I. PENDAHULUAN I.a. Latar Belakang I.b. Tujuan II. METODOLOGI II.a.

Alat dan Bahan Alat yang dibutuhkan dalam praktikum ini adalah gelas kimia, HPLC, statip, Erlenmeyer. Bahan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah teh hijau, teh hitam, aquades, kopi bubuk, kopi arabika bubuk, kopi robusta bubuk, dan coklat bubuk.

II.b. Tempat Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Pengawasan Mutu dan Laboratorium Instrumen Departemen Teknologi Industri Pertanian

II.c. Metode 1. Ekstraksi Kafein

2. Penentuan Kadar Kafein

Sebanyak 10 mg kafein ditimbang Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml Larutkan sampai tanda tera Aduk dengan sonifikasi selama 5 menit

Larutan disaring

Larutan diinjeksikan ke alat HPLC

III. HASIL DAN PEMBAHASAN III.a. Hasil Praktikum [Terlampir] III.b. Pembahasan Kafein merupakan jenis alkaloid yang secara alamiah terdapat dalam biji kopi, daun teh, daun mete, biji kola, biji coklat, dan beberapa minuman penyegar. Kafein memiliki berat molekul 194.19 dengan rumus kimia C8H10N8O2 dan pH 6.9 (larutan kafein 1% dalam air). Kafeina memiliki molekul metabolit yaitu 1-3-7-asam trimetilurat, paraksantina, teofillina dan teobromina dengan masing-masing lintasan metabolismenya. Kafein ialah alkaloid yang tergolong dalam keluarga methylxanthine bersama-sama senyawa tefilin dan teobromin. Pada keadaan asal, kafein ialah serbuk putih yang pahit. Nama sistematik kafein ialah: 1,3,7-trimetilxanthine atau 3,7-dihidro-1,3,7-trimetil-1H-purin-2,6-dione Sifat umum kafein menurut Siswoputranto (1993) adalah sebagai berikut: Titk beku : 238C Titik didih : 178C Tekanan uap : 760 mm Hg pada 178 C Berat molekul: 197,19 Kelarutan di air: 2,17% pH : 6,9 (1% larutan)

Dalam praktikum yang telah dilakukan, ekstraksi kafein dari tiap-tiap bahan menggunakan metode HPLC. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Snyder dan Kirkland, 1979; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain: Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik Dapat digunakan bermacam-macam detektor Kolom dapat digunakan kembali Mudah melakukan "sample recovery" Untuk zat yang labil & tidak mudah menguap Dilakukan pada suhu kamar Dapat untuk senyawa anorganik & Mr besar

Gambar Skema alat HPLC Prinsip kerja & Instrumentasi Fasa gerak zat cair (eluen/pelarut) Pelarut yang baik untuk cuplikan, murni, jernih, tidak kental, sesuai dengan detektor.

Pompa motor Berfungsi sebagai penggerak fasa gerak, syaratnya tahan korosi dan minimum tekanan pompa 6000 psi. Pemasukkan cuplikan Syarat pemasukkan cuplikan yaitu tekanan tidak turun. Teknik yang dipakai untuk memasukkan cuplikan dengan injeksi syringe disuntikkan melalui septum (tahan P = 1500 psi). Kolom Fungsi kolom menyaring kotoran dan menjenuhkan fasa diam. Ukuran kolom dari diameter 4-5 mm. Detektor Detektor HPLC digunakan untuk senyawa organik adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan yang dapat memisahkan setiap komponen dalam suatu campuran. Pemisahan ini didasarkan pada perbedaan migrasi setiap komponen yang disebabkan karena perbedaan sifat interaksi dari setiap komponen pada fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase geraknya metoda kromatografi cair dan kromatografi gas. Salah satu contoh dari pengembangan metode kromatografi cair dalam HPLC (High Performance Liquid Chromatgraphy) atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukurannya sempit (kolom) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relatif singkat. HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponenkomponen dalam campuran. Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat ditingkatkan dengan mengoptimasi perameter perameter HPLC yaitu retensi, selektivitas, dan evisiensi. Secara praktis parameter-parameter tersebut dapat dioptimalkan dengan mengubah: 1. komposisi dari fase gerak

