ALAT DAN BAHAN Alat 1. Perkolator 2. Oven 3. Perangkat destilasi 4. Lampu UV 5. Densitometer 6. Spektrofotometer UV 7.

Alat uji daya lekat 8. Kompor + kuali 9. Timbangan 10. Alumunium foil 11. Kertas saring 12. Alat-alat gelas Bahan 1. Serbuk sambiloto 2. Serbuk daun jambu biji 3. Simplisia kapulaga 4. Etanol 96% 5. Etanol 70% 6. Etanol 50% 7. Akuades 8. Heksana 9. Natrium anhidrat sulfat 10. Reagen Folin Ciocateau 11. Natrium karbonat 12. Silika gel F254 13. Kloroform

CARA KERJA Optimasi penyari dengan metode SLD Masing-masing sebanyak 10 gram simplisia sambiloto ditimbang dan direndam dalam 100 mL penyari dengan variasi : etanol 96%; etanol 70%; etanol 50% dan akuades.

Maserasi dilakukan selama 2 jam dengan pengadukan setiap 30 menit.

Maserat disaring lalu filtratnya ditotolkan sebanyak 2 L pada silika gel F254. Ekstrak dielusi bersama standar androgafolid 2 mg/mL sebanyak 2; 4; dan 6 L dengan fase gerak kloroform-metanol (9:1 v/v) dan jarak elusi 8 cm.

Hasil elusi dikuantifikasi luas bercaknya dengan densitometer pada panjang gelombang 254 nm.

Kadar androgafolid pada masing-masing ekstrak dihitung berdasarkan persamaan kurva kalibrasi yang dibuat dari hasil densitometri standar androgafolid.

Komposisi penyari (etanol-air) optimal ditentukan dengan metode simplex lattice design dengan rumus: Y = a (A) + b (B) + ab (A) (B) Y merupakan kadar senyawa androgafolid, a dan A merupakan besar fraksi air dan koefisien fraksi air, b dan B merupakan besar fraksi etanol dan koefisien fraksi etanol, serta ab merupakan koefisien fraksi etanol air.

Perkolasi Sebanyak 100 gram serbuk sambiloto dibasahi dengan 50 mL penyari (komposisi diperoleh dari hasil SLD).

Perkolator diisi dengan kapas dan kertas saring lalu serbuk yang sudah dibasahi dimasukkan kedalamnya.

Sebanyak 500 mL penyari ditambahkan ke dalam perkolator lalu didiamkan selama 24 jam.

Perkolat ditampung dengan kecepatan penetesan 1 mL/menit.

Sebanyak 80 mL tampungan pertama dipisahkan dan perkolasi dilanjutkan dengan hingga perkolat yang keluar terakhir tidak meninggalkan sisa jika diuapkan.

Perkolat selanjutnya diuapkan dengan pengurangan tekanan hingga volume 20 mL.

Perkolat hasil penguapan kemudian dicampur dengan perkolat pertama (80 mL).

Campuran kemudian dibagi dua sama banyak, setengah bagian disimpan sebagai ekstrak cair dan setengah bagian diuapkan hingga menjadi ekstrak kental.

Ekstrak kental ditimbang dan dihitung rendemennya.

Penetapan kadar androgafolid dengan KLT Perkolat, ekstrak terpurifikasi dan sisa purifikasi maserat simplisia sambiloto dikuantifikasi kadar androgafolidnya dengan metode KLT-densitometri dengan fase diam silika F254 dan fase gerak kloroform-metanol (9:1 v/v) serta pengukuran bercak pada panjang gelombang 230 nm.

Kadar androgafolid dalam ekstrak dihitung menggunakan persamaan kurva kalibrasi yang diperoleh dari hasil densitometri standar androgafolid 2 mg/mL dengan variasi volume totolan sebanyak 2; 4; 6; dan 8 L.

Berikut skema totolan ekstrak dan standar pada plat KLT:

8 cm

Keterangan: 1 = 2 L standar androgafolid 2 mg/mL 2 = 4 L standar androgafolid 2 mg/mL 3 = 6 L standar androgafolid 2 mg/mL 4 = 8 L standar androgafolid 2 mg/mL 5 = 5 L ampas sisa purifikasi maserat (dibuat dengan melarutkan 1 g ampas dalam 10 mL etanol) 6 = 5 L ekstrak terpurifikasi (dibuat dengan melarutkan sisa penguapan ekstrak heksan dalam 3 mL etanol) 8 = 5 L perkolat (dibuat dengan melarutkan 1 g perkolat dalam 10 mL etanol)

HASIL Optimasi penyari dengan SLD Kurva kalibrasi androgafolid: No 1 2 3 Jumlah androgafolid (g) 4 8 12 Luas area 11412,5 19193,7 27795,0

30000 25000 Luas area 20000 15000 10000 5000 0 2 4 6 8 10 12 14 Jumlah androgafolid (g)

y = 2047.8x + 3084.6 R = 0.9992

Kadar androgafolid dalam ekstrak: Jumlah androgafolid (g) = Kadar androgafolid = ( x ) % b/b

