Diseo de un Potenciostato de Bajo Coste Para Biosensores Amperomtricos

J. Blanco, J. Campo, J. Antn, F. Ferrero

Dpto. Ingeniera Elctrica, Electrnica, Comp. y Sistemas Universidad de Oviedo Gijn, Espaa ferrero@uniovi.es
AbstractEste trabajo presenta los resultados preliminares obtenidos en el diseo de un potenciostato de bajo coste para biosensores amperomtricos, que monitoriza las corrientes faradaicas resultantes de intercambios electrnicos entre el sistema de reconocimiento biolgico (enzima) y un electrodo mantenido a un potencial constante apropiado. El objetivo final es obtener una relacin lineal entre dicha corriente y la concentracin del sustrato que se quiere analizar. Antes de describir el diseo del potenciostato, se hace necesario realizar una introduccin a los biosensores. El instrumento puede ser empleado para detectar concentraciones extremadamente bajas de una amplia variedad de sustancias. Se muestran los resultados experimentales obtenidos con un biosensor amperomtrico de alcohol oxidasa. Keywords- biosensor; detector amperomtrico; electroqumica; potenciostato; microcontrolador; celda

J.M. Pingarrn, A.J. Reviejo, J. Manso Dpto. Qumica Analtica. Facultad de Qumicas Universidad Complutense de Madrid Madrid, Espaa pingarro@quim.ucm.es

El sistema de reconocimiento biolgico (biorreceptor o simplemente receptor) debe inmovilizarse o retenerse sobre la superficie de un dispositivo, el transductor, que permita convertir la velocidad de la reaccin bioqumica que se produce en el proceso de reconocimiento biolgico en una respuesta medible, que usualmente es una seal elctrica que posteriormente es amplificada, procesada y convertida a la forma deseada. Las enzimas son los sistemas de reconocimiento biolgico ms empleados. Como se sabe, las enzimas son protenas que catalizan las reacciones bioqumicas en los seres vivos. La reaccin cataltica enzimtica es eficiente y adems extremadamente selectiva, por lo que se combinan dos factores (reconocimiento particular de especies y amplificacin de la seal) necesarios para la mayora de las aplicaciones analticas de estos sensores. El mtodo de trabajo ms usual implica la inmovilizacin de la enzima en su forma de reactivo puro sobre el transductor, obtenindose de este modo los biosensores enzimticos propiamente dichos. En cuanto al transductor, los dispositivos electroqumicos son los ms utilizados en el desarrollo de biosensores debido principalmente a las siguientes ventajas: Las medidas electroqumicas pueden realizarse en volmenes pequeos, con relativa facilidad. Esto hace que tales dispositivos sean especialmente apropiados para la monitorizacin in vivo. La seal obtenida, obviamente es elctrica, y por tanto es factible la conversin directa de la velocidad de reaccin en la seal de lectura. Los lmites de deteccin que se obtienen, normalmente entre 10-9 y 10-6 M, son suficientes y adecuados para la deteccin de numerosos analitos de inters. La relativa simplicidad y el bajo coste de la instrumentacin electroqumica permite una fcil disponibilidad de estos dispositivos. En el contexto de los biosensores electroqumicos, los ms prometedores, sobre todo en trminos de sensibilidad, son los biosensores amperomtricos, los cuales monitorizan las corrientes faradaicas resultantes de intercambios electrnicos

I.

INTRODUCCIN

En las ltimas dcadas se ha puesto de manifiesto la potencialidad de la tecnologa de los sensores para estimar y monitorizar sustancias de inters biolgico o bioqumico con el objeto ltimo de controlar los propios procesos biolgicos. As, un grupo especialmente atractivo dentro de los sensores en general es el constituido por los biosensores, los cuales utilizan mecanismos o principios biolgicos para el reconocimiento de especies particulares. El reconocimiento de molculas o grupos de molculas particulares constituye un proceso fundamental en el funcionamiento de los sistemas biolgicos. As, la naturaleza ha desarrollado un amplio conjunto de biomolculas o estructuras moleculares que son capaces de reconocer especficamente alguna propiedad particular de una determinada molcula de entre una mezcla de ellas. La Fig. 1 muestra la configuracin generalizada de un biosensor [1].
Seal elctrica Analito Receptor Transductor ELECTRNICA

Biosensor
Figura 1. Esquema generalizado de un biosensor.

entre el sistema biolgico y un electrodo mantenido a un potencial apropiado constante. La Fig. 2 muestra el esquema del biosensor amperomtrico utilizado en las pruebas realizadas [2-5]. El electrodo bienzimtico consta de una matriz compsita (conductor: grafito, aislante: tefln) en la que se ha inmovilizado la fase sensora: las enzimas alcohol oxidasa AOD y HRP (peroxidasa) y un compuesto mediador, ferrocianuro potsico. Se obtiene as un depsito tridimensional, en forma de pastillas cilndricas, de los tres componentes, y cuya superficie puede regenerarse por simple pulido. Estas pastillas vienen insertadas en un tubo soporte de Tefln, constituyendo el electrodo enzimtico base del biosensor.
i e

E =c te

WE E l ect ro d o d e t rab aj o

RE E l ect ro d o d e referen ci a

Figura 4. Celda electroqumica simple.

