebih dari 10 %, akan tetapi hal ini tergantung pula pada alat yang digunakan (Ritschel, 1976). Dalam sebuah analisis obat dalam cairan hayati, ada hal-hal penting dalam farmakokinetika yang digunakan sebagai parameter- parameter antara lain :

Tetapan laju invasi atau tetapan absorpsi. Volume distribusi : menghubungkan jumlah obat dalam tubuh dengan konsentrasi obat (C) di dalam darah atau plasma. Ikatan protein. Laju eliminasi dan waktu paruh dalam plasma (t1/ 2 ) Clearence ginjal, ekstrarenal dan total Luas dibawah kurva dalam plasma (AUC) Ketersediaan hayati Parameter di atas diperoleh dari perubahan konsentrasi bahan obat dan metabolitnya dalam cairan darah (darah, plasma, serum) dan dalam urin terhadap waktu. Kedua cairan tersebut mudah dilewati dan konsentrasi dalm darah yaitu alat transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler,

dan konsentrasi dalm darah yaitu alat transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler, 1991).
dan konsentrasi dalm darah yaitu alat transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler, 1991).
dan konsentrasi dalm darah yaitu alat transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler, 1991).
dan konsentrasi dalm darah yaitu alat transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler, 1991).
dan konsentrasi dalm darah yaitu alat transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler, 1991).
dan konsentrasi dalm darah yaitu alat transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler, 1991).
dan konsentrasi dalm darah yaitu alat transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler, 1991).

1991).

C. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah labu takar 100 mL, pipet volume, tabung reaksi, pipet ukur 0.5mL, 1mL, 5mL, spektrofotometer, skalpel, sentrifuge, stopwatch, kalkulator, dan kertas grafik numerik. Bahan yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah Asam trikloroasetat (TCA) 20%, Natrium Nitrit 10%, Amonium sulfamat 15%, Parasetamol, Natrium Hidroksida 10%, HCl 6N, antikoagulan, dan darah.

D. Cara Kerja

Pembuatan Larutan Stok

Ditimbang

secukupnya.

100

mg

parasetamol

Larutan Stok Ditimbang secukupnya. 100 mg parasetamol dan dilarutkan dengan aquadest panas Dipindahkan ke dalam

dan

dilarutkan

dengan

aquadest

panas

Dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL kemudian di-add aquades sampai tanda.

Penetapan OT Dipipet 4 mL dari larutan stok, kemudian di-add hingga 10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL.

10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL. Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L
10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL. Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L
10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL. Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L
10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL. Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L

Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L larutan intermediet, sehingga diperoleh larutan parasetamol dengan konsentrasi 200 g/mL.

diperoleh larutan parasetamol dengan konsentrasi 200 g/mL. Dicampur homogen lalu ditambah 2 mL TCA 20%, dihomogenkan

Dicampur homogen lalu ditambah 2 mL TCA 20%, dihomogenkan dengan vortex,

lalu di-sentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 2500 rpm.

di- sentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Diambil sebanyak 1,5 mL, dimasukkan dalam labu

Diambil sebanyak 1,5 mL, dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan 0,5

mL HCl 6 N

dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N Ditambahkan (perlahan) 1 mL

Ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO 2 10 % dan dihomogenkan dengan vortex.

1 mL NaNO 2 10 % dan dihomogenkan dengan vortex . Didiamkan selama 5, 10, 15,

Didiamkan selama 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 45 menit, untuk pengukuran OT.

5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 45 menit, untuk pengukuran OT. Ditambahkan 1 mL Amonium

Ditambahkan 1 mL Amonium Sulfat 15 %.

untuk pengukuran OT. Ditambahkan 1 mL Amonium Sulfat 15 %. Ditambahkan 3,5 mL NaOH 10% di-

Ditambahkan 3,5 mL NaOH 10% di-add aquadest hingga 10 m dan didegasing 10 menit.

10% di- add aquadest hingga 10 m dan didegasing 10 menit. Baca absorbansi pada panjang gelombang

Baca absorbansi pada panjang gelombang teoritis (430 nm), untuk pengukuran OT

Penetapan λ max

Dipipet 4 mL dari larutan stok, kemudian di-add hingga 10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL.

10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL. Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L
10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL. Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L
10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL. Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L
10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL. Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L

Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L larutan intermediet, sehingga diperoleh larutan parasetamol dengan konsentrasi 200 g/mL.

diperoleh larutan parasetamol dengan konsentrasi 200 g/mL. Dicampur homogen lalu ditambah 2 mL TCA 20%, dihomogenkan

Dicampur homogen lalu ditambah 2 mL TCA 20%, dihomogenkan dengan vortex,

lalu di-sentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 2500 rpm.

di- sentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Diambil sebanyak 1,5 mL, dimasukkan dalam labu

Diambil sebanyak 1,5 mL, dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan 0,5

mL HCl 6 N

dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N Ditambahkan (perlahan) 1 mL

Ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO 2 10 % dan dihomogenkan dengan vortex.

1 mL NaNO 2 10 % dan dihomogenkan dengan vortex . Didiamkan selama OT. Ditambahkan 1

Didiamkan selama OT.

10 % dan dihomogenkan dengan vortex . Didiamkan selama OT. Ditambahkan 1 mL Amonium Sulfat 15

Ditambahkan 1 mL Amonium Sulfat 15 %.

. Didiamkan selama OT. Ditambahkan 1 mL Amonium Sulfat 15 %. Ditambahkan 3,5 mL NaOH 10%

Ditambahkan 3,5 mL NaOH 10% di-add aquadest hingga 10 m dan didegasing 10 menit.

10% di- add aquadest hingga 10 m dan didegasing 10 menit. Discan λ m a x
10% di- add aquadest hingga 10 m dan didegasing 10 menit. Discan λ m a x

Discan λ max pada range 400-480 nm, untuk pembacaan Pembuatan Kurva Baku Dari larutan stok yang ada, dipipet sebanyak 3; 3,5; 4; 5; 7 mL dan kemudian di- add 10 mL.

max.