2. laju alir 3. sifat kimia dari fase gerak 4. jenis kolom Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kualitatif dan kuantitatif. Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatografi sampel dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan untuk analisa kuantitatif dapat ditentukan dengan menggunakan persamaan: Cx = Ax / Ap x Cp Keterangan: Cx = Konsentrasi sampel Ax = Peak area sampel (Luas puncak) Ap = Peak area pembanding (Luas puncak) Cp = Konsentrasi pembanding Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut. Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masingmasing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan

menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama. Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). Jika larutan X kurang pekat, area dibawah pucak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Kafein mengikat reseptor adenosina diotak. Adenosina ialah nukleotida yang mengurangi aktivitas sel saraf saat tertambat pada sel tersebut. Seperti adenosina, molekul kafein juga tertambat pada reseptor yang sama, tetapi akibatnya berbeda. Kafein tidak akan memperlambat aktivitas sel saraf atau otak, sebaliknya menghalangi adenosina untuk berfungsi. Dampaknya aktivitas otak meningkat dan mengakibatkan hormon epinefrinterlepas. Hormon tersebut akan menaikkan detak jantung, meninggikan tekanan darah, menambah penyaluran darah ke otot-otot, mengurangi penyaluran darah ke kulit dan organ dalam dan mengeluarkan glukosa dari hati. Lebih jauh, kafein juga menaikkan permukaan neurotransmiter dopamin di otak. Produk Kandungan kafein Secangkir Kopi Bubuk 85 mg Secangkir Teh 35 mg Sebotol Coco cola 35 mg Minuman energi (kratingdaeng, M-150,Galin Bugar, dll ) 50 mg Kopi Instan 2.8 5.0% Kopi Moka (mentah) 1.08% Kopi Moka (sangrai) 0.82% Kopi Robusta Jawa 1.48% Kopi Arabika 1.16% Kopi Liberika (mentah) 1.59% Kopi Liberika (sangrai) 2.19% Sumber: Johnson, E. L. and Steven son, R. (1978). Tanaman kopi termasuk dalam famili Rubiaceae dan terdiri atas banyak jenis antara Coffea arabica, Coffea robusta dan Coffea liberica. Negara asal tanaman kopi adalah Abessinia yang tumbuh di dataran tinggi (Ridwansyah, 2003). Tanaman kopi Robusta tumbuh baik di dataran rendah sampai ketinggian sekitar 1.000 m diatas permukaan laut, daerah-daerah dengan suhu sekitar 200C. Kopi Robusta digolongkan lebih rendah mutu citarasanya dibandingkan dengan citarasa kopi Arabika. Hampir seluruh produksi kopi Robusta di seluruh dunia dihasilkan secara kering dan untuk mendapatkan rasa lugas tidak boleh mengandung rasa-rasa asam dari hasil fermentasi. Kopi Robusta memiliki kelebihan yaitu kekentalan lebih dan warna yang kuat (Siswoputranto, 1992).

Tanaman kopi arabika menghendaki daerah-daerah yang lebih tinggi sampai ketinggian sekitar 1700 m diatas permukaan laut, daerah-daerah yang umumnya dengan suhu sekitar 10-16C. Tanaman kopi liberika dapat tumbuh di dataran rendah. Kopi Arabika adalah kopi yang paling baik mutu cita rasanya, tandatandanya adalah biji picak dan daun hijau tua dan berombak-ombak (Ridwansyah, 2003).