El electrodo de trabajo (WE) de la Fig. 2 funciona como un ctodo. Los electrones salen de el y van hacia la disolucin, siendo atrados por el electrodo de referencia (RE) o nodo. La corriente de electrones se cierra por este electrodo y el circuito de medida exterior. El electrodo de referencia suele ser de Ag/AgCl. Para que los resultados obtenidos sean repetibles es imprescindible que la diferencia de potencial entre ambos electrodos, E, se mantenga constante. Sin embargo esta diferencia de potencial se ve afectada por la cada de tensin en la resistencia de la disolucin, RS.

Figura 2. Esquema del biosensor compsito utilizado en las pruebas.

E = EWE - ERE + iRS En las aplicaciones con biosensores, el valor de la corriente suele ser muy pequeo, no as el valor de RS. Para minimizar esta cada se aade a la celda electroqumica un tercer electrodo, el electrodo auxiliar (AE), que acta como un nodo de forma que toda la corriente se cierre por el, segn se muestra en la Fig. 5. Este electrodo, generalmente es un hilo de platino.

Como ejemplo, la Fig. 3 muestra las reacciones implicadas en la determinacin de etanol. La reaccin enzimtica principal es la oxidacin de etanol que, catalizada por AOD genera acetaldehdo y H2O2 como productos de reaccin. Aprovechando la generacin de H2O2, se ha acoplado como reaccin enzimtica secundaria la reduccin del mismo catalizada por HRP, empleando ferroceno como mediador, y monitorizando electrdicamente la reduccin electrdica de ferricinio a ferroceno.
Colesterol + O2 Etanol COD
Acetaldehido Colestenona + H2O2

POTENCIOSTATO
WE RE AE

Ferricianuro

ELECTRODE

HRPred

e-

i i=0 mV i

H2 O

HRPox

Ferrocianuro

Figura 3. Reacciones implicadas en la determinacin de etanol con el electrodo bienzimtico

WE

RE i

AE

II. FUNDAMENTO DE LA MEDIDA AMPEROMTRICA En los biosensores amperomtricos, la medida de analito presente en la muestra se realiza a partir de la corriente generada en la reaccin electroqumica inducida, manteniendo un potencial constante entre los electrodos. El valor de este potencial depende de la sustancia a determinar y suele ser inferior a 2V, de forma que al aplicar siempre el mismo las medidas sean repetibles. La Fig. 4 muestra una simple celda electroqumica con los electrodos que intervienen en la medida. En toda reaccin electroqumica se requieren como mnimo dos electrodos:

Figura 5. Principio de una celda electroqumica con potencial controlado.

III.

DISEO DEL DETECTOR AMPEROMTRICO

Como resumen de lo expuesto en el punto anterior, las funciones principales que ha de tener el detector amperomtrico son:

1) Medir la diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el de referencia sin que este ltimo electrodo resulte polarizado. 2) Mantener constante la diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el de referencia. Los instrumentos que realizan las dos funciones anteriores se denominan potenciostatos [6], siendo empleados en diversos tipos de anlisis electroqumicos, biosensores, anlisis de procesos de corrosin, investigacin y desarrollo de nuevos materiales, etc. La Fig. 6 muestra el diagrama de bloques del prototipo de potenciostato diseado, que realiza las funciones descritas anteriormente. A continuacin se describen cada uno de estos bloques con un poco ms de detalle. A. Convertidor corriente-tensin Este circuito convierte la corriente generada en la celda electroqumica en una tensin proporcional, ms adecuada para su procesamiento en el microcontrolador. Esta corriente es directamente proporcional a la concentracin del analito presente en la disolucin. Las corrientes a medir estn en el margen de unos pocos A, utilizndose un esquema de convertidor I/V basado en un solo amplificador operacional. El bajo nivel de la corriente a medir condiciona la eleccin del operacional que ha de tener una alta impedancia de entrada, baja corriente de offset y bajo ruido [7,8]. En la realimentacin es conveniente aadir un condensador de compensacin de fase para minimizar los posibles ruidos de altas frecuencias.