3; 3,5; 4; 5; 7 mL dan kemudian di- add 10 mL. m a x .

Diperoleh seri kadar larutan intermediet 300, 350, 400, 500, 700

seri kadar larutan intermediet 300, 350, 400, 500, 700 g/mL. Masing-masing intermediet diambil sebanyak 250 plasma.

g/mL.

seri kadar larutan intermediet 300, 350, 400, 500, 700 g/mL. Masing-masing intermediet diambil sebanyak 250 plasma.

Masing-masing intermediet diambil sebanyak 250 plasma.

g/mL. Masing-masing intermediet diambil sebanyak 250 plasma. L, kemudian ditambah 250 L Kemudian didapatkan seri larutan

L, kemudian ditambah 250

diambil sebanyak 250 plasma. L, kemudian ditambah 250 L Kemudian didapatkan seri larutan baku dengan konsentrasi
L
L

Kemudian didapatkan seri larutan baku dengan konsentrasi 150, 175, 200, 250, 350 g/mL

plasma. L, kemudian ditambah 250 L Kemudian didapatkan seri larutan baku dengan konsentrasi 150, 175, 200,
Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2 mL TCA, di- vortex , lalu di- sentrifuge dengan

Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2 mL TCA, di-vortex, lalu di- sentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit.

di- sentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Diambil 1,5 mL, kemudian di- add aquades

Diambil 1,5 mL, kemudian di-add aquades 10 mL.

5 menit. Diambil 1,5 mL, kemudian di- add aquades 10 mL. Ditambahkan 0,5 mL HCl 6

Ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO 2 10 %, dihomogenkan dengan vortex, lalu didiamkan OT.

2 10 %, dihomogenkan dengan vortex , lalu didiamkan OT. Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15

Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15 %, ,.

lalu didiamkan OT. Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15 %, ,. Ditambah 3,5 mL NaOH 10

Ditambah 3,5 mL NaOH 10 % add aquadest hingga tanda, di-degassing 10 menit

10 % add aquadest hingga tanda, di- degassing 10 menit Dibaca absorbansi pada m a x

Dibaca absorbansi pada

m a x . max .

Pembuatan Blanko Diambil sebanyak 250 µL aquades dan 250 µL plasma.

Blanko Diambil sebanyak 250 µL aquades dan 250 µL plasma. Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2

Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2 mL TCA, di-vortex, lalu di- sentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit.

di- sentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Diambil 1,5 mL, kemudian di- add aquades

Diambil 1,5 mL, kemudian di-add aquades 10 mL.

5 menit. Diambil 1,5 mL, kemudian di- add aquades 10 mL. Ditambahkan 0,5 mL HCl 6

Ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO 2 10 %, dihomogenkan dengan vortex, lalu didiamkan OT.

2 10 %, dihomogenkan dengan vortex , lalu didiamkan OT. Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15

Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15 %, ,.

lalu didiamkan OT. Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15 %, ,. Ditambah 3,5 mL NaOH 10

Ditambah 3,5 mL NaOH 10 % add aquadest hingga tanda, di-degassing 10 menit

10 % add aquadest hingga tanda, di- degassing 10 menit Dibaca absorbansi pada m a x

Dibaca absorbansi pada

m a x . max .

Pembuatan dan Penetapan Kadar Sampel

Stok sampel dibuat dengan cara: ditimbang 50 mg parasetamol dan dilarutkan dengan aquadest panas secukupnya.

parasetamol dan dilarutkan dengan aquadest panas secukupnya. Dipindahkan ke dalam labu ukur 50 mL kemudian di-

Dipindahkan ke dalam labu ukur 50 mL kemudian di-add aquades sampai tanda.

labu ukur 50 mL kemudian di- add aquades sampai tanda. Untuk mendapatkan larutan intermediet untuk sampel,

Untuk mendapatkan larutan intermediet untuk sampel, dipipet sebanyak 3, 4, dan 7 mL dari larutan stok, kemudian di-add hingga 10 mL.

dan 7 mL dari larutan stok, kemudian di- add hingga 10 mL. Masing-masing larutan intermediate diambil
dan 7 mL dari larutan stok, kemudian di- add hingga 10 mL. Masing-masing larutan intermediate diambil

Masing-masing larutan intermediate diambil 250 L kemudin ditambahkan dengan 250 L plasma sehingga didapatkan kadar larutan intermediet sebesar 150, 200, 350 g/mL.

kadar larutan intermediet sebesar 150, 200, 350 g/mL. Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2 mL TCA,
kadar larutan intermediet sebesar 150, 200, 350 g/mL. Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2 mL TCA,

Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2 mL TCA, di-vortex, lalu di- sentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit.

di- sentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Diambil 1,5 mL, kemudian di- add aquades

Diambil 1,5

dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Diambil 1,5 mL, kemudian di- add aquades 10 mL.

mL, kemudian di-

2500 rpm selama 5 menit. Diambil 1,5 mL, kemudian di- add aquades 10 mL. Ditambahkan 0,5

add aquades 10 mL.

Ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO 2 10 %, dihomogenkan dengan vortex, lalu didiamkan OT.

2 10 %, dihomogenkan dengan vortex , lalu didiamkan OT. Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15

Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15 %, ,.

lalu didiamkan OT. Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15 %, ,. Ditambah 3,5 mL NaOH 10

Ditambah 3,5 mL NaOH 10 % add aquadest hingga tanda, di-degassing 10 menit

10 % add aquadest hingga tanda, di- degassing 10 menit Dibaca absorbansi pada Dihitung : Perolehan

Dibaca absorbansi pada Dihitung :

Perolehan Kembali (recovery) =

Kesalahan Sistematik = 100 P%

Kesalahan Acak =

( recovery ) = Kesalahan Sistematik = 100 – P% Kesalahan Acak = m a x

max .

E. Data dan Analisis Data

x 100% = P %

1.