Bentuk murni kafein dijumpai sebagai kristal berbentuk tepung putih atau berbentuk seperti benang sutera yang panjang dan kusut. Bentuk kristal benang itu berkelompok akan terlihat seperti bulu domba. Kristal kafein mengikat satu molekul air, dapat larut dalam air mendidih. Didalam pelarut organic maka pengkristalan yang terjadi tanpa ikatan molekul air. Kafein mencair pada suhu 235-237C dan akan menyublin pada suhu 1760 C dialam ruangan terbuka. Kafein mengeluarkan bau yang wangi, mempunyai rasa yang sangat pahit dan mengembang di dalam air (Ridwansyah, 2003). Kadar kafein dalam kopi robusta yang dihasilkan pada percobaan sebesar 947,1087763 ppm (0,947 gram kafein/ 1 kg kopi robusta). Sedangkan, menurut Clarke and Macrae (1987) kadar kafein dalam kopi robusta 2 % bobot kering atau sekitar 20 gram kafein per 1 kg kopi robusta. Hasil percobaan sangat berbeda jauh dengan literatur. Kopi robusta sampel lebih rendah kadar kafeinnya dibandingkan kadar kafein kopi robusta dari literatur karena kopi robusta yang digunakan sebagai sampel bukan kopi yang baru. Kopi tersebut telah disimpan sekitar lebih dari 20 tahun. Kafein adalah basa moncidic yang lemah dan dapat memisah dengan penguapan, serta mudah diuraikan oleh alkalis yang panas (Ridwansyah, 2003).

Sehingga seiring berjalannya waktu, kadar kafein yang terdapat dalam biji kopi semakin berkurang. Kadar kafein dalam kopi arabika sebesar 1 % bobot kering atau sama dengan 10 gram kafein dalam 1 kg kopi arabika (Clarke and Macrae, 1987). Kadar kafein dalam kopi arabika yang dihasilkan pada percobaan sebesar 2082,3698745 ppm (2,082 gram kafein/ 1 kg kopi arabika). Seperti halnya kopi robusta, kopi arabika yang digunakan sebagai sampel telah disimpan sekitar lebih dari 20 tahun. Kadar kafein kopi arabika sampel lebih kecil dibandingkan kadar kafein kopi arabika literatur. Kopi yang telah lama disimpan mengakibatkan kafeinnya terdegradasi menjadi kafeol dan terpisah dari kafein. Sehingga kadar kafein kopi arabika sampel menjadi lebih kecil dibanding literatur. Ekstraksi kafein dari kopi, untuk menghasilkan kopi tanpa kafein (kopi decaf) dan ekstraksi kafein tersebut dapat dilakukan dengan alcohol, benzene, kloroform, trichloroethylene dan diklorometana semuanya telah digunakan selama bertahuntahun tetapi untuk alasan kesehatan dipilih ekstraksi air yaitu: biji kopi direndam dalam air yang mengandung senyawa lain selain kafein dan berkontribusi terhadap rasa kopi, Kafein dapat diisolasi dengan adsorpsi arang aktif atau dengan cara penyulingan, rekristalisasi, atau osmosis terbalik. Air kemudian dituang kembali dengan kacang-kacangan hingga menguap dan kering, sehingga tercipta kopi tanpa kafein dengan rasa aslinya. Kafein yang telah diekstraksi biasanya digunakan kembali dalam pembuatan obat-obatan maupun makanan. Kopi bubuk yang beredar dipasaran biasanya merupakan campuran antara kopi arabika dan kopi robusta. Kopi instan atau kopi bubuk mengandung 65 miligram kafein per porsi; kopi diseduh di perkolator memiliki 80 miligram, dan kopi yang dibuat menggunakan metode tetes memiliki 155 miligram (Matissek, R. 1997). Namun berdasarkan hasil praktikum, didapatkan banyaknya kafein dalam bahan kopi bubuk dengan rendemen 17.35% adalah sebanyak 10413.6768767 ppm. Dibandingkan dengan kadar kafein standar yang digunakan, area sample kopi bubuk adalah yang palung luas yaitu sebesar 12129.8. Namun hal ini belum memastikan kopi bubuk memiliki kadar kafein tertinggi karena kadar kafein dalam bahan the hijau yang digunakan adalah yang terbesar (12778.9105926 ppm). Kadar kafein kopi bubuk cukup tinggi karena luasan permukaan kopi bubuk lebih besar dibandingkan dengan kopi mentah sehingga proses ekstraksi kopi bubuk dapat lebih efisien. Cokelat yang didapatkan dari biji kakao mengandung sejumlah kecil kafeina. Efek rangsangan yang dihasilkan oleh coklat berasal dari efek kombinasi teobromina, teofilina, dan kafeina. Coklat mengandung jumlah kafeina yang sangat sedikit untuk mengakibatkan rangsangan yang setara dengan kopi. 28 gram sajian coklat susu batangan mengandung kadar kafeina yang setara dengan secangkir kopi yang didekafeinasi. Menurut Matissek, R (1997), bukti awal penggunaan kafein kakao berasal dari residu yang ditemukan di sebuah pot tembikar Maya kuno bertanggal ke 600 SM. Di Dunia Baru, cokelat dikonsumsi dalam minuman pahit dan pedas disebut xocolat, sering dibumbui dengan vanili, lada chile, dan achiote.