A continuacin del convertidor I/V la seal es acondicionada para adecuarla a los niveles de tensin de la entrada del convertidor AD del microcontrolador. Este acondicionamiento consiste en aplicar una ganancia ajustable mediante un potencimetro digital, y aadir un nivel de continua, para poder medir corrientes en ambos sentidos. Finalmente la seal es filtrada mediante un filtro paso bajo de Butterworth a fin de quedarnos solo con las componentes de ms baja frecuencia, ya que la seal del biosensor es bastante ruidosa. El filtro se implementa digitalmente en el propio microcontrolador, pudiendo el usuario seleccionar la frecuencia de corte que ms se ajuste a la aplicacin. B. Amplificador de control Este bloque es clave en el funcionamiento y estabilidad del potenciostato. Se encarga de mantener constante la tensin del electrodo de referencia. Para ello implementa un regulador de tipo PI que compara la tensin del electrodo de referencia VRE, con la tensin de control VC, generada por el DAC. Si ambas tensiones no son iguales la salida del amplificador de control inyecta ms o menos corriente en la celda electroqumica al objeto de mantener constante la tensin en el electrodo de referencia. El operacional utilizado para el regulador ha de tener valores altos de ganancia en bucle abierto, impedancia de entrada y CMRR [9]. La tensin de control, VC se puede obtener de varias maneras, como por ejemplo filtrando la salida PWM del microcontrolador o mediante un convertidor DA externo. Se ha optado por esta ltima opcin por proporcionar mejores resultados. En concreto se utiliz un convertidor DA de 16 bits con estructura serie de forma que sea menos vulnerable a interferencias de acoplo capacitivo.

Amplificador de control

VC V RE

DAC

AE Celda electroqumica WE iWE RE + Acondiciona miento

Microcontrolador

USB

+ Convertidor I/V

Acondiciona miento

Batera Figura 6. Diagrama de bloques bsico del potenciostato

La estabilidad del amplificador de control se prob excitndolo con una onda cuadrada de 1 kHz y 200 mV de amplitud. La celda electroqumica se simul mediante con una celda dummy como la mostrada en la Fig. 7. De esta forma se est obligando al potenciostato a operar en unas condiciones ms duras que las que en realidad va a estar sometido. La Fig. 8 muestra las formas de onda de la tensin de control vC aplicada y la tensin de referencia, vRE obtenida. La velocidad de respuesta y la sobreoscilacin obtenidas en estas condiciones son aceptables.
AE RE WE

de implementar, en la actualidad est en desuso. La comunicacin inalmbrica mediante Bluetooth, aunque actualmente est bastante extendida y pudiera resultar interesante no se ha previsto en este primer prototipo, debido a que no es particularmente til en un aparato de estas caractersticas, aparte de la complejidad y el coste extra que conlleva. Se ha optado finalmente por utilizar una conexin USB por ser en estos momentos la opcin ms universal, verstil y con las mayores prestaciones de las contempladas. Adems de estar hoy en da ampliamente extendida en todo tipo de dispositivos electrnicos, proporciona una alta tasa de transferencia de datos, y nos permite alimentar el instrumento directamente desde el puerto, con el consiguiente ahorro de batera. El software para el computador fue desarrollado en VisualBasic y ofrece diversas posibilidades. Permite visualizar en tiempo real los datos recogidos por el instrumento as como modificar parmetros como el potencial aplicado, frecuencia de corte o el margen de corriente a medir. Una mejora futura a incorporar sera permitir un acceso remoto al equipo mediante una plataforma Web. E. Alimentacin La circuitera electrnica del potenciostato requiere una alimentacin de 5V. Se parte de bateras convencionales, del tipo AA, emplendose un convertidor cc-cc elevador para obtener la tensin positiva [11] y un convertidor cc-cc inversor para generar la tensin negativa [12]. El puerto USB aade la posibilidad de obtener directamente de l la alimentacin de +5V, lo que nos permite un ahorro de batera cuando el potenciostato est conectado a un computador. Es importante seleccionar los componentes que tengan un menor consumo a fin de alargar la vida de las bateras. En este sentido se tiene previsto incorporar un sistema de recarga rpida de las bateras cuando el equipo est conectado. F. Cableado y apantallado Dado que se manejan seales de pequeo nivel es esencial evitar que se induzcan tensiones de ruido debidas a interferencias electromagnticas. Para ello es necesario emplear una pantalla electrosttica conectada a la masa del circuito. Adems, en el diseo del PCB hay que tener en cuenta ciertas reglas bsicas como son: separar los planos de masa analgica y digital los cuales deben estar unidos en un solo punto a la alimentacin, minimizar los bucles de corriente en la masa, situar un condensador de desacoplo a la entrada de la alimentacin, conexiones a masa deben ser lo ms cortas posible, etc. [13]. IV. RESULTADOS EXPERIMENTALES

R1

R2

Figura 7. Celda dummy empleada en el anlisis de estabilidad.

