INMUNOLOGA

de Kuby

Iconos usados en este libro

Pptido antignico Anticuerpo

Receptor de clula T CD3

CD4

MHC clase I

Citocina Receptor de citocina

CD8

MHC clase II

Timocito inmaduro

Clula TH

Clula TC

Clula T citotxica

Clula asesina natural

Clula B

Clula plasmtica

Clula estromtica de la mdula sea

Eritrocito

Plaquetas

Neutrfilo

Basfilo

Eosinfilo

Mastocito

Clula dendrtica MHC clase I

Monocito

Macrfago

Clula presentadora de antgeno MHC clase II

CD8 Clula TC Clula propia alterada Clula B

CD4 Clula TH

INMUNOLOGA
de Kuby
SEXTA EDICIN

Thomas J. Kindt
National Institutes of Health

Richard A. Goldsby
Amherst College

Barbara A. Osborne
University of Massachusetts at Amherst

Traduccin:

Roberto Palacios Martnez

Universidad Autnoma de Baja California

MXICO BOGOT BUENOS AIRES CARACAS GUATEMALA LISBOA MADRID NUEVA YORK SAN JUAN SANTIAGO SAO PAULO AUCKLAND LONDRES MILN MONTREAL NUEVA DELHI SAN FRANCISCO SINGAPUR ST. LOUIS SIDNEY TORONTO

Editor sponsor: Javier de Len Fraga Correccin de estilo: Roberto Palacios Martnez Supervisor de edicin: Camilo Heras Martnez Supervisora de produccin: ngela Salas Caada Composicin y formacin: Ediciones y Recursos Tecnolgicos, S.A. de C.V. Diseo de portada: Impulso Creativo Publicidad y Diseo, S.C.

NOTA
La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se requerirn cambios de la teraputica. El (los) autor(es) y los editores se han esforzado para que los cuadros de dosicacin medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la fecha de publicacin. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina, ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparacin de la obra garantizan que la informacin contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha informacin se obtengan. Convendra recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habr que consultar la hoja informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la informacin de esta obra es precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contraindicaciones para su administracin. Esto es de particular importancia con respecto a frmacos nuevos o de uso no frecuente. Tambin deber consultarse a los laboratorios para recabar informacin sobre los valores normales.

INMUNOLOGA de Kuby Prohibida la reproduccin total o parcial de esta obra, por cualquier medio, sin autorizacin escrita del editor.

DERECHOS RESERVADOS 2007, respecto a la segunda edicin en espaol por McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A. de C.V. A subsidiary of The McGraw-Hill Companies, Inc. Prolongacin Paseo de la Reforma 1015, Torre A, Piso 17, Col. Desarrollo Santa Fe, Delegacin lvaro Obregn C. P. 01376, Mxico, D. F. Miembro de la Cmara Nacional de la Industria Editorial Mexicana, Reg. nm. 736 ISBN 13: 978-970-10-6454-2 ISBN 10: 970-10-6454-2 Translated from the sixth english edition of Kuby Immunology Copyright 2007, 2003, 2000, 1997, 1994, 1992 by W.H. Freeman and Company. All Rights Reserved ISBN 13: 978-1-4292-0211-4 ISBN 10: 1-4292-0211-4 1234567890 Impreso en Mxico 09865432107 Printed in Mexico

Comit asesor para la revisin cientfica de la edicin en espaol

Dra. Alicia del Toro Arreola Doctora en Ciencias Biomdicas, Orientacin en Inmunologa, Centro Universitario de Ciencias de la Salud de la Universidad de Guadalajara. Dra. Susana del Toro Arreola Doctora en Ciencias de la Salud, Orientacin Biomdica, Centro Universitario de Ciencias de la Salud de la Universidad de Guadalajara. Profesor Investigador Titular C Centro Universitario de Ciencias de la Salud Universidad de Guadalajara. Dra. Trinidad Garca Iglesias Doctora en Inmunologa Centro Universitario en Ciencias de la Salud de la Universidad de Guadalajara. Profesora de Bioqumica en el Centro Universitario de Ciencias de la Salud de la Universidad de Guadalajara. Miembro de Bilogos Colegiados de Jalisco A.C. Dra. Cecilia Magdalena Guilln Vargas Doctora en Inmunologa y Profesora Investigadora Titular A de la Universidad de Guadalajara, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Departamento de Fisiologa. Dra. Ana Molina Ocaa Doctora en Ciencias Biolgicas Investigadora y Docente en la Seccin de Inmunopatologa Experimental e Inmunoqumica de Investigacin, Hospital Ramn y Cajal (Madrid). Investigadora y Docente en el Department of Nutritional Chemistry, School of Medicine, University of Tokushima (Japn). Investigadora y Docente en el rea de Inmunologa, Facultad de Biologa, Universidad de Vigo (Pontevedra). Miembro de la Sociedad Espaola de Inmunologa (SEI). Dr. Saturnino Muoz Martnez Doctor en Ciencias Biolgicas Investigador y Docente en la Seccin de Inmunopatologa Experimental e Inmunoqumica de Investigacin, Hospital Ramn y Cajal (Madrid). Investigador y Docente en el Department of Nutritional Chemistry, School of Medicine, University of Tokushima (Japn). Investigador y Docente en el rea de Inmunologa, Facultad de Biologa, Universidad de Vigo (Pontevedra). Miembro de la Sociedad Espaola de Inmunologa (SEI). Dr. Pedro Ernesto Snchez Hernndez Doctor en Ciencias Biomdicas con orientacin a inmunologa Centro Universitario de Ciencias de la Salud Centro Universitario de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara. Profesor de Inmunologa del Centro Universitario de Ciencias de la Salud de la Universidad de Guadalajara.

ACERCA DE LOS AUTORES

De izquierda a derecha: Richard A. Goldsby, Barbara A. Osborne y Thomas J. Kindt

Thomas J. Kindt es requerido con regularidad como consultor en temas de inmunologa y enfermedades infecciosas por organizaciones gubernamentales y privadas, y ha fungido por muchos aos como director de investigacin intramuros en el National Institute of Allergy and Infectious Diseases de los National Institutes of Health, un cargo que lo mantiene en contacto diario con la vanguardia de la inmunologa clnica y experimental. Es profesor adjunto en el Departamento de Biologa de la University of New Mexico y pertenece a la Regional Association of Medical and Biological Organizations con sede en New Mexico.

Richard A. Goldsby ensea inmunologa a estudiantes de licenciatura y posgrado

en el Amherst College. Sus intereses en la investigacin incluyen tecnologas para generar anticuerpos humanos y sometidos a ingeniera gentica en biorreactores animales. En muchas ocasiones ha sido director de curso en el Chautauqua Short Course Program de la National Science Foundation, donde presenta los avances vigentes en la inmunologa a profesores universitarios.

Barbara A. Osborne, de la University of Massachusetts at Amherst, es una contribuyente reconocida en las reas rpidamente cambiantes de muerte celular programada y desarrollo de reacciones de clulas T. Investigadora muy activa, Barbara tambin imparte cursos de inmunologa a estudiantes de licenciatura y posgrado. Janis Kuby, quien muri en 1997, ense en la San Francisco State University y en la University of California at Berkeley. La profesora Kuby fue quien inici este libro y es autora de las primeras tres ediciones. Su enseanza experta y sus habilidades para la escritura hicieron de Inmunologa el texto ms vendido para el curso; su visin de la obra como una forma de combinar el contenido actualizado con un formato accesible y pedaggicamente rico persiste en la nueva edicin.

A nuestros muchos alumnos, compaeros y colegas que han hecho de nuestras carreras en inmunologa un tiempo de continua emocin y alegra. Esperamos que las generaciones futuras de inmunlogos encuentren el tema tan satisfactorio como nosotros.

Prefacio

n la segunda edicin de Inmunologa, Janis Kuby escribi: ...el crecimiento continuo de la inmunologa es inevitable y desafa tanto a la comunidad mdica como a la acadmica para mantenerse actualizada. Nuestro objetivo con cada nueva edicin de Inmunologa es presentar el conocimiento a una nueva generacin de cientficos y profesionales mdicos. Debemos dar a quienes se aproximan por primera vez al tema un panorama amplio del campo de la inmunologa. Tenemos que mantenernos actualizados. Y debemos adems introducir los experimentos y modelar los sistemas sobre los cuales se ha construido nuestro conocimiento del sistema inmunitario.

Clulas, molculas antimicrobianas solubles y receptores unidos a membrana colaboran para montar un ataque instantneo contra los agentes infecciosos. El sistema inmunitario acta no slo como primera lnea de defensa, sino tambin como un activador esencial para el sistema inmunitario adaptativo. Los defectos en los componentes del sistema inmunitario innato a menudo dan por resultado reacciones dbiles o inadecuadas del sistema inmunitario adaptativo.

Nuevo captulo 3: Inmunidad innata

Los medios por los cuales se dedujeron los mecanismos del sistema inmunitario innato y el rpido avance en el conocimiento sobre esta rama de la inmunidad se encuentran entre los desarrollos ms impactantes en inmunologa desde la edicin anterior de este libro. El nuevo captulo 3, Inmunidad innata, explora el modo en que Las actividades de efectores inmunitarios como los receptores de reconocimiento de patrn se integran en la inmunorreaccin innata.

Hincapi en la pertinencia clnica

Una inmunorreaccin deficiente o excesiva puede tener consecuencias nefastas. Es fundamental que quienes estn interesados en seguir carreras mdicas comprendan el funcionamiento de este sistema. En todo el libro se cubre una amplia gama de enfermedades e infecciones nuevas, y se actualizan los ensayos Enfoque clnico y sus correspondientes Preguntas de estudio al final del captulo. En esta edicin se incorporan: Explicacin de la presentacin cruzada en lo que se refiere a inmunidad a virus y otros agentes infecciosos (cap. 8).

Clula bacteriana (E. coli)

Organizacin de la pared celular Lipopolisacrido (endotoxina)

Membrana externa Peptidoglucano Membrana interna

FIGURA 3-9 Lipopolisacrido (LPS) en la pared celular de E. coli. El LPS es un potente estmulo
de la inmunidad innata. [Micrografa de Gary Gaugler/Visuals Unlimited.]

P R E FAC I O

ix

Una exposicin ms amplia de las citocinas y su cometido en inflamacin y enfermedad (cap. 12 en adelante). ltimos descubrimientos sobre la diversidad de receptores de clula NK y el modo en que su variabilidad gentica influye en la susceptibilidad a enfermedades (cap. 14). Nuevo ensayo Enfoque clnico sobre la influencia de KIR/MHC en la enfermedad (cap. 14). Nueva cobertura de la tolerancia central y perifrica y el modo en que se relacionan con enfermedad autoinmunitaria y rechazo de aloinjertos (cap. 16). Nuevas exposiciones sobre mtodos para aliviar el sufrimiento causado por diversos trastornos de autoinmunidad como esclerosis mltiple, lupus eritematoso y enfermedad de Crohn (cap. 16). Cobertura del uso clnico creciente de los anticuerpos monoclonales como agentes teraputicos (caps. 4, 5, 6, 16, 17 y otros). Mayor cobertura de enfermedades infecciosas, incluyendo descripciones de grupos de patgenos importantes y las inmunorreacciones caractersticas que provocan; material actualizado sobre gripe, incluidas las cepas aviares y las amenazas que representan para las poblaciones humanas; y por qu las enfermedades micticas han aumentado en grado significativo debido a la propagacin del SIDA y al aumento de la cantidad de personas que toman medicamentos contra enfermedades autoinmunitarias (cap. 18). Cobertura del SARS, incluidos el descubrimiento y la determinacin del modo en que salt de los animales al ser humano (caps. 18 y 19). Nuevos datos sobre consecuencias del SIDA (cap. 20). Informe sobre la relacin entre el virus del papiloma humano (HPV) y el cncer cervicouterino, los ensayos de vacunas para su prevencin, y un nuevo Enfoque clnico donde se examinan ms a fondo estos descubrimientos (cap. 21).

Mayor cobertura del receptor de clula T , incluida una imagen tridimensional reciente que revela diferencias en el modo en que los receptores de clula T y se unen a antgeno (caps. 9 y 10).

Nuevas tcnicas
Las siguientes exposiciones de tcnicas modernas importantes han producido fascinantes conocimientos nuevos en el campo de la inmunologa: Descripcin de la tcnica de resonancia de plasmones superficiales y su aplicacin a interrogantes bsicas en inmunologa (cap. 6). Uso de tetrmeros antgeno-MHC marcados para etiquetar receptores de clula T unidos a membrana (cap. 14). Ilustracin del poder de la microscopia bifotnica para seguir el recorrido de clulas en un ganglio linftico (caps. 11 y 22).

Organizacin actualizada
Tras consultar con numerosos profesores de inmunologa, en la sexta edicin se realizaron los siguientes cambios de organizacin para mejorar la secuencia de exposicin y evitar redundancias: Se combinaron los captulos sobre anticuerpo y antgeno (cap. 4). El captulo acerca del complemento se adelant, para situarlo inmediatamente despus de los captulos sobre anticuerpo (cap. 7). Se combinaron los captulos de MHC y presentacin de antgeno (cap. 8).

Herramientas pedaggicas
Figuras para visualizacin de conceptos
Varios conceptos son especialmente cruciales para que los estudiantes establezcan conocimientos firmes de inmunologa. En este libro se emplean imgenes diseadas de manera especfica con este fin, para ayudar a los estudiantes a dominar el material. Los conceptos principales se ilustran en figuras para visualizacin de conceptos. Estas figuras resumen ideas y procesos importantes de tal manera que un texto escrito no puede lograr por s solo; a menudo se disponen como diagramas de recorrido, que incluyen leyendas ms extensas y sistemticas que ayudan a visualizar procesos clave. Se hace uso consistente de iconos, los cuales representan diversas clulas del sistema inmunitario y molculas de membrana importantes, para ayudar a los estudiantes a visualizar relaciones complejas. Estos iconos aparecen al principio del libro en un cuadro, que constituye una gua accesible.

Mayor cobertura sobre sealizacin

En los ltimos pocos aos ha habido un gran avance en el conocimiento sobre los procesos que ocurren despus de que los receptores se unen a sus ligandos. Ahora se dedica una seccin a presentar el tema general de la transduccin de seales, donde se resume el patrn general de sealizacin y se nombran algunos de los componentes clave ms universales. Por ejemplo, se incluyen Una nueva seccin donde se describe la transduccin de seales que sigue a la unin de los receptores tipo Toll con sus ligandos (cap. 3). Mayor cobertura de las interacciones moleculares implicadas en la migracin y la extravasacin celulares (caps. 3 y 13). Nuevos detalles sobre las vas de sealizacin que llevan a maduracin, diferenciacin y activacin de diversos tipos celulares (caps. 10 y 11).

PREFAC I O

FIGURA 1-6 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

Temas comunes

en la transduccin de seales
Recepcin de la seal 1 Las vas de sealizacin se inician cuando una seal se une a su receptor Receptor en la superficie celular Seal unida a membrana Ligando hidrosoluble Ligando soluble en membrana

Receptor intracelular

Transduccin 2 La unin del ligando al receptor induce el ensamblaje de componentes de la va de sealizacin Generacin mediada por seal del sitio de unin La protena adaptadora se une Se unen una o ms protenas adicionales

3 La generacin de segundo mensajero lleva la seal al interior de la clula

Sustrato (inactivo) 4 Los ciclos de fosforilacin/ desfosforilacin bajo control de la va de sealizacin activan/ desactivan componentes adicionales de la va Cinasa P

P Segundo mensajero

Activacin de componentes de la va

Inactiva

ATP

ADP

Activa

P Fosfatasa 5 Cascadas enzimticas amplifican la seal, convirtiendo molculas a sus formas activas P Pueden ocurrir cientos o miles de reacciones en cada nivel

Efectores metablicos

P R E FAC I O

xi

Preguntas de estudio
Ideadas por Janis Kuby, las Preguntas de estudio de Inmunologa han demostrado ser un valioso recurso para instructores y estudiantes por igual. En todos los captulos de la sexta edicin se presentan preguntas nuevas y revisadas, incluida una serie totalmente nueva titulada Analice los datos, donde se utilizan bibliografa moderna y datos cuantitativos, y se desafa a los estudiantes a extrapolar informacin con las herramientas adquiridas en el estudio del texto. Las preguntas se complementan con respuestas ampliadas y actualizadas como material de respaldo al final del libro.

Reconocimientos
Debemos un agradecimiento especial a varios colegas que ayudaron a realizar complejas revisiones y que realizaron lecturas detalladas, todo lo cual desemboc en grandes mejoras al texto. Entre estos notables contribuyentes se incluyen los doctores J. Donald Capra y Kendra White de la Oklahoma Medical Research Foundation, la doctora JoAnn Meerschaert de la Saint Cloud State University, el doctor Jiri Mestecky de la University of Alabama at Birmingham, el doctor Jonathan Yewdell de NIAID, NIH, el doctor James Kindt de la Emory University, la doctora Johnna Wesley de la Brown University, y el doctor Eric Long de NIAID, NIH. Esperamos que el producto final refleje la alta calidad de lo aportado por estos expertos y por todos aquellos que se enumeran ms adelante, que proporcionaron ideas crticas y orientacin. Tambin deseamos expresar nuestra gratitud y aprecio a la doctora JoAnn Meerschaert de la Saint Cloud State University por haber escrito excelentes problemas nuevos, y al doctor Stephen K. Chapes, de la Kansas State University, por crear las preguntas de la seccin Analice los datos. Agradecemos a los siguientes revisores sus comentarios y sugerencias acerca del manuscrito durante la elaboracin de esta sexta edicin. Su maestra y su agudeza contribuyeron enormemente a este libro. Ruth D. Allen, Indiana University-Purdue University Indianapolis Avery August, The Pennsylvaia State University Pamela J. Baker, Bates College Kenneth J. Balazovich, University of Michigan Cynthia L. Baldwin, University of Massachusetts Amherst Scott R. Barnum, University of Alabama, Birmingham Stephen H. Benedict, University of Kansas Earl F. Bloch, College of Medicine Howard University Lisa Borghesi, University of Pittsburgh Lauren Brossay, Brown University Jane Bruner, California State University, Stanislaus James W. Campbell, Rice University Stephen Keith Chapes, Kansas State University Koteswara R. Chintalacharuvu, UCLA Jefrey R. Dawson, Duke University, School of Medicine Janet M. Decker, University of Arizona

Michael Edidin, The Johns Hopkins University Sherry D. Fleming, Kansas State University Scott C. Garman, University of Massachusetts, Amherst Elizabeth Godrick, Boston University Sandra O. Gollnick, Roswell Park Cancer Institute Hans W. Heidner, The University of Texas at San Antonio Vincent W. Hollis, Jr., Howard University W. Martin Kast, University of Southern California Dennis J. Kitz, Southern Illinois University, Edwardsville Katherine L. Knight, Loyola University Paul M. Knopf, Brown University Kay K. Lee-Fruman, California State University, Long Beach Alan D. Levine, Case Western Reserve University Judith Manning, University of Wisconsin School of Medicine James A. Marsh, Cornell University College of Veterinary Medicine John Martinko, Southern Illinois University Carbondale Andrea M. Mastro, The Pennsylvania State University Jennifer M. Mataraza, Boston College Dennis W. McGee, Binghamton University JoAnn Meerschaert, Saint Cloud State University Jiri Mestecky, University of Alabama, Birmingham Michael F. Minnick, University of Montana Thomas W. Molitor, University of Minnesota, College of Veterinary Medicine David M. Mosser, University of Maryland Rita B. Moyes, Texas A&M University Philip C. Nelson, University of Pennsylvania Alma Moon Novotny, Rice University Kim ONeill, Brigham Young University Luke ONeill, Trinity College, Dublin, Ireland Leonard D. Pearson, Colorado State University Christopher A. Pennel, University of Minnesota Wendy R. Raymond, Williams College Robert C. Rickert, University of California, San Diego Kenneth H. Roux, Florida State University Abhineet Sheoran, Tufts Cummings School of Veterinary Medicine Michail Sitkovsky, Northeastern University Robert C. Sizemore, Alcorn State University Gary Splitter, University of Wisconsin, Madison Douglas A. Steeber, University of Wisconsin, Milwaukee Lisa Steiner, Massachusetts Institute of Technology Jeffrey L. Stott, University of California, Davis School of Veterinary Medicine Denise G. Wingett, Boise State University Jon Yewdell, NIH-NIAID Kirk Ziegler, Emory University School of Medicine Asimismo, deseamos dar las gracias a nuestros experimentados y talentosos colegas de W. H. Freeman and Company. Nuestro agradecimiento en especial a Kate Ahr, Georgia Lee Hadler, Karen Taschek, Vicki Tomaselli, Paul Rohloff, Susan Timmins, Ted Szczepanski, Hannah Thonet y Nick Tymoczko. La ejecucin de este trabajo no habra sido posible sin la frrea determinacin de nuestro editor de desarrollo, Morgan Ryan, quien nos ayud a ilustrar la historia de la inmunologa.

Contenido resumido Prefacio

PARTE I

Introduccin
1 2 3 Panorama general del sistema inmunitario Clulas y rganos del sistema inmunitario Inmunidad innata 1 23 52

PARTE II

Respuestas de las clulas B y T

4 5 6 7 8 9 10 11 Antgenos y anticuerpos Organizacin y expresin de los genes de inmunoglobulina Interacciones antgeno-anticuerpo: principios y aplicaciones Sistema del complemento Complejo mayor de histocompatibilidad y presentacin de antgeno Receptor de clula T Maduracin, activacin y diferenciacin de la clula T Generacin, activacin y diferenciacin de la clula B 76 111 145 168 189 223 245 271

PARTE III

Mecanismos inmunoefectores
12 13 14 15 16 Citocinas Activacin y migracin de leucocitos Reacciones citotxicas mediadas por clulas Reacciones de hipersensibilidad Tolerancia y autoinmunidad 302 327 351 371 401

PARTE IV

El sistema inmunolgico en la salud y la enfermedad

17 18 19 20 21 22 Inmunologa de los trasplantes Inmunorreaccin a las enfermedades infecciosas Vacunas SIDA y otras inmunodeciencias Cncer y sistema inmunitario Sistemas experimentales 425 447 475 493 525 546 A-1 A-27 G-1 R-1 I-1

Apndice I: Antgenos CD Apndice II: Citocinas Glosario Respuestas a las preguntas de estudio ndice alfabtico

Contenido

Prefacio

viii

PARTE I
1

Introduccin

En la hemostasia hematopoytica intervienen muchos factores La muerte celular programada es un mecanismo homeosttico esencial Las clulas madre hematopoyticas pueden enriquecerse

26 26 28

Clulas del sistema inmunitario

30
30 32 34 34 35 35 36 36 37 38 38 40

Panorama general del sistema inmunitario

Clulas linfoides

1
2
2 3

ENFOQUE CLNICO CLULAS MADRE: USOS CLNICOS Y POTENCIAL Linfocitos B (clulas B) Linfocitos T (clulas T) Las poblaciones de clulas B y T comprenden subpoblaciones de clonas Clulas asesinas naturales Fagocitos mononucleares La fagocitosis es seguida de la digestin y presentacin de antgeno Clulas granulocticas Clulas cebadas Clulas dendrticas Clulas dendrticas foliculares

Perspectiva histrica
Los estudios pioneros sobre la vacunacin abrieron el campo para la inmunologa La vacunacin es una tarea continua a nivel mundial

Primeros estudios sobre inmunidad humoral y celular Desafos tericos Infeccin e inmunidad Inmunidad innata y adaptativa
Las clulas fagocticas constituyen una barrera contra las infecciones Algunas molculas solubles contribuyen a la inmunidad innata La colaboracin entre la inmunidad innata y la adaptativa incrementa la inmunorreactividad La inmunidad adaptativa es altamente especca Linfocitos y clulas presentadoras de antgeno cooperan en la inmunidad adaptativa Las clulas presentadoras de antgeno interactan con clulas T Las inmunorreacciones humoral y celular tienen distintas funciones efectoras Los receptores de antgeno de los linfocitos B y T son diversos Las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad unen pptidos antignicos La seleccin de antgeno por los linfocitos causa expansin clonal

4 5 7 8
9 9 9 10 12 14 14 14 16 16

rganos del sistema inmunitario

rganos linfoides primarios rganos linfoides secundarios

40
40 43

Clulas y rganos linfoides: comparaciones evolutivas

49

Inmunidad innata

52
53 55 57
59

Barreras anatmicas Conexiones entre la inmunidad innata y la adaptativa Inamacin

La extravasacin leucocitaria es un proceso altamente regulado de mltiples pasos

Disfuncin inmunitaria y sus consecuencias

ENFOQUE CLNICO ALERGIA Y ASMA COMO PROBLEMAS GRAVES
DE SALUD PBLICA

18
20

Molculas solubles y receptores relacionados con membrana

Los pptidos antimicrobianos contribuyen a la defensa innata contra bacterias y hongos Las protenas de la reaccin de fase aguda contribuyen a la inmunidad innata La inmunidad innata utiliza diversos receptores para detectar infeccin

59
59 61 61

Clulas y rganos del sistema inmunitario

23
23
24

Hematopoyesis
La hematopoyesis se regula a nivel gentico

xiii

xiv

CO N T E N I D O

Receptores tipo Toll Tipos celulares de inmunidad innata

Los neutrlos se especializan en fagocitosis y matanza ENFOQUE CLNICO LA PROTENA C REACTIVA ES UN MARCADOR
CLAVE DE RIESGO CARDIOVASCULAR

62 65
65 66 66

La citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpo (ADCC) destruye otras clulas Algunos anticuerpos pueden cruzar capas epiteliales por transcitosis

95 95

Clases de anticuerpos y actividades biolgicas

Inmunoglobulina G (IgG) Inmunoglobulina M (IgM) ENFOQUE CLNICO TERAPUTICA PASIVA CON ANTICUERPO Inmunoglobulina A (IgA) Inmunoglobulina E (IgE) Inmunoglobulina D (IgD)

95
95 96 98 99 100 100

Los macrfagos despliegan varios recursos contra los patgenos Las clulas NK son una importante primera lnea de defensa contra los virus y constituyen una seal de activacin clave para otras clulas Las clulas dendrticas atacan patgenos e invocan inmunorreacciones adaptativas al activar clulas T

68 68

Determinantes antignicos en inmunoglobulinas

Isotipo Alotipo Idiotipo

100
101 101 101

Vas de transduccin de seales

La sealizacin por TLR es tpica de las vas de transduccin de seales

69
69

Ubicuidad de la inmunidad innata

71

Receptor de clula B
Los receptores Fc se enlazan con regiones Fc de anticuerpos

102
102

PARTE II Respuestas de las clulas B y T

4 Antgenos y anticuerpos 76
77
77 78 80

Superfamilia de las inmunoglobulinas Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales tienen usos clnicos importantes Las abzimas son anticuerpos monoclonales que catalizan reacciones

103 105
106 106

Inmunogenicidad y antigenicidad
Los haptenos son valiosos instrumentos de investigacin y diagnstico Las propiedades del inmungeno contribuyen a la inmunogenicidad El sistema biolgico contribuye a la inmunogenicidad

Organizacin y expresin de los genes de inmunoglobulina

111

Diseo de un modelo gentico compatible con la estructura de la inmunoglobulina

Modelos de lnea germinal y de variacin somtica propuestos para explicar la diversidad de anticuerpos Dreyer y Bennett propusieron un revolucionario modelo de dos genes-un polipptido La bomba de Tonegawa: los genes de la inmunoglobulina se reordenan

112
113 113 114

Eptopos
Los eptopos de clulas B tienen propiedades caractersticas

81
81

Estructura bsica y funcin de los anticuerpos

Los anticuerpos son heterodmeros Mtodos qumicos y enzimticos revelaron la estructura bsica del anticuerpo La determinacin de las secuencias de la cadena ligera revel regiones constantes y variables Existen cinco clases principales de cadenas pesadas Las inmunoglobulinas poseen mltiples dominios con base en el plegamiento de la inmunoglobulina

84
85 85 87 87 87

Organizacin multignica de genes de inmunoglobulina

Cada familia multignica tiene caractersticas distintas Familia multignica de la cadena pesada

115
115 115

Reordenamientos gnicos de regin variable

El DNA de la cadena ligera experimenta reordenamientos VJ El DNA de cadena pesada experimenta reordenamientos VDJ

116
117 118

Sitio de unin de anticuerpos

Las CDR unen antgeno La unin de antgeno puede inducir cambios conformacionales Dominios de regin constante

89
90 92 93

Mecanismo de los reordenamientos de DNA de regin variable

Secuencias seal dirigen la recombinacin Los segmentos gnicos se unen mediante recombinasas Los reordenamientos del gen de inmunoglobulina (Ig) pueden ser productivos o improductivos

119
119 119 121

Funciones efectoras mediadas por anticuerpo

El anticuerpo promueve la opsonizacin Los anticuerpos activan el complemento

94
94 95

CONTE N ID O

xv
149 149
150

La exclusin allica asegura la especicidad antignica nica

Reactividad cruzada
121

Resonancia de plasmones superciales

La SPR puede usarse para caracterizar las especicidades de eptopo de grupos de anticuerpos

Generacin de diversidad de anticuerpos

Existen numerosos segmentos gnicos V, D y J de la lnea germinal La unin combinatoria VJ y VDJ genera diversidad La exibilidad de unin contribuye a la diversidad La adicin P aade diversidad a secuencias palindrmicas La adicin N promueve una considerable diversidad por la agregacin de nucletidos La hipermutacin somtica agrega diversidad en segmentos gnicos ya reordenados Un origen ltimo de la diversidad es la asociacin combinatoria de cadenas pesada y ligera La diversicacin de los genes de inmunoglobulina diere entre las especies

123
123 123 123 125 125 125 127 127

Reacciones de precipitacin
Las reacciones de precipitacin en gel producen lneas de precipitina visibles La inmunoelectroforesis combina electroforesis e inmunodifusin doble

151
151 152

Reacciones de aglutinacin
La hemaglutinacin se utiliza en la tipicacin sangunea La aglutinacin bacteriana se emplea para diagnosticar infecciones La aglutinacin pasiva es til con antgenos solubles En la inhibicin de la aglutinacin, la ausencia de aglutinacin es diagnstica de antgeno

153
153 154 154 154

Cambio de clase entre genes de la regin constante

La desaminasa de citidina inducida por activacin (AID) media tanto la hipermutacin somtica como el cambio de clase

128

Radioinmunoensayo
128

154 155
155

Ensayo de inmunosorbente ligado a enzima

Existen mltiples variantes de ELISA

Expresin de genes de inmunoglobulina

Los transcritos primarios de cadena pesada experimentan procesamiento diferencial del RNA

130
130

Western blotting Inmunoprecipitacin

158 158 160 161 162

163

Sntesis, ensamblaje y secrecin de inmunoglobulinas Regulacin de la transcripcin de genes de inmunoglobulina

El reordenamiento del DNA acelera en gran medida la transcripcin En las clulas T est inhibida la expresin de los genes de inmunoglobulina

133 133
135 135

Inmunouorescencia Citometra de ujo y uorescencia Alternativas a las reacciones antgeno-anticuerpo

ENFOQUE CLNICO CITOMETRA DE FLUJO Y TIPIFICACIN DE
LEUCEMIAS

Genes de anticuerpos e ingeniera de anticuerpos

Los anticuerpos monoclonales quimricos y humanizados poseen un gran potencial clnico Se han creado ratones con loci de inmunoglobulina humana Las bibliotecas de exhibicin en fago permiten producir anticuerpos monoclonales sin necesidad de inmunizacin ENFOQUE CLNICO TERAPUTICA DEL LINFOMA NO HODGKIN
Y OTRAS ENFERMEDADES MEDIANTE ANTICUERPOS ELABORADOS POR INGENIERA GENTICA

136
136 137

Microscopia inmunoelectrnica

164

Sistema del complemento

168
168 169 169
170 173 175 175

Funciones del complemento Componentes del complemento Activacin del complemento

La va clsica se inicia con la unin de antgeno y anticuerpo La va alterna es independiente de anticuerpo La va de lectina se inicia con la unin de protenas del hospedador a supercies microbianas Las tres vas del complemento convergen en el complejo de ataque a membrana

137

140

Interacciones antgenoanticuerpo: principios y aplicaciones

145
145
145 148

Regulacin del sistema del complemento Consecuencias biolgicas de la activacin del complemento

177 180

Potencia de las interacciones antgeno-anticuerpo

La anidad de anticuerpo es una medida cuantitativa de la fuerza de la unin La avidez del anticuerpo incorpora la anidad de mltiples sitios de unin

El complejo de ataque a membrana puede lisar una amplia gama de clulas 180 Los productos de escisin de componentes del complemento median la inamacin 182

xvi

CO N T E N I D O

ENFOQUE CLNICO HEMOGLOBINURIA PAROXSTICA NOCTURNA:

UN DEFECTO DE LA REGULACIN DE LA LISIS POR COMPLEMENTO

183 184 184 185

Pruebas de la existencia de diferentes vas de procesamiento y presentacin de antgeno Antgenos endgenos: va citoslica
Complejos de proteasa llamados proteasomas generan los pptidos para presentacin Los pptidos se transportan del citosol al retculo endoplsmico rugoso Los pptidos se ensamblan con MHC clase I auxiliados por carabinas moleculares ENFOQUE CLNICO LA DEFICIENCIA DE TRANSPORTADORES RELACIONADOS CON LA PRESENTACIN DE ANTGENO (TAP) CAUSA

209 210
211 211 212

La unin de C3b y C4b facilita la opsonizacin El sistema del complemento tambin neutraliza la infectividad vrica El sistema del complemento depura inmunocomplejos de la circulacin

Deciencias de complemento

185

Complejo mayor de histocompatibilidad y presentacin de antgeno

189
190
190 191 193

UNA DIVERSA GAMA DE ENFERMEDADES

213

Antgenos exgenos: va endoctica Organizacin general y herencia del MHC

El MHC codica tres clases de molculas principales Las formas allicas de los genes MHC se heredan en grupos unidos llamados haplotipos Las cepas endogmicas de ratn han sido de utilidad en el estudio del MHC Los pptidos se generan a partir de molculas internalizadas en vesculas endocticas La cadena invariante gua el transporte de molculas MHC clase II a las vesculas endocticas Los pptidos se ensamblan con molculas MHC clase II por desplazamiento de CLIP