No 1 2 3 4

Fraksi air 1 0,5 0,3 0,04

Fraksi etanol 0 0,5 0,7 0,96

Luas area 0* 2141,9 2484,7 3038,4

Jumlah androgafolid (g) -0,4603** -0,2930** -0,0226**

Kadar androgafolid (%) -0,0000** -0,0000** -0,0000**

* tidak terdeteksi sebagai peak * Perhitungan SLD tidak menggunakan kadar androgafolid karena diperoleh hasil negatif. Peubah Y pada persamaan SLD menggunakan luas area bercak hasil densitometri

Perhitungan SLD: Y = a (A) + b (B) + ab (A) (B) (1) 2141,9 = 0,5a + 0,5b + (0,5)(0,5)ab (2) 2484,7 = 0,3a + 0,7b + (0,3)(0,7)ab (3) 3038,4 = 0,04a + 0,96b + (0,04)(0,96)ab

Dari (1) dan (2) 2141,9 = 0,5a + 0,5b + 0,25ab 2484,7 = 0,3a + 0,7b + 0,21ab ( x3) ( x5) 6425,7 = 1,5a + 1,5b + 0,75ab 12423,5 = 1,5a + 3,5b + 1,05ab -5997,8 = -2b 0,3ab..................(4) Dari (1) dan (3) 2141,9 = 0,5a + 0,5b + 0,25ab ( x0,4) 856,76 = 0,2a + 0,2b + 0,1ab 15192 = 0,2a + 4,8b + 0,192ab -14335,2 = -4,6b 0,092ab...........(5)

3038,4 = 0,04a + 0,96b + 0,0384ab ( x5)

Dari (4) dan (5) 5997,8 = 2b + 0,3ab 14335,2 = 4,6b + 0,092ab ( x2,3) ( x1) 13794,94 = 4,6b + 0,69ab 14335,24 = 4,6b + 0,092ab -540,3 = 0,598ab ab = -903,51

Dari (4) 5997,8 = 2b + 0,3ab 5997,8 = 2b + 0,3 x (-903,51) 5997,8 = 2b 271,05

2b = 5997,8 + 271,05 = 6268,85 b = 3134,43

Dari (1) 2141,9 = 0,5a + 0,5(3134,43) + 0,25(-903,51) 2141,9 = 0,5a + 1567,21 225,88 0,5a = 2141,9 1567,21 + 225,88 = 800,57 a = 1601,14 Persamaan SLD : Y = 1601,14a + 3134,43b 903,51ab Fraksi air (A) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Fraksi etanol (B) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 (A)(B) 0 0,09 0,16 0,21 0,24 0,25 0,24 0,21 0,16 0,09 0 Luas area 1601,14 1835,78 2052,36 2250,86 2431,30 2593,66 2737,96 2864,18 2972,33 3062,42 3134,43

3300 3100 2900 Luas area 2700 2500 2300 2100 1900 1700 1500 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Fraksi etanol

Rendemen ekstrak Perkolasi: Ekstrak cair Rendemen = x x 100%

= 10 % v/b Ekstrak kental Berat wadah = 73,91 g Berat wadah + ekstrak = 78,48 g Berat simplisia = 100 g Rendemen = = 5,14 % b/b x x 100%

Penetapan kadar androgafolid dengan KLT Profil kromatogram:

No 1 2 3 4 5 6 7

Sampel Standar 4g Standar 8g Standar 12g Standar 16g Sisa purifikasi Ekstrak terpurifikasi Perkolat

Rf 0,58 0,55 0,54 0,55 0,57 0,58 0,63

Luas area 15932,3 27435,5 34947,4 38047,3 64324,9 8768,6 66050,2

Kurva kalibrasi androgafolid: No 1 2 3 4 Jumlah androgafolid (g) 4 8 12 16 Luas area 15932,3 27435,5 34947,4 38047,3 (reject)

40000 35000 30000 Luas area 25000 20000 15000 10000 5000 0 0 2 4 6 8 10 Jumlah androgafolid (g) 12 14

y = 2376.9x + 7090 R = 0.9855

Kadar androgafolid dalam ekstrak: No 1 2 3 Jenis ekstrak Ampas sisa purifikasi Ekstrak terpurifikasi Perkolat Luas area 64324,9 8768,6 66050,2 Jumlah androgafolid (g) 24,080 0,706 24,805