Penetapan Operating Time (OT) dan Penentuan λ max Parasetamol Penimbangan Parasetamol untuk Penentuan OT dan Penentuan λ max

Berat Kertas

0,3908 g

Berat Kertas + Zat

0,4969 g

Berat Kertas + Sisa

0,3967 g

Berat

0,1002 g = 100,2 mg

Konsentrasi Stok :

Penetapan Operating Time (OT)

Waktu (menit)

Absorbansi

5

0,103

10

0,104

15

0,110

20

0,086

25

0,104

30

0,119

35

0,122

45

0,172

Berdasarkan data di atas, tidak diperoleh absorbansi yang stabil sehingga operating time yang digunakan adalah operating time teoritis parasetamol, yaitu 15 menit.

A

= 0,0811

B

= 1,4677 x 10 -3

r

= 0,7669

y

= 1,46877 x 10 -3 x + 0,081

Kurva Baku Waktu vs Absorbansi

0.2 0.18 y = 0.0015x + 0.0811 0.16 R² = 0.5882 0.14 0.12 0.1 0.08
0.2
0.18
y = 0.0015x + 0.0811
0.16
= 0.5882
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0
10
20
30
40
50
Absorbansi

Waktu (menit)

0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 10 20 30 40 50 Absorbansi Waktu

Series1

Linear (Series1)

Penetapan λ max Parasetamol Scanning menggunakan panjang gelombang 425-450 nm. Dari hasil scanning diperoleh panjang gelombang maksimum 432,5 nm dengan absorbansi 0,117.

2. Pembuatan Seri Larutan Baku Parasetamol Penimbangan Larutan Stok Parasetamol

Berat Kertas

0,3908 g

Berat Kertas + Zat

0,4969 g

Berat Kertas + Sisa

0,3967 g

Berat

0,1002 g = 100,2 mg

Konsentrasi Stok :

Seri Larutan Intermediet Parasetamol (µg/mL)

C1.V1 = C2.V2

C1.V1 = C2.V2

1002

μg/mL . 3 mL = C2 . 10 mL

1002

μg/mL . 5 mL = C2 . 10 mL

C2 = 300,6 μg/mL

C2

= 501 μg/mL

C1.V1 = C2.V2

C1.V1 = C2.V2

1002 μg/mL . 3,5 mL = C2 . 10 mL

1002 μg/mL . 7 mL = C2 . 10 mL

C2 = 350,7 μg/mL C1.V1 = C2.V2 1002 μgmL . 4 mL = C2 . 10 mL C2 = 400,8 μg/mL

C2 = 701,4 μg/mL

Seri Larutan Baku Internal Parasetamol(µg/mL)

C 1. V 1 = C 2 .V 2 300,6 μg/mL . 250 μL = C 2 . 500 μL C 2 = 150,3 μg/mL C 1. V 1 = C 2 .V 2 350,7 μg/mL . 250 μL = C 2 . 500 μL C 2 = 175,35 μg/mL C 1. V 1 = C 2 .V 2 400,8 μg/mL . 250 μL = C2 . 500 μL C 2 = 200,4 μg/mL

C 1. V 1 = C 2 .V 2 501 μg/mL . 250 μL = C 2 . 500 μL C 2 = 250,5 μg/mL C 1. V 1 = C 2 .V 2 701,4 μg/mL . 250 μL = C 2 . 500 μL C 2 = 350,7 μg/mL

3. Pengukuran Absorbansi Seri Larutan Baku Parasetamol Kelompok A 1 :

Kadar Terhitung (µg/mL)

Absorbansi

150,3

0,269

175,35

0,109

200,4

0,127

250,5

0,194

350,7

0,245

Blangko

0

A = 0,1287

r = 0,2999 y = 2,664 x 10 -4 x + 0,1287

Kurva Baku Konsentrasi (µg/mL) vs Absorbansi A1

0.3 y = 0.0003x + 0.1287 0.25 R² = 0.09 0.2 0.15 0.1 0.05 0
0.3
y = 0.0003x
+ 0.1287
0.25
R² = 0.09
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
100
200
300
400
Absorbansi

Kadar (µg/mL)

0.25 R² = 0.09 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 100 200 300 400 Absorbansi Kadar

Series1

Linear (Series1)

Kelompok A 2 :

Kadar Terhitung (µg/mL)

Absorbansi

150,3

0,115

175,35

0,128

200,4

0,133

250,5

0,162

350,7

0,199

Blangko

0

A = 0,0522

B = 4,2216 x 10 -4

r = 0,9960 y = 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522 (kurva baku yang digunakan)

Kurva Baku Konsentrasi (µg/mL) vs Absorbansi A2

0.25 y = 0.0004x + 0.0522 0.2 R² = 0.992 0.15 0.1 0.05 0 0
0.25
y = 0.0004x
+ 0.0522
0.2
R² = 0.992
0.15
0.1
0.05
0
0
100
200
300
400
Absorbansi

Kadar (µg/mL)

+ 0.0522 0.2 R² = 0.992 0.15 0.1 0.05 0 0 100 200 300 400 Absorbansi

Series1

Linear (Series1)

Kelompok A 3

Kadar Terhitung (µg/mL)

Absorbansi

150,3

0,134

175,35

0,141

200,4

0,154

250,5

0,180

350,7

0,266

Blangko

0

A = 0,0238

B = 6,7066 x 10-4

r = 0,9872 y = 6,7066 x 10 -4 x + 0,0238

Kurva Baku Konsentrasi (µg/mL) vs Absorbansi A3

0.3 y = 0.0007x + 0.0238 0.25 R² = 0.9746 0.2 0.15 0.1 0.05 0
0.3
y =
0.0007x + 0.0238
0.25
R² =
0.9746
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
100
200
300
400
Absorbansi

Kadar (µg/mL)

0.25 R² = 0.9746 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 100 200 300 400 Absorbansi Kadar

Series1

Linear (Series1)

4. Pengukuran Kadar Parasetamol dalam Sampel

Kelompok A 1

Penimbangan Parasetamol (µg/mL)

Berat kertas

0,3994 g

Berat kertas + zat

0,4496 g

Berat kertas + sisa

0,3998 g

Berat zat

0,0498 g = 49,8 mg

Konsentrasi larutan stok sampel:

C induk =

Konsentrasi larutan intermediet:

V 1 x C 1

= V 2 x C 2

3 mL x 996 μg/mL

= 10 mL x C 2

C 2

= 298,8 μg/mL

Konsentrasi larutan 250 µL sampel + plasma 250 µL:

V 1 x C 1

250 µL x 298,8 μg/mL = 500 µL x C 2

= V 2 x C 2

C 2

= 149,4 μg/mL (kadar teoritis)

 

Sampel

Absorbansi

Kadar

Teoritis

Kadar Sebenarnya

Recovery

CV(%)

   

(µg/mL)

(µg/mL)

(%)

 

Replikasi I

0,090

 

89,5395

59,9327%

x

       
       

Replikasi II

0,084

149,4

75,3269

50,4196%

100% =

Replikasi III

0,087

82,4332

55,1762%

8,6207%

82,4332 55,1762%  

82,4332

55,1762%

 

SD =

% CV =

=
=

x 100% = 8,6207 %

% Recovery Sampel 1 =

  SD = % CV = = x 100% = 8,6207 % % Recovery Sampel 1

x 100%= 59,9327%

% Recovery Sampel 2 =

% Recovery Sampel 3 =

x 100%= 50,4196%x 100%= 59,9327% % Recovery Sampel 2 = % Recovery Sampel 3 = x 100%= 55,1762%

% Recovery Sampel 2 = % Recovery Sampel 3 = x 100%= 50,4196% x 100%= 55,1762%

x 100%= 55,1762%

7.1063

Kesalahan sistematis sampel 1= 100% - 59,9327% = 40,0673%

Kesalahan sistematis sampel 2 = 100% - 50,4196% = 49,5804%

Kesalahan sistematis sampel 3= 100% - 55,1762% = 44,8238%

Kelompok A 2

Penimbangan Parasetamol (µg/mL)

Berat kertas

0,3998 g

Berat kertas + zat

0,4555 g

Berat kertas + sisa

0,4013 g

Berat zat

0,0541 g = 54,1 mg

Konsentrasi larutan stok sampel:

C induk =

Konsentrasi larutan intermediet:

V 1 x C 1

= V 2 x C 2

4 mL x 1082 μg/mL

= 10 mL x C 2

C 2

= 432,8 μg/mL

Konsentrasi larutan 250 µL sampel + plasma 250 µL:

V 1 x C 1

= V 2 x C 2

C 2

= 216,4 μg/mL (kadar teoritis)

 
     

Kadar

   

Sampel

Absorbansi

Kadar Teoritis

(µg/mL)

Sebenarnya

(µg/mL)

Recovery

(%)

CV(%)

Replikasi I

0,124

 

170,0777

78,5941

 

Replikasi II

0,150

216,4

231,6657

107,0544

 

x

µg/mL

100%

Replikasi III

0,154

241,1408

111,4329

= 18,0056%

214,2947 99,0271  

214,2947

99,0271

 

SD =

38.5850

% CV =

x 100% = 18,0056%

% Recovery Sampel 1 =

x 100%= 78,5941%

% Recovery Sampel 2 =

x 100%= 107,0544%

% Recovery Sampel 3 =

x 100%= 111,4329%

Kesalahan sistematis sampel 1= 100% - 78,5941% = 21,4059%

Kesalahan sistematis sampel 2 = 100% - 107,0544% = -7,0544%

Kesalahan sistematis sampel 3= 100% - 111,4329% = -11,4329%

Kelompok A 3

Penimbangan Parasetamol (µg/mL)

Berat kertas

0,4038 g

Berat kertas + zat

0,4535 g

Berat kertas + sisa

0,4033 g

Berat zat

0,0502 g = 50,2 mg

Konsentrasi larutan stok sampel:

C induk =

Konsentrasi larutan intermediet:

 

V 1 x

C 1

= V 2 x C 2

7 mL x 1004 μg/mL

= 10 mL x C 2

C 2

= 702,8 μg/mL

Konsentrasi larutan sampel + plasma 250 µL:

 

V 1 x

C 1

= V 2 x C 2

250 µL x 702,8 μg/mL

= 500 µL x C 2

C 2

= 351,4 μg/mL (kadar teoritis)

Sampel

Absorbansi

Kadar

Teoritis

Kadar Sebenarnya (µg/mL)

Recovery

CV(%)

(µg/mL)

(%)

Replikasi I

0,266

 

506,443

114,121

x

Replikasi II

0,257

351,4

485,124

138,055

µg/mL

100%

Replikasi III

0,274

525,393

149,514

= 2,8887%

505,653 133,897  

505,653

133,897

 

SD =

14.607

% CV =

x 100% = 2,8887%

% Recovery Sampel 1 =

x 100% = 114,121%

% Recovery Sampel 2 =

x 100% = 138,055%

% Recovery Sampel 3 =

x 100% = 149,514%

Kesalahan sistematis sampel 1= 100% - 114,121% = -14,121%

Kesalahan sistematis sampel 2 = 100% - 138,055% = -38,055%

Kesalahan sistematis sampel 3= 100% - 149,514% = -49,514%

Perhitungan Kadar Sebenarnya Parasetamol dalam Sampel

   

149,4 μg/mL

 

216,4 μg/mL

 

351,4 μg/mL

 

Replikasi

Kadar

Sebenarnya :

 

Kadar

Sebenarnya :

 

Kadar

Sebenarnya :

 

1

y

=4,2216 x 10 -4 x + 0,0522

y

= 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522

y

= 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522

 

0,090

= 4,2216

x

10 -4 x +

0,124

= 4,2216

x

10 -4 x +

0,266

=4,2216

x

10 -4 x

+

 

0,0522

 

0,0522

 

0,0522

 

x

= 89,5395 μg/mL

x

= 170,0777 µg/mL

x

= 506,443 μg/mL

 

Replikasi

Kadar

Sebenarnya :

 

Kadar

Sebenarnya :

 