214
214 214 215

Molculas y genes MHC

Las molculas clase I tienen una cadena pesada de glucoprotena y una cadena ligera protenica pequea Las molculas clase II tienen dos cadenas glucoprotenicas distintas La disposicin de exones e intrones en los genes clase I y clase II reeja su estructura de dominio Las molculas clase I y clase II muestran polimorsmo en la regin que se une a pptidos Las molculas clase I y clase II muestran diversidad dentro de una especie, y se presentan mltiples formas de ellas en un individuo

193
193 195 196

Presentacin cruzada de antgenos exgenos Presentacin de antgenos no peptdicos

217 217

Receptor de clula T

223
223
224 224 224

Primeros estudios sobre el receptor de clula T

197 Experimentos clsicos demostraron la restriccin del receptor de clula T al MHC propio El uso de anticuerpos clonotpicos permiti aislar receptores de clula T El gen de la cadena del TCR se clon mediante hibridacin sustractiva

199

Mapa genmico detallado de los genes MHC

La regin de la clase I humana abarca alrededor de 2 000 kb en el extremo telomrico del complejo de antgenos de histocompatibilidad leucocticos (HLA) Los genes del MHC clase II se localizan en el extremo centromrico del HLA Los genes del MHC clase III del ser humano estn entre las clases I y II

201

202 203 203

Receptores de clula T y funciones

: estructuras 226 228

229 230 231 232 231 232

Organizacin y reordenamiento de los genes del TCR

Los genes de la regin variable del TCR se reordenan de manera similar a los genes de anticuerpo Mecanismo de los reordenamientos del DNA del TCR Exclusin allica de los genes de TCR Los genes del TCR reordenados se ensamblan a partir de segmentos gnicos V, D y J ENFOQUE CLNICO REORDENAMIENTOS DE CLULAS T COMO
MARCADORES DE CLULAS CANCEROSAS

Expresin celular de molculas MHC Regulacin de la expresin del MHC MHC y susceptibilidad a enfermedades MHC e inmunorreactividad Restriccin de clulas T a MHC propio Funcin de las clulas presentadoras de antgeno
Es necesario que el antgeno sea procesado para que las clulas T lo reconozcan La mayora de las clulas puede presentar antgeno con MHC clase I; la presentacin con MHC clase II se restringe a clulas presentadoras de antgeno (APC)

203 204 205 206 207 207

208

La diversidad de TCR se genera en forma similar a la diversidad de anticuerpos pero sin mutacin somtica

Complejo receptor de clula T: TCR-CD3 Molculas de membrana accesorias de la clula T

Correceptores CD4 y CD8 se unen a regiones conservadas de las molculas MHC clase II o I

235 236
236

209

CONT E N ID O

xvii

La anidad del TCR por complejos pptido-MHC es intensicada por correceptores

238

Estructuras tridimensionales de complejos TCR-pptido-MHC

Los TCR interactan de manera diferente con molculas clase I y clase II

240
241

Los marcadores de supercie celular identican las etapas del desarrollo Las clulas B-1 son un subconjunto de clulas B que se renuevan por s mismas En la mdula sea se seleccionan negativamente clulas B autorreactivas Es posible rescatar clulas B autorreactivas al editar genes de cadena ligera

275 275 276 278

Alorreactividad de las clulas T

241

Activacin y proliferacin de la clula B

Los antgenos dependientes e independientes del timo tienen diferentes requerimientos para reaccionar Dos tipos de seales impulsan a las clulas B hacia el ciclo celular y a travs de l La transduccin de seales activadoras incluye heterodmeros Ig- /IgLa sealizacin de clulas B es iniciada por la unin de antgeno e induce muchas vas de transduccin de seales El complejo correceptor de clula B puede intensicar las reacciones de la clula B, y el CD22 es capaz de inhibirlas ENFOQUE CLNICO AGAMMAGLOBULINEMIA LIGADA AL SEXO:
UNA FALLA EN LA TRANSDUCCIN DE SEALES Y EL DESARROLLO DE LA CLULA

278
278 279 279

10

Maduracin, activacin y diferenciacin de la clula T

245
245 248
249 250 250 251

Timo y maduracin de la clula T Seleccin tmica del repertorio de clulas T

La seleccin positiva asegura la restriccin en MHC La seleccin negativa asegura la autotolerancia Algunos experimentos revelaron los elementos esenciales de las selecciones positiva y negativa Algunos temas centrales de la seleccin tmica an no se resuelven

281 281

284 285 287

Activacin de la clula T
La unin del TCR inicia mltiples vas de sealizacin Cuntos complejos de TCR deben ensamblarse para inducir la activacin de la clula T? Para la activacin completa de las clulas T se requieren seales coestimuladoras Cuando no existe una seal coestimuladora se presenta anergia clonal Los superantgenos inducen la activacin de clulas T al unir el TCR y el MHC II de modo simultneo

254
254 258 259 259 260

Las clulas TH tienen acciones esenciales en la mayor parte de las reacciones de la clula B Es posible la seleccin negativa de clulas B autorreactivas maduras en la periferia

Reaccin humoral
Las respuestas primaria y secundaria dieren en grado signicativo Las clulas T colaboradoras tienen un papel crtico en la reaccin humoral a conjugados de hapteno y portador

289
289 290

Diferenciacin de la clula T
Las clulas T activadas generan clulas T efectoras y de memoria Una subpoblacin CD4 CD25 de clulas T regula de modo negativo las inmunorreacciones Las clulas presentadoras de antgeno tienen propiedades coestimuladoras caractersticas

261
262 263 263

Sitios in vivo para la induccin de reacciones humorales Centros germinales y diferenciacin de la clula B inducida por antgeno
La maduracin de la anidad es el resultado de mutaciones y selecciones repetidas Las clulas B de memoria y las clulas plasmticas se generan en centros germinales

292 292
293 296

Muerte celular y poblaciones de clulas T

ENFOQUE CLNICO LA FALTA DE APOPTOSIS CAUSA HOMEOSTASIS
DEFECTUOSA DE LINFOCITOS

264
266

Regulacin de la inmunorreaccin efectora

Diferentes antgenos pueden competir entre s La presencia de anticuerpo puede suprimir la reaccin al antgeno

297
297 297

11

Generacin, activacin y diferenciacin de la clula B

271
271
272 273 274 275

PARTE III

Maduracin de la clula B
Las clulas B progenitoras proliferan en la mdula sea El reordenamiento del gen de inmunoglobulina (Ig) produce clulas B inmaduras Para el desarrollo de la clula B es esencial el receptor de clula pre-B En experimentos de desactivacin gnica se identicaron factores de transcripcin esenciales

Mecanismos inmunoefectores
302
302
305

12

Citocinas

Propiedades de las citocinas

Las citocinas pertenecen a cuatro familias estructurales

xviii

CO N T E N I D O

Las citocinas tienen mltiples funciones biolgicas

306

Receptores de citocinas
Los receptores de citocina pertenecen a cinco familias Las subfamilias de los receptores de citocina clase I tienen en comn subunidades de sealizacin IL-2R es uno de los receptores de citocinas estudiado de modo ms extenso Los receptores de citocina inician la sealizacin

307
308 309 311 312

El sistema de la coagulacin proporciona mediadores de la inamacin generados por la brina El sistema brinoltico proporciona mediadores de la inamacin generados por la plasmina El sistema del complemento produce analatoxinas Algunos lpidos actan como mediadores de la inamacin Algunas citocinas son mediadores importantes de la inamacin

338 338 338 339 339

Proceso inamatorio
Los neutrlos tienen un papel temprano e importante en la inamacin Las reacciones inamatorias pueden ser localizadas o generalizadas ENFOQUE CLNICO DEFICIENCIA DE ADHESIN LEUCOCTICA (LAD)
EN SERES HUMANOS Y BOVINOS

340
340 340 343 344 344 346

Antagonistas de citocinas Secrecin de citocinas por los subconjuntos TH1 y TH2

El desarrollo de los subconjuntos TH1 y TH2 depende del ambiente de las citocinas Los perles de citocinas son regulados de manera cruzada El balance TH1/TH2 determina los resultados nales de una enfermedad

314 314
316 317 318

Enfermedades relacionadas con citocinas

El choque sptico es comn y potencialmente letal El choque txico bacteriano se debe a superantgenos La actividad de las citocinas se relaciona con los cnceres linfoide y mieloide La enfermedad de Chagas es causada por un parsito

318
318 319 319 320

Se desarrolla inamacin crnica cuando el antgeno persiste Funciones de IFN- y TNF- en la inamacin crnica En enfermedades inamatorias crnicas se producen estructuras tipo HEV

Agentes antiinamatorios
Los tratamientos con anticuerpos reducen la extravasacin de leucocitos Los corticosteroides son frmacos antiinamatorios potentes Los NSAID combaten el dolor y la inamacin

346
346 347 347

Tratamientos basados en citocinas Citocinas en la hematopoyesis

ENFOQUE CLNICO TERAPUTICA CON INTERFERONES

320 321
322

14

Reacciones citotxicas mediadas por clulas

351
351 352
352 352 353

13

Activacin y migracin de leucocitos

327
327 329
331

Reacciones efectoras Propiedades generales de las clulas T efectoras

Molculas de adhesin celular Quimiocinas

Los perles de receptores de quimiocina median la actividad de los leucocitos

Las necesidades de activacin de las clulas T son diferentes Las molculas de adhesin celular facilitan las interacciones mediadas por el receptor de clula T (TCR) Las clulas T efectoras expresan varias molculas efectoras

Clulas T citotxicas
Los linfocitos T citotxicos efectores se generan a partir de precursores propios Los linfocitos T citotxicos CD8 pueden rastrearse con tecnologa de tetrmeros MHC Los linfocitos T citotxicos (CTL) destruyen clulas de dos maneras

353
353 355 355

Extravasacin de leucocitos: el paradigma de los pasos mltiples Recirculacin de linfocitos Extravasacin de linfocitos
Las vnulas con endotelios altos (endotelios venulares altos, HEV) son sitios de extravasacin de linfocitos El direccionamiento (trco) de los linfocitos es guiado por perles y seales de los receptores Los linfocitos vrgenes recirculan hacia tejido linfoide secundario Los linfocitos efectores y de memoria adoptan patrones de trco distintos

332 334 334

334 336 336 337

Clulas asesinas naturales

Las clulas asesinas naturales (NK) y las clulas T comparten algunas caractersticas La destruccin (muerte) por clulas asesinas naturales es similar a la mediada por linfocitos T citotxicos Las clulas asesinas naturales tienen receptores de activacin e inhibicin ENFOQUE CLNICO COMBINACIONES DE GENES MHC-KIR
INFLUYEN EN LA SALUD

360
361 361 362 364

Otros mediadores de la inamacin

La lesin tisular activa el sistema de las cininas

338
338

CONTE N ID O

xix

Clulas NKT Citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpo Valoracin experimental de la citotoxicidad mediada por clulas
El cultivo concurrente de clulas T con clulas extraas estimula la reaccin de linfocitos mixtos Es posible demostrar la actividad de linfocitos T citotxicos mediante linflisis mediada por clulas La reaccin de injerto contra hospedador indica citotoxicidad mediada por clulas

364 366 366

366 367 367

16

Tolerancia y autoinmunidad

401
402
403 404 406 407 407

Establecimiento y mantenimiento de la tolerancia

La tolerancia central limita el desarrollo de clulas T y B autorreactivas La tolerancia perifrica regula las clulas autorreactivas en circulacin Las clulas T reguladoras son un componente de la tolerancia perifrica El secuestro de antgeno es un modo de proteger antgenos propios El fallo de la tolerancia causa autoinmunidad

15

Reacciones de hipersensibilidad

371
371 372
373 377 377 379 381 383 383 384 386 386

Enfermedades autoinmunitarias especcas de rganos

Algunas enfermedades autoinmunitarias son mediadas por lesin celular directa Algunas enfermedades autoinmunitarias son mediadas por autoanticuerpos estimuladores o bloqueadores

407
407 409

Clasicacin de Gell y Coombs Hipersensibilidad mediada por IgE (tipo I)

Existen varios componentes comunes de las reacciones tipo I El enlace cruzado de IgE inicia la desgranulacin Sucesos intracelulares inducen la desgranulacin de los leucocitos Diversos agentes farmacolgicos median las reacciones tipo I Las reacciones tipo I pueden ser generales o localizadas Las reacciones de fase tarda inducen inamacin localizada Las reacciones tipo I son reguladas por muchos factores ENFOQUE CLNICO GENTICA DEL ASMA Se emplean diversos mtodos para identicar las reacciones de hipersensibilidad tipo I Las hipersensibilidades tipo I pueden controlarse por medios mdicos

Enfermedades autoinmunitarias sistmicas

El lupus eritematoso sistmico ataca muchos tejidos La esclerosis mltiple ataca el sistema nervioso central La artritis reumatoide ataca las articulaciones

410
410 411 411

Modelos animales de enfermedades autoinmunitarias

Los animales pueden desarrollar autoinmunidad de manera espontnea Puede inducirse autoinmunidad de manera experimental en animales

411
412 413

Pruebas de la participacin de clulas T CD4 , MHC y TCR en la autoinmunidad

Las clulas T CD4 y el equilibrio entre las clulas TH1 y TH2 desempean una funcin importante en la autoinmunidad de algunos modelos animales La autoinmunidad puede relacionarse con MHC o con receptores de clulas T particulares

413

Hipersensibilidad citotxica mediada por anticuerpo (tipo II)

Las reacciones transfusionales son tipo II La enfermedad hemoltica del neonato se debe a reacciones tipo II La anemia hemoltica inducida por frmacos es una reaccin tipo II

414 414

388
388 389 391

Mecanismos propuestos para la induccin de autoinmunidad

La liberacin de antgenos secuestrados puede inducir enfermedad autoinmunitaria ENFOQUE CLNICO POR QU LAS MUJERES SON MS SUSCEPTIBLES QUE LOS VARONES A LA AUTOINMUNIDAD? DIFERENCIAS DE GNERO

414
415

Hipersensibilidad mediada por inmunocomplejos (tipo III)

Las reacciones tipo III pueden ser localizadas Las reacciones tipo III tambin pueden ser generalizadas

391
392 392

EN LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNITARIAS

416 416 418 418 419

Hipersensibilidad tipo IV o tarda (DTH)

Existen diversas fases de la reaccin de hipersensibilidad tarda Numerosas citocinas participan en la reaccin de hipersensibilidad tarda La reaccin de hipersensibilidad tarda se identica con una prueba cutnea La dermatitis por contacto es un tipo de reaccin de hipersensibilidad tarda

393
394 395 396 396

El mimetismo molecular puede contribuir a la enfermedad autoinmunitaria Se cuenta con pruebas de imitacin entre MBP y pptidos vricos La expresin inapropiada de molculas MHC clase II puede sensibilizar las clulas T autorreactivas La activacin de las clulas B policlonales puede ocasionar enfermedad autoinmunitaria

Tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias

El tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias del ser humano plantean desafos especiales

419
420

xx

CO N T E N I D O

La inamacin es un blanco del tratamiento de la autoinmunidad Las clulas T activadas son un posible blanco teraputico Los antgenos orales pueden inducir tolerancia

420 421 421

El trasplante de pncreas ofrece una curacin de la diabetes mellitus Se emplean injertos cutneos para tratar a las vctimas de quemaduras El xenotrasplante puede ser la solucin ante la escasez de rganos de donante humano

443 443 444

PARTE IV El sistema inmunolgico en la salud y la enfermedad

17 Inmunologa de los trasplantes 425

18

Inmunorreaccin a las enfermedades infecciosas

447
448
449 450 450 451 454 454

Infecciones vricas Bases inmunitarias del rechazo de injertos

El rechazo de aloinjertos maniesta especicidad y memoria Las clulas T desempean una funcin clave en el rechazo de los aloinjertos Los perles antignicos similares propician la aceptacin de los aloinjertos Se determinan los antgenos eritrocticos y los MHC de los donantes y los receptores de injertos El rechazo de injerto mediado por clulas se produce en dos etapas

426
426 426 428 428 431

Muchos virus son neutralizados por anticuerpos La inmunidad mediada por clulas es importante para el control y la depuracin vricos Los virus pueden evadir los mecanismos de defensa del hospedador La gripe es la causa de algunas de las peores pandemias de la historia La reaccin humoral a la gripe es especca de cepa La cepa aviar H5N1 representa una amenaza de pandemia

Infecciones bacterianas
Las reacciones inmunitarias a las bacterias extracelulares e intracelulares pueden diferir Las bacterias pueden evadir con ecacia los mecanismos de defensa del hospedador Las reacciones inmunitarias pueden contribuir a la patognesis bacteriana La difteria (Corynebacterium diphteriae) puede controlarse mediante inmunizacin con toxoide desactivado La tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) es controlada primordialmente por clulas T CD4

455
455 455 457 458 458

Manifestaciones clnicas del rechazo de injertos

Los anticuerpos preexistentes en el receptor median el rechazo hiperagudo Reacciones de clulas T median el rechazo agudo El rechazo crnico ocurre meses o aos despus del trasplante

433
433 434 434

Tratamiento inmunosupresor general

Los inhibidores de la mitosis impiden la proliferacin de las clulas T ENFOQUE CLNICO TIENEN FUTURO CLNICO LOS XENOTRASPLANTES? Los corticosteroides suprimen la inamacin Algunos metabolitos micticos son inmunosupresores La radiacin linfoide total elimina los linfocitos

434
434 435 436 436 436

Enfermedades parasitarias
Las enfermedades por protozoarios afectan a millones de personas en todo el mundo El paludismo (especies de Plasmodium) infecta a 600 millones de personas en todo el mundo Dos especies de Trypanosoma causan la enfermedad del sueo La leishmaniosis es un modelo til para demostrar las diferencias en las reacciones del hospedador Diversas enfermedades son causadas por gusanos parsitos (helmintos)

460
460 460 462 462 462

Tratamiento inmunosupresor especco

Los anticuerpos pueden suprimir las reacciones de rechazo de injerto Bloquear las seales coestimuladoras puede inducir anergia

436
437 438

Inmunotolerancia a los aloinjertos

Los sitios privilegiados aceptan desigualdades antignicas La exposicin temprana a los aloantgenos puede inducir tolerancia especca

439
439 439

Enfermedades micticas
La inmunidad innata controla la mayora de las infecciones micticas La inmunidad contra patgenos micticos puede ser adquirida

465
466 466

Trasplante clnico
El rgano trasplantado con ms frecuencia es el rin Se practican trasplantes de mdula sea para tratar leucemias, anemias e inmunodeciencias El trasplante cardaco es una operacin desaante Los trasplantes de pulmn son cada vez ms comunes Los trasplantes de hgado se practican para tratar defectos congnitos y lesiones por agentes vricos o qumicos

440
441 441 442 442

Enfermedades infecciosas emergentes

Las enfermedades pueden resurgir por diversas razones ENFOQUE CLNICO AMENAZA DE INFECCIN POR AGENTES
POTENCIALES DE BIOTERRORISMO

467
467 468 470 470

442

Otras enfermedades letales han aparecido recientemente El brote de SARS desencaden una rpida respuesta internacional

CONTE N ID O

xxi

19

Vacunas

475
476

ENFOQUE CLNICO VACUNACIN: DESAFOS EN ESTADOS UNIDOS

Y EN PASES EN DESARROLLO

Inmunizaciones activa y pasiva

La inmunizacin pasiva consiste en la transferencia de anticuerpos preformados La inmunizacin activa conere proteccin prolongada

477
477 478

Los estudios in vitro revelaron el ciclo de multiplicacin del VIH-1 La infeccin por el VIH-1 propicia infecciones oportunistas Los agentes teraputicos inhiben la multiplicacin de los retrovirus Es posible que una vacuna sea el nico medio para detener la epidemia de VIH/SIDA

509 512 515 518

21

Cncer y sistema inmunitario

525
525 526 527
527 529 530

Diseo de vacunas para inmunizacin activa Vacunas con microorganismos vivos atenuados Vacunas de microorganismos desactivados o muertos Vacunas subunitarias
Algunos toxoides se emplean como vacunas Se usan cpsulas bacterianas de polisacrido como vacunas Podran elaborarse vacunas con glucoprotenas vricas Por medio de tcnicas recombinantes se obtienen protenas de agentes patgenos El empleo de pptidos sintticos como vacunas ha progresado con lentitud

481 481 484 484

485 485 485 485 485

Cncer: origen y terminologa Transformacin maligna de clulas Oncogenes e induccin de cncer

Los genes relacionados con el cncer tienen muchas funciones Los protooncogenes pueden convertirse en oncogenes La induccin del cncer es un proceso de mltiples etapas

Tumores del sistema inmunitario Antgenos tumorales

Algunos antgenos son especcos de tumor ENFOQUE CLNICO UNA VACUNA QUE PREVIENE EL CNCER Los virus pueden inducir antgenos tumorales Pocos antgenos tumorales son exclusivos de clulas tumorales Los tumores pueden inducir reacciones inmunitarias potentes Clulas asesinas naturales y macrfagos son importantes en el reconocimiento de tumores

530 531
532 534 535 536 537 537

Vacunas conjugadas
Un polisacrido conere proteccin contra varios hongos Las vacunas subunitarias multivalentes coneren inmunidad celular y humoral

486
486 486

Vacunas de DNA Vacunas con vectores recombinantes

488 488

20

SIDA y otras inmunodeciencias

493
493
495 500 502 502 503

Evasin del sistema inmunitario por los tumores

Los anticuerpos antitumorales pueden intensicar el crecimiento de los tumores Los anticuerpos pueden modular los antgenos tumorales Las clulas tumorales expresan con frecuencia concentraciones bajas de molculas MHC clase I Las clulas tumorales pueden emitir seales coestimuladoras decientes

538
538 538 538 538

Inmunodeciencias primarias
Las inmunodeciencias linfoides pueden incluir clulas T, clulas B o ambas Las inmunodeciencias del linaje mieloide afectan la inmunidad innata Los defectos del complemento causan inmunodeciencia o enfermedad por inmunocomplejos Los trastornos de inmunodeciencia se tratan mediante restitucin del elemento defectuoso Los modelos experimentales de inmunodeciencia incluyen animales alterados por medios genticos

Inmunoterapia del cncer

La manipulacin de las seales coestimuladoras puede incrementar la inmunidad El incremento de la actividad de clulas presentadoras de antgeno puede modular la inmunidad tumoral El tratamiento con citocinas puede acentuar las inmunorreacciones a los tumores Los anticuerpos monoclonales son ecaces para tratar ciertos tumores

539
539 540 540 542

SIDA y otras inmunodeciencias adquiridas o secundarias

La epidemia de VIH/SIDA ha cobrado millones de vidas a nivel mundial El VIH-1 se propaga por contacto sexual, sangre infectada y de madre a hijo ENFOQUE CLNICO PREVENCIN DE LA INFECCIN INFANTIL POR VIH MEDIANTE TRATAMIENTO ANTIRRETROVRICO El retrovirus VIH-1 es el causante del sndrome de inmunodeciencia adquirida

504
505 505 507 508

22

Sistemas experimentales

546
546
547

Modelos animales experimentales

Las cepas endogmicas pueden reducir la variacin experimental

xxii

CO N T E N I D O

Los sistemas de transferencia adoptivos permiten el examen in vivo de poblaciones de clulas aisladas

547

Sistemas de cultivo celular

Los cultivos de clulas linfoides primarias provienen de sangre u rganos linfoides Las lneas celulares linfoides clonadas son herramientas importantes en inmunologa Creacin de lneas de clulas linfoides hbridas

547
547 549 550

El anlisis de retardo en gel identica complejos de DNA y protena Los ensayos de luciferasa miden la actividad transcripcional

561 562

Transferencia de genes a clulas de mamfero

Los genes clonados transferidos a clulas cultivadas permiten el anlisis in vitro de la funcin gnica Los genes clonados transferidos a embriones de ratn permiten el anlisis in vivo de la funcin gnica En los ratones con desactivacin gnica, el gen seleccionado se daa La tecnologa knock-in permite reemplazar un gen endgeno La seleccin de genes inducibles por el sistema Cre/lox tiene como nalidad la supresin gnica

562
562 563 564 565 565

Bioqumica de protenas
Las tcnicas de radiomarcado permiten la identicacin sensible de antgenos o anticuerpos Las marcas de biotina facilitan la deteccin de pequeas cantidades de protenas La electroforesis en gel separa las protenas por tamao y carga La cristalografa de rayos X ofrece informacin estructural

551
551 551 551 553

Microarreglos: mtodo para analizar patrones de expresin gnica

ENFOQUE CLNICO ANLISIS DE MICROARREGLOS COMO
INSTRUMENTO DIAGNSTICO PARA LAS ENFERMEDADES HUMANAs

567
568

Tecnologa de DNA recombinante

Las enzimas de restriccin escinden el DNA en secuencias precisas Las secuencias de DNA se clonan en vectores Los vectores de clonacin son de utilidad para duplicar secuencias de DNA denidas La clonacin del cDNA y el DNA genmico permite el aislamiento de secuencias denidas Las clonas de DNA se seleccionan por hibridacin La prueba de Southern blotting identica el DNA de una secuencia determinada La prueba de Northern blotting identica mRNA La reaccin en cadena de la polimerasa amplica cantidades pequeas de DNA

555
555 556 556 556 558 559 559 559

Microscopia bifotnica para visualizacin in vivo del sistema inmunitario Avances en la tecnologa de uorescencia

570 571

Apndice I: Antgenos CD Apndice II: Citocinas Glosario Respuestas a las preguntas de estudio ndice alfabtico

A-1 A-27 G-1 R-1 I-1

Anlisis de secuencias reguladoras del DNA

El anlisis de huellas de DNA identica los sitios en que se jan protenas a ste

560
560

captulo 1
Panorama general del sistema inmunitario
Pptido antignico MHC clase I MHC clase II Receptor de clula T CD8 CD4 Clula infectada con virus Clula TH Clula presentadora de antgeno Clula TC Clula TH Clula TC

l sistema inmunitario surgi por evolucin para proteger a los organismos multicelulares de los agentes patgenos. Es muy adaptable, y defiende al organismo contra invasores tan diversos como el virus que causa la polio y la planaria que produce la esquistosomiasis. Genera una enorme variedad de clulas y molculas capaces de reconocer y eliminar de manera especfica invasores extraos. Todas esas clulas y molculas actan en conjunto en una red dinmica. La proteccin conferida por el sistema inmunitario puede dividirse en dos actividades vinculadas: reconocimiento y reaccin (o respuesta). El reconocimiento inmunitario es notable por su capacidad de distinguir entre invasores extraos y componentes propios. El sistema puede reconocer patrones moleculares que caracterizan a grupos de patgenos comunes y atacarlos de manera rpida y decisiva. Incluso es capaz de detectar diferencias qumicas sutiles que distinguen a un patgeno de otro. Encima de todo, puede discriminar entre molculas extraas y clulas y protenas del cuerpo (discriminacin entre propio y extrao). Adems, est capacitado para reconocer clulas propias alteradas que pueden desembocar en cncer. Tpicamente, el reconocimiento de un agente patgeno por el sistema inmunitario activa una reaccin efectora, que suprime o neutraliza al invasor. Los mltiples componentes del sistema inmunitario son capaces de convertir el suceso de reconocimiento inicial en una variedad de reacciones (respuestas) efectoras, cada una adaptada de manera nica para anular un tipo especfico de patgeno. Determinadas exposiciones inducen una reaccin de memoria, caracterizada por una respuesta inmunitaria (inmunorreaccin) ms rpida e intensa en caso de ataque ulterior. Se trata de la notable propiedad de memoria que impide contraer por segunda vez algunas enfermedades, y la memoria inmunitaria es la base de la vacunacin, la cual constituye un medio para instruir al sistema inmunitario y prepararlo para ataques posteriores. Aunque se hace referencia al sistema inmunitario, debe sealarse que existen dos de ellos, la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa (o adquirida), que colaboran para proteger al organismo. La inmunidad innata incluye mecanismos moleculares y celulares que se montan antes de una infeccin y cuyo fin es prevenirla o eliminarla. Esta primera lnea de defensa altamente eficaz impide la mayora de las infecciones desde el principio o las anula en las horas que siguen a su contacto con el sistema inmunitario innato. Los elementos de reconocimiento de este sistema distinguen de manera precisa entre lo propio y lo

Reconocimiento del complejo antgeno-MHC por el linfocito T.

Perspectiva histrica Primeros estudios sobre inmunidad humoral y celular Desafos tericos Infeccin e inmunidad Inmunidad innata y adaptativa Disfuncin inmunitaria y sus consecuencias

extrao, pero no estn especializados para distinguir diferencias pequeas en las molculas extraas. Una segunda forma de inmunidad, conocida como inmunidad adaptativa, se establece en respuesta a las infecciones y se adapta para reconocer, eliminar y ms tarde recordar al patgeno invasor. La inmunidad adaptativa se desarrolla a partir de la innata y comienza pocos das despus de la infeccin inicial. Constituye una segunda lnea de defensa amplia que elimina los patgenos que evaden las reacciones innatas o persisten a pesar de stas. Una importante consecuencia de la reaccin inmunitaria adaptativa es la memoria. Si el mismo agente patgeno u otro estrechamente relacionado infectan al organismo en una segunda ocasin, las clulas de memoria aportan los medios para que el sistema inmunitario adaptativo monte un ataque rpido y a menudo muy eficaz contra el invasor. Este captulo es una introduccin al estudio de la inmunologa desde una perspectiva histrica. En l se esbozan sus aspectos altamente prcticos o aplicados, poniendo de relieve el papel de la vacunacin en el desarrollo de la inmunologa como un campo cientfico y como un importante aspecto de la salud pblica. Se presenta un panorama general de los agentes patgenos a los que estamos expuestos, con un repaso amplio de los

PARTE I

INTRODUCCIN

procesos, clulas y molculas que componen los sistemas inmunitarios innato y adaptativo. Por ltimo, se describen las circunstancias en que dichos sistemas no pueden actuar o en que se constituyen en agresores y dirigen sus impresionantes fuerzas contra el propio organismo.

Perspectiva histrica
La disciplina de la inmunologa surgi cuando se observ que los individuos recuperados de ciertos trastornos infecciosos quedaban protegidos despus contra la enfermedad. El trmino latino immunis, que significa exento, es el origen de la palabra inmunidad, que se refiere al estado de proteccin contra anomalas infecciosas. Tal vez la primera referencia escrita sobre los fenmenos de la inmunidad se encuentra en Tucdides, el gran historiador de las Guerras del Peloponeso. Al describir una plaga en Atenas, escribi en el ao 430 ac que slo quienes se haban recuperado de ella podan cuidar a los enfermos porque no contraeran el padecimiento una segunda vez. Aunque las primeras sociedades reconocieron el fenmeno de la inmunidad, transcurrieron casi 2 000 aos antes que el concepto se convirtiera con xito en una prctica mdica eficaz.

Los estudios pioneros sobre la vacunacin abrieron el campo para la inmunologa

Los primeros intentos registrados de inducir inmunidad de manera deliberada los llevaron a cabo los chinos y los turcos en el siglo XV. Pretendan prevenir la viruela, una enfermedad que es letal en alrededor de 30% de los casos y que deja a los sobrevivientes desfigurados de por vida (fig. 1-1). Los informes sugieren que las costras secas dejadas por las pstulas de la viruela se inhalaban por las narinas o se insertaban en pequeos cortes de la piel (una tcnica que se conoce como variolacin). En 1718, lady Mary Wortley Montagu, la esposa del embajador britnico en Constantinopla, observ los efectos positivos de la variolacin en la poblacin nativa y practic la tcnica en sus hijos. En 1798, el mdico ingls Edward Jenner dio un paso gigantesco en el desarrollo deliberado de inmunidad. Intrigado por el hecho de que las nieras que haban contrado la pstula vacuna o pstula mamaria de la vaca (una enfermedad leve) quedaban inmunes a la viruela, que es una afeccin deformante y con frecuencia letal, Jenner razon que al introducir el lquido de una pstula vacuna en una persona (es decir, el mtodo de inoculacin) podra protegrsele de la viruela. A fin de verificar esta idea, inocul a un nio de ocho aos de edad con lquido de una pstula vacuna y luego lo infect de manera intencional con viruela. Como lo esperaba, el nio no present la enfermedad. La tcnica de Jenner de inoculacin con pstula vacuna para proteger contra la viruela se difundi con rapidez en toda Europa. Sin embargo, transcurrieron unos 100 aos antes que se aplicara este mtodo a otras enfermedades. Como sucede con tanta frecuencia en la ciencia, la casualidad combinada con la observacin perspicaz condujo al siguiente adelanto importante en inmunologa, la introduccin de la inmunidad al clera.

FIGURA 1-1 Nio africano con el exantema tpico de la viruela en cara, trax y brazos. La viruela, causada por el virus Variola major, tiene un ndice de mortalidad de 30%. Los sobrevivientes a menudo quedan con cicatrices desgurantes. [Centers for Disease
Control.]

Louis Pasteur tuvo xito en el cultivo de la bacteria que al parecer causaba el clera de las gallinas, y confirm la participacin de este microorganismo cuando los pollos inyectados con la bacteria cultivada murieron por el trastorno. Despus de regresar de unas vacaciones de verano, inyect algunos pollos con un cultivo viejo. Los animales enfermaron pero, para sorpresa suya, se recuperaron. A continuacin, Pasteur desarroll un cultivo nuevo de la bacteria con la intencin de inyectarla en algunos pollos nuevos. No obstante, segn cuenta la historia, su abastecimiento de pollos era limitado y, por esa razn, utiliz los pollos inyectados con anterioridad. Una vez ms, para su sorpresa, los pollos estaban del todo protegidos contra la enfermedad. Pasteur conjetur y demostr que el envejecimiento haba debilitado la virulencia del agente patgeno y que esta cepa atenuada podra administrarse para conferir proteccin contra el padecimiento. Denomin a esta cepa atenuada vacuna (del latn vacca, que significa vaca), en honor del trabajo de Jenner con la inoculacin de pstula vacuna. Pasteur extendi estos descubrimientos a otras afecciones y demostr que era posible atenuar, o debilitar, un agente patgeno y suministrar la cepa atenuada como una vacuna. En un experimento ahora clsico realizado en la pequea aldea de Pouilly-le-Fort en 1881, Pasteur vacun por primera vez a un

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P TU L O

FIGURA 1-2 Grabado en madera de Louis Pasteur que observa a Joseph Meister mientras recibe una vacuna para la rabia. [Tomada de Harpers Weekly 29:836; cortesa de la National Library
of Medicine.]

grupo de ovejas con el bacilo del carbunco (Bacillus anthracis) atenuado por calor; a continuacin inocul a las ovejas vacunadas y algunas no vacunadas con un cultivo virulento del bacilo. Todas las ovejas vacunadas vivieron y las no vacunadas murieron. Estos experimentos marcaron los inicios de la disciplina de la inmunologa. En 1885, Pasteur administr su primera vacuna a un ser humano, un nio que haba sufrido repetidas mordeduras de un perro rabioso (fig. 1-2). El nio, Joseph Meister, recibi preparados de virus de la rabia atenuados. Vivi y ms adelante se convirti en custodio del Instituto Pasteur.

