Anda di halaman 1dari 33

PUSTAKA

B.R. Glick & J.J. Pasternak.2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA 3RD Edition, ASM Press.
5/6/12

Brown,T.A.1995.Gene Cloning: An Introduction. Chapman Hall, London.

Bollag, D.M.1996.Protein Methods.John Willey&Sons, New York.

O.Kayser, R.H. Muller. 2003. Phamaceutical Biotechnology: Drug Discovery and Clinical

Vektor (kloning, ekspresi, shuttle)


Click Indrayati Ana to edit Master subtitle style

5/6/12

Vektor kloning

Molekul DNA, berfungsi sebagai kendaraan untuk membawa fragmen DNA ke dalam sel inang
5/6/12

Mendapatkan DNA Macam-macam vektor kloning:

BAKTERI: plasmid, bakteriofaga, kosmid, fasmid

YEAST: YAC (yeast artificial chromosome)

Plasmid sebagai vektor kloning

DNA untai ganda berbentuk sirkuler Ukuran relatif kecil mudah masuk ke dalam sel Gen marker: sekurang kurangnya mempunyai dua gen marker (plasmid, gen sisipan)
5/6/12

MCS: tempat pengenalan enzim restriksi untuk menyisipkan DNA

Ori: titik awak replikasi sehingga plasmid dapat bereplikasi di dalam sel inang

a. b. c.

Berbentuk linier Overhang T Produk PCR dengan enzim Tag polimerase-ujung A

5/6/12

Seleksi biru putih

Mengetahui apakah DNA sisipan ada di dalam


5/6/12

plasmid-sudah menyisip dengan benar

MCS terdapat gen lacZ yang mengkode enzim beta galaktosidase

Beta galaktosidase memecah laktosa (X-gal) menjadi glukosa dan galaktosa dihasilkan warna biru Jika DNA sisipan ada maka akan merusak gen lacZ sehingga beta galaktosidase tidak dihasilkan

X-gal tidak diuraikan- dihasilkan warna putih

Beberapa contoh vektor kloning


Nama pBR322 Tipe Plasmid Sel inang E. coli Keterangan

pUC8

Plasmid

E. coli

Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan umum Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Kloning cDNA Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle

pBluescript gt10 YEp24

Plasmid Bakteriofaga Plasmid

E. coli E. coli E. coli/ragi

5/6/12

Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan umum

Vektor ekspresi

Mendapatkan
5/6/12

protein

Kaset ekspresi

Komponen transkripsi: promotor, terminator

Komponen translasi: RBS, kodon start, kodon stop

Vektor shuttle
5/6/12

Mempunyai dua ori sehingga dapat bereplikasi di dalam dua sel inang yang berbeda

Pengaturan ekspresi gen


Click to edit Master subtitle style Ana Indrayati

5/6/12

Komponen transkripsi
5/6/12

Produk ekspresi gen:

tRNA, rRNA, mRNA Protein ( ribosom, RNA polimerase, enzim)

Mengapa ekspresi gen harus diatur?

Penggunaan energi efektif dan efisien Ekspresi gen dapat diatur, dihidupkan atau dimatikan-aliran listrik (turn on/turn off)

Transkripsi (prokariot) , prosesing RNA, tranlasi

5/6/12

Konstitutif vs indusibel

Enzim konstitutif:

Selalu diproduksi oleh sel tidak bergantung dengan kondisi lingkungan sekitar atau media dimana sel tersebut ditumbuhkan

Enzim glikolisis dan siklus TCA

Enzim indusible: dapat diinduksi dan diproduksi di dalam sel sebagai respon terhadap lingkungan sekitar, diproduksi hanya ketika diperlukan, waktu dan dalam sel tertentu

Beta galaktosidase

5/6/12

Induksi dan represi pada E. coli

Glukosa (monosakarida) sumber karbon utama: enzim


5/6/12

konstitutif

Gen-gen yang mengkode enzim pemecah laktosa turn off

Laktosa (disakarida): enzim-enzim pemecah laktosa diekspresikan

Gen-gen yang mengkode enzim pemecah laktosa turn on

INDUKSI: Ekspresi gen terjadi karena faktor lingkungan

a.

Fase eksponensial pertumbuhan 1: glukosa digunakan sebagai sumber karbonSETELAH GLUKOSA HABIS Laktosa digunakan pada fase eksponensial pertumbuhan 2

b.

5/6/12

Induksi dan represi pada Salmonella typhimurium

Gen-gen yang mengkode enzim untuk biosintesis


5/6/12

triptofan

Medium tidak terdapat triptofan-turn on Medium terdapat triptofan-turn off

REPRESI: ekspresi gen tidak terjadi (turn off) karena respon terhadap lingkungan

KOREPRESOR: zat yang menyebabkan terjadinya represi

Triptofan sebagai KOREPRESOR

Mekanisme induksi dan represi

Model operon : F. Jacob dan J. Monod (1961) Operon: sekumpulan gen yang terletak antara promotor dan terminator
5/6/12

Gen-gen pada satu operon akan diekspresikan secara bersamaan- Promotor dan terminator sama

5/6/12

Gen regulator vs gen struktural

Gen regulator: gen yang produk ekspresinya mengatur ekspresi gen yang lain

gen lac-I: berhubungan dengan keberadaan laktosa gen crp: berhubungan dengan keberadaan glukosa

Gen struktural: gen yang ekspresinya diatur gen regulator

Operon Laktosa: gen lac Z, Lac Y, dan Lac A

5/6/12

Operon Lac
5/6/12

5/6/12

5/6/12

5/6/12

Penjelasan operon Lac


1.

Keadaan tidak ada Laktosa dalam sel


a.

Protein repressor (Protein I) tidak ada yang mengblok sisi aktifnya

b. c.

Protein represor berikatan dengan operator ( Lac O ) Gen Lac Z, Lac Y dan Lac A tidak dapat diekspresikan menjadi protein

2.

Bila di dalam sel dijumpai laktosa,


a.

Sisi aktif protein represor diisi oleh laktosa sehingga struktur protein represor berubah dan tidak cocok dengan operator Protein repressor menjadi inaktif

5/6/12

5/6/12

5/6/12

Regulasi operon Lac-Represi katabolit

Glukosa berlebih maka -galaktosidase dihentikan


5/6/12

sintesisnya

3 komponen: glukosa, cAMP (cyclic AMP), dan CAP (protein aktivator/ represor yang dikode oleh gen crp)

Glukosa menghambat sintesis cAMP melalui penghambatan aktivitas adenylate cyclase (AC)

Kompleks cAMP -CAP berperan sebagai aktivator untuk RNAp sehingga RNAp dapar berikatan pada promotorTRANSKRIPSI ON

Kuantitas cAMP di dalam sel berbanding terbalik

5/6/12

5/6/12

Komponen operon triptofan (trp)

O: Urutan nukleotida untuk operator- tempat


5/6/12

represor berikatan

P: Urutan nukleotida untuk promotor- tempat RNA polimerase berikatan untuk menginisiasi transkripsi

Trp A, B,C, D, E: Gen-gen struktural enzim yang terlibat pada biosintesis triptofan

Trp: Produk akhir dari biosintesis triptofan Ketika dikombinasikan dengan protein represor

Penjelasan operon Trp

Tidak ada trp

represor menjadi tidak aktif dan tidak dapat berikatan dengan operator trp untuk menghambat transkripsi

Sel dapat mensintesis asam amino.

Ada trp

Represor menjadi aktif dan berikatan dengan operator dan mencegah pengikatn RNA

5/6/12

5/6/12

Terima kasih
Click to edit Master subtitle style

5/6/12