0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 -0,001 -0,0005 -0,05 0 t(s) 0,0005 0,001 0,0015

vC

vRE

Figura 8

Formas de onda del amplificador de control.

C. Medida de la tensin del electrodo de referencia Como se puede observar en la figura 6, el electrodo de trabajo est conectado a la masa virtual del convertidor I/V. Esta disposicin hace que la medida de la diferencia de potencia entre electrodos se pueda hacer directamente sobre el electrodo de referencia. Para medir VRE se emplea un seguidor de tensin, realizado con un operacional de alta entrada JFET con alta impedancia de entrada, baja corriente de polarizacin y baja tensin de ruido [10]. Le sigue un circuito amplificador para la adaptacin al margen de entrada del microcontrolador y no perder resolucin. Se requiere una resistencia en la entrada no inversora para proteger dicha entrada frente a cargas estticas. D. Interfaz con el PC Con objeto de poder realizar un tratamiento ms amplio de los datos recogidos, guardndolos indefinidamente y dando la posibilidad de hacer estadsticas, grficas, etc., se implementar la conectividad del instrumento con un computador. Las principales soluciones que se pueden adoptar son: el puerto serie del PC, Bluetooth y USB. La primera opcin se desech ya que, aunque es la ms sencilla

Para comprobar el correcto funcionamiento del potenciostato se realizaron diversas medidas empleando el electrodo de trabajo de la Fig. 2 en un medio disolucin

reguladora de fosfato 0.05 M (pH 7.4). Una vez alcanzado el estado estacionario se procedi a realizar adiciones sucesivas de 25 l de una disolucin patrn de etanol 0.1 M. Antes de realizar cada una de las adiciones se esper a que la corriente alcanzara el estado estacionario. En la Figura 9 se muestra uno de los amperogramas obtenidos en estas condiciones experimentales. La determinacin del analito en la muestra se puede llevar a cabo mediante la interpolacin de la intensidad de corriente obtenida en un calibrado (I vs. Concentracin) previamente establecido con patrones, si no hay efecto matriz en la muestra analizada, o bien mediante el mtodo de adicciones estndar si se ha detectado este efecto matriz [14]. El software del instrumento llevar estas dos opciones y podr elegirse una de ellas dependiendo de si hay o no efecto matriz.
3 2,5 Corriente WE (uA) 2 1,5 1 0,5 0 0 100 200 300 Tiempo (s)
Figura 9.
100,0 80,0 60,0 Tension WE-RE (uV) 40,0 20,0 0,0 -20,0 -40,0 -60,0 -80,0 -100,0 0 100 200 300 Tiempo (s) 400 500 600

LSB del convertidor AD de 10 bits que integra el microcontrolador. V. CONCLUSIONES

Este trabajo presenta los resultados preliminares obtenidos en el diseo de un potenciostato de bajo coste para la deteccin amperomtrica con biosensores enzimticos. Su aplicacin puede extenderse a todo tipo de anlisis electroqumicos en sistemas de tres electrodos. En este artculo, el potenciostato diseado se prob con un biosensor de alcohol y est previsto su empleo con un biosensor para la determinacin de colesterol en alimentos. Este tipo de instrumentacin si bien no tiene una excesiva complejidad electrnica, requiere un cuidadoso diseo de todos sus elementos, ya que se trata de medir seales muy pequeas en presencia de modo comn y posibles fuentes de interferencias electromagnticas. La alimentacin mediante bateras y la conectividad a travs del bus USB le confiere una mayor flexibilidad de funcionamiento. AGRADECIMIENTOS Este trabajo est financiado por la Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa (CC-04-PTR19950783-0P). REFERENCIAS

400

500

600

[1] [2]

Medida de corriente con adiciones sucesivas de etanol.

[3]

[4]

[5]

[6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14]

Figura 10. Tensin en el electrodo de referencia.

Hemos comentado que es esencial que la tensin entre los electrodos de referencia y de trabajo ha de ser constante, en el valor que cada biosensor requiera. En las pruebas realizadas con el sensor de alcohol la tensin entre dichos electrodos ha de ser de 0,000 V. La Fig. 10 muestra como el amplificador de control mantiene dicho valor. Las variaciones de tensin son, en cualquier caso, inferiores al

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