La vacunacin es una tarea continua a nivel mundial

El surgimiento de la ciencia de la inmunologa y el descubrimiento de las vacunas estn estrechamente vinculados. El descubrimiento, desarrollo y uso apropiado de las vacunas sigue siendo un reto para los inmunlogos en la actualidad. En 1977 se observ en Somalia el ltimo caso conocido de viruela contrada de manera natural. Esta temida enfermedad fue erradicada por la aplicacin universal de una vacuna que no difiere mucho de la que us Jenner en el decenio de 1790. Una consecuencia de la erradicacin es que la vacunacin univer-

sal se hace innecesaria; ste es un tremendo beneficio porque la vacuna de la viruela conllevaba un ligero grado de riesgo tanto para las personas vacunadas como para las expuestas a quienes recin se haban vacunado. Sin embargo, la erradicacin al final de la vacunacin universal tiene un lado oscuro. Con el tiempo, el nmero de personas sin inmunidad a la viruela necesariamente aumentar. Y un da la enfermedad puede ser reintroducida por medios no naturales. De hecho, la viruela se considera una de las ms potentes armas del bioterrorismo. Debido a ello, en la actualidad se desarrollan nuevas y ms potentes vacunas contra esta infeccin. Un logro de la ciencia de las vacunas comparable a la erradicacin de la viruela podra estar a la vuelta de la esquina. En este caso se trata de la poliomielitis paraltica, una enfermedad discapacitante que se espera ser erradicada en el futuro cercano. Una campaa lanzada por la Organizacin Mundial de la Salud se basa en programas de inmunizacin masiva para lograr este objetivo. El proyecto fue frenado por la resistencia en ciertas regiones a causa de rumores en el sentido de que la inmunizacin causa esterilidad en varoncitos. El resurgimiento regional de casos de poliomielitis en determinadas zonas de Asia y frica como resultado de esta resistencia es un retroceso, pero se ha superado por medio de educacin y al observarse los beneficios de la vacuna. El hecho de que la poliomielitis no sea una amenaza a nivel mundial y de que se haya eliminado de la mayora de los pases es un triunfo que no debe ser opacado por las demoras en el programa de erradicacin. En Estados Unidos y otros pases industrializados, las vacunas han eliminado una multitud de enfermedades de la niez que se consideraban inseparables del proceso de crecer hace apenas 50 aos. Sarampin, paperas, tos ferina, ttanos, difteria y poliomielitis son extremadamente raras o no ocurren debido a las prcticas actuales de vacunacin (cuadro 1-1). Es difcil estimar el ahorro que representa para la sociedad la prevencin de estas enfermedades. Aparte del sufrimiento y las muertes, el costo econmico de tratar estas enfermedades y sus secuelas (como parlisis, sordera, ceguera y retraso mental) es inmenso, y junto a l resultan insignificantes los costos de la inmunizacin. Para algunas enfermedades, la inmunizacin es la mejor y ms eficaz defensa, si no la nica. Dado que en la actualidad se dispone de pocos frmacos antivricos, la principal defensa contra la gripe (influenza) debe ser una vacuna eficaz. Si recurre una epidemia de gripe, como muchos expertos predicen que ocurrir, se producir una carrera entre su dispersin y la manufactura y administracin de tal vacuna. Al momento en que esto se escribe, se sigue muy de cerca el surgimiento de una cepa de gripe aviar. Se han documentado unos 200 casos de infeccin en seres humanos, de los cuales alrededor de la mitad fueron letales. Si este virus se adapta para propagarse de manera eficiente en seres humanos, el resultado ser una gran pandemia. Sin una vacuna preventiva, es posible que se iguale o rebase la devastacin causada por la pandemia de gripe de 1918, que dej nada menos que 50 millones de muertos. A pesar de las cifras de xito de las vacunas y de nuestra confianza en ellas, quienes se oponen a los programas de vacunacin han afirmado que las vacunas causan ms dao que beneficio, y que la vacunacin infantil debe restringirse o incluso suspenderse. No hay duda que las vacunas constituyen un tema especial en materia de seguridad, porque se administran a personas

PARTE I

INTRODUCCIN

CUADRO 1-1

Casos de enfermedades infecciosas seleccionadas antes y despus de la introduccin de vacunas ecaces

CASOS/AO CASOS EN 2004 Despus 0 0 37 236 18 957 0 12 26 (casos) 172 Reduccin (%) 100 100 99.99 99.85 87.13 100 99.97 98.02 99.14 Antes 48 164 175 885 503 282 152 209 147 271 16 316 47 745 1 314 (muertes) 20 000

Enfermedad Viruela Difteria Sarampin Paperas Tos ferina Poliomielitis paraltica Rubola Ttanos Inuenza por Haemophilus invasor

FUENTE: Adaptado de W.A. Orenstein et al., 2005, Health Affairs 24:599.

sanas. Adems, existe acuerdo general en que las vacunas deben regularse y las personas deben tener acceso a informacin clara y completa sobre ellas. Si bien los reclamos de los crticos deben ser evaluados, muchos de ellos pueden responderse mediante un anlisis cuidadoso y objetivo de los registros. Un ejemplo reciente es la afirmacin de que el conservador a base de mercurio llamado timerosol, que se usaba en algunas vacunas, causa autismo y fue la causa de aumentos recientes en la incidencia del trastorno, el cual se caracteriza por intensa introspeccin e incapacidad de relacionarse con otros. Este trastorno suele manifestarse entre las edades de uno y dos aos, la ventana de tiempo en que se administran muchas vacunas (cap. 19). El gobierno dans conserva meticulosos registros de la salud de sus ciudadanos, y esa fuente de datos arroja luz reveladora sobre la supuesta conexin causal entre timerosol y autismo. Los registros indican que la incidencia de autismo aument significativamente desde 1992 en Dinamarca. Sin embargo, tambin revelan que el uso de timerosol como conservador en vacunas ya haba cesado por completo en ese pas varios aos antes. Datos como stos hacen difcil vincular el autismo con el uso de timerosol, y sugieren la necesidad de mayor investigacin sobre las causas del incremento del autismo. Quiz el mayor desafo actual en el desarrollo de vacunas es la carencia de ellas para azotes mayores como paludismo y SIDA. Se espera que los inmunlogos de la actualidad, dotados de las herramientas de la biologa molecular y celular, la genmica y la protemica, construyan caminos hacia la prevencin de estas enfermedades. Una preocupacin ms acerca de las vacunas es el hecho de que millones de nios de pases en vas de desarrollo mueren a causa de enfermedades del todo prevenibles por medio de vacunas seguras y accesibles. Altos costos de manufactura, inestabilidad de los productos y problemas de envo impiden que estas vacunas lleguen a quienes se beneficiaran enormemente de ellas. En muchos casos, este problema podra paliarse mediante el desarrollo de vacunas de nueva generacin con bajo costo, termoestables y susceptibles de administrarse por vas distintas de la inyeccin.

Primeros estudios sobre inmunidad humoral y celular

Aunque Pasteur demostr que la vacunacin funcionaba, no comprenda cmo. El trabajo experimental de Emil von Behring y Shibasaburo Kitasato en 1890 proporcion la primera informacin sobre el mecanismo de la inmunidad; esto le vali a von Behring el premio Nobel de medicina en 1901 (cuadro 1-2). Von Behring y Kitasato demostraron que el suero (el componente lquido, no celular, de la sangre coagulada) de animales inmunizados con anterioridad contra la difteria poda transferir el estado de inmunidad a animales no inmunizados. En la investigacin del agente protector, varios cientficos probaron durante la dcada siguiente que un componente activo del suero inmune poda neutralizar y precipitar toxinas y aglutinar (agrupar) bacterias. En cada caso, el agente activo recibi su nombre segn la actividad que mostraba: antitoxina, precipitina y aglutinina, respectivamente. Al inicio se pens que distintos componentes del suero eran los que inducan cada actividad, pero durante la dcada de 1930, en particular con los esfuerzos de Elvin Kabat, qued claro que una fraccin de suero llamada primero globulina gamma (en la actualidad inmunoglobulina) era la que generaba todas estas actividades. Las molculas activas en la fraccin de inmunoglobulina se llamaron anticuerpos. (Los trminos anticuerpo e inmunoglobulina pueden usarse de manera indistinta, pero el primero suele reservarse para inmunoglobulinas con especificidad conocida para un antgeno.) Debido a que los anticuerpos contenidos en lquidos corporales (conocidos en esa poca como humores) mediaban la inmunidad, se acu el trmino inmunidad humoral. La observacin de von Behring y Kitasato se aplic a la prctica clnica. Antes del advenimiento de la antibioticoterapia para las enfermedades infecciosas, pacientes con una variedad de afecciones reciban antisueros, a menudo obtenidos de caballos. En la actualidad existen tratamientos basados en la transferencia de inmunoglobulinas, y con el desarrollo de tecnologa de anticuerpos monoclonales, la terapia con anticuerpos es una empresa comercial bien establecida (vase el enfoque clnico del cap. 4). El

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P TU L O

CUADRO 1-2
Ao 1901 1905 1908 1913 1919 1930 1951 1957 1960 1972 1977 1980

Premios Nobel concedidos por investigacin en inmunologa

Galardonado Emil von Behring Robert Koch Elie Metchnikoff Paul Ehrlich Charles Richet Jules Bordet Karl Landsteiner Max Theiler Daniel Bovet F. Macfarlane Burnet Peter Medawar Rodney R. Porter Gerald M. Edelman Rosalyn R. Yalow George Snell Jean Dausset Baruj Benacerraf Cesar Milstein Georges E. Khler Niels K. Jerne Susumu Tonegawa E. Donnall Thomas Joseph Murray Peter C. Doherty Rolf M. Zinkernagel Sydney Brenner H. Robert Horvitz J. E. Sulston Pas Alemania Alemania Rusia Alemania Francia Blgica Estados Unidos Sudfrica Suiza Australia Gran Bretaa Gran Bretaa Estados Unidos Estados Unidos Estados Unidos Francia Estados Unidos Gran Bretaa Alemania Dinamarca Japn Estados Unidos Estados Unidos Australia Suiza Sudfrica Estados Unidos Gran Bretaa Investigacin Antitoxinas sricas Inmunidad celular a la tuberculosis Funcin de la fagocitosis (Metchnikoff) y las antitoxinas (Ehrlich) en la inmunidad Analaxis Bacterilisis mediada por complemento Descubrimiento de los grupos sanguneos humanos Desarrollo de la vacuna para la ebre amarilla Antihistamnicos Descubrimiento de la tolerancia inmunitaria adquirida Estructura qumica de los anticuerpos Desarrollo de los radioinmunoensayos Complejo mayor de histocompatibilidad

1984

Anticuerpos monoclonales Teoras reguladoras inmunitarias Transposicin gnica en la produccin de anticuerpo Inmunologa de trasplantes Funcin del complejo mayor de histocompatibilidad en el reconocimiento de antgeno por clulas T Regulacin gentica del desarrollo de rganos y la muerte celular (apoptosis)

1987 1991 1996 2002

empleo de urgencia de sueros que contienen anticuerpos contra venenos de serpientes o escorpiones es una prctica comn en vctimas de ataques de estos animales. Mientras que una vacuna induce inmunidad activa en el hospedador, la transferencia de anticuerpo con determinada especificidad confiere inmunidad pasiva. Los neonatos se benefician de la inmunizacin pasiva conferida por la presencia de anticuerpos maternos en su circulacin. La inmunidad pasiva puede inducirse de manera preventiva (profilctica) en aquellos que se prev que estarn expuestos a una enfermedad dada o en quienes tienen baja inmunidad. Los antisueros contra determinadas toxinas bacterianas, como las causantes de tos ferina y ttanos, pueden administrarse a individuos infectados para detener la enfermedad provocada por la toxina. Un vvido ejemplo de esta aplicacin es el caso del viaje de 674 millas (1 080 km) en trineos tirados por perros sobre los pramos helados de Alaska para llevar antitoxina diftrica desde Fairbanks hasta los nios afectados en la ciudad sitiada por el hielo de Nome durante un brote de difteria en 1925. El feliz desenlace es conmemorado cada ao en la carrera de trineos tirados por perros conocida como Iditarod, y en el Central Park de Nueva York existe una estatua dedicada a Balto, uno de los perros de tiro que particip en el tramo final del viaje.

En 1883, incluso antes de descubrirse que un componente srico poda transferir inmunidad, Elie Metchnikoff (nombre dado en Inglaterra a Ilia Ilich Mechnikov) demostr que las clulas tambin contribuan al estado inmunitario de un animal. Observ que ciertos glbulos blancos, que denomin fagocitos, eran capaces de ingerir (fagocitar) microorganismos y otro material extrao (fig. 1-3). Al observar que estas clulas fagocticas eran ms activas en animales inmunizados, Metchnikoff conjetur que las clulas, en lugar de los componentes sricos, eran los principales efectores de la inmunidad. Las clulas fagocticas activas identificadas por Metchnikoff probablemente eran monocitos y neutrfilos sanguneos (cap. 2).

Desafos tericos
Si bien el desarrollo de vacunas seguras y eficaces y el uso de inmunoterapia pasiva siguen siendo problemas desafiantes en la investigacin clnica (tambin llamada traduccional), el estudio de la inmunologa plante asimismo cuestiones tericas intrigantes que ocuparon a la comunidad cientfica.

PARTE I

INTRODUCCIN

FIGURA 1-3 Dibujo realizado por Elie Metchnikoff de clulas fagocticas que rodean una partcula extraa. Metchnikoff fue el primero en describir y nombrar el proceso de la fagocitosis, o ingestin de materia extraa por leucocitos. [Con permiso de The British
Library: 7616.h.19, Lectures on the Comparative Pathology of Inammation delivered at the Pasteur Institute in 1891, traducido por F.A. Starling y E.H. Starling, con grabados de Ilia Ilich Mechnikov, 1893, pg. 64, g. 32.]

Una interrogante que pronto sali a la superficie se refera a las funciones relativas de la inmunidad celular y la humoral. Surgi una controversia entre quienes planteaban el concepto de inmunidad humoral y quienes concordaban con el concepto de Metchnikoff de inmunidad mediada por clulas. Ahora es claro que ambos son correctos: para una reaccin inmunitaria completa se requieren tanto respuestas celulares como humorales. Los estudios pioneros de las clulas inmunitarias fueron obstaculizados por la falta de modelos animales genticamente definidos y de las tcnicas modernas de cultivo de tejidos, mientras que en los estudios con suero se aprovechaba la amplia disponibilidad de sangre y de tcnicas bioqumicas establecidas para purificar mediadores protenicos de la inmunidad humoral. Por tanto, la informacin sobre la inmunidad celular se rezag respecto de los descubrimientos relacionados con la inmunidad humoral. En un experimento fundamental realizado en la dcada de 1940, Merrill Chase, que trabajaba en el Rockefeller Institute, tuvo xito en la transferencia de inmunidad contra el microorganismo de la tuberculosis al transferir glbulos blancos entre cobayos. Hasta entonces, los intentos por desarrollar una vacuna o terapia de anticuerpos eficaces contra la tuberculosis haban fracasado. As, la demostracin de Chase ayud a reavivar el inters por la inmunidad celular. Con el surgimiento de mejores tcnicas de cultivo de clulas en la dcada de 1950, se reconocieron los linfocitos como las clulas a cargo de las inmunidades celular y humoral. Poco tiempo despus, los experimentos pioneros de Bruce Glick con pollos en la Mississippi State University indicaron que haba dos tipos de linfocitos: linfocitos T, derivados del timo y que mediaban la inmunidad celular, y linfocitos B, de la bolsa de Fabricio (una evaginacin de la cloaca en aves), que participaban en la inmunidad humoral. La controversia sobre las funciones de la inmunidad humoral y celular se resolvi cuando se demostr que los dos sistemas es-

taban entretejidos. Se hizo evidente que ambos eran necesarios para la reaccin inmunitaria. Uno de los mayores enigmas que afrontaron los primeros inmunlogos fue la especificidad de la molcula de anticuerpo en relacin con el material extrao, o antgeno (el trmino general para una sustancia que se une con un anticuerpo especfico). Alrededor de 1900, Jules Bordet ampli en el Instituto Pasteur el concepto de la inmunidad ms all de las enfermedades infecciosas al demostrar que sustancias no patgenas, como los glbulos rojos de otras especies, podan actuar como antgenos. El suero de un animal inoculado previamente con material no infeccioso reaccionaba a este material de una manera especfica en un segundo encuentro. El trabajo de Karl Landsteiner y quienes le siguieron prob que al inyectar a un animal casi cualquier sustancia qumica orgnica poda inducirse la produccin de anticuerpos que se unan de manera especfica a la sustancia qumica. Estos estudios dejaron en claro que los anticuerpos son capaces de una gama ilimitada de reactividad, incluidas las reacciones a compuestos que slo hasta fecha reciente se haban sintetizado en el laboratorio y que no existan antes en la naturaleza. Adems, se demostr que las molculas que diferan en el ms pequeo detalle podan distinguirse por su reactividad con diferentes anticuerpos. Se propusieron dos teoras principales para explicar esta especificidad: la selectiva y la instruccional. La concepcin ms temprana de la teora selectiva procede de Paul Ehrlich en 1900. En un intento de explicar el origen del anticuerpo srico, Ehrlich propuso que las clulas en la sangre expresaban una diversidad de receptores, a los que denomin receptores de cadena lateral, que podan reaccionar con agentes infecciosos y desactivarlos. Con base en un concepto empleado por Emil Fischer en 1894 para explicar la interaccin entre una enzima y su sustrato, Ehrlich propuso que la unin de los receptores a un agente infeccioso era similar al ajuste entre una cerradura y la llave. Ehrlich sugiri que la interaccin entre un agente infeccioso y un receptor unido a la clula inducira a la clula a producir y liberar ms receptores con la misma especificidad (fig. 1-4). Segn la teora de este cientfico, la especificidad del receptor estaba determinada antes de su exposicin al antgeno y este ltimo seleccionaba el receptor apropiado. Por ltimo, se demostr que todos los aspectos de la teora de Ehrlich eran correctos, con la excepcin menor de que el receptor existe como una molcula de anticuerpo soluble y como un receptor unido a la clula; la forma soluble es la que se secreta en lugar de liberarse la forma unida. En los decenios de 1930 y 1940, varias teoras instruccionales desafiaron la teora de la selectividad, en la cual el antgeno tena un sitio central en la determinacin de la especificidad de la molcula de anticuerpo. Segn las teoras instruccionales, un antgeno particular podra servir como una plantilla alrededor de la cual se plegara el anticuerpo. Por consiguiente, la molcula de anticuerpo asumira una forma complementaria a la propia de la plantilla de antgeno. Este concepto lo postularon por primera vez Friedrich Breinl y Felix Haurowitz alrededor de 1930, y en la dcada de 1940, Linus Pauling lo redefini en trminos del plegamiento de protenas. Las teoras instruccionales fueron formalmente desechadas en el decenio de 1960, en el que comenz a publicarse informacin sobre la estructura del DNA, el RNA y las protenas, que ofrecera nuevos datos para resolver el arduo problema de determinar el modo en que un individuo puede elaborar anticuerpos contra casi cualquier cosa.

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P TU L O

Grupos principales de patgenos para el ser humano Virus Bacterias Hongos Parsitos

Ejemplos de enfermedades Poliomielitis, viruela, gripe, sarampin, SIDA Tuberculosis, ttanos, tos ferina Algodoncillo, tia Paludismo, leishmaniasis

FIGURA 1-4 Representacin de la teora de la cadena lateral

de Paul Ehrlich para explicar la formacin de anticuerpos. La clula es pluripotente en el sentido de que expresa varios receptores o cadenas laterales diferentes, todos con distinta especicidad; si un antgeno se encuentra con esta clula y existe buen ajuste con una de sus cadenas laterales, se activa la sntesis de ese receptor, que ser liberado. [Tomada de Ehrlichs Croonian lecture of 1900 to the Royal
Society.]

En la dcada de 1950 resurgieron algunas teoras selectivas como resultado de nuevos datos experimentales y, a travs de la perspicacia de Niels Jerne, David Talmadge y F. Macfarlane Burnet, se depuraron en una teora que se conoci como la teora de la seleccin clonal. Segn sta, un linfocito individual expresa receptores de membrana especficos para un antgeno preciso. Esta especificidad de receptor nico se determina antes que el linfocito se exponga al antgeno. La unin del antgeno a su receptor especfico activa la clula y la hace proliferar en una clona de clulas que tienen la misma especificidad inmunitaria que la clula original. La teora de la seleccin clonal se ha refinado an ms, y hoy en da se acepta como el paradigma subyacente de la inmunologa moderna.

Infeccin e inmunidad
Junto con el campo en desarrollo de la inmunologa creci el estudio de la microbiologa mdica, que abarcaba la identificacin de agentes infecciosos y los modos en que causan enfermedad. Los organismos que producen enfermedad se denominan agentes patgenos, y la manera en que atacan al hospedador recibe el nombre de patogenia. Los agentes patgenos para el ser humano pueden agruparse en categoras amplias, como se muestra en el cuadro siguiente y en la figura 1-5.

De gran inters aqu son los medios por los cuales puede lograrse una inmunidad eficaz contra los patgenos. Una buena defensa depende fundamentalmente de la naturaleza del microorganismo individual. Por ejemplo, dado que los virus requieren de las clulas de los mamferos para multiplicarse, una estrategia defensiva eficaz puede implicar el reconocimiento y la destruccin de cualquier clula que est infectada por virus antes de que stos completen su ciclo de vida. En el caso de microorganismos que se multiplican fuera de las clulas del hospedador, puede recurrirse al reconocimiento rpido de estos invasores por los anticuerpos o por molculas solubles, seguido de mecanismos de inmunidad celular y molecular para eliminar al agente patgeno. Algunos patgenos que proliferan en el ambiente no causan problemas a los individuos sanos porque stos poseen inmunidad preexistente adecuada. Sin embargo, quienes presentan deficiencias en la inmunidad pueden ser susceptibles a las enfermedades causadas por esos microorganismos ubicuos. Por ejemplo, el hongo Candida albicans, que se halla casi en todas partes, no causa problemas a la mayora de las personas. Sin embargo, en quienes tienen disminuida la inmunidad puede provocar un exantema irritante y una infeccin que se disemina a la mucosa que recubre las cavidades bucal y vaginal. El exantema, llamado algodoncillo, en ocasiones es el primer signo de disfuncin inmunitaria. Si no se controla, C. albicans puede propagarse y causar candidosis sistmica, un trastorno que pone en peligro la vida. Otro ejemplo es el caso del virus Herpesvirus simplex, que normalmente provoca lesiones pequeas alrededor de los labios o los genitales. En las personas inmunodeficientes, tales lesiones pueden propagarse hasta cubrir grandes porciones del cuerpo. Dichas infecciones por microorganismos ampliamente difundidos, que se observan a menudo en casos de deficiencia inmunitaria, se denominan infecciones oportunistas. Varias infecciones oportunistas poco comunes que se identificaron en los primeros pacientes de SIDA fueron la seal de que su sistema inmunitario estaba gravemente afectado. En el caso de algunos patgenos que se sabe causan enfermedad grave, los mecanismos de adquisicin de inmunidad estn bien documentados y permiten controlar el trastorno. Por ejemplo, el ttanos es causado por una bacteria que es comn en el suelo (Clostridium tetani) y la cual acta a travs de una toxina que ataca el sistema nervioso (neurotoxina). Si no se trata, el ttanos produce la muerte en un corto tiempo. Existe una vacuna eficaz contra este trastorno, y si llega a fallar, es posible administrar anticuerpos contra la toxina para prevenir la enfermedad potencialmente letal. Antes de que se dispusiera de estas medidas de prevencin y tratamiento, todo aquel que sufra una herida por puncin con un objeto contaminado con tierra, por ejemplo un clavo mohoso, se encontraba en riesgo de sufrir una infeccin tetnica letal. En notable contraste con el xito para controlar el ttanos, no ha sido posible disear estrategias inmunitarias para controlar la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que provoca el SIDA.

PARTE I

INTRODUCCIN

c) a)

b)

d) [David M. Phillips/Photo Researchers.] c) Hongos: Candida albicans, una levadura que habita en boca, faringe, intestinos y vas genitourinarias del ser humano; C. albicans suele causar algodoncillo bucal o vaginitis en individuos inmunodecientes o que reciben antibiticos, los cuales destruyen la ora bacteriana normal. [Stem Jems/Photo Researchers.] d) Parsitos: forma larvaria de una laria, gusano parsito, al ser atacada por macrfagos. Alrededor de 120 millones de personas en todo el mundo padecen alguna forma de lariasis. [Oliver
Meckes/Nicole Ottawa/Eye of Science/Photo Researchers.]

FIGURA 1-5 Los patgenos representan las principales categoras de microorganismos que causan enfermedades al ser humano. a) Virus: micrografa electrnica de transmisin de rotavirus, principales causantes de diarrea en nios. Los rotavirus causan la muerte de alrededor de un milln de nios al ao en pases en vas de desarrollo, y la hospitalizacin de unos 50 000 lactantes al ao en Estados Unidos. [VEM/Photo Researchers.] b) Bacterias: Pseudomonas, una bacteria del suelo que constituye un patgeno oportunista para el ser humano; se le muestra al ser ingerida por macrfagos humanos.

El sistema inmunitario debe enfrentar todo tipo de agentes patgenos y ha desarrollado por evolucin mltiples estrategias para combatir la invasin de agentes patgenos que han rebasado las primeras barreras de la piel y las mucosas. Veremos que algunas de estas estrategias estn encaminadas a reaccionar en el instante mismo en que un patgeno supera las barreras del hospedador; otras defensas estn diseadas para actuar una vez que se ha establecido la infeccin.

Inmunidad innata y adaptativa

La inmunidad el estado de proteccin contra una enfermedad infecciosa tiene un componente menos especfico y otro que lo es ms. El componente menos especfico, la inmunidad innata,

es la primera lnea de defensa contra una infeccin. Casi todos los componentes de la inmunidad innata se encuentran antes del inicio de la infeccin y constituyen un grupo de mecanismos de resistencia contra la enfermedad que no son especficos de un patgeno particular sino que incluyen componentes celulares y moleculares, que reconocen clases de molculas peculiares a los patgenos que se encuentran con frecuencia. El primer obstculo para un patgeno son las barreras que protegen al hospedador. De stas, las ms conspicuas son la piel y las membranas mucosas. La acidez del contenido estomacal y del sudor son otra barrera contra los microorganismos incapaces de prosperar en condiciones cidas. Enzimas como la lisozima, presente en las lgrimas, atacan las paredes celulares de determinadas bacterias cuando entran en contacto con ellas. La importancia de estas barreras se hace evidente cuando son supe-

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P TU L O

radas. Las mordeduras o picaduras de animales pueden desgarrar la piel e introducir diversas enfermedades. Las mordeduras de vertebrados pueden transmitir rabia y ttanos, mientras que los invertebrados propagan una multitud de enfermedades, como paludismo (mosquitos), peste (pulgas) y enfermedad de Lyme (garrapatas). Un ejemplo impresionante de prdida de la funcin de barrera lo constituye el caso de las vctimas de quemaduras, quienes pierden la piel protectora en el sitio quemado y deben tratarse de manera vigorosa con frmacos para prevenir infecciones bacterianas y micticas. Despus de las barreras mecnicas, la inmunidad innata incluye diversas clulas, como los fagocitos demostrados por Metchnikoff, as como los compuestos antimicrobianos sintetizados por el hospedador que son capaces de reconocer y neutralizar a los invasores con base en marcadores moleculares de superficie comunes.

Las clulas fagocticas constituyen una barrera contra las infecciones

Otro mecanismo innato de defensa importante es la ingestin de material particulado extracelular por fagocitosis. Esta ltima es un tipo de endocitosis, el trmino general para la captacin por una clula de material de su ambiente. En la fagocitosis la membrana plasmtica de la clula se expande alrededor del material particulado, que puede incluir microorganismos patgenos completos. Casi la totalidad de la fagocitosis la llevan a cabo clulas especializadas, como los monocitos y neutrfilos sanguneos y los macrfagos tisulares (cap. 2). La mayora de los tipos celulares son capaces de adoptar otras formas de endocitosis, como la endocitosis mediada por receptor, en la que se internalizan molculas extracelulares despus de unirse a receptores celulares especficos, y la pinocitosis, proceso por el cual las clulas captan lquido del medio ambiente junto con cualquier molcula contenida en l.

Algunas molculas solubles contribuyen a la inmunidad innata

Diversos factores solubles contribuyen a la inmunidad innata, entre ellos la protena lisozima, las protenas del interfern, y componentes del sistema del complemento (cap. 7). La lisozima, una enzima hidroltica que se encuentra en las secreciones mucosas y las lgrimas, puede romper la capa de peptidoglucano de la pared celular bacteriana. El interfern es un grupo de protenas producidas por clulas infectadas por virus. Entre las mltiples funciones de los interferones se encuentra la capacidad de unirse a clulas cercanas e inducir un estado antivrico generalizado. El complemento, que se examina con detalle en el captulo 7, es un grupo de protenas sricas que circulan en estado inactivo. Mltiples mecanismos inmunitarios especficos e inespecficos pueden convertir las formas inactivas de las protenas del complemento en un estado activo con la capacidad de daar las membranas de microorganismos patgenos, sea que las destruyan o faciliten su eliminacin. El complemento se encuentra en una posicin prcticamente con un pie en el sistema inmunitario innato y el otro en el adaptativo, ya que algunos de sus componentes pueden enfrentar de manera directa a los patgenos, mientras que otros requieren de unin previa de anticuerpos para activar su sistema efector. Las reacciones entre molculas del complemento o fragmentos de ellas y receptores celulares estimulan la activacin de clulas del sistema inmunitario in-

nato o del adaptativo. Estudios recientes sobre las colectinas indican que estas protenas tensoactivas pueden destruir ciertas bacterias de manera directa por alteracin de sus membranas lipdicas o, de manera alternativa, al agregar las bacterias para incrementar su susceptibilidad a la fagocitosis. Muchas de las molculas que participan en la inmunidad innata tienen la propiedad del reconocimiento de patrn, que es la capacidad de identificar una clase especfica de molculas. Debido a que hay ciertos tipos de molculas que son exclusivas de los microorganismos y nunca se encuentran en organismos multicelulares, la capacidad de reconocer y combatir de inmediato a invasores que poseen estas molculas es una caracterstica muy til de la inmunidad innata. Las molculas con capacidad de reconocimiento de patrn pueden ser solubles, como la lisozima y los componentes del complemento descritos con anterioridad, o bien pueden ser receptores relacionados con clulas, como los receptores tipo Toll (TLR, del ingls Tolllike receptors), que se describen en el captulo 3. Si el patgeno invasor supera las barreras fsicas y qumicas del hospedador, entonces es posible que sea detectado por molculas de reconocimiento de patrn del hospedador y atrapado por clulas fagocticas, lo que hace que el sistema experimente una reaccin inflamatoria (caps. 3 y 13). Esta reaccin concentra elementos de inmunidad innata en el sitio de inflamacin y puede dar por resultado una reaccin inmunitaria especfica contra el invasor. La respuesta especfica inducida por la inflamacin es la inmunorreaccin adaptativa (que a veces recibe el nombre de adquirida). En contraste con la amplia reactividad del sistema inmunitario innato, que es uniforme en todos los miembros de una especie, el componente especfico, la inmunidad adaptativa, no acta sino hasta que existe un reto antignico para el organismo. La inmunidad adaptativa responde al desafo con un grado elevado de especificidad y, asimismo, con la propiedad notable de memoria. De manera caracterstica, se observa una reaccin inmunitaria adaptativa contra un antgeno en el transcurso de cinco a seis das despus de la exposicin inicial a ese antgeno. La exposicin al mismo antgeno algn tiempo despus tiene como resultado una respuesta de memoria: la reaccin inmunitaria al segundo contacto ocurre en menos tiempo que la primera, es ms potente y con frecuencia ms eficaz para neutralizar y eliminar el patgeno. Los principales agentes de la inmunidad adaptativa son los linfocitos y los anticuerpos que stos producen. En el cuadro 1-3 se comparan la inmunidad innata y la adaptativa. Debido a que las respuestas inmunitarias adaptativas requieren cierto tiempo para emitirse, la inmunidad innata proporciona la primera lnea de defensa durante el perodo crtico, inmediatamente despus de la exposicin del hospedador a un patgeno. En general, la mayora de los microorganismos que encuentra un individuo sano son eliminados con facilidad en el transcurso de unos cuantos das por los mecanismos de defensa del sistema inmunitario innato antes de activar el adaptativo.

La colaboracin entre la inmunidad innata y la adaptativa incrementa la inmunorreactividad

Es importante apreciar que los sistemas inmunitarios innato y adaptativo no operan de manera independiente entre s; funcionan en un sistema altamente interactivo y cooperativo, produciendo una respuesta combinada ms eficaz de lo que cualquiera

10

PA RT E I

INTRODUCCIN

CUADRO 1-3

Comparacin de las inmunidades innata y adaptativa

Innata Adaptativa

molculas conocidas como protenas adaptadoras se unen de manera especfica y simultnea a dos o ms molculas distintas que participan en la va de sealizacin, de modo que las acercan entre s y promueven su actividad combinada. La recepcin de seales a menudo ocasiona la generacin de un segundo mensajero dentro de la clula; se trata de una molcula o ion capaz de difundirse a otros sitios de la clula y estimular cambios metablicos. Son ejemplos nucletidos cclicos (cAMP, cGMP), ion calcio (Ca2+) y derivados de fosfolpido de membrana como diacilglicerol (DAG) y trifosfato de inositol (IP3). Se activan o inhiben proteincinasas y proteinfosfatasas. Las cinasas catalizan la fosforilacin de residuos blanco (tirosina, serina o treonina) de protenas de transduccin de seales clave. Las fosfatasas catalizan la desfosforilacin, con lo cual invierten el efecto de las cinasas. Estas enzimas tienen papeles esenciales en muchas vas de transduccin de seales de inters inmunolgico. Las seales son amplificadas por cascadas enzimticas. Una enzima en una va de sealizacin, una vez activada, cataliza muchas otras reacciones. La enzima puede generar una multitud de molculas del componente que sigue en la va o activar muchas copias de la siguiente enzima en la secuencia. Esto amplifica en gran medida la seal en cada paso y da oportunidades para modular la intensidad de una seal.