Kadar

Sebenarnya :

 

2

y

= 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522

y

= 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522

y

= 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522

 

0,084

= 4,2216

x

10 -4 x +

0,150

= 4,2216

x

10 -4 x +

0,257

=

4,2216

x

10 -4 x +

 

0,0522

 

0,0522

 

0,0522

 

x

= 75,3269 μg/mL

x

= 231,6657 µg/mL

x

= 485,124 μg/mL

 

Replikasi

Kadar

Sebenarnya :

 

Kadar

Sebenarnya :

 

Kadar

Sebenarnya :

 

3

y

= 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522

y

= 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522

y

= 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522

 

0,087

= 4,2216

x

10 -4 x +

0,154

= 4,2216

x

10 -4 x +

0,274

=

4,2216

x

10 -4 x +

 

0,0522

 

0,0522

 

0,0522

 

x

= 82,4332 μg/mL

x

= 241,1408 µg/mL

x

= 525,393 μg/mL

 

F. Pembahasan Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk menentukan kadar parasetamol dalam plasma dengan metode Chafetz (secara kolorimetri). Prinsip dari kolorimetri adalah pengukuran absorbansi dari zat yang semula tak berwarna diubah menjadi berwarna (direaksikan dengan zat tertentu) yang kemudian diukur serapannya pada daerah tampak/visible (diantara λ 400-800 nm). Pengukuran ini sendiri didasarkan pada hukum Lambert-Beer. Hukum Lambert menyatakan bahwa intensitas sinar keluar akan menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan tebal dari zat penyerap. Hukum Beer menyatakan bahwa intensitas sinar keluar menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan konsentrasi zat penyerap. Secara matematis, Hukum Lambert-Beer dapat dituliskan menjadi :

dimana:

A = ε b c

A = absorbansi ε = daya serap molar

b = tebal zat penyerap

c = konsentrasi zat penyerap Penggunaan spektrofotometri visibel (untuk pengukuran absorbansi kolorimetri) merupakan jenis spektrofotometri serap yang mengukur serapan radiasi elektromagnetik pada λ tertentu yang sempit (mendekati monokromatik) yang diserap oleh zat. Prinsip dasar dari spektrofotometri visible adalah senyawa uji yang dikenai radiasi elektromagnetik (REM) berupa cahaya tampak (λ diantara 400-800 nm), bila energi REM sesuai dengan energi yang dibutuhkan untuk transisi ke excited state dari ground state, maka elektron akan tereksitasi. Di tingkat eksitasi, elektron akan berada pada keadaan yang tak stabil dan cenderung akan kembali ke ground state sambil melepaskan energi emisi. Cahaya yang dipancarkan ke senyawa, ada yang diabsorbsi dan ada juga yang diteruskan, oleh detektor dengan sistem read out, akan diperoleh angka absorbansi zat uji tersebut. Perbedaan kolorimetri dengan spektrofotometri lainnya adalah:

Perbedaan

Kolorimetri

Spektrofotometri

Spektrofotometri

   

Visibel

UV

Ada atau tidaknya dari senyawa yang diuji

warna

Senyawa

yang

Senyawa yang diukur dari asalnya sudah memiliki warna.

Senyawa

yang

diukur

merupakan

diukur merupakan tak

senyawa

yang

senyawa

yang

memiliki warna.

 

tak

berwarna,

 

yang

kemudian

dibuat

berwarna,

baru diukur.

λ yang digunakan

400-800 nm

400-800 nm

200-400 nm

Kuvet

yang

Kuvet yang digunakan terbuat dari gelas

Kuvet

yang

Kuvet

yang

digunakan

digunakan

terbuat

digunakan

terbuat

dari gelas

dari kuarsa

Ada/tidaknya OT

Adanya

OT

Tidak

dibutuhkan

Tidak

dibutuhkan

(Operating Time) untuk

OT

OT

mengetahui

absorbansi

yang

dihasilkan

sudah

stabil/tidak.

Kriteria analisis kolorimetri yang baik adalah:

1. Kesebandingan antara warna dan konsentrasi: intensitas warna hendaknya meningkat secara linear dengan naiknya konsentrasi zat yang akan ditetapkan.

2. Kestabilan warna: warna yang dihasilkan hendaknya cukup stabil untuk memberikan hasil pengukuran yang tepat.

3. Reprodusibilitas: hasil yang didapat harus dapat diulang jika dilakukan pada kondisi yang sama.

4. Kejernihan larutan: larutan harus bebas dari endapan agar tidak terjadi penghamburan cahaya maupun menyerap cahaya, yang akan mengganggu hasil pengukuran.

5. Kepekaan tinggi: diharapkan reaksi warna sangat peka walaupun pada zat dengan konsentrasi/ kuantitas yang kecil, namun menyerap kuat pada daerah tampak, bukan pada daerah UV. Asetaminofen/parasetamol dapat diukur kadarnya dengan berbagai metode, antara lain spektrofotometri UV, kromatografi gas dan HPLC. Meskipun sudah terdapat metode kromatografi untuk penetapan kadarnya, metode spektrofotometri masih sering digunakan di dalam laboratorium. Hal ini dikarenakan metode ini relatif mudah, ekonomis, dan cepat dalam pengerjaannya (dibandingkan dengan metode kromatografi). Metode kolorimetri untuk parasetamol atau yang dikenal dengan metode Chafetz merupakan salah satu metode penetapan kadar parasetamol secara spektrofotometrik. Metode ini didasarkan pada reaksi nitrasi pada cincin benzen dari parasetamol. Reaksi nitrasi merupakan reaksi pembentukan warna pada parasetamol yang merupakan reaksi substitusi aromatik elektrofilik (SAE). Dalam reaksi nitrasi, yang digunakan sebagai agen penitrasi merupakan HNO2/asam nitrit. HNO2 merupakan gas pada suhu kamar. Oleh karenanya, untuk mendapatkan HNO2 dengan mudah, garam NaNO2 direaksikan dengan HCl yang kemudian didiamkan beberapa saat agar reaksi berjalan dengan sempurna. Reaksi yang terjadi:

agar reaksi berjalan dengan sempurna. Reaksi yang terjadi: Gambar 1. Mekanisme pembentukan ion nitrosonium Elektofil
agar reaksi berjalan dengan sempurna. Reaksi yang terjadi: Gambar 1. Mekanisme pembentukan ion nitrosonium Elektofil