Xocolat diyakini untuk melawan kelelahan, sebuah keyakinan yang mungkin disebabkan oleh kandungan theobromine dan kafein. Chocolate adalah sebuah kemewahan yang penting baik di seluruh Mesoamerika pra-Columbus, dan biji coklat sering digunakan sebagai mata uang. Hal ini menunjukkan penggunaan cokelat yang meluas dan dapat diterima di berbagai wilayah. Karena itu, pengolahan cokelat terus berkembang hingga kini. Hasil praktikum ekstraksi kafein dengan bahan cokelat bubuk menunjukkan bahwa cokelat bubuk yang digunakan sebagai sampel uji memang memiliki kadar kafein yang rendah. Hal ini sesuai dengan literature yang ada. Walaupun bahan adalah bubuk halus dengan luas permukaan besar, namun dari hasil tersebut didapatkan bahwa kadar kafein dalam bahan cokelat hanya sebanyak 145.6629571 ppm. Kafein dalam cokelat bubuk sangat rendah karena dalam cokelat kandungan bahan alkaloid yang dominan memang bukanlah cokelat melainkan teobromin. Selain karena itu, proses pengolahan cokelat bubuk biasanya dilakukan dengan proses fermentasi yang panjang sehingga kandungan alkaloid dalam cokelat menurun akibat paparan oksigen (oksidasi). Pengolahan cokelat yang ada juga biasanya bertujuan untuk mengurangi kafein yang ada sehingga rasa cokelat bubuk tidak terlalu pahit untuk digunakan dalam produk pangan lainnya. Kafein (caffeine) yang dikandung dalam teh adalah sekitar 7,6% dari berat kering. Jumlah kafein dalam takaran satu cangkir teh (sekitar 200 ml) adalah sebesar 50 mg atau sekitar 40% dari setengah cangkir yang sama jika kita menyeduh kopi. Kandungan kafein pada teh ini lebih rendah disebabkan karena formasinya yang begitu kompleks yang tergabung dalam polyphenol teh, sehingga efek perangsang yang ditimbulkannya juga lebih ringan. Efek rangsangan yang ringan ini membantu untuk meningkatkan daya konsentrasi dan kewaspadaan. Menurut Canada's Food Guides to Healthy Eating, tingkat kafein dalam teh tersebut dapat dikatakan memiliki efek positif. Kebanyakan orang bisa minum teh hingga 10 atau 12 cangkir per hari dan masih pada batas maksimum kafein yang dianjurkan (Dunianya Sari, 2010). Hasil perhitungan dengan HPLC untuk kadar kafein dalam teh hijau sebesar 12778,9105926 ppm, sedangkan kadar kafein yang terkandung dalam teh hitam sebesar 9789,7899511 ppm. Area sampel untuk teh hijau lebih luas daripada area sampel teh hitam yaitu sebesar 9256,32617 untuk teh hijau dan 8527,74902 untuk teh hitam. Dalam literature yang didapatkan, kadar kafein dalam teh hijau seharusnya lebih sedikit bila dibandingkan dengan teh hitam yaitu sebesar 45 mg untuk teh hitam dan 20 mg untuk teh hijau. Perbedaan hasil ini mungkin disebabkan teh hijau yang diuji disini masih segar (baru saja dibuka) sehingga zat-zat xanthin yang terdapat dalam teh hijau belum banyak yang menguap sedangkan pada teh hitam zat-zat xanthinnya sudah banyak yang hilang karena sudah lama dibuka. Selain itu, lamanya pengekstraksian kafein dari bahan juga akan mempengaruhi jumlah kafein yang dihasilkan.