Tiempo de respuesta Especicidad

Horas Limitada y ja

Das Muy diversa; mejora durante el curso de la reaccin inmunitaria Mucho ms rpida que la respuesta primaria Linfocitos; receptores especcos de antgeno; anticuerpos

Respuesta a infecciones repetidas Componentes principales

Idntica a la respuesta primaria Barreras (p. ej., piel); fagocitos; molculas de reconocimiento de patrn

de las dos ramas podra producir por s misma. Determinados componentes inmunitarios celulares y moleculares tienen importantes papeles en ambos tipos de inmunidad. Un ejemplo de cooperacin se observa en el encuentro entre macrfagos y microorganismos. Las interacciones entre receptores en los macrfagos por un lado y componentes microbianos por el otro generan protenas solubles que estimulan y dirigen inmunorreacciones adaptativas, lo que facilita la participacin del sistema inmunitario adaptativo en la eliminacin del patgeno. Las protenas solubles son molculas tipo factor del crecimiento conocidas por el nombre general de citocinas. stas reaccionan con receptores presentes en diversos tipos celulares e indican (sealan) a la clula que realice funciones como la sntesis de nuevos factores o que experimente la diferenciacin en un nuevo tipo celular. Una clase restringida de citocinas, llamadas quimiocinas, tiene actividad quimiotctica y recluta clulas especficas en el sitio en que la clula secreta esa citocina. El tipo de comunicacin intracelular mediado por citocinas recibe el nombre general de sealizacin. Bsicamente, la sealizacin consiste en la reaccin entre una molcula soluble (ligando) y una molcula unida a la membrana celular (receptor) o entre molculas unidas a membrana en dos clulas distintas. La interaccin entre un receptor y su ligando induce adaptaciones metablicas en las clulas. Existe una enorme cantidad de vas de transduccin de seales distintas, todas las cuales exhiben temas en comn tpicos de estos procesos integrativos:

La transduccin de seales comienza cuando una seal se une a su receptor. Los receptores pueden estar dentro o fuera de la clula. Las seales que no pueden penetrar la membrana celular se unen a receptores en la superficie de la clula. Este grupo incluye molculas de sealizacin hidrosolubles y ligandos unidos a membrana (complejos MHC-pptido, por ejemplo). Las seales hidrfobas, como los esteroides, pueden difundirse a travs de la membrana celular y son capturadas (enlazadas) por receptores intracelulares. Muchas vas de transduccin de seales implican el ensamblaje de componentes de esa va inducido por una seal. Las

Estos procesos se representan de manera esquemtica en la figura 1-6. La actividad que resulta de la transduccin de seales puede ser de sntesis o secrecin (o ambas) de determinadas protenas, de diferenciacin, o de inicio o cese de funciones especficas. Por ejemplo, los macrfagos estimulados secretan citocinas que pueden dirigir inmunorreacciones adaptativas de linfocitos contra patgenos especficos. De manera complementaria, el sistema inmunitario adaptativo produce seales y componentes que elevan la eficacia de las reacciones innatas. Algunos linfocitos T, cuando encuentran antgeno presentado de manera apropiada, sintetizan y secretan citocinas que incrementan la capacidad de los macrfagos de destruir los microorganismos que han ingerido. Asimismo, los anticuerpos producidos contra el invasor se unen al patgeno, con lo cual lo marcan como un blanco del ataque de macrfagos o de protenas del complemento y sirven como un potente activador del ataque. Una diferencia importante entre la inmunidad adaptativa y la innata es la rapidez de la segunda, la cual utiliza un repertorio preexistente pero limitado de componentes de respuesta. La inmunidad adaptativa compensa su inicio ms lento con su capacidad de reconocer un repertorio mucho ms amplio de sustancias extraas y de mejorar durante una respuesta, mientras que la inmunidad innata permanece constante.

La inmunidad adaptativa es altamente especca

La inmunidad adaptativa es capaz de reconocer y eliminar de manera selectiva microorganismos y molculas extraas especficos (es decir, antgenos ajenos). A diferencia de las reacciones

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T U L O

11

FIGURA 1-6 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

Temas comunes

en la transduccin de seales
Recepcin de la seal 1 Las vas de sealizacin se inician cuando una seal se une a su receptor Receptor en la superficie celular Seal unida a membrana Ligando hidrosoluble Ligando soluble en membrana

Receptor intracelular

Transduccin 2 La unin del ligando al receptor induce el ensamblaje de componentes de la va de sealizacin Generacin mediada por seal del sitio de unin La protena adaptadora se une Se unen una o ms protenas adicionales

3 La generacin de segundo mensajero lleva la seal al interior de la clula

Sustrato (inactivo) 4 Los ciclos de fosforilacin/ desfosforilacin bajo control de la va de sealizacin activan/ desactivan componentes adicionales de la va Cinasa P

P Segundo mensajero

Activacin de componentes de la va

Inactiva

ATP

ADP

Activa

P Fosfatasa 5 Cascadas enzimticas amplifican la seal, convirtiendo molculas a sus formas activas P Pueden ocurrir cientos o miles de reacciones en cada nivel

Efectores metablicos

12

PA RT E I

INTRODUCCIN

inmunitarias innatas, las adaptativas no son iguales en todos los miembros de una especie, sino que son respuestas a retos antignicos especficos. La inmunidad adaptativa posee cuatro atributos caractersticos:

Especificidad antignica Diversidad Memoria inmunitaria Reconocimiento de lo propio y lo extrao

ciones normales slo a antgenos extraos, lo que indica que es capaz de reconocer entre lo propio y lo extrao. La capacidad del inmunosistema de diferenciar lo propio de lo ajeno y reaccionar slo a molculas extraas es esencial. Como se describe ms adelante, la incapacidad de tal reconocimiento lleva a una respuesta inapropiada a molculas propias y puede ser letal.

La especificidad antignica del sistema inmunitario adaptativo permite reconocer diferencias sutiles entre los antgenos. Los anticuerpos pueden distinguir entre dos molculas protenicas que difieren slo en un aminocido. El sistema inmunitario es capaz de generar una enorme diversidad de molculas de reconocimiento, lo cual posibilita identificar miles de millones de estructuras nicas en antgenos extraos. Esta capacidad contrasta con el caso de las molculas de reconocimiento de patrn del sistema innato, que reconocen clases amplias de microorganismos con base en estructuras moleculares presentes en ellos. El sistema adaptativo puede reconocer un tipo individual de microorganismo y distinguir entre individuos de esta especie con variaciones genticas mnimas. Una vez que el sistema inmunitario adaptativo reconoce y responde a un antgeno muestra memoria inmunitaria; es decir, un segundo encuentro con el mismo antgeno induce un estado mucho mayor de inmunorreactividad. Debido a este atributo, el sistema inmunitario puede conferir inmunidad durante toda la vida contra muchos agentes infecciosos despus de un contacto inicial. Por ltimo, el sistema inmunitario reacciona en condia) Clula B b) Sitio de unin a antgeno

Linfocitos y clulas presentadoras de antgeno cooperan en la inmunidad adaptativa

Una reaccin inmunitaria eficaz incluye dos grupos principales de clulas: linfocitos T y clulas presentadoras de antgeno. Los linfocitos son uno de muchos tipos de glbulos blancos que se producen en la mdula sea por el proceso de hematopoyesis (cap. 2). Salen de la mdula sea, circulan en los sistemas sanguneo y linftico y residen en diversos rganos linfoides. Debido a que producen y exhiben receptores de superficie celular que unen antgeno, los linfocitos median los atributos inmunitarios definitorios de especificidad, diversidad, memoria y autorreconocimiento. En este captulo se describen de manera sinptica, y con mayor detalle en captulos siguientes, las dos poblaciones principales de linfocitos: clulas B y clulas T.

Clulas B
Las clulas B o linfocitos B maduran dentro de la mdula sea; cuando la abandonan, cada una expresa un receptor de unin a antgeno nico en su membrana (fig. 1-7). Este receptor de unin a antgeno o receptor de clula B es una molcula de anticuerpo unida a la membrana (fig. 1-7b, c). Los anticuerpos
c)

Anticuerpo de superficie

Anticuerpo soluble

Receptor de unin a antgeno (anticuerpo)

Enlaces disulfuro

Cadena ligera

Cadena pesada

Membrana plasmtica

FIGURA 1-7 Clula B. a) Las supercies de las clulas B albergan

unas 105 molculas de anticuerpo ligado a membrana por clula. Todas las molculas de anticuerpo en una clula B dada tienen la misma especicidad antignica y pueden interactuar directamente con antgeno. b) Anticuerpo ligado a membrana y soluble (secreta-

do) que muestra las cadenas pesadas y ligeras. c) Ntese que la forma soluble carece de las secuencias que se unen a la membrana celular. (Los valos en el diagrama representan pliegues caractersticos en la protena llamados dominios Ig, que se consideran en el captulo 4.)

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T U L O

13

a) Clula TH TCR CD4

c) Clulas presentadoras de antgeno

MHC clase II Antgeno presentado por una molcula MHC b) Clula TC TCR CD8

MHC clase I

CD4

TCR Membranas plasmticas de clulas T

CD8

TCR

Clulas T colaboradoras (TH)

Clulas T citotxicas (TC )

FIGURA 1-8 Clulas T. El receptor de clula T (TCR), una

molcula de jacin de antgeno, es clave para el funcionamiento de los linfocitos T. En general, las clulas T que portan CD4 (clulas CD4+) actan como a) linfocitos colaboradores, y b) las clulas CD8+ actan como clulas citotxicas. c) Las clulas CD4+ slo reconocen antgeno unido a molculas MHC clase II en clulas presentadoras

de antgeno. Las clulas CD8+ slo reconocen antgeno asociado a molculas MHC clase I. Ambos tipos de clulas T expresan alrededor de 105 molculas idnticas del receptor de clula T de unin a antgeno por clula, todas con la misma especicidad antignica. (Los valos en los diagramas representan pliegues caractersticos en la protena, que se consideran en el captulo 4.)

son glucoprotenas que constan de dos cadenas polipeptdicas pesadas idnticas y dos ligeras tambin idnticas. Cada cadena pesada est unida a una ligera por enlaces disulfuro, y los pares de cadenas pesada y ligera se conservan unidos entre s mediante enlaces disulfuro adicionales. Los extremos amino terminales de los pares de cadenas pesada y ligera forman una hendidura dentro de la cual se unen antgenos. Cuando una clula B virgen o inocente (que no ha encontrado antes algn antgeno) halla por primera vez el antgeno que corresponde a su anticuerpo unido a la membrana, la unin del antgeno al anticuerpo hace que la clula se divida con rapidez y su progenie se diferencie en clulas B de memoria y clulas B efectoras llamadas clulas plasmticas. Las clulas B de memoria tienen un lapso de vida ms prolongado que las clulas vrgenes y expresan el mismo anticuerpo unido a membrana que la clula B original. Las clulas plasmticas producen el anticuerpo en una forma que puede secretarse (fig. 1-7b, derecha) y tienen poco o nada de anticuerpo unido a membrana. Aunque las clulas plasmticas slo viven unos cuantos das, secretan cantidades enormes de anticuerpos durante este perodo. Una clula plasmtica individual puede liberar cientos a miles de molculas de anticuerpo por segundo. Los anticuerpos secretados son las principales molculas efectoras de la inmunidad humoral.

Clulas T
Las clulas T tambin se generan en la mdula sea. A diferencia de las clulas B, que maduran dentro de sta, las clulas T migran a la glndula timo para madurar. Las clulas T en maduracin expresan en su membrana una molcula de unin a antgeno nica, denominada receptor de clula T (TCR, del ingls T-cell receptor). Existen dos subpoblaciones de clulas T bien definidas: clulas T colaboradoras (TH) y clulas T citotxicas (TC). Ambos tipos (fig. 1-8a y b) pueden distinguirse entre s por la presencia de glucoprotenas de membrana CD4 o CD8 en su superficie. Las clulas T que muestran CD4 suelen funcionar como clulas TH, en tanto que las que exhiben CD8 lo hacen casi siempre como clulas TC (cap. 2). Un tercer tipo recin caracterizado de clula T, conocida como linfocito T regulador (Treg), porta CD4 en su superficie pero puede distinguirse de las clulas TH y TC por marcadores de superficie asociados a su fase de activacin. A diferencia de los anticuerpos unidos a membrana en las clulas B, que reconocen antgenos libres, la mayora de los receptores de clula T nicamente puede identificar antgenos unidos a protenas de membrana celular llamadas molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, del ingls major histocompatibility complex). Las molculas del MHC (o simplemente molculas MHC) son glucoprotenas polimrficas

14

PA RT E I

INTRODUCCIN

(diversas desde el punto de vista gentico) que se encuentran en las membranas celulares (cap. 8). Existen dos tipos principales de molculas MHC: molculas MHC clase I, que casi todas las clulas nucleadas de las especies de vertebrados expresan, y molculas MHC clase II, que slo las clulas presentadoras de antgeno (APC, del ingls antigen-presenting cells) expresan (fig. 1-8c). Cuando una clula T virgen encuentra antgeno asociado con una molcula MHC en una clula, prolifera y se diferencia en clulas T de memoria y varias clulas T efectoras. Una vez que la clula TH reconoce un complejo de antgeno y molcula MHC clase II e interacta con l, se activa: experimenta una transformacin metablica y comienza a secretar diversas citocinas. Las citocinas secretadas tienen una funcin importante en la activacin de clulas B, clulas TC, macrfagos y varios tipos celulares ms que intervienen en la inmunoreaccin. Las diferencias en los tipos de citocinas producidas por clulas TH activadas tienen como resultado diferentes patrones de inmunorreaccin. Una posible respuesta es la induccin de un cambio en las clulas TC para formar linfocitos T citotxicos (CTL, del ingls cytotoxic T lymphocytes), los cuales exhiben actividad citotxica o de destruccin celular. El CTL tiene una funcin vital en la vigilancia de las clulas del cuerpo y la eliminacin de cualquiera que exhiba antgeno, como las clulas infectadas por virus, las clulas tumorales y las clulas de un injerto de tejido extrao.

FIGURA 1-9 Micrografa electrnica de un macrfago presentador de antgeno (derecha) al asociarse a un linfocito T. [Tomada
de A.S. Rosenthal et al., 1982, en PhagocytosisPast and future, Academic Press, p. 239.]

Las clulas presentadoras de antgeno interactan con clulas T

La activacin de las ramas humoral y mediada por clulas del sistema inmunitario requiere citocinas producidas por linfocitos TH. Es esencial que se regule de modo cuidadoso la activacin de clulas TH por s mismas, dado que una respuesta inapropiada del linfocito T a componentes propios puede tener consecuencias autoinmunitarias letales. Una salvaguarda contra la actividad descontrolada de clulas TH es que sus receptores de antgeno slo pueden reconocer antgeno que se exhibe junto con molculas MHC clase II en la superficie de clulas presentadoras de antgeno. Estas clulas especializadas, que incluyen macrfagos, linfocitos B y clulas dendrticas, se distinguen por dos propiedades: a) expresan molculas MHC clase II en sus membranas y b) son capaces de producir citocinas que causan la activacin de clulas TH. Las clulas presentadoras de antgeno primero internalizan antgeno, sea por fagocitosis o endocitosis, y a continuacin exhiben una parte de dicho antgeno en su membrana unido a una molcula MHC clase II. El linfocito TH interacta con el complejo de antgeno y molcula MHC clase II en la membrana de la clula presentadora de antgeno (fig. 1-9). Entonces esta clula produce una seal adicional que conduce a la activacin de la clula TH.

La rama humoral del sistema inmunitario funciona cuando sucede la interaccin de las clulas B con antgeno y su proliferacin y diferenciacin subsecuentes en clulas plasmticas que secretan anticuerpo (fig. 1-10). El anticuerpo acta como efector de la respuesta humoral, se une a antgeno y neutraliza o facilita su eliminacin. Un antgeno cubierto de anticuerpo puede eliminarse de varias maneras. Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazar en forma cruzada varios antgenos y formar agregados que las clulas fagocticas ingieren con mayor facilidad. La unin de anticuerpo a antgeno en un microorganismo tambin puede activar el sistema de complemento, que tiene como resultado la lisis del microorganismo. El anticuerpo tambin puede neutralizar toxinas o partculas vricas y recubrirlas, lo que impide que se unan a clulas del hospedador. Las clulas T efectoras generadas en respuesta a antgeno tienen a su cargo la inmunidad mediada por clulas (fig. 1-10). Las clulas TH activadas y los linfocitos T citotxicos (CTL) sirven como clulas efectoras en las reacciones inmunitarias mediadas por clulas. Las citocinas secretadas por clulas TH pueden activar varias clulas fagocticas y permitirles que fagociten y destruyan microorganismos con mayor eficacia. Este tipo de respuesta inmunitaria mediada por clulas es en especial importante para liberar al hospedador de bacterias y protozoarios contenidos en clulas hospedador infectadas. Los CTL participan en las reacciones inmunitarias mediadas por clulas y destruyen clulas propias alteradas; tienen una funcin esencial en la destruccin de clulas infectadas por virus y clulas tumorales.

Las inmunorreacciones humoral y celular tienen distintas funciones efectoras

Como ya se mencion, las reacciones inmunitarias pueden dividirse en humoral y mediada por clulas. La humoral se refiere a la inmunidad que puede conferirse a un individuo no inmune mediante la administracin de anticuerpos sricos de una persona inmune. En contraste, la inmunidad mediada por clulas slo puede transferirse con la administracin de clulas T de un sujeto inmune.

Los receptores de antgeno de los linfocitos B y T son diversos

El receptor de unin a antgeno ligado a la membrana (es decir, el anticuerpo) expresado por la clula determina la especificidad antignica de cada clula B. A medida que madura la clula B en la mdula sea, se crea su especificidad por reordenamientos aleatorios de una serie de segmentos del gen que codifica la molcula de anticuerpo (cap. 5). En la madurez, cada clula B posee un gen funcional nico que codifica la cadena pesada de anticuerpo y un gen funcional nico que codifica la cadena ligera de

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P TU L O 1

15

FIGURA 1-10 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

Ramas humoral y mediada por clulas del sistema inmunitario

Antgenos

Protenas extraas

Virus

Bacterias

Parsitos

Hongos

Antgeno internalizado digerido por la clula 2

La clula propia alterada presenta antgeno MHC clase I

MHC clase II Clula TH 3

Clula TC Los receptores de la clula T reconocen antgeno unido a molculas MHC 6

Clula TH activada 4 La unin de antgeno con MHC activa clulas T

Los CTL activados reconocen y destruyen clulas propias alteradas

Linfocito T citotxico (CTL) 5 Respuesta mediada por clulas Respuesta humoral

La clula TH activada secreta citocinas que contribuyen a la activacin de clulas B, clulas TC y otras clulas

+ Antgeno Clula B 7 Las clulas B interactan con el antgeno y se diferencian en clulas plasmticas que secretan anticuerpo Clulas plasmticas que secretan anticuerpo 8 El anticuerpo une antgeno y facilita su eliminacin del cuerpo

En la respuesta humoral interactan clulas B con antgeno y, a continuacin, se diferencian en clulas plasmticas que secretan anticuerpo. El anticuerpo secretado se une al antgeno y facilita su eliminacin del cuerpo. En la respuesta mediada por clulas varias subpoblaciones de clulas T reconocen antgeno presen-

tado en clulas propias. Las clulas TH responden al antgeno y producen citocinas. Las clulas TC reaccionan al antgeno y evolucionan a linfocitos T citotxicos (CTL), que median la destruccin de clulas propias alteradas (p. ej., clulas infectadas por virus).

16

PA RT E I

INTRODUCCIN

Pptido antignico MHC clase I MHC clase II Receptor de clula T CD8

Clula TC

Clula TH

Clula TC

Clula TH CD4 Clula infectada con virus Clula presentadora de antgeno

FIGURA 1-11 Funcin de las molculas MHC en el reconocimiento de antgeno por clulas T. Las molculas MHC clase I se expresan en casi todas las clulas nucleadas. Las molculas MHC clase II slo lo hacen en clulas presentadoras de antgeno. Las clulas T que slo reconocen pptidos antignicos, que se muestran

con una molcula MHC clase II, suelen funcionar como clulas T colaboradoras (TH). Las clulas T que slo reconocen pptidos antignicos, que se muestran con una molcula MHC clase I, por lo general actan como clulas T citotxicas (TC).

anticuerpo. Todas las molculas de anticuerpo en un linfocito B determinado tienen especificidad idntica, lo que confiere a cada linfocito B y a la clona de clulas hijas a la que da lugar una especificidad precisa para un eptopo nico en cada antgeno. Por esta razn, se dice que la clula B madura est antignicamente comprometida o dedicada. El reordenamiento aleatorio del gen durante la maduracin de la clula B en la mdula sea crea un nmero enorme de diferentes especificidades antignicas. Se estima que la poblacin de clulas B resultante, que consiste en clulas B individuales que expresan cada una un anticuerpo nico, muestra en conjunto ms de 1010 diferentes especificidades antignicas. Un proceso de seleccin en la mdula sea elimina cualquier clula B con anticuerpo unido a membrana que reconozca componentes propios. (Esto se considera en detalle en el captulo 11.) Tal proceso de seleccin ayuda a asegurar que no se propaguen anticuerpos autorreactivos (autoanticuerpos). Los atributos de especificidad y diversidad tambin caracterizan al receptor de clula T (TCR) de unin a antgeno en los linfocitos T. Al igual que la maduracin de la clula B, el proceso de maduracin de la clula T incluye reordenamientos aleatorios de una serie de segmentos del gen que codifican los receptores de unin a antgeno de la clula (cap. 9). Cada linfocito T expresa alrededor de 105 receptores, y todos los receptores en la clula y su progenie clonal tienen una especificidad de antgeno idntica. El reordenamiento aleatorio de los genes que codifican TCR es capaz de generar especificidades antignicas nicas en el orden de 109.

cibi atencin por primera vez debido a que acta como barrera contra el trasplante de tejidos. La incompatibilidad de genes del MHC ocasiona el rechazo de tejidos y rganos trasplantados, de aqu el nombre histocompatibilidad. Los loci del MHC codifican dos clases mayores de glucoprotenas unidas a membrana: molculas MHC clase I y clase II. Como se coment con anterioridad, las clulas TH suelen reconocer antgeno asociado con molculas clase II, en tanto que las clulas TC por lo general identifican antgeno asociado con molculas clase I (fig. 1-11). Las molculas MHC funcionan como molculas de reconocimiento de antgeno, pero no poseen la especificidad fina para antgeno caracterstica de los anticuerpos y receptores de clula T. Por el contrario, cada molcula MHC puede unirse a una gama de pptidos antignicos derivados principalmente de la degradacin de molculas protenicas. En las molculas MHC clase I y clase II hay una hendidura dentro de la cual se asienta el pptido antignico y se presenta a linfocitos T (fig. 1-11).

La seleccin de antgeno por los linfocitos causa expansin clonal

Un animal maduro inmunocompetente (con capacidad inmunitaria) contiene un gran nmero de clonas de linfocitos T y B reactivos a antgeno; la especificidad del receptor de unin a antgeno en la membrana de los linfocitos de la clona determina la especificidad antignica de cada una de estas clonas. Como se coment, la especificidad de cada linfocito T y B se establece antes de su contacto con el antgeno por reordenamientos aleatorios en el gen durante la maduracin en el timo o la mdula sea. La funcin del antgeno se torna crtica cuando ste interacta con linfocitos T y B maduros antignicamente comprometidos y los activa; esto provoca la expansin de la poblacin de clulas con una especificidad antignica determinada. En este proceso de seleccin clonal, un antgeno se une a una clula T o B dada y la estimula para que se divida repetidas veces en una

Las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad unen pptidos antignicos

El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) es un complejo gentico grande con mltiples loci. Este grupo de genes re-

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T U L O

17

Mdula sea

Tejido linfoide perifrico

Clula de memoria 2 2 1 1 2 Clulas plasmticas 2 Antgeno 2 2 2 2 2 2 Anticuerpo 2

Reordenamiento de gen Clula madre 3 3 2 2

2 2 2 Linfocitos B maduros Maduracin hacia clulas B maduras antignicamente comprometidas Linfocitos B maduros Proliferacin y diferenciacin dependiente de antgeno en clulas plasmticas y de memoria

FIGURA 1-12 Maduracin y seleccin clonal de linfocitos B. La maduracin, que ocurre en ausencia de antgeno, produce clulas B antignicamente comprometidas, cada una de las cuales expresa anticuerpo con especicidad antignica nica (indicada por 1, 2, 3 y 4). Ocurre seleccin clonal cuando un antgeno se une a una clula B cuyas molculas de anticuerpo unidas a membrana son especcas para eptopos en dicho antgeno. La expansin clonal de una clula B activada por antgeno (nmero 2 en este ejemplo) conduce a una

clona de clulas B de memoria y clulas B efectoras, llamadas clulas plasmticas; todas las clulas en la clona expandida son especcas para el antgeno original. Las clulas plasmticas secretan anticuerpo que reacciona con el antgeno activador. Se observan procesos similares en la poblacin de linfocitos T, cuyos resultados son clonas de clulas T de memoria y clulas T efectoras; estas ltimas incluyen clulas TH activadas, que secretan citocinas, y linfocitos T citotxicos (CTL).

clona de clulas con la misma especificidad antignica que la clula original (fig. 1-12). La seleccin clonal proporciona un marco estructural para comprender la especificidad y el reconocimiento de lo propio y lo extrao que es caracterstico de la inmunidad adaptativa. La especificidad se demuestra porque slo linfocitos cuyos receptores son especficos para un eptopo determinado en un antgeno se expanden clonalmente y por tanto se movilizan para oponer una reaccin inmunitaria. La discriminacin de lo propio y lo extrao se efecta por la eliminacin, durante el desarrollo, de linfocitos que llevan receptores autorreactivos o por la supresin funcional de estas clulas si alcanzan la madurez.

La memoria inmunitaria es otra consecuencia de la seleccin clonal. Durante sta se amplifica en grado considerable el nmero de linfocitos especficos para un antgeno determinado. Ms an, muchos de estos linfocitos, que se denominan clulas de memoria, tienen al parecer un lapso de vida ms prolongado que los linfocitos vrgenes de los cuales provienen. El encuentro inicial de un linfocito virgen con capacidad inmunitaria con un antgeno induce una inmunorreaccin primaria; un contacto posterior del hospedador con antgeno causa una inmunoreaccin secundaria ms rpida e intensa. La poblacin amplificada de clulas de memoria explica la rapidez e intensidad que distingue a una reaccin secundaria de la primaria.

18

PA RT E I

INTRODUCCIN

Valor de anticuerpo srico

Antgeno A

Antgeno A + antgeno B

Respuesta primaria anti-A

Respuesta secundaria Respuesta anti-A primaria anti-B

FIGURA 1-13 Las diferencias en las respuestas primaria y

secundaria a un antgeno inyectado (respuesta humoral) y un injerto cutneo (respuesta mediada por clulas) reejan el fenmeno de memoria inmunitaria. Cuando se inyecta un antgeno a un animal, genera una reaccin primaria de anticuerpo srico de baja magnitud y duracin corta, que llega al mximo hacia los 10 a 17 das. Una segunda inmunizacin con el mismo antgeno activa una respuesta secundaria de mayor magnitud, que llega al mximo en menos tiempo (dos a siete das) y dura ms tiempo (meses a aos) que la respuesta primaria. Comprese la respuesta secundaria al antgeno A con la respuesta primaria al antgeno B administrados a los mismos ratones (parte sombreada azul claro).

14

0 6 Tiempo, das

14

En la rama humoral del sistema inmunitario, el antgeno induce la proliferacin clonal de linfocitos B en clulas plasmticas que secretan anticuerpo y clulas B de memoria. Como se observa en la figura 1-13, la respuesta primaria tarda alrededor de cinco a siete das antes de que comiencen a aumentar las concentraciones de anticuerpo. Este retraso es el tiempo requerido para la activacin de clulas B vrgenes por antgeno y clulas TH y para la proliferacin y diferenciacin subsecuentes de las clulas B activadas en clulas plasmticas. Las concentraciones de anticuerpo alcanzan su punto mximo en la respuesta primaria hacia los 14 das y luego comienzan a decrecer a medida que las clulas plasmticas mueren. En la reaccin secundaria, el retraso es mucho ms corto (slo uno a dos das), las concentraciones de anticuerpo son mucho ms altas y se sostienen por mucho ms tiempo. La respuesta secundaria refleja la actividad de la poblacin de clulas B de memoria expandida clonalmente. Estas clulas de memoria responden al antgeno con mayor rapidez que las clulas B vrgenes; adems, debido a que existen muchas ms clulas de memoria que linfocitos B vrgenes para la respuesta primaria, en la reaccin secundaria se generan ms clulas plasmticas; por consiguiente, las concentraciones de anticuerpo son 100 a 1 000 veces ms altas. En la rama del sistema inmunitario mediada por clulas, el reconocimiento de un complejo de antgeno y MHC por un linfocito T maduro especfico induce la proliferacin clonal en varias clulas T con funciones efectoras (clulas TH y CTL) y clulas T de memoria. Como en el caso de las inmunorreacciones humorales, las respuestas secundarias mediadas por clulas son ms rpidas y ms intensas que las primarias.

correcta. Algunas veces es incapaz de dar proteccin adecuada al hospedador o dirige de modo errneo sus actividades para causar malestar, enfermedades debilitantes o incluso la muerte. Existen varias manifestaciones comunes de disfuncin inmunitaria:

Alergia y asma Rechazo de un injerto y enfermedad de injerto contra hospedador Enfermedad autoinmunitaria Inmunodeficiencia

Disfuncin inmunitaria y sus consecuencias

El anterior panorama general de la inmunidad innata y la adaptativa ilustra un sistema interactivo de mltiples componentes que protege al hospedador contra la invasin por agentes que causan enfermedades infecciosas y contra clulas alteradas que podran reproducirse de manera descontrolada y producir cncer. Este cuadro general no sera completo si no se mencionara que el sistema inmunitario puede funcionar de manera in-

La alergia y el asma son efectos de una respuesta inmunitaria inapropiada, con frecuencia a antgenos comunes como polen, alimentos o caspa de animales. La posibilidad de que ciertas sustancias agudicen la sensibilidad en lugar de proteger fue reconocida hacia 1902 por Charles Richet, quien intent inmunizar a perros contra las toxinas de un tipo de medusa, Physalia. Este investigador y su colega, Paul Portier, observaron que los perros expuestos a dosis subletales de la toxina reaccionaban casi de manera instantnea y letal a un contacto ulterior con cantidades diminutas de la toxina. Richet concluy que una inmunizacin o vacunacin exitosa creaba filaxis, o proteccin, y que poda observarse el resultado opuesto, anafilaxis, en la cual la exposicin al antgeno poda precipitar una sensibilidad potencialmente letal a l si se repeta la exposicin. Richet recibi el premio Nobel en 1913 por su descubrimiento de la reaccin anafilctica. Por fortuna, casi ninguna reaccin alrgica en seres humanos provoca la muerte con rapidez. Una respuesta alrgica o anafilctica especfica suele incluir un tipo de anticuerpo, llamado inmunoglobulina E (o, ms a menudo, IgE). La unin de IgE a su antgeno especfico (alergeno) libera sustancias que causan irritacin e inflamacin. Cuando una persona alrgica se expone a un alergeno, los sntomas pueden incluir estornudos, sibilancias y dificultad para respirar (asma); dermatitis o erupciones cutneas (urticaria), y, en casos ms extremos, ahogamiento debido al bloqueo de las vas respiratorias por inflamacin (fig. 1-14). Una proporcin considerable de los recursos para la salud se gasta en el cuidado de los pacientes que sufren alergia y asma. Estas dos ltimas anomalas representan en Estados Unidos las

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T U L O

19

FIGURA 1-14 Paciente con inamacin del ojo derecho debida a los efectos de la reaccin alrgica a una picadura de abeja. Tales reacciones de hipersensibilidad se deben a la sensibilizacin causada por la exposicin previa al veneno de abeja. Las picaduras de este insecto pueden causar dolor, enrojecimiento y tumefaccin, como se aprecia aqu, o provocar reacciones analcticas sistmicas que llevan a la muerte si no se tratan con rapidez. [Dr. P.
Marazzi/Photo Researchers.]

razones ms comunes para acudir al mdico o visitar la sala de urgencias de un hospital (vase el enfoque clnico). Cuando el sistema inmunitario encuentra clulas o tejido extraos, reacciona con intensidad para eliminar a los invasores del hospedador. Suele emitir la misma respuesta contra clulas mutantes propias, incluidas clulas cancerosas. Sin embargo, en algunos casos el trasplante de clulas u rgano de otra persona puede ser el nico tratamiento posible para una enfermedad, aunque el sistema inmunitario lo tome como una invasin extraa. Por ejemplo, se estima que slo en Estados Unidos ms de 70 000 personas se beneficiaran con un trasplante de rin. El hecho de que el sistema inmunitario ataque y rechace cualquier rgano trasplantado que reconozca como extrao constituye una barrera formidable que limita este tratamiento capaz de salvar la vida. Un peligro adicional del trasplante es que todas las clulas trasplantadas con capacidad inmunitaria (p. ej., cuando se trasplanta mdula sea para restablecer la actividad inmunitaria) pueden considerar al nuevo hospedador como ajeno y reaccionar contra l. Esta reaccin, que se conoce como enfermedad de injerto contra hospedador, puede ser letal. La reaccin de rechazo y la enfermedad de injerto contra hospedador pueden suprimirse con medicamentos, pero este tipo de teraputica anula toda la funcin inmunitaria, de tal manera que el hospedador ya no es protegido por su sistema inmunitario y se torna susceptible a enfermedades infecciosas. Los estudios de trasplante han tenido un papel relevante en el desarrollo de la inmunologa. Se concedi el premio Nobel a Karl Landsteiner (mencionado antes por su contribucin al concepto de especificidad inmunitaria) en 1930 por el descubrimiento de los grupos sanguneos ABO en el ser humano, lo que permiti llevar a cabo con seguridad transfusiones sanguneas. En 1980 se distingui a G. Snell, J. Dausset y B. Benacerraf por su descubrimiento del

complejo mayor de histocompatibilidad, y en 1991 E. D. Thomas y J. Murray recibieron el premio Nobel por los adelantos en la inmunidad de trasplantes. El desarrollo de procedimientos que permitan que un rgano extrao sea aceptado sin suprimir la inmunidad a todos los antgenos sigue siendo un desafo para los inmunlogos actuales. En ciertas personas, el sistema inmunitario falla porque pierde su capacidad de reconocer lo propio y lo extrao, lo cual propicia un ataque inmunitario en el hospedador. Este estado, llamado de autoinmunidad, puede ocasionar varias enfermedades crnicas debilitantes. Los sntomas de autoinmunidad difieren con los tejidos y rganos que se ataquen. Por ejemplo, la esclerosis mltiple se debe a un ataque autoinmunitario a cerebro y sistema nervioso central, en la enfermedad de Crohn la reaccin se enfoca en los tejidos intestinales, y la artritis reumatoide supone la lesin de las articulaciones de brazos y piernas. Los factores genticos y ambientales que desencadenan y sostienen una enfermedad autoinmunitaria son reas muy activas de la investigacin inmunolgica, al igual que el desarrollo de mejores tratamientos. Si cualesquiera de los mltiples componentes de las inmunidades innata o especfica es defectuoso como consecuencia de alguna anormalidad gentica, o si se pierde cualquier funcin inmunitaria a causa de dao por agentes qumicos, fsicos o biolgicos, el hospedador sufre inmunodeficiencia. La gravedad del trastorno por inmunodeficiencia depende del nmero de componentes comprometidos. Un tipo comn de inmunodeficiencia en Estados Unidos es una inmunodeficiencia selectiva, en la cual slo se carece de un tipo de inmunoglobulina (IgA); los sntomas pueden consistir en aumento de determinados tipos de infecciones, o bien es posible que la deficiencia pase inadvertida. En contraste, una anormalidad ms rara llamada inmunodeficiencia combinada grave (SCID, del ingls severe combined immunodeficiency), que afecta a clulas B y T, causa la muerte por infeccin a una edad temprana si no se trata. Desde el decenio de 1980, la forma ms comn de inmunodeficiencia es el sndrome de inmunodeficiencia adquirida, o SIDA, que resulta de la infeccin por un retrovirus, el virus de la inmunodeficiencia humana o VIH. En el SIDA este patgeno infecta y destruye las clulas T colaboradoras, y la consecuencia es un colapso del sistema inmunitario. Se estima que 40 millones de personas en el mundo padecen este trastorno, que suele ser letal en el transcurso de ocho a 10 aos despus de la infeccin. Aunque ciertos tratamientos pueden prolongar la vida de los pacientes con SIDA, no se conoce una curacin para la enfermedad. Este captulo es una breve introduccin al sistema inmunitario y proporciona un esquema sinptico del modo en que este complejo sistema protege al hospedador de la enfermedad. En los captulos siguientes se examinan la estructura y funcin de clulas, rganos y molculas individuales que lo caracterizan. Se describen los conocimientos actuales acerca de la forma en que interactan los componentes de la inmunidad y los experimentos que permitieron descubrir estos mecanismos. Los temas de captulos ulteriores son reas especficas de la inmunologa aplicada, como la inmunidad a enfermedades infecciosas, el cncer, las prcticas actuales de vacunacin y los principales tipos de disfuncin inmunitaria.