Gambar 1. Mekanisme pembentukan ion nitrosonium

Elektofil yang terbentuk kemudian akan menyerang cincin benzen dari parasetamol yang bersifat nukleofil. Gugusan nitro kemudian dapat masuk pada posisi orto marupun para pada cincin benzen. Hal ini dikarenakan pada parasetamol terdapat dua gugusan bersifat aktivator (gugus OH dan NH 2 ) yang mengarahkan substituen ke arah para ataupun orto untuk substitusi berikutnya. Namun karena pada posisi para telah terisi oleh gugus amida (NH-CO), maka gugus nitro kemudian akan masuk pada posisi orto dari cincin benzen.

Gambar 2. Mekanisme reaksi nitrasi pada parasetamol. (A) struktur dari asetaminofen (p-asetamidofenol); (B)

Gambar 2. Mekanisme reaksi nitrasi pada parasetamol. (A) struktur dari asetaminofen (p-asetamidofenol); (B) 2-nitro-4-asetamidofenol, terbentuk dari hasil nitrasi dengan asam nitrit; dan (C) anion 2-nitro-4- asetamidofenol yang merupakan gugusan kromofor yang memberikan warna kuning dengan serapan maksimum pada λ 430 nm (Balley, 1982).

Pada gambar, terlihat bahwa gugus kromofor dari parasetamol mengalami perpanjangan. Pemanjangan gugus kromofor ini akan memperpanjang panjang gelombang yang dapat diserap oleh parasetamol. Pemanjangan ini dinamakan dengan pergesaran batokromik. Pada reaksi, penambahan asam sulfamat bertujuan untuk menghilangkan sisa HNO 2 yang mungkin terbentuk pada reaksi :

Pada reaksi, penambahan asam sulfamat bertujuan untuk menghilangkan sisa HNO 2 yang mungkin terbentuk pada reaksi
Pada reaksi, penambahan asam sulfamat bertujuan untuk menghilangkan sisa HNO 2 yang mungkin terbentuk pada reaksi

Oleh karena pada reaksi terbentuk gas N 2 , maka sebelum dilakukan pengukuran, perlu dilakukan degassing untuk menghilangkan gas yang terbentuk dengan memberikan getaran ultrasonik pada larutan. Hal ini dilakukan agar N 2 yang terbentuk tidak mengganggu saat pengukuran absorbansi dari larutan yang diuji.

Pada percobaan digunakan plasma yang berasal dari darah tikus. Darah tikus tersebut diambil dari daerah sinus orbitalis (mata) dan harus ditambahkan antikoagulan untuk mencegah penggumpalan darah, antikoagulan yang digunakan adalah heparin. Setelah penambahan heparin, darah disentrifuge untuk memisahkan plasma (cairan yang berwarna jernih/supernatan) dari sel-sel darah. Plasma lebih dipilih untuk digunakan daripada serum karena dalam plasma terdapat protein (yang mengikat obat) yang tidak ikut mengendap sehingga obat masih ada di dalam plasma yang nantinya akan diukur kadarnya. Tujuan sentrifugasi yaitu untuk mempercepat pengendapan protein sehingga plasma lebih mudah diperoleh, prinsip sentrifugasi ini yaitu pemisahan zat berdasarkan bobot molekulnya. Plasma yang didapat ditambahkan TCA 20% untuk merusak struktur sekunder dan tersier protein yaitu dengan merusak sulfida yang merupakan pembentuk kedua struktur tersebut, akibatnya protein akan mengendap sementara obat tetap berada di dalam plasma. Jika tidak diendapkan maka protein plasma yang dapat berikatan dengan parasetamol akan membentuk molekul yang lebih besar, sehingga dapat mengganggu analisis. Reaksi TCA dengan protein plasma adalah sebagai berikut :

Reaksi TCA dengan protein plasma adalah sebagai berikut : TCA merupakan asam kuat yang memiliki keelektronegatifan
Reaksi TCA dengan protein plasma adalah sebagai berikut : TCA merupakan asam kuat yang memiliki keelektronegatifan

TCA merupakan asam kuat yang memiliki keelektronegatifan yang besar sehingga mampu menarik protein membentuk suatu ikatan. Ikatan ini bersifat reversible karena ikatan yang terjadi antara obat dengan protein plasma adalah ikatan lemah (Van der Walls). Selain itu, karena ikatan obat dengan protein bersifat non-spesifik artinya satu tempat bisa ditempati oleh banyak senyawa

dengan cara mendesak senyawa lain. Oleh karena itu setelah penambahan TCA, larutan kemudian divortex untuk menghomogenkan campuran ini. Supernatan yang diperoleh kemudian diukur kadar parasetamolnya dengan menggunakan metode Chafetz (metode kolorimetri). Plasma darah ini direaksikan dengan HCl 6N, HCl 6N berfungsi menghidrolisis parasetamol dan memberikan suasana asam. Hasil hidrolisis parasetamol akan bereaksi dengan Na nitrit (NaNO 2 ) 10% dan membentuk garam diazonium, larutan campuran parasetamol HCl 6N dan Na nitrit (NaNO 2 ) 10% didiamkan selama 15 menit agar pembentukan garam diazonium berlangsung sempurna. Kemudian setelah pendiaman selama Operating Time (15 menit) ditambahkan Asam sulfamat 15 % untuk menghentikan reaksi antara NaNO 2 (Natrium nitrit) dengan parasetamol dalam pembentukan garam diazonium yaitu dengan cara menghilangkan NaNO 2 yang berlebihan. Lalu dilakukan penambahan NaOH tujuannya untuk memperpanjang gugus kromofor sehingga warna yang terbentuk akan semakin jelas.