- Ampas sisa purifikasi Kadar androgafolid = ( x x ) % b/b

= 4,816 % b/b

- Ekstrak terpurifikasi Kadar androgafolid = ( x x ) % b/b

= 0,111 % b/b - Perkolat Kadar androgafolid = ( x x ) % b/b

= 4,961 % b/b

PEMBAHASAN Optimasi komposisi penyari dengan metode SLD

Metode optimasi dengan

Simplex Lattice Design (SLD)

ini bertujuan untuk

menentukan komposisi penyari etanol-air yang optimal untuk mengekstraksi senyawa andrografolid dari simplisia daun sambiloto (Andrographis paniculata). Andrografolid

adalah senyawa diterpen lakton dan merupakan kandungan kimia utama dalam tanaman sambiloto (Fujita dkk, 1984). Pada fraksi etil asetat dari ekstrak metanol herba sambiloto juga ditemukan senyawa sejenis yaitu 14-epi-andrografolida dan isoandrografolida (Matsuda dkk, 1994). Persamaan SLD ditentukan dengan mengukur kadar andrografolid yang tersari pada 4 variasi komposisi penyari etanol air yaitu: air, etanol 50%, etanol 70% dan etanol 96%. Untuk menghitung kadar andrografolid pada ekstrak etanol-air, androgafolid standar dengan 3 variasi jumlah androgafolid yaitu 4, 8, dan 12 g dielusi dengan fase diam silika gel F254 dan fase gerak kloroform:metanol (9:1 v/v) bersama ekstrak serta dikuantifikasi bercaknya secara densitometri pada panjang gelombang 254 nm. Persamaan regresi linear antara jumlah androgafolid dalam g (sumbu-x) dan luas bercak (sumbu-y) adalah y = 2047,8x + 3084,6 dengan nilai koefisien determinasi (R2) sebesar 0,9992. Dari hasil perhitungan jumlah andrografolid pada ekstrak menggunakan kurva kalibrasi androgafolid, diperoleh nilai yang negatif untuk keseluruhan ekstrak sehingga tidak digunakan untuk perhitungan SLD. Hasil yang negatif diperoleh karena perhitungan dilakukan secara ekstrapolasi dari kurva kalibrasi. Peubah y pada persamaan SLD menggunakan luas area kromatogram dan persamaan dibuat menggunakan data ekstrak etanol 50%, 70% dan 96% karena pada ekstrak air tidak ditemukan peak dalam kromatogram. Persamaan SLD yang diperoleh adalah Y = 1601,14a + 3134,43b 903,51ab dengan luas area maksimum pada etanol-air (100:0) atau etanol 100%. Berdasarkan persamaan SLD yang diperoleh, penyari yang optimal untuk mengekstraksi androgafolid dari simplisia adalah etanol 96% (etanol dan air membentuk campuran yang tidak dapat dipisahkan pada kadar 96%).

Perkolasi Secara umum, perkolasi dinyatakan sebagai proses dimana simplisia diekstraksi dengan pelarut yang sesuai dengan cara melewatkan penyari perlahan-lahan melewati simplisia yang dimampatkan dalam perkolator. Kelebihan proses ini adalah penyari baru secara terus-menerus dialirkan pada simplisia sehingga tidak tercapai kondisi jenuh dan zat aktif dalam simplisia akan terus bergerak menuju penyari akibat adanya gradien konsentrasi.

Penyari yang digunakan untuk perkolasi simplisia daun sambiloto adalah etanol 96% yang merupakan pelarut dengan komposisi optimal untuk mengekstraksi senyawa androgafolid. Dari proses perkolasi diperoleh dua jenis ekstrak yaitu ekstrak cair dengan jumlah rendemen 10% v/b dan ekstrak kental dengan rendemen sebesar 5,14%. Dengan demikian masih terdapat kandungan penyari hampir 50% pada ekstrak cair yang diperoleh.

Kuantifikasi kadar andrografolid dengan metode KLT Ekstrak yang dikuantifikasi kadar andrografolidnya dengan metode KLT adalah perkolat, ekstrak terpurifikasi dan sisa purifikasi maserat sambiloto. Sistem KLT yang digunakan terdiri atas fase diam silika gel F254 dan fase gerak kloroform:metanol (9:1) v/v serta densitometri untuk kuantifikasi luas bercak pada panjang gelombang 230 nm. Untuk penentuan kadar, dibuat kurva kalibrasi andrografolid dengan andrografolid standar 4, 8 dan 12 g. Persamaan kurva kalibrasi yang diperoleh adalah y = 2376,9x + 7090 dengan nilai koefisien determinasi (R2) sebesar 0,9855. Kadar andrografolid pada perkolat sambiloto diperoleh sebesar 4,961% b/b. Sementara ini, ekstrak terpurifikasi dan sisa purifikasinya masing-masing mengandung androgafolid sebesar 0,111% b/b dan 4,816% b/b. Ekstrak yang dipurifikasi dengan pelarut heksana justru memiliki kandungan andrografolid yang jauh lebih kecil dibanding sisa purifikasinya. Hal ini menunjukkan bahwa heksana tidak cukup baik untuk mengekstraksi andrografolid dari ekstrak etanolik. Dari kandungan andrografolid sisa purifikasi maserat juga terlihat maserat dan perkolat etanolik memiliki kandungan androgafolid yang hampir sama.