20

PA RT E I

INTRODUCCIN

EN F O Q U E C L N I C O

Alergia y asma como problemas graves de salud pblica

Aunque el sistema inmunitario protege
al hospedador de infecciones y cncer, las respuestas inapropiadas de este sistema pueden conducir a enfermedades. Entre los resultados comunes de la disfuncin inmunitaria se encuentran alergias y asma, ambos problemas de salud pblica relevantes. En el captulo 15 se describen detalles de los mecanismos que sustentan las reacciones alrgicas y asmticas a antgenos (o alergenos) ambientales. Dicho en forma simple, las reacciones alrgicas son respuestas a estmulos antignicos que inducen inmunidad basada sobre todo en la clase IgE de inmunoglobulina. La exposicin al antgeno (o alergeno) desencadena la liberacin de molculas mediada por IgE que causa sntomas variables, desde estornudo y dermatitis hasta inamacin de los pulmones en un ataque de asma. En la gura adjunta se muestra la secuencia de fenmenos de una reaccin alrgica. Las molestias por alergias comunes, por ejemplo al polen, son breves, y consisten en estornudos y secrecin nasal; estos problemas pueden parecer inocuos si se comparan con los efectos de cncer, paro cardaco o infecciones que ponen en peligro la vida. Una reaccin alrgica ms grave es el asma, una afeccin crnica de los pulmones en que la inamacin, mediada por antgenos ambientales o infecciones, causa intensa dicultad respiratoria. Segn las estadsticas para 2002 de los Centers for Disease Control, de Estados Unidos, 20 millones de personas padecen asma en ese pas, y cada ao 12 millones sufren una crisis asmtica. Se registran alrededor de 5 000 muertes por ao a causa del asma. En los ltimos dos decenios se duplic la prevalencia de asma en el mundo occidental.* La importancia de la alergia como problema de salud pblica se destaca por el hecho de que las cifras anuales de visitas a mdicos por hipertensin, exmenes mdicos sistemticos o embarazo normal son menores que el nmero de consultas por padecimientos alrgicos. En realidad, la razn ms comn para acudir a una sala de urgencias de un hospital es un ataque de asma, que representa un tercio de todas las visitas. Adems de los sujetos tratados en salas de urgencias, en el
Primer contacto con un alergeno (polen) Polen

Clula B IgE Produccin de grandes cantidades de anticuerpo IgE contra polen Clula plasmtica

Molculas IgE unidas a clulas cebadas

Clula cebada

Contacto ulterior con alergeno

La clula cebada preparada por IgE libera molculas que causan sibilancias, estornudos, secrecin nasal, lagrimeo y otros sntomas

Secuencia de fenmenos que conducen a una respuesta alrgica. Cuando el anticuerpo que se produce por contacto con un alergeno es IgE, esta clase de anticuerpo reacciona a travs de su regin constante con una clula cebada. La reaccin ulterior del sitio de unin del anticuerpo con el alergeno estimula a la clula cebada a la cual se uni IgE para que secrete molculas que inducen los sntomas alrgicos.

ltimo ao se realizaron 160 000 hospitalizaciones por asma, con un internamiento promedio de tres a cuatro das. Aunque son afectadas personas de todas las edades y razas, la mortalidad por asma es 3.5 veces mayor en nios afroestadounidenses. An se desconocen las razones de los incrementos del nmero de casos de asma y la tasa ms alta de mortalidad en este grupo tnico de poblacin, aunque es posible que se descubran algunos indicios al valorar los estudios recientes de factores genticos en padecimientos alrgicos (vase el enfoque clnico del cap. 15). Un problema de salud cada vez ms relevante es la alergia a los alimentos, en especial a cacahuates y nueces (almendras, maran y nuez de nogal). Alrededor de tres millones de estadounidenses son alrgicos a estos alimentos, que son las causas principales de reacciones alrgicas (analcticas) letales o casi letales a los alimentos. Si bien evitar estas semillas puede prevenir consecuencias perjudiciales en personas alrgicas, la adicin generalizada de protena de cacahuate (man) y productos de nueces a una diversidad de alimentos lo diculta mucho. Cuando menos 50% de las reacciones de consideracin se deben a exposiciones accidentales a cacahuates, nueces o sus derivados. Esto ha promovido movimientos controversiales para prohibir los cacahuates en escuelas y aviones. Por lo general, la analaxis ocurre en el transcurso de una hora tras la ingestin del alergeno alimenticio, y el tratamiento ms ecaz consiste en inyectar adrenalina. Quienes son propensos a ataques analcticos suelen llevar consigo adrenalina inyectable para usarla en caso de exposicin. Adems del sufrimiento y la ansiedad originados por reacciones inmunitarias o alergias inapropiadas a antgenos ambientales, existe un costo exorbitante (que se estima en casi 20 000 millones de dlares) en trminos del tiempo de trabajo perdido de los afectados y quienes los cuidan. Estos costos justican los extensos esfuerzos que llevan a cabo inmunlogos, alerglogos y clnicos para aliviar las molestias secundarias a estos trastornos.

*Holgate, S.T. The epidemic of allergy and asthma, Nature 1999, Supp. to vol. 402, B2. Hughes, D.A., and C. Mills, 2001. Food allergy: A problem on the rise. Biologist (London) 48:201.

PANORAMA GENERAL DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T U L O

21

RESUMEN

Sitios tiles de la red

http://www.aaaai.org/
El sitio de la American Academy of Allergy, Asthma and Immunology incluye una extensa biblioteca con informacin sobre enfermedades alrgicas.

Inmunidad es el estado de proteccin contra microorganismos o sustancias extraas (antgenos). Los vertebrados tienen dos tipos de inmunidad: innata y adaptativa. La inmunidad innata constituye una primera lnea de defensa, que incluye barreras, clulas fagocticas y molculas que reconocen determinadas clases de patgenos. Las inmunidades innata y adaptativa operan de manera coordinada; la activacin de la respuesta inmunitaria innata produce seales que estimulan una inmunorreaccin adaptativa ulterior. Las respuestas inmunitarias adaptativas poseen cuatro atributos: especificidad, diversidad, memoria y reconocimiento de lo propio y lo extrao. El elevado grado de especificidad de la inmunidad adaptativa proviene de las actividades de molculas (anticuerpos y receptores de clula T) que reconocen y fijan antgenos especficos. Los anticuerpos reconocen antgenos e interactan de modo directo con ellos. Los receptores de clula T slo reconocen al antgeno asociado con molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las dos principales subpoblaciones de linfocitos T son las clulas T colaboradoras (TH), CD4+, y las clulas T citotxicas (TC), CD8+, que dan origen a los linfocitos T citotxicos (CTL). Las disfunciones del sistema inmunitario incluyen afecciones comunes como alergia o asma, as como inmunodeficiencia y autoinmunidad.

http://www.aai.org
El sitio de red de la American Association of Immunologists contiene un gran cmulo de informacin de inters para inmunlogos.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/
PubMed, la base de datos de la National Library of Medicine, con ms de nueve millones de publicaciones, es la ms amplia en el mundo para bibliografas biolgicas y biomdicas. Tambin es un sitio muy fcil de utilizar.

Preguntas de estudio
PREGUNTA
DE ENFOQUE CLNICO Un individuo joven desarroll una grave alergia a las nueces (semillas de rboles en general). Qu precauciones son aconsejables para el paciente y sus padres? Debe conocer este padecimiento el personal de la escuela?

1. Por qu la vacuna de Jenner era superior a los mtodos previos para conferir resistencia a la viruela? 2. Confera inmunidad activa o pasiva contra el virus de la rabia el tratamiento usado por Pasteur? Hay alguna manera de probarlo? 3. Inmediatamente despus de nacer, a menudo los neonatos estn en riesgo de infeccin por estreptococos del grupo B. Se ha propuesto una vacuna que se administra a mujeres en edad reproductiva. Cmo puede ayudar a los bebs la inmunizacin de las madres? 4. Indique a cul o cules ramas del sistema inmunitario se aplican las afirmaciones siguientes; utilice H para la rama humoral y MC para la rama mediada por clulas. Algunas afirmaciones pueden aplicarse a ambas ramas. a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. k. Incluye molculas MHC clase I Reacciona a infeccin vrica Incluye clulas T colaboradoras Incluye antgeno procesado Reacciona despus de un trasplante de rgano Incluye clulas T citotxicas Incluye clulas B Incluye clulas T Reacciona a una infeccin bacteriana extracelular Incluye anticuerpo secretado Destruye clulas propias infectadas por virus

Bibliografa
Burnet, F.M. 1959. The Clonal Selection Theory of Acquired Immunity. Cambridge University Press, Cambridge, MA. Cohen, S. G., and M. Samter. 1992. Excerpts from Classics in Allergy. Symposia Foundation, Carlsbad, CA. Desour, L. 1922. Pasteur and His Work (translated by A.F. and B.H. Wedd). T. Fisher Unwin, London. Kimbrell, D.A., and B. Beutler. 2001. The evolution and genetics of innate immunity. Nature Reviews Genetics 2:256. Kindt, T.J., and J.D. Capra. 1984. The Antibody Enigma. Plenum Press, New York. Landsteiner, K. 1947. The Specificity of Serologic Reactions. Harvard University Press, Cambridge, MA. Medawar, P. B. 1958. The Immunology of Transplantation: The Harvey Lectures, 1956-1957. Academic Press, New York. Metchnikoff, E. 1905. Immunity in the Infectious Diseases. Macmillan, New York. ONeill, A. J. 2005. Immunitys early warning system. Scientific American 292:38. Paul, W., ed. 2003. Fundamental Immunology, 5th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. Roitt, I. M. and P. J. Delves, eds. 1998. An Encyclopedia of Immunology, 2nd ed., vols. 1-4. Academic Press, London.

5. La inmunidad adaptativa posee cuatro atributos caractersticos mediados por linfocitos. Indique esos cuatro atributos y explique brevemente cmo se originan. 6. Mencione tres caractersticas de una reaccin inmunitaria secundaria que la diferencien de una primaria. 7. Compare y contraste los cuatro tipos de molculas que unen antgeno utilizadas por el sistema inmunitario anticuerpos,

22

PA RT E I

INTRODUCCIN

receptores de clula T, molculas MHC clase I y molculas MHC clase II en trminos de las caractersticas siguientes: a. Especificidad para antgeno b. Expresin celular c. Tipos de antgeno reconocidos 8. Llene los espacios en blanco en las afirmaciones siguientes con los trminos ms apropiados: a. ____________, _______________ y _________________ funcionan todas como clulas presentadoras de antgeno. b. Las clulas presentadoras de antgeno llevan una seal ____ _____ a clulas _________. c. Slo las clulas presentadoras de antgeno expresan molculas MHC clase ____, en tanto que casi todas las clulas expresan molculas MHC clase ____. d. El trmino cientfico que hace referencia a los glbulos blancos en general es ______. e. La rama _________ del sistema inmunitario se llama as porque genera anticuerpos en respuesta a patgenos especficos. Es necesaria la exposicin previa a un patgeno para que se desarrolle esta parte del sistema inmunitario. f. Los linfocitos T deben tener correceptores para poder unirse de manera eficiente a las molculas MHC. El correceptor para el reconocimiento de molculas MHC clase I es ____ ______, y el correceptor para el reconocimiento de las de clase II es __________. g. La parte del antgeno unida por un anticuerpo se conoce como ________. 9. Se dice que la clula T es restringida clase I. Qu significa esto? 10. Las inmunidades innata y adaptativa actan en conjunto y en formas interdependientes para proteger al hospedador. Describa la colaboracin de estas dos formas de inmunidad. 11. Proporcione ejemplos de consecuencias leves y graves de la disfuncin inmunitaria. Cul es la causa ms comn de inmunodeficiencia en todo el mundo en la actualidad?

12. Cules de los siguientes enunciados acerca del modo en que las clulas B y T reconocen antgenos son ciertos? a. Las clulas B slo reconocen antgeno que es presentado por molculas MHC clases I o II. b. Ambos tipos celulares pueden reconocer antgeno en solucin (sin clulas). c. Ambos tipos celulares reconocen antgenos unidos a la matriz extracelular. d. Las clulas T slo reconocen antgeno que es presentado por molculas MHC clase I o clase II. 13. Indique si cada uno de los siguientes enunciados es cierto o falso. En este ltimo caso explique por qu. a. Se requieren dosis de refuerzo porque la exposicin repetida al antgeno crea una inmunorreaccin ms intensa. b. El gen para el receptor de clula T debe cortarse y empalmarse junto, borrando secciones completas, para que pueda transcribirse. c. El cuerpo humano experimenta la mayor invasin de agentes extraos a travs de las membranas mucosas. d. La presencia de antgeno induce una mayor produccin de anticuerpo en el sistema inmunitario. e. El antgeno es unido directamente por los linfocitos T. f. Los pptidos son colocados en la hendidura de unin de las molculas MHC clase I en el citosol. g. Para que las clulas B maduren y se conviertan en clulas plasmticas necesitan la colaboracin de clulas T. 14. Relacione el tipo celular con el receptor presente en esa clula. Tipo celular a. b. c. d. Clula presentadora de antgeno Linfocito B Clula T colaboradora Clula T citotxica Receptor 1. 2. 3. 4. CD8+ MHC BCR CD4+

captulo 2
Clulas y rganos del sistema inmunitario

a multitud de clulas, rganos y tejidos del sistema inmunitario se encuentran distribuidos por todo el cuerpo. Desde el punto de vista funcional pueden clasificarse en dos grupos principales. Los rganos linfoides primarios proporcionan microambientes apropiados para el desarrollo y la maduracin de los linfocitos. Los rganos linfoides secundarios atrapan antgeno, por lo general procedente de tejidos prximos o espacios vasculares, y son sitios en que los linfocitos maduros pueden interactuar de manera eficaz con esos antgenos. Los vasos sanguneos y los sistemas linfticos conectan estos rganos y los unen en un conjunto funcional. Transportados dentro de la sangre y la linfa e incluidos en los rganos linfoides se encuentran diversos glbulos blancos, o leucocitos, que participan en la reaccin inmunitaria. De estas clulas, slo los linfocitos poseen los atributos de diversidad, especificidad, memoria y reconocimiento de lo propio y lo extrao, las caractersticas distintivas de una respuesta inmunitaria adaptativa. Otros leucocitos tambin tienen funciones importantes, algunos como clulas presentadoras de antgeno y otros como clulas efectoras en la eliminacin de antgeno por fagocitosis o en la secrecin de molculas efectoras inmunitarias. Algunos leucocitos, en especial los linfocitos T, secretan varias molculas protenicas llamadas citocinas. Estas molculas actan como hormonas inmunorreguladoras y tienen funciones importantes en la regulacin de las reacciones inmunitarias. En este captulo se describen la maduracin de las clulas sanguneas, las propiedades de las diversas clulas del sistema inmunitario y las funciones de los rganos linfoides.

Micrografa electrnica de barrido de un macrfago. [L. Nilsson, Boehringer Ingelheim International GmbH.]

Hematopoyesis Clulas del sistema inmunitario rganos del sistema inmunitario Clulas y rganos linfoides: comparaciones evolutivas

Hematopoyesis
Todas las clulas sanguneas provienen de un tipo de clula llamada clula madre hematopoytica (HSC, del ingls hematopoietic stem cell). Las clulas madre pueden diferenciarse en otros tipos celulares; se renuevan por s mismas mantienen su poblacin por divisin celular. En el ser humano la hematopoyesis, o sea la formacin y desarrollo de glbulos rojos y blancos, se inicia en el saco vitelino embrionario durante las primeras semanas del desarrollo. Las clulas madre del saco vitelino se diferencian en clulas eritroides primitivas que contienen hemoglobina embrionaria. Hacia el tercer mes de la gestacin las clulas madre hematopoyticas migran del saco vitelino al hgado fetal

y a continuacin al bazo; estos dos rganos tienen funciones mayores en la hematopoyesis desde el tercero al sptimo meses del embarazo. Despus de este perodo, la diferenciacin de la HSC en la mdula sea se constituye en el principal factor de la hematopoyesis, y hacia el nacimiento sta es escasa o nula en hgado y bazo. En la figura 2-1 se muestra la migracin de la hematopoyesis durante el desarrollo desde una serie de sitios primitivos hasta la mdula sea. Es notable que toda clula sangunea madura funcionalmente especializada deriva de una HSC. Sin embargo, el estudio de las clulas madre hematopoyticas es difcil por dos razones. Son escasas, normalmente menos de una HSC por 5 104 clulas en la mdula sea, y son difciles de cultivar in vitro. Como resultado, sigue siendo incompleto el conocimiento que tenemos acerca del modo en que se regulan su proliferacin y diferenciacin. Debido a su capacidad de renovarse por s mismas (autorrenovarse), las clulas madre hematopoyticas se mantienen en concentraciones estables durante toda la vida adulta; empero, cuando aumenta la demanda de hematopoyesis, las HSC muestran una enorme capacidad de proliferacin. Esto puede demostrarse en ratones cuyos sistemas hematopoyticos se han destruido por completo con una dosis letal de rayos X (950 rads1). Estos ratones radiados mueren en el transcurso de
1

Un rad representa la absorcin por un blanco radiado de una cantidad de radiacin correspondiente a 100 erg/g del blanco.

23

24

PA RT E I

INTRODUCCIN

Feto

Adulto

Actividad hematopoytica

Hgado y bazo

Crneo, pelvis, esternn, costillas, vrtebras

Saco vitelino

Huesos largos

5 Meses

10 Nacimiento

20

30 Aos

40

50

Durante la hematopoyesis, los eritrocitos y muchos tipos distintos de glbulos blancos descienden de las pocas clulas madre hematopoyticas en un proceso complicado que incluye muchos pasos los cuales atraviesan por una jerarqua de poblaciones precursoras. Por qu surgi por evolucin tal proceso complejo para generar clulas sanguneas? En el curso de su vida, una persona producir unas 1016 de tales clulas. Esto hace necesario una enorme cantidad de divisiones celulares. John Dick ha sealado que la divisin celular es propensa a errores y da la oportunidad para que el genoma sufra mutaciones, algunas de las cuales pueden producir cncer. l ha sugerido que para hacer menos probable este suceso potencialmente catastrfico, el sistema formador de sangre est organizado en una ingeniosa jerarqua en la cual la mayor parte de la proliferacin ocurre dentro de precursores ms diferenciados y no en la poblacin misma de clulas madre hematopoyticas. Estos precursores en diferenciacin progresiva no se autorrenuevan, y las clulas sanguneas maduras que forman son incapaces de dividirse o slo lo hacen en circunstancias especiales. En consecuencia, la posibilidad de generar cncer en las HSC y sus descendientes inmediatos se reduce, si bien no a cero.

FIGURA 2-1 Sitios de hematopoyesis en distintos momentos durante el desarrollo prenatal y posnatal del ser humano.

La hematopoyesis se regula a nivel gentico

El desarrollo de clulas madre hematopoyticas pluripotentes en distintos tipos de clulas requiere la expresin de distintos grupos de genes determinantes y especficos de linaje en los tiempos apropiados y en el orden correcto. Las protenas especificadas por estos genes son componentes crticos de las redes reguladoras que dirigen la diferenciacin de la clula madre y su descendencia. Gran parte de lo que se conoce en la actualidad sobre la dependencia de la hematopoyesis respecto de un gen particular proviene de estudios en ratones en los que se desactiva o altera (en ingls knock out, apagar o noquear) un gen por alteracin dirigida, lo que bloquea la produccin de la protena que dicho gen codifica (cap. 22). Si los ratones no producen glbulos rojos o blancos especficos cuando se desactiva un gen, se concluye que es necesaria la protena especificada por el gen para el desarrollo de dichas clulas. La tecnologa de desactivacin de genes (knockout) es uno de los instrumentos ms potentes disponibles para determinar las funciones de genes particulares en una amplia gama de procesos y ha hecho contribuciones importantes a la identificacin de muchos genes que regulan la hematopoyesis. Aunque an queda mucho por hacer, la desactivacin dirigida y otros mtodos han identificado varios factores de transcripcin, que tienen actividades relevantes en la hematopoyesis (cuadro 2-1). Algunos de estos factores de transcripcin afectan muchos diferentes linajes hematopoyticos y otros slo un linaje aislado, como la va de desarrollo que conduce a linfocitos. Un factor de transcripcin que afecta mltiples linajes es el GATA-2, un miembro de una familia de factores de transcripcin que reconoce la secuencia tetranucletido GATA, un motivo presente en genes blanco. Para el desarrollo de los linajes linfoide, eritroide y mieloide es esencial un gen GATA-2 funcional, que especifica este factor de transcripcin. Como cabra esperar, los animales en los que se altera este gen mueren

10 das a menos que se les administren por infusin clulas de mdula sea normales de un ratn singnico (genticamente idntico). Aunque un ratn normal tiene 3 108 clulas de mdula sea, la infusin de slo 104 a 105 de estas clulas (es decir, 0.01 a 0.1% de la cantidad normal) de un donador es suficiente para restablecer por completo el sistema hematopoytico, lo que demuestra la enorme capacidad de las HSC de autorrenovarse. En un momento temprano de la hematopoyesis, una clula madre multipotente se diferencia a lo largo de una de dos vas y da lugar a una clula progenitora linfoide o una clula progenitora mieloide (fig. 2-2). Las clulas progenitoras han perdido la capacidad de renovarse por s mismas y estn comprometidas respecto de un linaje celular particular. Las clulas progenitoras linfoides dan lugar a clulas B, T y NK (asesinas naturales). Las clulas madre mieloides generan progenitoras de glbulos rojos (eritrocitos), muchos de los diversos glbulos blancos (neutrfilos, eosinfilos, basfilos, monocitos, clulas cebadas, clulas dendrticas) y clulas generadoras de plaquetas llamadas megacariocitos. En la mdula sea las clulas hematopoyticas y sus descendientes crecen, se diferencian y maduran en un andamiaje parecido a red de clulas del estroma o estromales, entre las que se incluyen clulas adiposas (adipocitos), clulas endoteliales, fibroblastos y macrfagos. Las clulas estromales influyen en la diferenciacin de clulas madre hematopoyticas al proporcionar un microambiente inductor hematopoytico (HIM, del ingls hematopoietic-inducing microenvironment) que consiste en una matriz celular y factores que promueven el crecimiento y la diferenciacin. Muchos de estos factores de crecimiento hematopoyticos son agentes solubles que llegan a sus clulas blanco por difusin; otros son molculas unidas a membrana en la superficie de clulas estromales que requieren contacto clula a clula entre las clulas que responden y las estromales.

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

25

FIGURA 2-2 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

Hematopoyesis

Clula madre hematopoytica

Autorrenovacin

Clula dendrtica

Progenitora mieloide

Progenitora linfoide

Clula asesina natural (NK)

Macrfago

Monocito Clula colaboradora TH Progenitora de granulocitos y monocitos

Neutrfilo

Progenitora de clulas T Clula T citotxica TC

Eosinfilo

Progenitora de eosinfilos Progenitora de clulas B

Clula B

Basfilo

Progenitora de basfilos

Clula dendrtica Plaquetas Megacariocito

Eritrocito Progenitor eritroide

Las clulas madre hematopoyticas, que se autorrenuevan, dan origen a progenitoras linfoides y mieloides. Todas las clulas lin-

foides descienden de clulas progenitoras linfoides, y todas las clulas de linaje mieloide provienen de progenitoras mieloides.

26

PA RT E I

INTRODUCCIN

CUADRO 2-1
Factor GATA-1 GATA-2 PU.1 Bmi-1 Ikaros Oct-2

Algunos factores de transcripcin esenciales para linajes hematopoyticos

Linaje dependiente Eritroide Eritroide, mieloide, linfoide Eritroide (etapas de maduracin), mieloide (etapas tardas), linfoide Todos los linajes hematopoyticos Linfoide Linfoide B (diferenciacin de clulas B en clulas plasmticas)

La muerte celular programada es un mecanismo homeosttico esencial

La muerte celular programada, un proceso inducido y ordenado en el cual la clula participa de modo activo para consumar su muerte, es un factor crtico en la regulacin homeosttica de muchos tipos de poblaciones celulares, incluidos los del sistema hematopoytico. Las clulas que experimentan la muerte celular programada a menudo exhiben cambios morfolgicos precisos, que se denominan en conjunto apoptosis (figs. 2-3, 2-4). Estos cambios incluyen decremento notable del volumen celular, modificacin del citoesqueleto cuyo efecto se manifiesta en la vesiculacin de la membrana, condensacin de la cromatina y degradacin del DNA en fragmentos. Despus de estos cambios morfolgicos, una clula apoptsica libera diminutos cuerpos apoptsicos unidos a membrana que contienen organelos intactos. Los macrfagos fagocitan cuerpos apoptsicos y clulas en las etapas avanzadas de apoptosis. Ello asegura que no se libere hacia el tejido circundante su contenido intracelular, incluidas las enzimas proteolticas y otras lticas, protenas catinicas y molculas oxidantes. En consecuencia, la apoptosis no induce una respuesta inflamatoria local. La apoptosis difiere notablemente de la necrosis, los cambios relacionados con la muerte celular a causa de una lesin. En la necrosis, la clula daada se hincha y estalla; entonces libera su contenido y tal vez desencadena una reaccin inflamatoria perjudicial. Cada uno de los leucocitos que se producen por hematopoyesis tiene un lapso de vida caracterstico y a continuacin perece por muerte celular programada. Por ejemplo, en el ser humano adulto hay alrededor de 5 1010 neutrfilos en la circulacin. Estas clulas tienen un perodo de vida de slo unos cuantos das antes de que se inicie la muerte celular programada. La produccin constante de neutrfilos mantiene una cifra estable de estas clulas. La muerte celular programada tambin tiene un sitio en la conservacin de cifras apropiadas de clulas hematopoyticas progenitoras de eritrocitos y diversos tipos de leucocitos. Adems de la hematopoyesis, la apoptosis es importante en procesos inmunitarios como la tolerancia y destruccin de clulas blanco por clulas T citotxicas o clulas asesinas naturales. Han surgido detalles sobre los mecanismos que sustentan la apoptosis; se describen con amplitud en los captulos 10 y 14. La apoptosis en leucocitos y otros tipos de clulas se acompaa de la expresin de varios genes (cuadro 2-2). Algunas de las protenas especificadas por estos genes inducen apoptosis, otras son crticas durante esta ltima y algunas ms la inhiben. Por ejemplo, puede inducirse apoptosis en timocitos mediante radiacin, pero slo si se encuentra presente la protena p53; muchas muertes celulares son consecuencia de seales de Fas, una molcula que se encuentra en la superficie de muchas clulas, y las proteasas que se conocen como caspasas participan en una cascada de reacciones que conduce a la apoptosis. Por otra parte, los miembros de la familia de genes bcl-2 (linfoma 2 de clulas B), bcl-2 y bcl-XL, codifican productos protenicos que inhiben la apoptosis. Como hecho interesante, el primer miembro de esta familia de genes, bcl-2, se encontr en estudios relacionados no con la muerte celular sino con la proliferacin descontrolada de clulas B en un tipo de cncer que se conoce como linfoma de clulas B. En este caso, el gen bcl-2 se hallaba en el punto

durante el desarrollo embrionario. En contraste con el GATA-2, otro factor de transcripcin, Ikaros (caro), slo es necesario para el desarrollo de clulas de linaje linfoide. Aunque los ratones alterados Ikaros no producen cifras considerables de clulas B, T y NK, su produccin de eritrocitos, granulocitos y otras clulas del linaje mieloide no se modifica. Los ratones alterados Ikaros sobreviven al desarrollo embrionario, pero son muy deficientes en sentido inmunitario y mueren por infecciones a una edad temprana. Otro regulador de la transcripcin ms, Bmi-1, es un represor transcripcional que constituye un determinante clave de la capacidad de las HSC de autorrenovarse. Cuando se desactiva el gen que codifica Bmi-1 (el cual es altamente expresado en las HSC de ser humano y ratn), los ratones deficientes en Bmi-1 mueren en un plazo de dos meses despus de nacer. La causa de la muerte es la incapacidad final de la mdula sea de generar glbulos rojos y blancos. Esta incapacidad de la mdula sea se rastre hasta la falta de autorrenovacin de las HSC.

En la hemostasia hematopoytica intervienen muchos factores

La hematopoyesis es un proceso de estado estable en el cual se producen clulas sanguneas maduras al mismo ritmo al que se pierden. (La principal causa de prdida de clulas sanguneas es el envejecimiento.) El eritrocito promedio tiene un lapso de vida de 120 das antes de que lo fagociten y digieran los macrfagos en el bazo. Los diversos leucocitos tienen perodos de vida que varan de un da, para los neutrfilos, hasta 20 a 30 aos en algunos linfocitos T. Con el fin de conservar valores en estado estable, el ser humano promedio debe producir un estimado de 3.7 1011 glbulos blancos por da. Este sistema masivo es regulado por mecanismos complejos en que participan todos los tipos celulares individuales, y en ltima instancia el nmero de clulas en cualquier linaje hematopoytico se establece por un equilibrio entre el nmero de clulas que se eliminan por muerte celular y la cifra que surge de la divisin y diferenciacin. Cualquier factor regulador o una combinacin de ellos puede afectar las tasas de reproduccin y diferenciacin de las clulas. Estos factores tambin pueden determinar si se induce la muerte de una clula hematopoytica.

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

27

NECROSIS

APOPTOSIS

Agregacin de cromatina Organelos hinchados Mitocondria floculenta

Convolucin leve Compactacin y segregacin de la cromatina Condensacin del citoplasma

Fragmentacin nuclear Vesiculacin Cuerpos apoptsicos

Desintegracin Liberacin del contenido intracelular

Fagocitosis Cuerpo apoptsico

Clula fagoctica Inflamacin

FIGURA 2-3 Comparacin de los cambios morfolgicos que

ocurren en la apoptosis y la necrosis. La apoptosis, que tiene como efecto la muerte celular programada de clulas hematopoyticas, no induce una respuesta inamatoria local. En contraste, la

necrosis, el proceso que conduce a la muerte de clulas lesionadas, provoca la liberacin del contenido celular, que puede activar una reaccin inamatoria local.

de rotura de una transposicin cromosmica en un linfoma humano de clulas B. La transposicin llev el gen bcl-2 hacia el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina y dio por resultado la activacin transcripcional del gen bcl-2 y la produccin excesiva de la protena que Bcl-2 codifica por las clulas de linfoma. Se piensa que las concentraciones altas resultantes de Bcl-2 ayudan a transformar las clulas linfoides en clulas cancerosas de linfoma por inhibicin de las seales que en condiciones normales induciran la muerte celular apoptsica. Se encontr que las concentraciones de Bcl-2 tienen un papel importante en la regulacin del perodo de vida normal de varios linajes de clulas hematopoyticas, incluidos los linfocitos. Un adulto normal tiene alrededor de cinco litros de sangre con unos 2 000 linfocitos/mm3, para un total aproximado de 1011 linfocitos circulantes. Durante una infeccin aguda aumenta la cifra de linfocitos cuatro veces o ms y se obtiene un recuento total de linfocitos de 40 1011. Debido a que el sistema inmunitario no puede sostener un incremento tan masivo de las cifras de clulas por un perodo prolongado, el sistema requiere un

medio para eliminar los linfocitos activados innecesarios una vez que pasa la amenaza antignica. Se ha reconocido que los linfocitos activados expresan valores ms bajos de Bcl-2 y, por consiguiente, son ms susceptibles a la induccin de muerte apoptsica que los linfocitos vrgenes o las clulas de memoria.