Penetapan Operating Time Dan Panjang Gelombang Maksimum Pada saat akan dilakukan penetapan kadar, sebelumnya harus dilakukan penetapan OT dan λ max . Tujuan dari penetapan OT adalah untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan untuk memperoleh serapan yang stabil/ konstan dan maksimal. Hal ini menunjukkan reaksi pembentukan senyawa berwarna yang terbentuk sudah stabil/ sempurna, sehingga dihasilkan pembacaan absorbansi yang maksimal juga. Setelah didapatkan OT dari reaksi, dilakukan penetapan λ max . Panjang gelombang maksimum (λ max ) merupakan panjang gelombang dimana serapan yang terjadi adalah maksimum. Pengukuran absorbansi dilakukan pada λ max karena dengan perubahan konsentrasi yang kecil, dapat memberikan absorbansi yang berbeda dengan signifikan (lebih sensitif). Hal ini menyebabkan pengukuran menjadi lebih peka dan teliti. Pada percobaan yang telah dilakukan, pada saat penetapan OT, tidak diperoleh serapan yang konstan. Serapan yang dihasilkan memberikan nilai yang fluktuatif. Hal ini membuat praktikan menggunakan OT sebesar 15 menit, sesuai

dengan OT teoritis yang terdapat pada metode Chafetz. Untuk pengukuran λ max sendiri diperoleh nilai sebesar 432,5 nm (λ teoritis sebesar 430 nm).

Kurva Baku Parasetamol Kurva baku parasetamol dibuat dengan membuat seri larutan baku dari larutan stok parasetamol. Digunakan 5 seri konsentrasi parasetamol yaitu 150, 175, 200, 250, 350 g/mL. Pengukuran larutan tersebut dilakukan pada panjang gelombang maksimum parasetamol yaitu 432,5 nm. Dari hasil pengukuran, absorbansi yang diperoleh secara berturut-turut yaitu 0,269; 0,109; 0,127; 0,194; 0,245. Dari hasil absorbansi masing-masing seri larutan, didapatkan persamaan regresi linier y = 2,664 x 10 -4 x + 0,1287 dengan nilai r = 0,2999. Persamaan kurva baku tersebut tidak digunakan untuk menghitung kadar parasetamol dalam sampel, tetapi digunakan regresi linear milik kelompok A 2 , yaitu y = 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522 dengan nilai r = 0,9960. Pada penetapan kadar sampel, secara teoritis diperoleh kadar rata-rata sampel I = 149,4 μg/mL; sampel II = 216,4 µg/mL; dan sampel III = 351,4 µg/mL. Sedangkan dari hasil pengukuran diperoleh kadar rata-rata Sampel konsentrasi I = 82,4332 μg/mL; Sampel konsentrasi II = 214,2947 μg/mL dan Sampel konsentrasi III = 505,653 μg/mL.

214,2947 μg/mL dan Sampel konsentrasi III = 505,653 μg/mL. Menentukan Perolehan Kembali, Kesalahan Acak Dan Kesalahan

Menentukan Perolehan Kembali, Kesalahan Acak Dan Kesalahan Sistematik Berdasarkan hasil percobaan diperoleh rata-rata % recovery larutan parasetamol dalam plasma dengan konsentrasi 149,4 g/mL = 55,1762%;

dalam plasma dengan konsentrasi 149,4 g/mL = 55,1762%; 216,4 g/mL = 99,0271%; dan 351,4 g/mL =
dalam plasma dengan konsentrasi 149,4 g/mL = 55,1762%; 216,4 g/mL = 99,0271%; dan 351,4 g/mL =
dalam plasma dengan konsentrasi 149,4 g/mL = 55,1762%; 216,4 g/mL = 99,0271%; dan 351,4 g/mL =

216,4 g/mL = 99,0271%; dan 351,4 g/mL = 133,897%. Menurut Munja dan Hanwar (2003), akurasi yang baik untuk kadar kecil adalah 90%-100%, untuk kadar obat yang lebih besar yaitu 95%-105%, akurasi untuk bahan baku biasanya 98%-102%, sedangkan rentang akurasi untuk bioanalisis yang masih dapat diterima yaitu 80%-120%, nilai % recovery tidak ada yang memenuhi persyaratan, kecuali pada konsentrasi 200 g/mL. Hal ini terjadi kemungkinan karena banyak sampel yang hilang selama preparasi (pada konsentrasi 149,4 g/mL) dan karena masih terdapat kandungan zat lain sehingga % recovery

149,4 g/mL) dan karena masih terdapat kandungan zat lain sehingga % recovery terlalu besar (pada konsentrasi
149,4 g/mL) dan karena masih terdapat kandungan zat lain sehingga % recovery terlalu besar (pada konsentrasi
149,4 g/mL) dan karena masih terdapat kandungan zat lain sehingga % recovery terlalu besar (pada konsentrasi

terlalu besar (pada konsentrasi 351,4 g/mL)

Untuk kesalahan sistematik dari larutan parasetamol dalam plasma

diperoleh pada replikasi I = 40,0673%; replikasi II = 49,5804%; replikasi III = 44,8238%. Semua kesalahan sistematik tersebut tidak memenuhi syarat karena menurut Munja dan Hanwar (2003), kesalahan sistematik yang baik yaitu kurang dari 10%. Kesalahan sistematis merupakan selisih antara 100% kadar dengan % recovery. Untuk persen kesalahan acak masing-masing sampel yaitu Sampel konsentrasi I = 8,6207 %, Sampel konsentrasi II = 18,0056 % dan Sampel konsentrasi III = 2,8887 %. Menurut Munja dan Hanwar (2003), harga CV (kesalahan acak) yang baik adalah kurang dari 2%, sedangkan untuk bioanalisis

CV dengan rentang 15-20% masih dapat diterima. Dari hasil perhitungan, %CV

yang didapat dari semua sampel memenuhi persyaratan. Untuk linearitas, dari percobaan diperoleh persamaan kurva baku kelompok A1: y = 2,664 x 10 -4 x + 0,1287; A2: y = 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522; A3:

y = 6,7066 x 10 -4 x + 0,0238 dengan nilai koefisien korelasi (r) berturut-turut (dari