IV. PENUTUP IV.a. Kesimpulan Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan yang dapat memisahkan setiap komponen dalam suatu campuran. Pemisahan ini didasarkan pada perbedaan migrasi setiap komponen yang disebabkan karena perbedaan sifat interaksi dari setiap komponen pada fase diam dan fase gerak. Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kualitatif dan kuantitatif. Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatografi sampel dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan untuk analisa kuantitatif dapat ditentukan dengan menggunakan perhitungan lebih lanjut. Hasil dari ekstraksi kafein dalam berbagai bahan di praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa kadar kafein dalam bahan uji kopi bubuk, kopi mentah arabika, kopi mentah robusta, cokelat bubuk, teh hijau, dan teh hitah adalah 10413.6768767, 2082.3698745, 947.1087763, 145.6629571, 12778.9105926, dan 9789.7899511 secara berturutturut. Kadar kafein dalam bahan yang tertinggi adalah dalam bahan uji teh hijau. Sedangkan kadar kafein bahan yang terendah ada pada bahan cokelat bubuk. Proses ekstraksi dapat berjalan dengan lebih efisien apabila luas permukaan bahan uji makin besar. Artinya, makin kecil ukuran bahan maka proses ekstraksi akan makin efisien. Selain itu proses penyimpanan bahan sebelum ekstraksi juga sangat berpengaruh terhadap kadar kafein bahan. Makin lama bahan disimpan di udara terbuka, kafein di dalam bahan akan makin sedikit karena terjadinya oksidasi kafein. Misalnya dalam yang telah lama disimpan mengakibatkan kafeinnya terdegradasi menjadi kafeol dan terpisah dari kafein.

IV.b. Saran Saran yang dapat diajukan dalam pelaksanaan praktikum kali ini diantaranya adalah penambahan jumlah alat HPLC yang digunakan sehingga pada waktu praktikum dilakukan hanya sedikit waktu yang terbuang untuk menunggu alat bekerja. Selain itu, penyediaan alat yang digunakan akan lebih baik jika terdapat pada satu ruangan sehingga saat praktikum berlangsung akan lebih terlihat tertib karena praktikan tidak melakukan mobilisasi berlebihan.

DAFTAR PUSTAKA Clarke, R. J. and Macrae, R. 1987. Coffe Chemestry (Volume 1). Elsevier Applied Science, London and New York. Dunianya Sari. 2010. Kopi dan Teh: semakin lama diseduh kadar kafeinnya semakin tinggi??. http://dunianyasari.blogspot.com/2010/12/kopi-dan-teh-semakinlama-diseduh-kadar.html [diakses 20 Maret 2011] Harry G. Brittain, Richard J. Prankerd (2007). Profiles of Drug Substances, Excipients and Related Methodology, volume 33: Critical Compilation of Pka Values for Pharmaceutical Substances. Academic Press. ISBN 012260833X Johnson, E. L. and Steven son, R. 1978. Basic Liquid Chromatography. Varian, California. Matissek, R (1997). Evaluation of Xanthine Derivativesi in Chocolate: Nutritional and Chemical Aspects. European Food Research and Technology 205 (3): 17584. Ridwansyah. 2003. Pengolahan Kopi. www.library-usu.ac.id [diakses 20 Maret 2011] Siswoputranto, P .S. 1993. Kopi Internasional dan Indonesia. Kanasius. Jakarta. Snyder, L. R and Kirkland J.J 1979. Introduction to Modern Liquid Chromatography. Second Edition. John Wiley & Sons.Inc NewYork, Chihester, Briebane, Toronto, Singapur.