CUADRO 2-2
Gen bcl-2 bax bcl-XL (bcl-Largo) bcl-XS (bcl-Corto) caspasa (varios diferentes) Fas

Genes que regulan la apoptosis

Funcin Previene la apoptosis Se opone a bcl-2 Previene la apoptosis Se opone a bcl-XL Proteasa Induce la apoptosis Funcin en la apoptosis Inhibe Promueve Inhibe Promueve Promueve Inicia

28
a)

PA RT E I

INTRODUCCIN

b)

c)

d)

FIGURA 2-4 Apoptosis. Micrografas pticas de: a) timocitos normales (clulas T en desarrollo en el timo) y b) timocitos apoptsicos. Micrografas electrnicas de barrido de timocitos c) normales y d) apoptsicos. [Tomada de B. A. Osborne y S.
Smith, 1997, Journal of NIH Research 9:35; cortesa de B. A. Osborne, University of Massachusetts at Amherst.]

Sin embargo, si no dejan de activarse los linfocitos por el antgeno, la seal que reciben durante la activacin bloquea la seal apoptsica. A medida que remiten las concentraciones de antgeno, se reduce asimismo la activacin del bloqueo y los linfocitos comienzan a morir por apoptosis.

Las clulas madre hematopoyticas pueden enriquecerse

Irv Weissman y colaboradores desarrollaron un mtodo novedoso para enriquecer la concentracin de clulas madre hematopoyticas del ratn, que en condiciones normales constituyen menos de 0.05% de todas las clulas de la mdula sea en ratones. Su mtodo se bas en el uso de anticuerpos especficos para molculas que se conocen como antgenos de diferenciacin, que slo tipos particulares de clulas expresan. Expusieron muestras de mdula sea a anticuerpos marcados con un compuesto fluorescente y especficos para los antgenos de diferenciacin expresados en la superficie de glbulos rojos y blancos maduros pero no de clulas madre (fig. 2-5). A continuacin eliminaron las clulas marcadas mediante citometra de flujo con un seleccionador celular activado por fluorescencia (cap. 6). Despus de

cada seleccin se valoraron las clulas restantes a fin de determinar la cifra necesaria para restablecer la hematopoyesis en un ratn radiado con niveles letales de rayos X. A medida que se tornaron relativamente ms numerosas las clulas madre pluripotentes en la poblacin restante, se requirieron cada vez menos clulas para restablecer la hematopoyesis en este sistema. Al eliminar las clulas hematopoyticas seleccionando la presencia de antgenos de diferenciacin conocidos fue posible un enriquecimiento de 50 a 200 veces de clulas madre pluripotentes. A fin de enriquecer an ms las clulas madre pluripotentes, se incubaron las clulas restantes con diversos anticuerpos formados contra clulas que tal vez se encontraban en las etapas tempranas de la hematopoyesis. Uno de estos anticuerpos reconoci un antgeno de diferenciacin llamado antgeno de clula madre 1 (Sca-1). El tratamiento con este anticuerpo ayud a capturar clulas madre indiferenciadas y proporcion una preparacin tan rica en clulas madre pluripotentes que una alcuota que slo contena 30 a 100 clulas restableci de manera sistemtica la hematopoyesis en un ratn radiado con cantidades letales de rayos X, en tanto que se requeran ms de 104 de clulas de mdula sea no enriquecidas para la restauracin. Mediante una variacin de este mtodo, H. Nakauchi y sus colaboradores disearon procedimientos tan eficaces que en uno de cada cinco

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

29

a) Ratn sometido a radiacin letal (950 rad) 2 105 clulas no enriquecidas Eo P L E N P S B N P Reaccin con anticuerpos Fl para diferenciacin de antgenos M L E

b) ndice de supervivencia, %

100 Clulas totalmente enriquecidas

Clulas parcialmente enriquecidas Clulas no enriquecidas

Restauracin de la hematopoyesis, el ratn vive 1 103 clulas parcialmente enriquecidas S P P P

101 102 103 104 105 Nmero de clulas inyectadas al ratn sometido a radiacin letal

M E L E

N B

L Eo N Clulas diferenciadas

Restauracin de la hematopoyesis, el ratn vive

Reaccin con anticuerpos Fl contra Sca-1

30100 clulas totalmente enriquecidas P S Clula madre Restauracin de la hematopoyesis, el ratn vive P P Clulas progenitoras

FIGURA 2-5 Enriquecimiento de clulas madre pluripotentes de mdula sea. a) Se extraen clulas hematopoyticas diferenciadas (blanco) mediante el tratamiento con anticuerpos marcados con uorescencia (anticuerpos Fl) especcos para molculas de membrana expresadas en linajes diferenciados, pero que no existen en clulas madre indiferenciadas (S) y clulas progenitoras (P). El tratamiento de la preparacin resultante, enriquecida de manera parcial con anticuerpo especco para Sca-1, un antgeno de diferenciacin temprano, elimin la mayor parte de las clulas progenitoras. M, moratones sometidos a radiacin letal, una clula hematopoytica aislada puede restablecer tanto los linajes mieloides como los linfoides (cuadro 2-3). Se encontr que el CD34, un marcador que existe en alrededor de 1% de las clulas hematopoyticas, si bien no es exclusivo en realidad de las clulas madre, se encuentra en una poblacin pequea de clulas que incluye clulas madre. La administracin de poblaciones de clulas humanas enriquecidas de manera adecuada para clulas CD34+ (el indica que se encuentra el factor en la membrana celular) puede reconstituir la totalidad

nocito; B, baslo; N, neutrlo; Eo, eosinlo; L, linfocito; E, eritrocito. b) El enriquecimiento de las preparaciones de clulas madre se mide por su capacidad de restablecer la hematopoyesis en ratones radiados con dosis letales. Slo sobreviven los animales en los que hay hematopoyesis. El enriquecimiento progresivo de clulas madre est indicado por la disminucin del nmero de clulas inyectadas necesario para restablecer la hematopoyesis. Por este procedimiento es posible un enriquecimiento total de unas 1 000 veces.

del sistema hematopoytico en un paciente (vase el enfoque clnico ms adelante). Un instrumento importante en estudios para identificar y caracterizar la clula madre hematopoytica humana es el uso de ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID, del ingls severe combined immunodeficiency) como sistemas de valoracin in vivo para la presencia y funcin de las clulas madre hematopoyticas (HSC). Los ratones con SCID carecen de linfocitos B y T y son incapaces de montar reacciones inmunitarias adaptativas, como las que actan en el rechazo normal de clu-

30

PA RT E I

INTRODUCCIN

CUADRO 2-3
Nmero de HSC enriquecidas 1 2 5 10 20

Reconstitucin de la hematopoyesis por clulas madre hematopoyticas (HSC)

Nmero de ratones reconstituidos (%) 9 de 41 (21.9) 5 de 21 (23.8) 9 de 17 (52.9) 10 de 11 (90.9) 4 de 4 (100)

CUADRO 2-4
Tipo de clula Glbulos rojos Plaquetas Leucocitos Neutrlos Linfocitos Monocitos Eosinlos Baslos

Cifras normales de clulas sanguneas en adultos

Clulas/mm3 5.0 2.5 7.3 106 105 103 103 103 10
2 2 2

Leucocitos totales (%)

3.75.1 1.53.0 14.4 12.2 1.3

5070 2040 16 13 1

10

FUENTE: Adaptado de M. Osawa et al., 1996, Science 273:242.

10

las, tejidos y rganos extraos. En consecuencia, estos animales no rechazan poblaciones de clulas humanas trasplantadas que contienen HSC o tejidos como timo y mdula sea. Los ratones inmunodeficientes han sido hospedadores sustitutos o alternativos para la investigacin in vivo de clulas madre humanas. Los ratones con SCID en los que se implantan fragmentos de timo y mdula sea humanos mantienen la diferenciacin de clulas madre hematopoyticas humanas en clulas hematopoyticas maduras. Este sistema ha permitido estudiar subpoblaciones de clulas CD34+ y el efecto de los factores de crecimiento humanos en la diferenciacin de diversos linajes hematopoyticos.

Clulas del sistema inmunitario

Los linfocitos que portan receptores de antgeno son las clulas centrales de la inmunidad adaptativa y son las responsables de sus propiedades caractersticas de diversidad, especificidad y memoria. Si bien los linfocitos son importantes, otros tipos de glbulos blancos tambin tienen funciones esenciales en inmunidad adaptativa, presentacin de antgenos, secrecin de citocinas y fagocitosis y destruccin de microorganismos. Adems, como se ver en el prximo captulo, el sistema inmunitario innato, que comparte muchas clulas con el adaptativo, realiza un indispensable papel de colaboracin para inducir respuestas adaptativas.

Clulas linfoides
Los linfocitos constituyen 20 a 40% de los glbulos blancos del cuerpo y 99% de las clulas de la linfa (cuadro 2-4). Hay alrededor de un billn (1012) de linfocitos en el cuerpo humano, que circulan continuamente en la sangre y la linfa y son capaces de migrar hacia espacios tisulares y rganos linfoides, por lo que constituyen un puente entre distintas partes del sistema inmunitario. En trminos generales, los linfocitos pueden subdividirse en tres poblaciones principales clulas B, clulas T y clulas asesinas naturales con base en la funcin y los componentes de la membrana celular. Los linfocitos B y T, fundamentales para la inmunidad adaptativa, portan cada uno su familia caracterstica de receptores de antgeno. Las clulas asesinas naturales (clulas NK) son linfocitos granulares (as llamados por su aspecto

granuloso al microscopio) grandes que forman parte del sistema inmunitario innato y no expresan el grupo de marcadores de superficie caracterstico de las clulas B o T. Los linfocitos B y T que no han interactuado con antgeno (a los que se denomina vrgenes, inocentes o no cebados) son clulas pequeas mviles no fagocticas que no es posible diferenciar entre s a nivel morfolgico. En su estado inactivo, permanecen en la fase G0 del ciclo celular. Dichas clulas, que se llaman asimismo linfocitos pequeos, slo tienen alrededor de 6 m de dimetro; su citoplasma forma anillos apenas discernibles alrededor del ncleo. Los linfocitos pequeos tienen cromatina empacada a gran densidad, pocas mitocondrias y retculo endoplsmico y aparato de Golgi poco desarrollados. En general se piensa que el linfocito virgen posee un perodo de vida corto. En condiciones apropiadas, la interaccin de los linfocitos pequeos con antgeno induce a estas clulas a avanzar en el ciclo celular de G0 a G1 y ms adelante a S, G2 y M (fig. 2-6a). A medida que experimentan el ciclo celular, los linfocitos crecen hasta convertirse en clulas de 15 m de dimetro llamadas linfoblastos; stos muestran una relacin citoplasma:ncleo ms alta y mayor complejidad de organelos que los linfocitos pequeos (fig. 2-6b). Los linfoblastos proliferan y al final se diferencian en clulas efectoras o bien en clulas de memoria. Las primeras funcionan de varias formas para eliminar antgeno. Estas clulas tienen lapsos de vida cortos que suelen variar de unos cuantos das a unos pocos meses. Las clulas plasmticas las clulas efectoras que secretan anticuerpo del linaje de clulas B evidencian un citoplasma tpico que incluye retculo endoplsmico abundante (para apoyar su alto ndice de sntesis de protenas) dispuesto en capas concntricas y asimismo muchas vesculas de Golgi (fig. 2-6b). Las clulas efectoras del linaje de clulas T incluyen la clula T colaboradora (clula TH) que secreta citocinas y clulas maduras activadas por antgeno del linaje de la clula T citotxica (clula TC) conocidas como CTL (linfocitos T citotxicos). Algunos miembros de la progenie de linfoblastos B y T se diferencian en clulas de memoria. La persistencia de esta poblacin de clulas es la que tiene a su cargo la inmunidad durante toda la vida contra muchos agentes patgenos. Las clulas de memoria parecen linfocitos pequeos pero pueden distinguirse de las clulas vrgenes por la presencia o ausencia de ciertas molculas en su membrana celular.

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

31

a)

Linfocito B virgen pequeo G0

Clula efectora G0 (es decir, clula plasmtica)

Clula de memoria G0

Repeticiones del ciclo

La activacin por antgeno induce la entrada en el ciclo celular

Divisin de la clula M

G2

G1 (activacin gnica)

Linfoblasto S (sntesis de DNA) b)

Linfocito pequeo (T o B) 6 m de dimetro

Blastocito (T o B) 15 m de dimetro

Clula plasmtica (B) 15 m de dimetro

FIGURA 2-6 Destino de linfocitos pequeos activados por antgeno. a) Un linfocito pequeo en reposo (virgen, inocente o no cebado) reside en la fase G0 del ciclo celular. En esta etapa, los linfocitos B y T no pueden diferenciarse de manera morfolgica. Despus de la activacin con antgeno, entra una clula B o T en el ciclo celular y crece hasta un linfoblasto, que lleva a cabo varios ciclos de divisin celular y, al nal, genera clulas efectoras y clulas de memoria. Se muestran clulas del linaje de clulas B. b) Micrografa electrnica

de un linfocito pequeo (izquierda) que posee cromatina condensada indicativa de una clula en reposo, un linfoblasto crecido (centro) en el que se observa cromatina descondensada y una clula plasmtica (derecha), que contiene retculo endoplsmico abundante, dispuesto en crculos concntricos y un ncleo prominente que se desplaz hacia una posicin excntrica caracterstica. Las tres clulas se muestran con amplicaciones diferentes. [Micrografas cortesa de J.
R. Goodman, Dept. of Pediatrics, University of California at San Francisco.]

32

PA RT E I

INTRODUCCIN

EN F O Q U E C L N I C O

Clulas madre: usos clnicos y potencial

El trasplante de clulas madre parece muy prometedor para regenerar tejido enfermo, daado o defectuoso. Las clulas madre hematopoyticas ya se utilizan para restaurar clulas hematopoyticas, y ms adelante se describe su uso en clnica. Sin embargo, los rpidos adelantos en la investigacin de clulas madre plantearon la posibilidad de usar tambin en poco tiempo otros tipos de clulas madre para reemplazar otras clulas y tejidos. Dos propiedades de las clulas madre sustentan su utilidad y expectativas. Tienen la capacidad de originar clulas ms diferenciadas y se renuevan por s mismas, ya que cada divisin de la clula madre crea cuando menos otra clula madre. Si estas clulas se clasican segn su descendencia y potencial de desarrollo, es posible reconocer cuatro niveles de clulas madre: totipotente, pluripotente, multipotente y unipotente. Las clulas totipotentes pueden dar origen a un organismo completo. Un huevo fecundado, el cigoto, es una clula totipotente. En el ser humano, las divisiones iniciales del cigoto y sus descendientes producen clulas que tambin son totipotentes. De hecho, los gemelos idnticos, cada uno con su placenta, se desarrollan cuando clulas totipotentes se separan y evolucionan a fetos genticos idnticos. Las clulas madre pluripotentes surgen de clulas totipotentes y pueden originar la mayor parte de los tipos de clulas necesarios para el desarrollo fetal. Por ejemplo, las clulas madre pluripotentes humanas pueden generar todas las clulas del cuerpo pero no una placenta. La diferenciacin adicional de clulas madre pluripotentes conduce a la formacin de clulas madre multipotentes y unipotentes. Las clulas multipotentes slo pueden crear un nmero limitado de tipos celulares, y las clulas unipotentes slo clulas de su mismo tipo. Las clulas pluripotentes, llamadas clulas madre embrionarias o clulas ES (del ingls embryonic stem cells), pueden aislarse de embriones tempranos; durante muchos aos se han desarrollado en laboratorios clulas ES de ratn como lneas celulares. Como hecho notable, estas clulas ES pueden inducirse a generar muchos tipos diferentes de clulas. Se ha demostrado que las clulas ES de ratn dan origen a clulas musculares, nerviosas, hepticas, pancreticas y, por supuesto, hematopoyticas. Adelantos recientes hicieron posible desarrollar lneas de clulas pluripotentes humanas. ste es un avance de gran importancia para comprender el desarrollo humano y tiene un gran potencial teraputico. Estudios in vitro de los factores que determinan o inuyen el desarrollo de clulas madre pluripotentes humanas a lo largo de una va de desarrollo en oposicin a otra estn proporcionando importantes indicios sobre el modo en que las clulas se diferencian en tipos especializados. Esta investigacin es motivada en parte por el gran potencial del uso de clulas madre pluripotentes para generar clulas y tejidos que podran reemplazar otros enfermos o daados. El xito en este esfuerzo sera un adelanto de importancia, porque en la actualidad la medicina de trasplantes depende por completo de rganos y tejidos donados, pero la demanda excede con mucho el nmero de donaciones y sigue aumentando. El xito de la obtencin de cantidades prcticas de clulas, tejidos y rganos a partir de clulas madre pluripotentes proporcionara el reemplazo de piel para pacientes quemados, clulas de msculo cardaco para quienes padecen una enfermedad cardaca crnica, clulas de islotes pancreticos para los enfermos con diabetes, y neuronas para usarse en las enfermedades de Parkinson o Alzheimer. El trasplante de clulas madre hematopoyticas (HSC) es una teraputica relevante para personas en las que es necesario reemplazar los sistemas hematopoyticos. Tiene tres aplicaciones principales:

Restaurar el sistema hematopoytico de sujetos con cncer despus del tratamiento con dosis de quimioterapia y radiacin tan altas que destruyen el sistema. Estos regmenes posolgicos elevados pueden ser mucho ms ecaces para destruir clulas tumorales que los tratamientos en los que se utilizan dosis ms convencionales de agentes citotxicos. El trasplante de clulas madre permite la recuperacin de esta drstica terapia. Asimismo, ciertos cnceres, como algunos casos de leucemia mieloide aguda, slo pueden curarse si se destruye la fuente de las clulas leucmicas, el propio sistema hematopoytico del paciente.

Proporcionar un sistema inmunitario funcional a individuos con una inmunodeciencia determinada de forma gentica, como la inmunodeciencia combinada grave (SCID). Reemplazar el sistema hematopoytico defectuoso por uno funcional para curar a algunos pacientes que tienen un trastorno gentico no maligno de la hematopoyesis que amenaza la vida, como anemia de clulas falciformes o talasemia.

Las clulas madre hematopoyticas tienen extraordinaria capacidad de regeneracin. Experimentos en ratones indican que una cantidad tan pequea como una sola HSC puede restablecer por completo la poblacin eritroide y el sistema inmunitario. En seres humanos, es necesario administrar tan poco como 10% del volumen total de mdula sea del donador para proporcionar sucientes HSC y restablecer por completo el sistema hematopoytico. Una vez que se inyectan en una vena, las HSC pasan a la circulacin y encuentran su camino hacia la mdula sea, donde comienzan el proceso de injerto. No es necesario que un cirujano inyecte de forma directa las clulas en huesos. Adems, las HSC pueden preservarse por congelacin. Esto signica que es posible crear bancos de clulas hematopoyticas. Despus de colectarse, las clulas se tratan con un criopreservador, se congelan y se almacenan para su uso posterior. Cuando se requieren, se descongela la preparacin congelada y se administra al paciente, en el que reconstituye el sistema hematopoytico. Esta tecnologa de congelacin de clulas hace posible incluso que las personas guarden sus clulas hematopoyticas propias para que les sean trasplantadas a ellas mismas en una poca posterior. En la actualidad, este procedimiento se utiliza para permitir que los sujetos con cncer donen clulas antes de someterse a quimioterapia y tratamientos de radiacin y se reconstituya ms adelante su sistema hematopoytico con sus clulas madre propias. Las clulas madre hematopoyticas se encuentran en poblaciones celulares que exhiben antgenos de supercie caractersticos. Como se expone en el texto, uno de estos antgenos es el CD34, que slo existe en un

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

33

porcentaje pequeo (~1%) de las clulas en la mdula sea adulta. Se emplea un anticuerpo especco para CD34 a n de seleccionar las clulas que muestran este antgeno y producir una poblacin enriquecida de clulas madre CD34+. Se han aplicado varias versiones de este procedimiento de seleccin con objeto de enriquecer poblaciones de clulas madre de diversas fuentes. El trasplante de poblaciones de clulas madre puede ser autlogo (el receptor es tambin el donador), singnico (el donador es idntico desde el punto de vista gentico, es decir, un gemelo idntico del receptor), o alognico (el donador y el receptor no son idnticos a nivel gentico). En cualquier procedimiento de trasplante, las diferencias genticas entre el donador y el receptor pueden dar lugar a reacciones de rechazo de base inmunitaria. Aparte del rechazo del hospedador del tejido trasplantado (hospedador contra injerto), los linfocitos en el injerto pueden atacar a los tejidos del receptor y causar en consecuencia una enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD, del ingls graft-versus-host disease), que pone en peligro la vida. Con el n de suprimir las reacciones de rechazo, es necesario suministrar frmacos inmunosupresores potentes. Por desgracia, estos medicamentos tienen efectos secundarios graves, y la inmunosupresin eleva el riesgo de infeccin del paciente y el crecimiento adicional de tumores. Por lo tanto, el trasplante de HSC se acompaa de menos complicaciones

cuando existe identidad gentica entre donador y receptor. En una poca, el trasplante de mdula sea fue el nico medio para restaurar el sistema hematopoytico. No obstante, el elemento esencial del trasplante de mdula sea es en realidad el trasplante de clulas madre. Por fortuna, es posible obtener cantidades signicativas de clulas madre de otros tejidos, como sangre perifrica y sangre del cordn umbilical. Estas fuentes alternativas de HSC son atractivas porque no es necesario anestesiar al donador y someterlo al procedimiento subsecuente muy invasivo por medio del cual se extrae mdula sea. Muchos autores piensan que la sangre perifrica reemplazar a la mdula como la fuente principal de clulas madre hematopoyticas para muchas aplicaciones. Para obtener preparaciones enriquecidas de HSC de sangre perifrica se usan agentes que inducen cifras mayores de HSC circulantes y despus la fraccin que contiene estas ltimas se separa del plasma y los glbulos rojos en un proceso denominado leucofresis. Si es necesario, puede llevarse a cabo una puricacin ms amplia para eliminar clulas T y enriquecer la poblacin CD34+. La sangre del cordn umbilical ya contiene un nmero elevado de clulas madre hematopoyticas. Ms an, se obtiene del tejido placentario (las secundinas), que casi siempre se descarta. En consecuencia, la sangre del cordn umbilical se ha constituido en una fuente atractiva de clulas para trasplante de clulas madre hema-

topoyticas. Aunque el injerto de HSC de sangre de cordn fracasa con frecuencia un poco mayor que el de clulas de sangre perifrica, los injertos de clulas de sangre del cordn causan menos GVHD que los injertos de mdula, tal vez porque la sangre del cordn tiene menos clulas T maduras. Adems de sus aplicaciones actuales en el tratamiento del cncer, muchos investigadores piensan que el trasplante autlogo de clulas madre ser til para la teraputica gnica, es decir, la introduccin de un gen normal para corregir un trastorno causado por un gen defectuoso. Los ltimos adelantos de la ingeniera gentica tal vez determinen pronto que la teraputica gnica sea un tratamiento realista para trastornos genticos de clulas sanguneas, y las clulas madre hematopoyticas son vehculos atractivos para este mtodo. El tratamiento implicara extraer una muestra de clulas madre hematopoyticas de un paciente, insertar un gen funcional para compensar el defectuoso y luego inyectar de nueva cuenta en el donador las clulas madre modicadas. La ventaja de usar clulas madre en la teraputica gnica radica en que se renuevan por s mismas. Por consiguiente, cuando menos en teora, los pacientes slo tendran que recibir una inyeccin de clulas madre modicadas. En contraste, la terapia gnica con linfocitos maduros modicados u otras clulas sanguneas exige inyecciones peridicas, toda vez que estas clulas no son capaces de renovarse por s mismas.

Clulas madre pluripotentes humanas

Las clulas madre pluripotentes humanas pueden diferenciarse en una diversidad de tipos celulares, algunos de los cuales se muestran aqu. [Adaptada de Stem Cell
Basics, NIH Web site http://stemcell.nih.gov/ info/basics. Micrografas (izquierda a derecha): Biophoto Associates/Sciences Source/Photo Researchers; Biophoto Associates/Photo Researchers; AFIP/Science Source/Photo Researchers; Astrid & Hanns-Frieder Michler/Science Photo Library/Photo Researchers.]

Mdula sea

Clulas nerviosas

Clulas de msculo cardaco

Clulas de islotes pancreticos

34

PA RT E I

INTRODUCCIN

CUADRO 2-5
Designacin CD* CD2 CD3 CD4 CD5 CD8 CD16 (Fc RIII) CD21 (CR2) CD28 CD32 (Fc RII) CD35 (CR1) CD40 CD45 CD56

Marcadores CD comunes utilizados para diferenciar subpoblaciones de linfocitos funcionales

CLULAS T Funcin Molcula de adhesin; transduccin de seales Elemento de transduccin de seales del receptor de clula T Molcula de adhesin que se une a molculas MHC clase II; transduccin de seales Desconocida (subconjunto) Molcula de adhesin que se une a molculas MHC clase I; transduccin de seales Receptor de baja anidad para la regin Fc de IgG Receptor para complemento (C3d) y virus de Epstein-Barr Receptor para molcula B7 coestimuladora en clulas presentadoras de antgeno Receptor para la regin Fc de IgG Receptor para complemento (C3b) Transduccin de seales Transduccin de seales Molcula de adhesin Clula B TH TC Clula NK

(casi siempre)

(casi siempre)

(casi siempre)

(casi siempre)

(variable)

*Los sinnimos se muestran entre parntesis.

Los diferentes linajes de etapas de maduracin de linfocitos pueden distinguirse por su expresin de molculas de membrana reconocidas por anticuerpos monoclonales particulares (anticuerpos especficos de un eptopo aislado de un antgeno; vase en el cap. 4 la descripcin de los anticuerpos monoclonales). Todos los anticuerpos monoclonales que reaccionan con una molcula de membrana particular pertenecen a un grupo de diferenciacin (CD, del ingls cluster of differentiation). Se analiza cada nuevo anticuerpo monoclonal que reconoce una molcula de membrana de un leucocito para determinar si se encuentra dentro de una designacin CD reconocida; si no es as, se le confiere una nueva designacin CD que seala una nueva molcula de membrana. Aunque la nomenclatura CD se ide al principio para las molculas de membrana de leucocitos humanos, las molculas de membrana homlogas de otras especies, como el ratn, suelen describirse con las mismas designaciones CD. En el cuadro 2-5 se incluyen algunas de las molculas CD (que muchas veces se conocen como marcadores CD) halladas en linfocitos humanos. Sin embargo, slo es una lista parcial de los ms de 250 marcadores CD descritos. En el apndice 1 se presentan una lista y la descripcin de los marcadores CD conocidos. Las caractersticas y funciones generales de los linfocitos B y T se revisan brevemente en las secciones que siguen. Estas clulas centrales del sistema inmunitario se examinan con mayor detalle en captulos posteriores.

mamferos, entre ellas el ser humano y los ratones. Las clulas B maduras se distinguen de forma definitiva de otros linfocitos y de todas las dems clulas por su sntesis y exhibicin de molculas de inmunoglobulina (anticuerpo) unidas a membrana, que sirven como receptores para antgeno. Cada una de las alrededor de 1.5 105 molculas de anticuerpo en la membrana de una clula B individual tiene un sitio de unin idntico para antgeno. Cuando un linfocito B virgen (que no ha tenido un encuentro previo con un antgeno) se topa con uno que concuerda con su anticuerpo unido a membrana, la unin del antgeno con el anticuerpo hace que la clula se divida rpidamente; su progenie se diferencia en clulas efectoras llamadas clulas plasmticas y en linfocitos B de memoria. Estos ltimos tienen un lapso de vida mayor que los linfocitos B vrgenes, y expresan el mismo anticuerpo unido a membrana que su clula B progenitora. Las clulas plasmticas, por otro lado, producen el anticuerpo en una forma que puede ser secretada y poseen poco o nada de anticuerpo unido a membrana. Estas clulas son clulas diferenciadas en sentido terminal y no se dividen. Aunque es posible encontrar algunas poblaciones longevas en la mdula sea, muchas mueren en una a dos semanas. Estn altamente especializadas en la secrecin de anticuerpo, y se estima que una sola clula es capaz de secretar desde unos pocos cientos hasta ms de mil molculas de anticuerpo por segundo.

Linfocitos T (clulas T)
Los linfocitos T derivan su nombre de su sitio de maduracin en el timo. Durante este proceso, la clula T adquiere la capacidad de expresar en su membrana una molcula nica de unin a antgeno llamada receptor de clula T. A diferencia de los anticuerpos unidos a membrana de los linfocitos B, que pueden reconocer antgeno libre, los receptores de los linfocitos T

Linfocitos B (clulas B)
La designacin B de los linfocitos procede de la bolsa de Fabricio, sitio donde maduran estas clulas en las aves; el nombre result adecuado toda vez que la mdula sea (en ingls bone marrow) es tambin su principal lugar de maduracin en varias especies de

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

35

slo reconocen antgeno unido a protenas de membrana llamadas molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, del ingls major histocompatibility complex). Las molculas del MHC (o molculas MHC, para abreviar) que intervienen en este proceso de reconocimiento (llamado presentacin de antgeno) son glucoprotenas genticamente diversas (polimrficas) presentes en las membranas celulares (cap. 8). Existen dos tipos principales de molculas MHC: las de clase I, que son expresadas prcticamente por todas las clulas nucleadas de los vertebrados, y las de clase II, que son expresadas slo por unos cuantos tipos celulares que se especializan en la presentacin de antgeno. Cuando un linfocito T reconoce antgeno asociado con una molcula MHC sobre una clula, en circunstancias apropiadas el linfocito prolifera y se diferencia en diversas clulas T efectoras y clulas T de memoria. Existen dos subpoblaciones bien definidas de clulas T: clulas T colaboradoras (TH) y clulas T citotxicas (TC); recientemente se caracteriz una tercera subpoblacin de clulas T, las clulas T reguladoras (Treg). Las clulas T colaboradoras y las citotxicas pueden distinguirse entre s por la presencia de glucoprotenas de membrana CD4 o CD8 en sus superficies. Las clulas T que exhiben CD4 generalmente funcionan como linfocitos TH, mientras que las que exhiben CD8 por lo general funcionan como linfocitos TC. Por tanto, la proporcin entre clulas TH y TC en una muestra puede estimarse determinando el nmero de clulas T CD4 y CD8 . Esta proporcin es de alrededor de 2:1 en sangre perifrica humana normal, pero suele alterarse en grado significativo en enfermedades de inmunodeficiencia, autoinmunitarias y de otros tipos. Despus de ser activadas por la interaccin con complejos antgeno-MHC adecuados, las clulas TH se diferencian en clulas efectoras que facilitan la activacin (o colaboran en ella) de linfocitos B, linfocitos TC, macrfagos y otras clulas diversas que participan en la inmunorreaccin. De manera alternativa, algunas clulas TH se diferencian en clulas de memoria en vez de hacerlo en clulas efectoras. El reconocimiento de complejos antgeno-MHC por una clula TC desencadena su proliferacin y diferenciacin en una clula efectora llamada linfocito T citotxico (CTL) o en una clula de memoria. El CTL tiene el papel vital de vigilar las clulas del cuerpo y eliminar a cualquiera que exhiba antgeno extrao en complejo con MHC clase I, como es el caso de clulas infectadas por virus, clulas tumorales y clulas de un injerto de tejido ajeno. Las clulas T reguladoras se identifican por la presencia tanto de CD4 como de CD25 en sus membranas. Sin embargo, a diferencia de los linfocitos T colaboradores que portan CD4, los linfocitos Treg suprimen inmunorreacciones: son reguladores negativos del sistema inmunitario. Al igual que las clulas TH y las TC, los miembros de la subpoblacin Treg de clulas T pueden ser progenitores de clulas de memoria.

la cual surge del mismo linfocito fundador, constituye una clona. En un momento dado, un ser humano o un ratn tendrn decenas de miles, quiz cien mil clonas distintas de clulas B y T, cada una de las cuales se caracteriza por propia cohorte idntica y distintiva de receptores de antgeno. El contacto con un antgeno induce a estas clulas a proliferar y diferenciarse. Los productos de este proceso incluyen tanto clulas efectoras como clulas de memoria. Las clulas efectoras realizan funciones especficas, mientras que las clulas de memoria persisten en el hospedador y en caso de un nuevo contacto con el mismo antgeno median una respuesta que es tanto ms rpida como de mayor magnitud. El primer encuentro se denomina respuesta primaria, y el reencuentro, respuesta secundaria.

Clulas asesinas naturales

El cuerpo contiene una poblacin pequea de linfocitos granulares grandes llamados clulas asesinas naturales (clulas NK, del ingls natural killer cell)* que poseen actividad citotxica contra una amplia gama de clulas tumorales y contra clulas infectadas por determinados virus. Una caracterstica extraordinaria de estas clulas, que constituyen 5 a 10% de los linfocitos en sangre perifrica humana, es su capacidad de reconocer clulas tumorales o infectadas por virus a pesar de que carecen de receptores especficos de antgeno. Las clulas asesinas naturales son parte del sistema inmunitario innato, y la mayora est desprovista de receptores de clula T o inmunoglobulina incorporada en sus membranas plasmticas; en otras palabras, no expresan las molculas de membrana ni los receptores que distinguen a los linajes de clulas B y T. Las clulas NK reconocen blancos celulares potenciales de dos modos distintos. En algunos casos, utilizan receptores de clula NK para distinguir anormalidades, en especial un decremento de la exhibicin de molculas MHC clase I o el perfil poco comn de antgenos de superficie que poseen algunas clulas tumorales y clulas infectadas por ciertos virus. Adems, en algunos casos estos dos tipos de clulas anormales exhiben antgenos contra los cuales el sistema inmunitario ha montado una respuesta de anticuerpo, de tal manera que estn unidos a sus superficies anticuerpos antitumorales o antivricos. Debido a que las clulas NK expresan un receptor de membrana (CD16) para una regin especfica de la molcula de anticuerpo, pueden unirse a estos anticuerpos y destruir despus las clulas blanco. ste es un ejemplo de un proceso denominado citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpo (ADCC, del ingls antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity). El mecanismo exacto de la citotoxicidad de las clulas NK, que es el foco de gran parte de los estudios experimentales actuales, se describe con mayor extensin en el captulo 14. Cada vez se reconoce ms otro tipo celular, la clula NKT, que tiene algunas de las caractersticas de las clulas T y NK. Al igual que las clulas T, las NKT poseen receptores de clula T (TCR). En cambio, a diferencia de la mayor parte de las clulas T, los TCR de clulas NKT interactan con molculas parecidas a MHC llamadas CD1 y no con las molculas MHC clase I o II. Tal y como se observa en las clulas NK, tienen valores va*N. del T.: una traduccin ms precisa del ingls natural killer cells sera clulas asesinas por naturaleza, dada la avidez con que estos linfocitos atacan clulas del propio hospedador, si bien slo las tumorales o infectadas por virus. Sin embargo, en espaol ha tomado carta de naturalizacin el trmino clulas asesinas naturales, y aqu se seguir esa prctica.