A1 hingga A3) adalah 0,2999; 0,9960; 0.9872. Persamaan ini selanjutnya

digunakan dalam penentuan kadar terukur dari sampel. Salah satu jaminan suatu metode dikatakan memenuhi syarat linearitas, nilai yang diharapkan adalah untuk b mendekati 0 dan r = ±1 tergantung arah garisnya. Suatu metode dikatakan memenuhi syarat linearitas jika nilai r tidak kurang dari 0,999. Dari tiga kelompok yang ada, nilai r yang didapatkan kurang dari 0,999 maka dari itu dapat disimpulkan bahwa untuk paramater linearitas, baik kelompok A1 hingga A3,

ketiganya masih belum memenuhi parameter linearitas.

G. Kesimpulan

1. Prinsip penetapan kadar parasetamol dengan metode Chafetz (metode kolorimetri) adalah pengukuran absorbansi dari zat yang semula tak berwarna diubah menjadi berwarna (direaksikan dengan zat tertentu) yang kemudian diukur serapannya pada daerah tampak/visible (diantara λ 400- 800 nm).

2. Persamaan kurva baku yang diperoleh kelompok A1: y = 2,664 x 10-4x + 0,1287; A2: y = 4,2216 x 10-4 x + 0,0522; A3: y = 6,7066 x 10-4 x + 0,0238 dengan nilai koefisien korelasi (r) berturut-turut (dari A1 hingga A3) adalah 0,2999; 0,9960; 0,9872. Persamaan yang digunakan untuk melakukan perhitungan adalah regresi kelompok A2.

3. Hasil recovery (perolehan kembali) yang didapat untuk sampel kadar 149,4 μg/mL adalah 59,9327% (replikasi I), 50,4196% (replikasi II), 55,1762% (replikasi III); 216,4 µg/mL adalah 78,5941% (replikasi I), 107,0544% (replikasi II), 111,4329% (replikasi III); dan 351,4 μg/mL adalah 114,121% (replikasi I), 138,055% (replikasi II), 149,514% (replikasi III).

4. Hasil kesalahan sistematik yang didapat untuk sampel dengan kadar 149,4 μg/mL adalah 40,0673% (replikasi I), 49,5804% (replikasi II), 44,8238% (replikasi III); 216,4 μg/mL adalah 21,4059% (replikasi I), -7,0544% (replikasi II), -11,4329% (replikasi III); dan 351,4 μg/mL adalah -14,121% (replikasi I); -38,055% (replikasi II), -49,514% (replikasi III).

5. Hasil kesalahan acak yang didapat untuk sampel dengan kadar 149,4 μg/mL adalah 8,6207%; 216,4 μg/mL adalah 18,0056% dan 351,4 μg/mL adalah 2,8887%.

H. Daftar Pustaka

Anonim a, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 765, Depkes RI, Jakarta

Anonim b, 1995, United States of Pharmacopeica, 23 rd ed, 1932-1983, New York, United State of America

Chafetz et al., 1971, Selective Colorimetric Determination of Acetaminophen, J.Pharm. Sci.,60 93), 463-466

Chamberlain, J., 1995, The Analysis of Drugs in Biological Fluids, 2 rd ed., 39-40, 84, CRC Press Inc, New York

Chambers

dan

Jones,

1976,

Comparison

of

a

Gas

Chromatographic

and

Colorimetric Method for the Determination of Plasma Paracetamol. Ann. Clinn. Biochem., 13(4),433-4

Katzung, 1989, Basic and Clinical Pharmacology, diterjemahkan oleh Binawati, H.K., Budi, I., Christianto, S., Hermawan, S., Yurita, H.H., Gunadi, B., Petrus, A., edisi 3, 3, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta

Montgomery et al., 1992, BioChemistry: A Case Oriented Approach, Alih bahasa Staff Pengajar FKUI. Edisi V, Jilid I, 80-91, Binarupa Aksara, Jakarta

Mulja, M., Hanwar , D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Laboratorium yang Baik, Majalah Farmasi Airlangga, Volume VI, 73, Airlangga University Press, Surabaya

Mulja, M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Cetakan Pertama, 6-9, Airlangga University Press, Surabaya

Mutschler, Ernst, 1991, Dinamika Obat, ed. V, hal 16-17, 36 , 90, Pnenrbit ITB, Bandung

Rang et al., 2003, Pharmacology, 5 th Ed., 96-97, Chorchill Livingstone, Ednburg, London, New York, Oxford, Philadelphia, St Louis, Sydney, Toronto

Ritschel, W. A, 1976, Handbook of Basic Pharmacokinetics, 1 st edition, hal 78, Drug Inteligence Publication Inc. Hamillton, USA

Roth, H.J., Blaschke, 1981, Pharmaceutical Analysis, diterjemahkan oleh sarjoko Kisman dan Slamet Ibrahim, 359-361, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta

Skoog, A., D., West, M., Donald, J., F., 1994, Analytical Chemistiy, 6 rh ed, 161- 195, Saunde College Publishing, United Stated of America

Stalcup et al., 1995, Medwork: Anatomy and Physiology, Chapter 13, section 2.2, page 2 of 2, Victory Technology Inc.

Widdop, B., 1986, Hospital Toxicology and Drug Abuse Screening, in Moffat A. C.,Jackson J.V., Moss, M.S., Widdop, B.,Greenfield, E.S., (Eds) Clarke’s Isolation and Identification of Drug in Pharmaceutical, Body Luids, and Post Mortem Material, 2 nd Ed., 23, The Pharmaceutical Press, London

Wilmana, P.F., 1995, Analgesik-Antipiretik, Analgesik Anti-Inflamasi Nonsteroid dan Obat Pirai, dalam Ganiswara, S.G., Farmakologi dan Terapi, Edisi IV, 214, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran-Universitas Indonesia, Jakarta