Las poblaciones de clulas B y T comprenden subpoblaciones de clonas

Todos los receptores de antgeno en la superficie de un linfocito B o T dado tienen estructura idntica y por tanto idntica especificidad para antgeno. Si un linfocito dado se divide para formar dos clulas hijas, stas tendrn ambos receptores con idntica especificidad de antgeno entre s y con la clula de la que surgieron, y lo mismo ocurrir con los descendientes que lleguen a producir. La poblacin resultante de linfocitos, toda

36

PA RT E I

INTRODUCCIN

a) Monocito Lisosoma

Ncleo

Fagosoma

migran hacia los tejidos y se diferencian en macrfagos especficos de tejido. La diferenciacin de un monocito en un macrfago tisular incluye varios cambios: la clula crece cinco a 10 veces; sus organelos intracelulares aumentan en nmero y complejidad; adquiere mayor capacidad fagoctica, que produce concentraciones ms altas de enzimas hidrolticas, y comienza a secretar una diversidad de factores solubles. Los macrfagos se dispersan en la totalidad del cuerpo. Algunos residen en tejidos particulares y se constituyen en macrfagos fijos, en tanto que otros permanecen movibles y se llaman macrfagos libres o errantes. Los macrfagos libres se desplazan a travs de los tejidos mediante movimientos ameboides. Las clulas parecidas a macrfagos tienen diferentes funciones en distintos tejidos y se denominan conforme a su localizacin tisular:

b) Macrfago Fagosoma

Macrfagos intestinales en los intestinos Macrfagos alveolares en el pulmn Histiocitos en los tejidos conectivos Clulas de Kupffer en el hgado Clulas mesangiales en el rin Clulas microgliales en el cerebro Osteoclastos en el hueso

Seudpodos

Fagolisosoma Lisosoma

Fagosoma

FIGURA 2-7 Morfologa tpica de: a) un monocito y b) un

macrfago. Los macrfagos son cinco a 10 veces ms grandes que los monocitos y contienen ms organelos, en especial lisosomas.

riables de CD16 y otros receptores tpicos de clulas NK y pueden destruir clulas marcadas. Una poblacin de clulas NKT activadas es capaz de secretar con rapidez grandes cantidades de las citocinas necesarias para mantener la produccin de anticuerpo por clulas B y, asimismo, la inflamacin y el desarrollo y expansin de clulas T citotxicas. Hay gran inters por la determinacin de las funciones exactas de las clulas NKT en la inmunidad.

Los macrfagos son activados por una diversidad de estmulos en el curso de una reaccin inmunitaria. La fagocitosis de antgenos particulados o el contacto con receptores que captan molculas presentes en los patgenos microbianos a menudo sirve como un estmulo activador inicial. Sin embargo, la actividad del macrfago puede ser estimulada de manera adicional por citocinas que secretan clulas TH activadas y por mediadores de la respuesta inflamatoria. Los macrfagos activados son ms eficaces que los que se encuentran en reposo para eliminar patgenos potenciales por varias razones. Presentan ms actividad fagoctica, mayor potencial de destruir microorganismos ingeridos, mayor secrecin de mediadores inflamatorios y mayor capacidad de activar clulas T. Adems, los macrfagos activados, aunque no los que se encuentran en reposo, secretan diversas protenas citotxicas que los ayudan a eliminar una amplia variedad de patgenos, incluidas clulas infectadas por virus, clulas tumorales y bacterias intracelulares. En el captulo 3 se hablar ms sobre las actividades antimicrobianas de los macrfagos. Los macrfagos activados tambin expresan valores ms altos de molculas MHC clase II, que les permiten funcionar con mayor eficacia como clulas presentadoras de antgeno. Por consiguiente, los macrfagos y las clulas TH facilitan entre s la activacin durante la reaccin inmunitaria.

Fagocitos mononucleares
El sistema fagoctico mononuclear comprende monocitos que circulan en la sangre y macrfagos diseminados en los tejidos (fig. 2-7). Durante la hematopoyesis en la mdula sea las clulas progenitoras de granulocitos y monocitos se diferencian en promonocitos, que salen de la mdula sea y pasan a la sangre, en donde se diferencian de modo adicional en monocitos maduros. Los monocitos circulan en el torrente sanguneo alrededor de ocho horas, durante las cuales crecen; a continuacin,

La fagocitosis es seguida de la digestin y presentacin de antgeno

Los macrfagos son capaces de ingerir y digerir antgenos exgenos, como microorganismos completos y partculas insolubles, y material endgeno, como clulas hospedadoras lesionadas o muertas, desechos celulares y factores de la coagulacin activados. La fagocitosis es iniciada por la adhesin del antgeno a la

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

37

a)

b) Seudpodos Bacteria

Lisosoma Fagosoma Fagolisosoma

MHC clase II Pptido antignico-MHC clase II

Material degradado expulsado (exocitosis)

FIGURA 2-8 Los macrfagos pueden ingerir y degradar antgenos particulados, incluidas las bacterias. a) Micrografa electrnica de barrido de un macrfago. Obsrvense los largos seudpodos que se extienden hacia las clulas bacterianas y sin contacto con ellas, una etapa temprana de la fagocitosis. b) Fagocitosis y procesamiento de antgeno exgeno por macrfagos. Casi todos los pro-

ductos que resultan de la digestin del material ingerido se expulsan (exocitosis), pero algunos productos peptdicos pueden interactuar con molculas MHC clase II y formar complejos que se mueven hacia la supercie celular, en donde se presentan a clulas TH. [(a) L.
Nilsson, Boehringer Ingelheim International GmbH.]

membrana celular del macrfago. Los antgenos complejos, como clulas bacterianas completas o partculas vricas, tienden a adherirse bien y se fagocitan con facilidad; las protenas aisladas y las bacterias encapsuladas se adhieren mal y se fagocitan con menor facilidad. La adhesin induce salientes de la membrana, llamadas seudpodos, que se extienden alrededor del material fijado (fig. 2-8a). La fusin de los seudpodos encierra el material dentro de una estructura limitada por una membrana conocida como fagosoma, que a continuacin ingresa a la va endoctica de procesamiento (fig. 2-8b). En esta va, un fagosoma se mueve hacia el interior de la clula, en donde se fusiona con un lisosoma para formar un fagolisosoma. Los lisosomas contienen una variedad de enzimas hidrolticas que digieren el material fagocitado. Despus se elimina el contenido digerido del fagolisosoma mediante un proceso llamado exocitosis (fig. 2-8b). La membrana del macrfago tiene receptores para ciertas clases de anticuerpos. Si un antgeno (p. ej., una bacteria) est recubierto con el anticuerpo apropiado, el complejo de antgeno y anticuerpo se une con mayor facilidad a los receptores de anticuerpo en la membrana del macrfago que un antgeno solo y mejora la fagocitosis. Por ejemplo, en un estudio, la rapidez de fagocitosis de un antgeno fue 4 000 veces ms alta en presencia de un anticuerpo especfico para el antgeno que en su ausencia. Por consiguiente, el anticuerpo acta como una opsonina, una molcula que se une al antgeno y el macrfago e incrementa la fagocitosis. El proceso por el cual las opsoninas hacen a los antgenos particulados ms susceptibles a la fagocitosis se denomina opsonizacin. Aunque la mayor parte del antgeno ingerido por macrfagos se degrada y elimina, experimentos con antgenos radiomarcados demuestran la presencia de pptidos antignicos en la membrana del macrfago. Como se muestra en la figura 2-8b, el antgeno fagocitado se digiere en la va endoctica de procesamiento y es convertido en pptidos que se vinculan con

molculas MHC clase II; estos complejos pptido-MHC clase II se dirigen a continuacin a la membrana del macrfago. Tales procesamiento y presentacin de antgeno, que se examinan con detalle en el captulo 8, son crticos para la activacin de la clula TH, un fenmeno central en el desarrollo de reacciones inmunitarias humorales y mediadas por clulas. Por ltimo, como se expone en el captulo 3, los macrfagos activados secretan protenas reguladoras que son importantes para el desarrollo de las inmunorreacciones.

Clulas granulocticas
Los granulocitos se clasifican en neutrfilos, eosinfilos o basfilos, segn la morfologa celular y las caractersticas de tincin citoplsmica (fig. 2-9). El neutrfilo tiene un ncleo multilobulado y un citoplasma granuloso que se tie con colorantes cidos y bsicos; con frecuencia se conoce como leucocito polimorfonuclear (PMN) por su ncleo multilobulado. El eosinfilo tiene un ncleo bilobulado y un citoplasma granuloso que se tie con el colorante cido rojo eosina (de ah su nombre). El basfilo posee un ncleo lobulado y un citoplasma muy granuloso que se tie con el colorante bsico azul de metileno. Los neutrfilos y eosinfilos son fagocticos, no as los basfilos. Los neutrfilos, que constituyen 50 a 70% de los glbulos blancos circulantes, son mucho ms numerosos que los eosinfilos (1 a 3%) o los basfilos ( 1%).

Neutrlos
Los neutrfilos se forman por hematopoyesis en la mdula sea. Se liberan a la sangre perifrica y circulan durante siete a 10 horas antes de migrar a los tejidos, en donde tienen un lapso de vida de slo unos cuantos das. En respuesta a muchos tipos de infecciones, la mdula sea libera ms de la cantidad

38

PA RT E I

INTRODUCCIN

a) Neutrfilo Glucgeno

Ncleo multilobulado

Grnulo secundario Grnulo azurfilo primario Fagosoma

yentes del sistema de coagulacin de la sangre y varias citocinas secretadas por macrfagos y clulas TH activados. Al igual que los macrfagos, los neutrfilos son fagocitos. La fagocitosis por neutrfilos es similar a la descrita para macrfagos, excepto porque las enzimas lticas y las sustancias bactericidas de los neutrfilos estn incluidas dentro de grnulos primarios y secundarios (fig. 2-9a). Los grnulos primarios, ms densos y grandes, son un tipo de lisosoma que contiene peroxidasa, lisozima y varias enzimas hidrolticas. Los grnulos secundarios, ms pequeos, incluyen colagenasa, lactoferrina y lisozima. Unos y otros se fusionan con fagosomas, cuyo contenido se digiere a continuacin y se elimina. Los neutrfilos generan una variedad de sustancias antimicrobianas, que se examinarn en el captulo 3.

b) Eosinfilo

Eosinlos
Grnulo cristaloide

Tal y como se observa con los neutrfilos, los eosinfilos son clulas fagocticas mviles (fig. 2-9b) que pueden migrar de la sangre hacia los espacios tisulares. Su funcin fagoctica es significativamente menos importante que la de los neutrfilos, y se piensa que intervienen en la defensa contra microorganismos parsitos secretando el contenido de los grnulos eosinoflicos, lo cual suele daar la membrana de los parsitos.

Baslos
Los basfilos son granulocitos no fagocticos (fig. 2-9c) que se producen por hematopoyesis y cuya funcin es liberar sustancias farmacolgicamente activas de sus grnulos citoplsmicos. Estas sustancias tienen un papel importante en ciertas reacciones alrgicas.
Glucgeno

c) Basfilo

Clulas cebadas
Los precursores de clulas cebadas, que se forman en la mdula sea mediante hematopoyesis, se liberan hacia la sangre como clulas indiferenciadas; no se diferencian sino hasta que salen de la sangre y penetran en los tejidos. Las clulas cebadas (o mastocitos) pueden encontrarse en muchos tejidos, que incluyen piel, tejidos conectivos de diversos rganos y tejido mucoso epitelial de las vas respiratoria, genital y digestiva. Como sucede con los basfilos circulantes, estas clulas presentan un gran nmero de grnulos citoplsmicos que contienen histamina y otras sustancias activas a nivel farmacolgico. Las clulas cebadas, aunadas a los basfilos sanguneos, tienen una participacin esencial en el desarrollo de alergias (cap. 15).

Grnulo

FIGURA 2-9 Esquemas que muestran la morfologa tpica de los granulocitos. Obsrvese las diferencias en la forma del ncleo y el nmero y aspecto de los granulocitos citoplsmicos.
usual de neutrfilos y estas clulas suelen ser las primeras que llegan al sitio de inflamacin. El incremento transitorio resultante del nmero de neutrfilos circulantes, llamado leucocitosis, se utiliza en clnica como una indicacin de infeccin. El desplazamiento de neutrfilos circulantes hacia los tejidos, lo que se conoce como extravasacin, requiere varias etapas: primero la clula se adhiere al endotelio vascular, a continuacin penetra en la brecha entre clulas endoteliales adyacentes que recubren la pared vascular, y por ltimo ingresa a la membrana basal vascular y se dirige a los espacios tisulares. (Este proceso se describe con mayor detalle en el captulo 3.) Varias sustancias producidas en una reaccin inflamatoria sirven como factores quimiotcticos que promueven la acumulacin de neutrfilos en un sitio inflamatorio. Entre estos factores quimiotcticos se encuentran algunos componentes del complemento, constitu-

Clulas dendrticas
Identificadas en 1868 por Paul Langerhans durante un detallado estudio anatmico de la piel, las clulas dendrticas fueron las primeras clulas del sistema inmunitario en ser descubiertas. La clula dendrtica (DC, del ingls dendritic cell) recibi ese nombre porque est cubierta de largas extensiones membranosas que semejan las dendritas de las clulas nerviosas. Existen muchos tipos de esta clula, y se reconocen al menos cuatro categoras principales: de Langerhans, intersticiales, derivadas de monocitos y derivadas de plasmacitoides. Cada una de ellas surge de clulas madre hematopoyticas a travs de diferentes vas y en distintos sitios (fig. 2-10). Las DC de Langerhans se encuentran en

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T U L O

39

Clula madre hematopoytica

Progenitor mieloide comn

DC de Langerhans inmadura (tejido epitelial)

DC intersticial inmadura (tejido no epitelial)

Monocito

Precursor de DC plasmacitoide

Maduracin y migracin

Diferenciacin y maduracin

Macrfago

DC de Langerhans (ganglio linftico)

DC intersticial (ganglio linftico, bazo)

DC derivada de monocitos

DC derivada de plasmacitoide

FIGURA 2-10 Diferentes tipos de clulas dendrticas y sus orgenes.

capas epidrmicas de la piel, y las intersticiales estn presentes en los espacios intersticiales de virtualmente todos los rganos excepto el encfalo. Como su nombre lo indica, las DC derivadas de monocitos provienen de monocitos que han emigrado del torrente sanguneo a los tejidos. Desde aqu pueden viajar por la linfa a los ganglios linfticos o volver al torrente sanguneo y usarlo como avenida de transporte hacia el tejido linfoide. Las DC de la tercera categora surgen de clulas plasmacitoides. Participan en la defensa inmunitaria innata y como clulas presentadoras de antgeno. Aunque existen importantes diferencias en las funciones y los fenotipos de las distintas variedades de DC, todas exhiben molculas MHC clase I y clase II, y en todas est presente la familia B7 de molculas coestimuladoras, CD80 y CD86. Las clulas dendrticas tambin tienen CD40, una

molcula capaz de influir en el comportamiento de los linfocitos T por interaccin con un ligando complementario presente en la superficie de stos. Las clulas dendrticas son verstiles; existen en muchas formas y realizan las distintas funciones de captura de antgeno en un sitio y presentacin de antgeno en otro. Fuera de los ganglios linfticos, las formas inmaduras de estas clulas vigilan el organismo en busca de signos de invasin por patgenos y capturan antgenos intrusos o externos. Entonces emigran a los ganglios linfticos, donde presentan el antgeno a clulas T. Cuando actan como centinelas en la periferia, las clulas dendrticas inmaduras toman a su cargo el antgeno de tres maneras. Lo engullen por fagocitosis, lo internalizan mediante endocitosis mediada por receptor, o lo inhiben por pinocitosis. De hecho,

40

PA RT E I

INTRODUCCIN

las clulas dendrticas inmaduras captan por pinocitosis 1 000 a 1 500 m3 de lquido por hora, un volumen muy cercano al de la clula misma. A travs de un proceso de maduracin, cambian de un fenotipo que captura antgeno a otro que apoya la presentacin de antgeno a clulas T. En esa transicin se pierden unos atributos y se ganan otros. Entre lo que se pierde est la capacidad de fagocitosis y la de pinocitosis a gran escala. La expresin de MHC clase II aumenta, lo cual es necesario para presentar antgeno a las clulas TH, y tambin aumenta la produccin de molculas coestimuladoras esenciales para la activacin de clulas T vrgenes. Al madurar, las clulas dendrticas salen de los tejidos perifricos, pasan a la circulacin sangunea o linftica, emigran a regiones de los rganos linfoides donde residen linfocitos T, y les presentan antgeno.

Adenoides Amgdalas Conducto torcico Vena subclavia izquierda Ganglios linfticos

Conducto linftico derecho Timo

Bazo

Clulas dendrticas foliculares

Las clulas dendrticas foliculares no se originan en la mdula sea y tienen funciones del todo distintas de las descritas para las DC recin consideradas. Las clulas dendrticas foliculares no expresan molculas MHC clase II y por tanto no funcionan como clulas presentadoras de antgeno para la activacin de linfocitos TH. Estas clulas dendrticas se denominaron as por su localizacin exclusiva en estructuras organizadas de los ganglios linfticos llamadas folculos linfticos, que son abundantes en clulas B. Aunque no expresan molculas clase II, las clulas dendrticas foliculares s expresan concentraciones elevadas de receptores de membrana para anticuerpo, lo que permite la unin eficiente de complejos de antgeno y anticuerpo. Como se expone en el captulo 11, la interaccin de los linfocitos B con DC foliculares es un paso importante en la maduracin y diversificacin de las clulas B.
Intestino grueso Apndice

Placas de Peyer Mdula sea Intestino delgado

rganos del sistema inmunitario

Varios rganos y tejidos, distintos desde los puntos de vista morfolgico y funcional, tienen diversas funciones en la formacin de las respuestas inmunitarias (fig. 2-11) y pueden distinguirse en rganos linfoides primarios y secundarios. El timo y la mdula sea son los rganos linfoides primarios (o centrales) en los que se lleva a cabo la maduracin de linfocitos. Los rganos linfoides secundarios (perifricos) son ganglios linfticos, bazo y diversos tejidos linfoides relacionados con mucosas (MALT, del ingls mucosa-associated lymphoid tissues), como el tejido linfoide intestinal (GALT, del ingls gut-associated lymphoid tissue). Estos rganos proporcionan sitios para que los linfocitos maduros interacten con antgeno. Una vez que se han generado linfocitos maduros en los rganos linfoides primarios, circulan en la sangre y el sistema linftico, una red de vasos que recoge lquido escapado hacia los tejidos desde los capilares del sistema circulatorio y lo devuelve a la sangre.

Linfticos tisulares

rganos linfoides primarios

Los linfocitos inmaduros que se generan en la hematopoyesis maduran y adquieren una especificidad antignica particular dentro de los rganos linfoides primarios. Slo despus de que los linfocitos maduran dentro de un rgano linfoide primario, la clula es inmunocompetente (capaz de activar una reaccin in-

FIGURA 2-11 Sistema linfoide humano. Se muestran los rganos primarios (mdula sea y timo) en rojo; los rganos y tejidos secundarios en azul. Estos rganos y tejidos linfoides, diversos desde los puntos de vista estructural y funcional, estn interconectados por los vasos sanguneos (no se muestran) y vasos linfticos (prpura). La mayora de los linfticos del cuerpo al nal desembocan en el conducto torcico, que vierte su contenido en la vena subclavia izquierda. Sin embargo, los vasos que drenan el brazo derecho y el lado derecho de la cabeza convergen para formar el conducto linftico derecho, que vierte su contenido en la vena subclavia derecha (no se muestra). Los huesos que contienen mdula son parte del sistema linfoide; normalmente las muestras de mdula sea se toman de la cresta iliaca o del esternn. [Adaptada de H. Lodish et al., 1995,
Molecular Cell Biology, 3rd ed., Scientic American Books, New York.]

munitaria). Las clulas T se originan en la mdula sea y se desarrollan en el timo. En muchos mamferos (p. ej., el ser humano y los ratones), las clulas B se originan en la mdula sea.

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

41

Cpsula Trabcula Timocito en divisin Clula epitelial cortical Clula muerta Timocito

Mdula

Corteza

Clula dendrtica Vaso sanguneo Macrfago Corpsculos de Hassall Clula epitelial medular

FIGURA 2-12 Corte transversal esquemtico de una porcin del timo que muestra varios lobulillos separados por cordones de tejido conectivo (trabculas). La corteza externa, densamente poblada, contiene muchos timocitos inmaduros (azul), que sufren proliferacin rpida junto con una tasa muy elevada de muerte celular. La mdula est escasamente poblada y contiene timocitos ms maduros. Durante su permanencia en el timo, los timocitos interactan con diversas clulas estromales, incluidas las clulas epiteliales

corticales (rojo claro), clulas epiteliales medulares (pardo), clulas dendrticas (prpura) y macrfagos (amarillo). Estas clulas producen hormonas tmicas y expresan valores altos de molculas MHC clases I y II. Los corpsculos de Hassall, que se encuentran en la mdula, contienen capas concntricas de clulas epiteliales en degeneracin. [Adaptada con autorizacin de W. van Ewijk, 1991, Annual Review
of Immunology 9:591, 1991 por Annual Reviews.]

Timo
El timo es el sitio de desarrollo y maduracin de las clulas T. Es un rgano bilobulado plano situado arriba del corazn. Cada lbulo est rodeado por una cpsula y dividido en lobulillos, separados entre s por cordones de tejido conectivo llamados trabculas (fig. 2-12). Cada lbulo se integra con dos compartimientos: el externo, o corteza, lo ocupan en gran densidad clulas T inmaduras, llamadas timocitos; el interno, o mdula, aloja escasos timocitos. Tanto la corteza como la mdula del timo estn cruzadas por una red tridimensional de clulas estromales compuesta de clulas epiteliales y dendrticas y macrfagos, que constituyen el armazn del rgano y contribuyen al crecimiento y la maduracin de los timocitos. Muchas de estas clulas estromales interactan fsicamente con los timocitos en desarrollo. La funcin del timo consiste en crear y seleccionar un repertorio de clulas T que protegern al cuerpo de infecciones. A medida que se desarrollan los timocitos, se produce una enorme diversidad de receptores de clula T por reconfiguracin gnica (cap. 9), que da lugar a algunas clulas T con receptores capaces de reconocer complejos de antgeno y MHC. Sin embargo, casi ninguno de los receptores de clula T que se producen por este proceso aleatorio es capaz de reconocer complejos de antgeno y MHC, y una porcin pequea reacciona con combinaciones de complejos de antgeno propio y MHC. Al utilizar los mecanismos que se exponen en el captulo 10, el timo induce la muerte de las clulas T incapaces de reconocer complejos de antgeno y MHC y las que

reaccionan con antgeno propio y MHC con la potencia suficiente para representar el peligro de causar una enfermedad autoinmunitaria. Ms de 95% de todos los timocitos muere por apoptosis en el timo sin alcanzar nunca la madurez. Es posible estudiar el papel del timo en la funcin inmunitaria en ratones al examinar los efectos de la timectoma neonatal, un procedimiento en el que se extirpa quirrgicamente el timo de ratones recin nacidos. Estos ratones timectomizados muestran una disminucin notable de linfocitos circulantes del linaje de clulas T y ausencia de inmunidad mediada por clulas. Otra prueba de la importancia del timo proviene de estudios de un defecto congnito de nacimiento en el ser humano (sndrome de DiGeorge) y en ciertos ratones (ratn desnudo). En ambos casos el timo no se desarrolla, y se advierte la ausencia de clulas T circulantes y de inmunidad mediada por clulas, adems de un incremento de enfermedades infecciosas. Se sabe que el funcionamiento del timo declina con la edad. Dicho rgano alcanza su tamao mximo en la pubertad y luego se atrofia, con disminucin considerable de clulas corticales y medulares e incremento del contenido total de grasa del rgano. En tanto que el peso promedio del timo es de 30 g en lactantes, su involucin dependiente de la edad deja un rgano con peso promedio de slo 3 g en la edad avanzada (fig. 2-13). La prdida de masa dependiente de la edad se acompaa de decremento de la produccin de linfocitos T. Hacia los 35 aos de edad, la generacin de tales clulas en el timo ha cado a 20% de la que ocurre en neonatos, y hacia los 65 aos es de apenas 2% de este valor.

42

PA RT E I

INTRODUCCIN

Peso total del timo (g)

50 40 30 20 10 0

llevan a cabo la maduracin, proliferacin y diversificacin de clulas B en un momento temprano de la gestacin es el bazo fetal. Ms adelante en la gestacin, esta funcin la asume una placa de tejido incluida en la pared del intestino llamada placa de Peyer ileal, que contiene un gran nmero de clulas B y T. El conejo utiliza asimismo tejidos relacionados con el intestino, por ejemplo el apndice, como tejido linfoide primario para las etapas importantes de la proliferacin y diversificacin de clulas B.

Sistema linftico
Naci- 10 miento 20 30 40 Edad (en aos) 50 60

FIGURA 2-13 Cambios del timo con la edad. El tamao y la celularidad del timo disminuyen despus de la pubertad.

Se han diseado varios experimentos para observar el efecto de la edad sobre la funcin inmunitaria del timo. En un estudio se injert en ratones adultos timectomizados el timo de un ratn de un da o de otro de 33 meses de edad. (Para la mayora de los ratones de laboratorio, 33 meses representa vejez avanzada.) Los ratones que recibieron el injerto de timo de recin nacidos mostraron una mejora significativamente mayor de la funcin inmunitaria que los ratones a los que se injert el timo de 33 meses de edad.

Mdula sea
La mdula sea es un tejido complejo en el que ocurren hematopoyesis y depsito de grasa. De hecho, con el paso del tiempo, 50% o ms del compartimiento medular del hueso llega a ser ocupado por grasa. Las clulas hematopoyticas generadas en la mdula sea avanzan a travs de las paredes de los vasos sanguneos e ingresan en la sangre circulante, que los lleva fuera de la mdula sea y distribuye estos diversos tipos celulares por el resto del cuerpo. En el ser humano y los ratones, la mdula sea es el sitio de origen y desarrollo de las clulas B. Estas clulas inmaduras, que provienen de progenitores linfoides, proliferan y se diferencian en la mdula sea; all las clulas estromales interactan directamente con las clulas B y secretan varias citocinas necesarias para el desarrollo. Los linfocitos B de la mdula sea son la fuente de alrededor de 90% de las inmunoglobulinas IgG e IgA del plasma. Al igual que la seleccin tmica durante la maduracin de las clulas T, un proceso de seleccin en la mdula sea elimina clulas B con receptores de anticuerpo autorreactivos. (Este proceso se explica en el captulo 11.) A pesar de su importancia decisiva en seres humanos y ratones, la mdula sea no es el lugar de desarrollo de los linfocitos B en todas las especies. En aves, un rgano linfoide relacionado con el intestino y llamado bolsa de Fabricio es el principal punto de maduracin de las clulas B. En mamferos como primates y roedores no existe la bolsa ni un equivalente que sirva como rgano linfoide primario. En bovinos y ovejas, el principal tejido linfoide en el que se

Conforme circula la sangre bajo presin, su componente lquido (plasma) escapa a travs de la pared delgada de los capilares hacia el tejido circundante. En un adulto, dependiendo de talla y actividad, la filtracin puede agregar hasta 2.9 L o ms durante un perodo de 24 h. Este lquido, llamado lquido intersticial, permea todos los tejidos y baa todas las clulas. Si no fuera devuelto a la circulacin, producira edema (tumefaccin progresiva) y con el tiempo pondra en peligro la vida. No nos preocupa este edema catastrfico porque gran parte del lquido es devuelto a la sangre a travs de las paredes de las vnulas. El resto del lquido intersticial ingresa en una delicada red de tubos de pared delgada llamados vasos linfticos primarios. La pared de los vasos primarios consta de una nica capa de clulas endoteliales laxamente superpuestas (fig. 2-14). Aunque los capilares estn cerrados en su extremo (son ciegos), la arquitectura porosa de los vasos primarios permite la entrada de lquidos e incluso de clulas en la red linftica. Dentro de estos vasos el lquido, que ahora se denomina linfa, fluye de la red de tubos diminutos a una serie de vasos colectores cada vez ms grandes llamados vasos linfticos o simplemente linfticos (fig. 2-14). El linftico ms grande, el conducto torcico, desemboca en la vena subclavia izquierda. Rene linfa de todo el cuerpo excepto el brazo derecho y el lado derecho de la cabeza. La linfa procedente de estas zonas se colecta en el conducto linftico derecho, que drena en la vena subclavia derecha (fig. 2-11). De esta forma, el sistema linftico recupera el lquido que se pierde de la sangre y lo devuelve a ella, lo que asegura volmenes estables de lquido dentro del sistema circulatorio. Linfocitos, clulas dendrticas, macrfagos y otras clulas tambin pueden entrar a travs de la delgada pared de clulas endoteliales laxamente unidas de los linfticos primarios e incorporarse al flujo de linfa (fig. 2-14). El corazn no bombea la linfa a travs del sistema linftico; en lugar de ello, el flujo de linfa se lleva a cabo a medida que se exprimen los vasos linfticos por movimientos de los msculos del cuerpo. Una serie de vlvulas unidireccionales a lo largo de los linfticos asegura que la linfa slo fluya en un sentido. Cuando un antgeno extrao penetra en los tejidos, el sistema linftico (que drena todos los tejidos del cuerpo) lo capta y desplaza hacia varios tejidos linfoides organizados, como los ganglios linfticos, que atrapan el antgeno extrao. A medida que pasa linfa de los tejidos a los vasos linfticos, se enriquece de modo progresivo de linfocitos. Por consiguiente, el sistema linftico tambin sirve como un medio para transportar linfocitos y antgeno de los tejidos conectivos a tejidos linfoides organizados donde los linfocitos pueden interactuar con el antgeno atrapado y activarse.

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

43

Espacio tisular

Capilares linfticos

Clulas de tejido circundante Movimiento de ingreso al capilar linftico Vasos linfticos Folculo linfoide Vaso linftico aferente Capilar linftico

FIGURA 2-14 Vasos linfticos. El lquido intersticial entra en

Ganglio linftico

Vaso linftico eferente

Folculo secundario Centro germinal

pequeos capilares linfticos de extremo cerrado (ciegos) movindose entre los colgajos laxamente unidos de la delgada capa de clulas endoteliales que constituye la pared del vaso. El lquido, que ahora recibe el nombre de linfa, es llevado por vasos linfticos cada vez ms grandes hacia ganglios linfticos regionales. A medida que la linfa sale de los ganglios, es llevada a travs de vasos linfticos eferentes ms grandes que al nal desembocan en el sistema circulatorio por el conducto torcico o el conducto linftico derecho (vase g. 2-11).

rganos linfoides secundarios

Varios tipos de tejidos linfoides organizados se localizan a lo largo de los vasos del sistema linftico. Cierto tejido linfoide en el pulmn y la lmina propia de la pared intestinal consiste en acumulaciones difusas de linfocitos y macrfagos. Otro tejido linfoide est organizado en estructuras llamadas folculos linfoides, que estn formados por agregados de clulas linfoides y no linfoides rodeadas por una red de capilares linfticos de drenaje. Mientras no lo activa un antgeno, un folculo linfoide denominado folculo primario comprende una red de clulas dendrticas foliculares y clulas B pequeas en reposo. Despus de un contacto antignico, un folculo primario se convierte en un folculo secundario ms grande: un anillo de linfocitos B empacados de manera concntrica en derredor de un centro (el centro germinal), donde se encuentra un foco de linfocitos B en proliferacin y un rea que contiene clulas B en reposo y algunas clulas T colaboradoras entremezcladas con macrfagos y clulas dendrticas foliculares (fig. 2-15). Los ganglios linfticos y el bazo son los rganos linfoides secundarios ms altamente organizados; no slo incluyen folculos linfoides sino tambin regiones adicionales precisas de actividad de clulas T y B, adems de que estn rodeados por una cpsula fibrosa. El tejido linfoide menos organizado, conocido en conjunto como tejido linfoide relacionado con mucosas (MALT),

se encuentra en varios sitios del cuerpo. El MALT incluye las placas de Peyer (en el intestino delgado), las amgdalas y el apndice as como mltiples folculos linfoides dentro de la lmina propia de los intestinos y las mucosas que recubren las vas respiratorias superiores, los bronquios y el aparato genitourinario.

Ganglios linfticos
Los ganglios linfticos son los sitios en que se activan las reacciones inmunitarias a antgenos en la linfa. Son estructuras encapsuladas en forma de habichuela que contienen una configuracin reticular empacada con linfocitos, macrfagos y clulas dendrticas. Los ganglios linfticos, agrupados en las uniones de los vasos linfticos, son la primera estructura linfoide organizada que encuentran los antgenos que penetran en los espacios tisulares. A medida que se filtra la linfa a travs de un ganglio, cualquier antgeno particulado que se encuentre en ella queda atrapado por la red celular de clulas fagocticas y dendrticas. La estructura total de un ganglio linftico confiere soporte a un microambiente ideal para que los linfocitos se encuentren y reaccionen de manera eficaz a los antgenos atrapados. Desde el punto de vista morfolgico, un ganglio linftico puede dividirse en tres regiones ms o menos concntricas: corteza, paracorteza y mdula, cada una de las cuales da soporte a un microambiente distinto (fig. 2-16a). La capa ms externa, la

44

PA RT E I

INTRODUCCIN

gc

m
FIGURA 2-15 Un folculo linfoide secundario incluye un centro germinal grande (gc) rodeado por un manto denso (m) de linfocitos pequeos. [Tomada de W. Bloom y D. W. Fawcett, 1975, Textbook of Histology, 10th ed., 1975 por W. B. Saunders Co.]

corteza, contiene linfocitos (sobre todo clulas B), macrfagos y clulas dendrticas foliculares dispuestas en folculos primarios. Despus de un contacto antignico, los folculos primarios crecen para formar folculos secundarios y cada uno contiene un centro germinal. En nios con deficiencia de clulas B, la corteza carece de folculos primarios y centros germinales. Abajo de la corteza yace la paracorteza, que est poblada en gran parte por linfocitos T y contiene asimismo clulas dendrticas que al parecer migraron desde los tejidos al ganglio. Estas clulas dendrticas expresan concentraciones elevadas de molculas MHC clase II, que son necesarias para presentar antgeno a las clulas TH. La mdula est menos densamente poblada de clulas de linaje linfoide, y de las presentes, muchas son clulas plasmticas que secretan de forma activa molculas de anticuerpo. A medida que la linfa lleva el antgeno hacia un ganglio regional, las clulas dendrticas de la paracorteza lo atrapan, procesan y presentan junto con molculas MHC clase II, lo que tiene como resultado la activacin de clulas TH. Se piensa asimismo que la activacin inicial de clulas B se lleva a cabo dentro de la paracorteza rica en clulas T. Una vez que se activan, las clulas TH y B forman focos pequeos que consisten, en buena medida, en clulas B en proliferacin en los bordes de la paracorteza. Algunas clulas B dentro de los focos se diferencian en clulas plasmticas que secretan anticuerpo. Estos focos alcanzan un tamao mximo en el lapso de cuatro a seis das tras el contacto con antgeno. En el transcurso de cuatro a siete das despus de dicho contacto, unas cuantas clulas B y TH migran hacia los

folculos primarios de la corteza, donde ocurren interacciones celulares entre clulas dendrticas foliculares, clulas B y clulas TH que conducen al desarrollo de un folculo secundario con un centro germinal central. Algunas de las clulas plasmticas que se generan en el centro germinal pasan a las reas medulares del ganglio linftico y pueden migrar hacia la mdula sea. Los vasos linfticos aferentes (entrantes) perforan la cpsula de un ganglio linftico en mltiples sitios y vierten la linfa al seno subcapsular (fig. 2-16b). La linfa que procede de los tejidos se filtra con lentitud hacia el interior a travs de corteza, paracorteza y mdula y permite que las clulas fagocticas y dendrticas atrapen cualquier bacteria o material particulado que la linfa transporte. Despus de una infeccin o la introduccin de otros antgenos en el cuerpo, la linfa que sale de un ganglio a travs de su vaso linftico eferente (saliente) nico se enriquece con anticuerpos recin secretados por clulas plasmticas medulares y tambin tiene una concentracin cinco veces ms alta de linfocitos que la linfa aferente. El incremento en la concentracin de linfocitos en la linfa que sale de un ganglio se debe en parte a la proliferacin de linfocitos dentro del ganglio en respuesta al antgeno. Sin embargo, la mayor proporcin del aumento representa linfocitos de origen sanguneo que migran al ganglio a travs de las paredes de las vnulas poscapilares. Estas vnulas estn recubiertas de clulas inusualmente masivas que les dan un aspecto engrosado, y se denominan vnulas endoteliales altas (HEV). Las HEV son importantes porque la mayora de los linfocitos que ingresan en el nodo pasa entre las clulas endoteliales especializadas de las HEV por extravasacin, un mecanismo que se considera en el captulo 3. Una fraccin de los linfocitos que abandonan un ganglio linftico migr a travs de esta capa endotelial y penetr en el ganglio desde la sangre. Debido a que la estimulacin antignica dentro de un ganglio puede incrementar esta migracin 10 veces, el nmero de linfocitos en un ganglio que responde de manera activa puede aumentar en grado considerable, ante lo cual el ganglio se hincha de modo visible. Se piensa que los factores que se liberan en los ganglios linfticos durante la estimulacin por antgeno facilitan este incremento de la migracin. En la figura 2-16b se resume el flujo de linfa y linfocitos a travs de un ganglio linftico.

Bazo
El bazo, situado en la parte alta del lado izquierdo de la cavidad abdominal, es un rgano linfoide secundario ovoide y grande que tiene un papel principal en el desarrollo de reacciones inmunitarias a antgenos en el torrente sanguneo. Mientras que los ganglios linfticos estn especializados para atrapar antgenos de tejidos locales, el bazo tiene la funcin particular de filtrar sangre y atrapar antgenos de origen sanguneo; por consiguiente, puede reaccionar a infecciones sistmicas. A diferencia de los ganglios linfticos, el bazo no recibe vasos linfticos. En lugar de ello, los antgenos y linfocitos de origen sanguneo llegan a este rgano a travs de la arteria esplnica. Los experimentos con linfocitos marcados con radiactividad demuestran que todos los das pasan ms linfocitos recirculantes a travs del bazo que en todos los ganglios linfticos en conjunto. El bazo est rodeado por una cpsula que emite varias proyecciones (trabculas) hacia el interior para formar una estructura segmentada. Los compartimientos son de dos tipos, pulpa rosa y pulpa blanca, separados por una zona marginal difusa

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

45

a)

Corteza Paracorteza Mdula Vlvula Linfocitos B Linfocito Vasos linfticos aferentes

Centros germinales

Vnula poscapilar

Extravasacin de linfocitos Torrente sanguneo

b)

Folculo linfoide primario

Cpsula

Cpsula

Corte transversal de vnula poscapilar

Centros germinales Linfocito Linfocitos B Arteria linftica Vena linftica Vaso linftico eferente Vlvula

FIGURA 2-16 Estructura de un ganglio linftico. a) Las tres capas de un ganglio linftico dan soporte a distintos microambientes. b) El lado izquierdo muestra la disposicin del retculo y los linfocitos dentro de las diversas regiones de un ganglio linftico. En la corteza y la paracorteza se encuentran macrfagos y clulas dendrticas, que atrapan antgeno. Las clulas TH se concentran en la paracorteza; las clulas B se localizan sobre todo en la corteza, dentro de folculos y centros germinales. La mdula est poblada en gran parte por clulas

plasmticas que producen anticuerpo. Los linfocitos que circulan en la linfa se desplazan dentro del ganglio por vasos linfticos aferentes; penetran en la matriz reticular del ganglio o pasan a travs de ella y salen por el vaso linftico eferente. El lado derecho de b) muestra la arteria y vena linfticas y las vnulas poscapilares. Los linfocitos en la circulacin pueden pasar al interior del ganglio desde las vnulas poscapilares por un proceso llamado extravasacin (recuadro).

(fig. 2-17). La pulpa roja esplnica se integra con una red de sinusoides poblados por macrfagos y mltiples glbulos rojos (eritrocitos) y unos cuantos linfocitos; es el sitio en que se destruyen y eliminan los glbulos rojos viejos y defectuosos. Muchos de los macrfagos dentro de la pulpa roja contienen glbulos rojos fagocitados o pigmentos de hierro de la hemoglobina degradada. La pulpa blanca esplnica rodea las ramas de la arteria esplnica y forma una vaina linfoide periarteriolar (PALS, del ingls periarteriolar lymphoid sheath), poblada en especial por linfocitos T. Los folculos linfoides primarios estn unidos a dicha vaina. Estos folculos son ricos en clulas B y

algunas de ellas contienen centros germinales. La zona marginal, localizada en sentido perifrico a la PALS, est poblada por linfocitos y macrfagos. Los antgenos y linfocitos de origen sanguneo penetran en el bazo a travs de la arteria esplnica, que desemboca en la zona marginal. En esta ltima las clulas dendrticas atrapan el antgeno y lo llevan hacia la PALS. Los linfocitos en la sangre tambin ingresan a senos de la zona marginal y migran a la vaina linfoide periarteriolar. La activacin inicial de clulas B y T se realiza en las PALS, ricas en clulas T. En este sitio, las clulas dendrticas capturan

46
a)

PA RT E I

INTRODUCCIN

Superficie gstrica Superficie renal Hilio Arteria esplnica

Vena esplnica

b) Cpsula

Trabcula Sinusoide vascular Folculo primario Zona marginal Vaina linfoide periarteriolar (PALS) Pulpa blanca

Pulpa roja

Centro germinal

Vena

Arteria

FIGURA 2-17 Estructura del bazo. a) El bazo, que tiene alrededor de 12.5 cm de largo en adultos, es el rgano linfoide secundario ms grande. Se especializa en atrapar antgenos de origen sanguneo. b) Diagrama de un corte transversal del bazo. La arteria esplnica perfora la cpsula y se divide en arteriolas cada vez ms pequeas, que terminan en sinusoides vasculares que drenan de nueva cuenta hacia la vena esplnica. Los sinusoides estn rodeados de pulpa
antgeno y lo presentan combinado con molculas MHC clase II a las clulas TH. Una vez activadas, estas clulas TH pueden activar a su vez clulas B. stas, junto con algunas clulas TH, se desplazan a continuacin a los folculos primarios en la zona marginal. En caso de contacto antignico, estos folculos primarios se convierten en los folculos secundarios caractersticos que contienen centros germinales (como los presentes en los ganglios linfticos), donde las clulas B de divisin rpida (centroblastos) y las clulas plasmticas estn rodeadas por grupos densos de linfocitos dispuestos en forma concntrica. La gravedad de los efectos de la esplenectoma depende de la edad a la que se extirpa el bazo. En nios, la esplenectoma a menudo ocasiona aumento de la incidencia de sepsis bacteriana debida sobre todo a Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis y Haemophilus influenzae. La esplenectoma en

roja llena de eritrocitos. La pulpa blanca forma una manguito, la vaina linfoide periarteriolar (PALS), alrededor de las arteriolas; esta vaina contiene mltiples clulas T. Con la PALS se relaciona de modo estrecho la zona marginal, un rea rica en clulas B que contiene folculos linfoides los cuales pueden desarrollarse hasta folculos secundarios que contienen centros germinales.

adultos tiene efectos menos adversos, aunque provoca algn incremento de las infecciones bacterianas de origen sanguneo (bacteriemia).

Tejido linfoide relacionado con mucosas

Las mucosas que recubren los aparatos digestivo, respiratorio y urogenital tienen un rea de superficie combinada de unos 400 m2 (casi el tamao de una cancha de bsquetbol) y son los principales sitios de entrada de la mayor parte de los agentes patgenos. Estas vulnerables membranas estn defendidas por un grupo de tejidos linfoides organizados, que se mencionaron con anterioridad y que se conocen en conjunto como tejido linfoide relacionado con mucosas (MALT). El tejido linfoide secundario relacionado con el epitelio respiratorio se denomina tejido linfoide bronquial (BALT), y el vinculado con el epitelio

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

47

Vellosidades

Clulas M

Lmina propia

Submucosa Vnula endotelial alta Linfocitos Clulas B

Linfocitos Vaso linftico Clulas T

Centro germinal Placa de Peyer

Capa muscular

FIGURA 2-18 Diagrama de un corte transversal de la mucosa que recubre el intestino; se muestra un ndulo de folculos linfoides que constituyen una placa de Peyer en la submucosa. La lmina propia intestinal contiene grupos laxos de clulas linfoides y folculos difusos.
del tubo digestivo se llama de manera colectiva tejido linfoide intestinal (GALT). Desde el punto de vista estructural, el MALT vara desde grupos laxos, apenas organizados de clulas linfoides en la lmina propia de vellosidades intestinales, hasta estructuras bien organizadas, como las placas de Peyer, que se

encuentran dentro del recubrimiento intestinal. El MALT tambin incluye las amgdalas y el apndice. Su importancia funcional en las defensas del cuerpo se comprueba por su poblacin considerable de clulas plasmticas que producen anticuerpo, cuya cifra excede con mucho a la de las clulas plasmticas en el bazo, los ganglios linfticos y la mdula sea combinados. Como se muestra en las figuras 2-18 y 2-19, se hallan clulas linfoides en varias regiones dentro de ese tejido. La capa epitelial mucosa externa contiene los llamados linfocitos intraepiteliales (IEL, del ingls intraepithelial lymphocytes), muchos de los cuales son clulas T. La lmina propia, que yace bajo la capa epitelial, contiene gran nmero de clulas B, clulas plasmticas, clulas TH activadas y macrfagos en grupos laxos. Los cortes histolgicos revelan ms de 15 000 folculos linfoides dentro de la lmina propia intestinal de un nio sano. Las placas de Peyer, que son ndulos de 30 a 40 folculos linfoides, se extienden desde el subepitelio hasta las capas musculares. Al igual que los folculos linfoides de otros sitios, los que componen las placas de Peyer pueden convertirse en folculos secundarios con centros germinales. Las clulas epiteliales de las mucosas poseen una funcin relevante para promover la respuesta inmunitaria al llevar muestras pequeas de antgeno extrao desde la luz de las vas respiratorias, digestivas y urogenitales hasta el tejido linfoide relacionado con la mucosa subyacente. Este transporte de antgeno lo efectan las clulas M especializadas. La estructura de la clula M es notable: se trata de clulas epiteliales aplanadas que carecen de las microvellosidades que caracterizan al resto del epitelio mucoso. Las clulas M tienen una invaginacin profunda, o bolsa, en la membrana plasmtica basolateral; esta bolsa est llena con un grupo de clulas B y T y macrfagos (fig. 2-19a). Los antgenos de la luz intestinal se desplazan por endocitosis hacia el interior de vesculas que son transportadas desde la membrana luminal (que limita la luz intestinal) hacia la

a) Clula M Antgeno

b) Luz Linfocito intraepitelial Clula M IgA

Antgeno Clula TH Bolsa Epitelio de la mucosa

IgA Clula plasmtica Folculo linfoide organizado Macrfago

Clulas B

Lmina propia

FIGURA 2-19 Estructura de clulas M y produccin de IgA en sitios inductores. a) Las clulas M, localizadas en la mucosa, captan por endocitosis antgeno de la luz de los aparatos digestivo, respiratorio y urogenital. El antgeno se transporta a travs de la clula y se elimina hacia la bolsa basolateral grande. b) El antgeno trasladado a travs de la capa epitelial por clulas M en un sitio in-

ductor activa clulas B en los folculos linfoides subyacentes. Las clulas B activadas se diferencian en clulas plasmticas, que producen IgA, y migran a lo largo de las submucosas. La capa epitelial mucosa externa contiene linfocitos intraepiteliales, de los cuales muchos son clulas T.

48

PA RT E I

INTRODUCCIN Ganglios linfticos Placa de Peyer Bazo Ganglios linfticos Mdula sea

Timo Timo Timo GALT Rin GALT GALT Timo Bazo Mdula sea GALT Bazo GALT

Bazo

Bolsa de Fabricio

Mdula sea

Lamprea

Trucha

Rana

Pollo

Ratn GALT Timo Bazo

Mdula sea Ganglios linfticos Centros germinales

Telesteos

Anuros

Aves

Mamferos

Reptiles

Anfibios

Osteictios Agnatos Gnatostomos

Vertebrados

FIGURA 2-20 Distribucin evolutiva de los tejidos linfoides. Se muestra la presencia y localizacin de tejidos linfoides en varios rdenes mayores de vertebrados. Aunque no se incluyen en el diagrama, los peces cartilaginosos, como los tiburones y las mantarrayas, tienen GALT, timo y bazo. Los reptiles poseen tambin GALT,
membrana de la bolsa subyacente. A continuacin las vesculas se fusionan con la membrana de la bolsa y llevan los antgenos (con el potencial de activar la respuesta) a los grupos de linfocitos y clulas presentadoras de antgeno contenidos dentro de la bolsa, los ms importantes de los cuales son clulas dendrticas. Los antgenos que las clulas M trasladan a travs de la mucosa en ltima instancia provocan la activacin de clulas B, que se diferencian y secretan IgA. Esta clase de anticuerpos se especia-

timo y bazo y pueden tener asimismo ganglios linfticos que participan en reacciones inmunitarias. Actualmente se investigan los sitios y la naturaleza de los tejidos linfoides primarios en los reptiles.
[Adaptada de Dupasquier y M. Flajnik, 2004, en Fundamental Immunology, 5th ed., W.E. Paul, ed., Lippincott-Raven, Philadelphia.]

liza en la secrecin y es un recurso importante del organismo para combatir muchos tipos de infeccin en mucosas.

Tejido linfoide cutneo

La piel es una barrera anatmica importante contra el ambiente externo. Constituye el rgano ms grande del cuerpo, y tiene un papel decisivo en las defensas inespecficas (innatas). La capa epidrmica (externa) de la piel consta en mayor medida

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

49

de clulas epiteliales especializadas llamadas queratinocitos, que secretan varias citocinas las cuales pueden actuar para inducir una reaccin inflamatoria local. Diseminadas entre la matriz de clulas epiteliales de la epidermis se encuentran clulas de Langerhans, un tipo de clula dendrtica que internaliza antgeno por fagocitosis o endocitosis. Como ya se mencion, las clulas de Langerhans maduran entonces y migran de la epidermis a los ganglios linfticos regionales, donde actan como activadores potentes de clulas TH vrgenes. Adems de clulas de Langerhans, la epidermis tambin contiene los llamados linfocitos intraepidrmicos, que son en su mayora clulas T. Algunos inmunlogos consideran que participan en el combate de antgenos que ingresan a travs de la piel, una funcin para la cual estn bien ubicados. La capa drmica subyacente de la piel tambin contiene clulas T y macrfagos diseminados. Al parecer, la mayor parte de estas clulas T drmicas son clulas previamente activadas o clulas de memoria.

hematopoytica pluripotente durante un proceso altamente regulado que recibe el nombre de hematopoyesis.

La apoptosis, un tipo de muerte celular programada, es un factor clave para regular las cantidades de clulas hematopoyticas y de otras poblaciones celulares. Existen tres tipos de clulas linfoides: clulas B, T y asesinas naturales (NK). Slo las clulas B y T son miembros de poblaciones clonales que se distinguen por tener receptores de antgeno de especificidad nica. Las clulas B sintetizan y exhiben anticuerpo de membrana, y las clulas T sintetizan y exhiben receptores de clula T. La mayor parte de las clulas NK son incapaces de sintetizar receptores especficos de antgeno, aunque una pequea subpoblacin de ellas, las NK-T, s sintetizan y exhiben un receptor de clula T. Los macrfagos y neutrfilos estn especializados para la fagocitosis y degradacin de antgenos. Los macrfagos tambin tienen la capacidad de presentar antgeno a las clulas T. Las formas inmaduras de las clulas dendrticas tienen la capacidad de capturar antgeno en un lugar, experimentar la maduracin y migrar a otro sitio, donde presentan el antgeno a clulas TH. Las clulas dendrticas son la principal poblacin de clulas presentadoras de antgeno. Los rganos linfoides primarios son los sitios en que los linfocitos se desarrollan y maduran. Los linfocitos T se producen en la mdula sea y se desarrollan en el timo; en seres humanos y ratones, los linfocitos B surgen y se desarrollan dentro de la mdula sea. Los rganos linfoides secundarios son sitios en donde los linfocitos encuentran antgenos, se activan y experimentan expansin clonal y diferenciacin en clulas efectoras. Los rdenes de vertebrados difieren mucho en cuanto a los tipos de rganos, tejidos y clulas linfoides que poseen. Los vertebrados ms primitivos, los peces sin mandbula, carecen de clulas B y T y no pueden montar respuestas inmunitarias adaptativas; los vertebrados con mandbula tienen clulas B y T, poseen inmunidad adaptativa y exhiben mayor variedad de tejidos linfoides.

Clulas y rganos linfoides: comparaciones evolutivas

En el siguiente captulo veremos que los sistemas innatos de inmunidad se encuentran en los vertebrados, los invertebrados e incluso en las plantas. La inmunidad adaptativa, que depende de linfocitos y es mediada por anticuerpos y clulas T, slo surgi en el subfilum de los vertebrados. Sin embargo, como se muestra en la figura 2-20, los tipos de tejidos linfoides que se observan en diferentes rdenes de vertebrados difieren en grado muy notable. A medida que se considera el espectro que va desde los vertebrados ms tempranos como los peces sin mandbula (agnatos) hasta las aves y los mamferos, resulta evidente que la evolucin ha aadido rganos y tejidos con funciones inmunitarias, como ganglios y tejidos linfticos (p. ej., placas de Peyer), pero ha tendido a conservar los que surgieron en rdenes ms tempranos (como el timo). Si bien todos los vertebrados tienen tejido linfoide intestinal (GALT) y la mayora cuenta con alguna versin de un bazo y un timo, no todos poseen ganglios linfticos, y muchos no producen linfocitos en la mdula sea. Las diferencias que se observan al nivel de rganos y tejidos tambin se reflejan en el nivel celular. Hasta la fecha no se han detectado linfocitos T o B ni otros componentes de un sistema inmunitario adaptativo en los peces sin mandbula. De hecho, slo los vertebrados con mandbula (gnatostomos), de los cuales los peces cartilaginosos (tiburones, mantarrayas) son los ejemplos ms primitivos, tienen linfocitos B y T y experimentan reacciones inmunitarias adaptativas.

Bibliografa
Appelbaum, F. R. 1996. Hematopoietic stem cell transplantation. In Scientific American Medicine. D. Dale and D. Ferderman, eds. Scientific American Publishers, New York. Banchereau J., et al. 2000. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology 18:767. Clevers, H. C., and R. Grosschedl. 1996. Transcriptional control of lymphoid development: lessons from gene targeting. Immunology Today 17:336. Cory, S. 1995. Regulation of lymphocyte survival by the BCL-2 gene family. Annual Review of Immunology 12:513. Ema, H., et al. 2005. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell 6:907. Godfrey, D. I., MacDonald, H.R. Kronenberg, M., Smyth, M. J., and Van Kaer, L. (2004). NKT cells: Whats in a name? Nature Reviews Immunology 4:231.

RESUMEN

Las respuestas humoral (por anticuerpos) y mediada por clulas del sistema inmunitario se deben a las actividades coordinadas de muchos tipos de clulas, rganos y tejidos distribuidos por todo el organismo. Gran parte de las clulas, tejidos y rganos del cuerpo provienen de la progenie de diferentes poblaciones de clulas madre. Los leucocitos se desarrollan a partir de una clula madre

50

PA RT E I

INTRODUCCIN

Liu, Y. J. 2001. Dendritic cell subsets and lineages, and their functions in innate adaptive immunity. Cell 106:259 Melchers, F., and A. Rolink. 1999. B-lymphocyte development and biology. In Fundamental Immunology, 4th ed. W. E. Paul, ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, p. 183. Nathan, C., and M. U. Shiloh. 2000. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. Proceedings of The National Academy of Science 97:8841. Pedersen, R. A. 1999. Embryonic stem cells for medicine. Scientific American 280:68. Osborne, B. A. 1996. Apoptosis and the maintenance of homeostasis in the immune system. Current Opinion in Immunology 8:245. Piccirillo, C. A., and E. M. Shevach. 2004. Naturally ocurring CD4+CD25+ immunoregulatory T cells: central players in the arena of peripheral tolerance. Seminars in Immunology 16:18. Picker, L. J., and M. H. Siegelman. 1999. Lymphoid tissues and organs. In Fundamental Immunology, 4th ed. W. E. Paul, ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, p. 145. Rothenberg, E. V. 2000. Stepwise specification of lymphocyte developmental lineages. Current Opin. Gen. Dev. 10:370. Shizuru, J. A., R. S. Negrin, and I. L. Weissman. 2005. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annual Review of Medicine 56:509. Ward, A. C., et al. 2000. Regulation of granulopoiesis by transcription factors and cytokine signals. Leukemia 14:973. Weissman, I. L. 2000. Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers and opportunities. Science 287:1442.

a. Las clulas T procedentes de las HSC del donador no atacan a las clulas pancreticas, cardacas y hepticas que surgieron de las clulas del donador, pero activan una respuesta de injerto contra hospedador (GVH, del ingls graft versus host) contra todas las otras clulas del hospedador. b. Las clulas T procedentes de las HSC del donador montan una respuesta GVH contra todas las clulas del hospedador. c. Las clulas T surgidas de las HSC del donador atacan a las clulas pancreticas, cardacas y hepticas que surgieron de clulas del donador, pero no activan una reaccin GVH contra todas las otras clulas del hospedador. d. Las clulas T originadas de las HSC del donador no atacan a las clulas pancreticas, cardacas y hepticas que surgieron de clulas del donador y no activan una respuesta GVH contra todas las otras clulas del hospedador. 1. Explique por qu son falsas las siguientes afirmaciones. a. Todas las clulas TH expresan CD4 y slo reconocen antgeno relacionado con molculas MHC clase II. b. La clula madre pluripotente es uno de los tipos celulares que ms abundan en la mdula sea. c. La activacin de macrfagos incrementa su expresin de molculas MHC clase I y hace que estas clulas presenten antgeno con mayor eficacia. d. Los folculos linfoides slo se hallan en el bazo y los ganglios linfticos. e. La infeccin no influye en el ritmo de hematopoyesis. f. Las clulas dendrticas foliculares pueden procesar y presentar antgeno a linfocitos T. g. Todas las clulas linfoides tienen receptores especficos de antgeno en su membrana. h. Todos los vertebrados generan linfocitos B en la mdula sea. i. Todos los vertebrados producen linfocitos B o T, y la mayora produce ambos. 2. Para cada uno de los siguientes grupos de clulas, indique la ltima clula progenitora comn que da origen a ambos tipos celulares. a. b. c. d. Clulas dendrticas y macrfagos Monocitos y neutrfilos Clulas TC y basfilos Clulas asesinas naturales y clulas B

Sitios tiles de la red

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow
Las guas PROW son revisiones autorizadas, breves y estructuradas acerca de protenas y familias de protenas; renen la informacin importante sobre cada molcula en un documento de formato estandarizado. Contienen informacin sobre CD1 a CD339.

http://stemcells.nih.gov/
Conexiones con fuentes de informacin bsica y clnica sobre clulas madre, y registros de clulas madre embrionarias disponibles.

3. Indique los rganos linfoides principales y resuma sus funciones en la reaccin inmunitaria. 4. Seale los rganos linfoides secundarios y resuma sus funciones en la reaccin inmunitaria. 5. Cules son las dos principales caractersticas que distinguen las clulas madre hematopoyticas de las clulas progenitoras? 6. Cules son las dos funciones principales del timo? 7. Qu tienen en comn los ratones desnudos y los seres humanos con sndrome de DiGeorge? 8. A qu edad llega el timo a su tamao mximo? a. b. c. d. Durante el primer ao de vida En los aos de la adolescencia (pubertad) Entre los 40 y 50 aos de edad Despus de los 70 aos de edad

Preguntas de estudio
PREGUNTA
DE ENFOQUE CLNICO Las clulas T y B que se diferencian de clulas madre hematopoyticas reconocen como propios los cuerpos en que se diferencian. Considrese el siguiente ejemplo: una mujer dona HSC a un varn sin relacin gentica, cuyo sistema hematopoytico fue destruido por completo por una combinacin de radiacin y quimioterapia. Supngase adems que si bien la mayor parte de las HSC del donador se diferencian en clulas hematopoyticas, algunas lo hacen en clulas de pncreas, hgado y corazn. Elija cul de los siguientes resultados finales es probable y explique su eleccin.

CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO

C A P T UL O

51

9. Los preparados enriquecidos en clulas madre hematopoyticas son tiles para la investigacin y la prctica clnica. En el mtodo de Weissman para enriquecer clulas madre hematopoyticas, por qu es necesario emplear ratones sometidos a radiacin letal para demostrar el enriquecimiento? 10. Explique la diferencia entre un monocito y un macrfago. 11. Qu efecto tendra en pollos la extirpacin de la bolsa de Fabricio (bursectoma)? 12. Algunos microorganismos (p. ej., Neisseria gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis y Candida albicans) se clasifican como patgenos intracelulares. Defina este trmino y explique por qu difiere la respuesta inmunitaria a estos patgenos de la de otros microorganismos como Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. 13. Indique si cada una de las afirmaciones siguientes sobre el bazo es verdadera o falsa. Si considera que una afirmacin es falsa, explique por qu. a. Filtra antgenos de la sangre. b. La zona marginal es rica en clulas T y la vaina linfoide periarteriolar (PALS) lo es en clulas B. c. Contiene centros germinales. d. Elimina glbulos rojos viejos y defectuosos. e. Los vasos linfticos que drenan los espacios tisulares penetran en el bazo. f. La funcin de los ganglios linfticos, pero no del bazo, es afectada por la desactivacin del gen Ikaros. 14. Para cada tipo de clula indicada (a-p), elija la descripcin ms apropiada (1-16) incluida enseguida. Cada descripcin puede emplearse una vez, ms de una vez o ninguna vez. Tipos de clulas a. ___________ Clulas progenitoras mieloides comunes b. ___________ Monocitos c. ___________ Eosinfilos d. ___________ Clulas dendrticas e. ___________ Clulas asesinas naturales (NK) f. ___________ Clulas de Kupffer g. ___________ Clulas dendrticas linfoides h. ___________ Clulas cebadas i. ___________ Neutrfilos j. ___________ Clulas M

k. ___________

Clulas estromales de la mdula sea

l. ___________ Linfocitos m. ___________ Clulas NK1-T n. ___________ Clulas microgliales o. ___________ Clulas dendrticas mieloides p. ___________ Clulas madre hematopoyticas Descripciones 1) Principal tipo de clula que presenta antgeno a clulas TH. 2) Clula fagoctica del sistema nervioso central. 3) Clulas fagocticas importantes en la defensa del cuerpo contra microorganismos parsitos. 4) Macrfagos que se encuentran en el hgado. 5) Da origen a glbulos rojos. 6) Una clula presentadora de antgeno derivada de monocitos que no es fagoctica. 7) Por lo general, la primera clula que llega al sitio de inflamacin. 8) Secreta factores estimulantes de colonias (CSF). 9) Da origen a timocitos. 10) Clulas sanguneas circulantes que se diferencian en macrfagos en los tejidos. 11) Una clula presentadora de antgeno que surge del mismo precursor que la clula T, pero no del mismo que el macrfago. 12) Clulas importantes en el muestreo de antgeno de la luz del intestino. 13) Clulas granulocticas no fagocticas que liberan varias sustancias con actividad farmacolgica. 14) Glbulos blancos que migran a los tejidos y tienen una funcin importante en el desarrollo de alergias. 15) Estas clulas reconocen en ocasiones sus blancos con ayuda de un receptor de superficie celular especfico de antgeno y, algunas veces, por mecanismos similares a los de las clulas asesinas naturales. 16) Los miembros de las clulas de esta categora no se encuentran en peces sin mandbula.

captulo 3
Inmunidad innata

os vertebrados son protegidos por dos sistemas de inmunidad: innata y adaptativa. La inmunidad innata consta de las defensas contra la infeccin que aun antes del ataque de un patgeno estn listas para activarse de inmediato. El sistema de inmunidad innata incluye barreras fsicas, qumicas y celulares. Las principales barreras fsicas son piel y membranas mucosas. Entre las barreras qumicas se incluyen la acidez del contenido estomacal y molculas solubles especializadas con actividad antimicrobiana. La lnea celular de defensa innata comprende una serie de clulas con receptores sensibles que detectan productos microbianos e instigan un contraataque. La respuesta a la invasin por un microorganismo infeccioso que supera las barreras iniciales de piel y membranas mucosas es rpida; tpicamente se inicia a los pocos minutos de la invasin. A pesar de las mltiples capas del sistema innato, es posible que algunos patgenos logren evadir esas defensas. Por ello existe un segundo sistema, llamado de inmunidad adaptativa (o inmunidad adquirida), que es inducido por la exposicin a microorganismos y combate la infeccin con una respuesta especfica a la medida del patgeno atacante en la forma de una gran poblacin de linfocitos B y T que de manera especfica reconocen al invasor. Montar una respuesta adaptativa requiere tiempo: puede tardar hasta una semana o ms antes de ser totalmente eficaz. La inmunidad adaptativa se caracteriza por el fenmeno de memoria inmunitaria, y una vez que es activada por un patgeno especfico, exposiciones ulteriores a ste inducen respuestas ms rpidas y a menudo ms potentes. El reconocimiento de los invasores es mediado por anticuerpos y receptores de clula T, los sensores de la inmunidad adaptativa. Estas molculas son producidas por genes con una caracterstica extraordinaria: experimentan modificacin y diversificacin recombinacin gentica en el hospedador para generar una gigantesca poblacin nica de centinelas en busca de invasores. Los procesos de modificacin y generacin de diversidad inmunitaria se consideran en los captulos 5 y 9. La inmunidad innata es la defensa ms antigua de los vertebrados contra los microorganismos; en todas las plantas y animales (organismos pluricelulares) se ha encontrado alguna forma de inmunidad innata. La inmunidad adaptativa surgi por evolucin en los vertebrados con mandbula y es un rasgo evolutivo mucho ms reciente que la inmunidad innata. En los vertebrados, la inmunidad adaptativa complementa a un sistema bien desarrollado de inmunidad innata. En el cuadro 3-1 se comparan ambos sistemas.

Un macrfago (rosa) y un monocito (prpura) capturan y fagocitan bacterias. [Dennis Kunkel Microscopy/Dennis Kunkel.]

Barreras anatmicas Conexiones entre la inmunidad innata y la adaptativa Inamacin Molculas solubles y receptores relacionados con membrana Receptores tipo Toll Tipos celulares de inmunidad innata Vas de transduccin de seales Ubicuidad de la inmunidad innata

Un acervo extenso y creciente de informes de investigacin revela que a medida que han coevolucionado la inmunidad innata y la adaptativa, entre ambos sistemas ha surgido un alto grado de interaccin e interdependencia. De hecho, si un patgeno evade por completo la primera lnea de defensa, el sistema inmunitario innato, la respuesta del sistema adaptativo puede ser muy dbil. El reconocimiento por el sistema inmunitario innato dispone el escenario para una inmunorreaccin adaptativa eficaz. En este captulo se describen los componentes del sistema inmunitario innato: barreras fsicas y fisiolgicas, agentes qumicos solubles, y varios tipos de clulas y sus receptores; asimismo se ilustra el modo en que actan de manera conjunta para defender al organismo contra la infeccin. Se concluye con un panorama general de la inmunidad innata a travs de los fila de animales y plantas.

52

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

53

CUADRO 3-1
Atributo Tiempo de reaccin Especicidad

Inmunidad innata y adaptativa

Inmunidad innata Minutos a horas Especca para molculas y patrones moleculares de los patgenos Un nmero limitado de receptores codicados por la lnea germinal Ninguna Perfecta; no hay patrones especcos de microorganismo en el hospedador Muchos pptidos y protenas antimicrobianos Fagocitos (monocitos, macrfagos, neutrlos), clulas asesinas naturales (NK), clulas dendrticas Inmunidad adaptativa Das Altamente especca; incluso discrimina diferencias mnimas en la estructura molecular; reconoce detalles de la estructura microbiana o no microbiana con alta especicidad Altamente diversa; un nmero enorme de receptores que surgen por recombinacin gentica de los genes que codican receptores Memoria persistente; la respuesta a la infeccin ulterior es ms rpida y de mayor magnitud Muy buena; fallos ocasionales de la discriminacin entre lo propio y lo extrao dan por resultado enfermedad autoinmunitaria Anticuerpos Linfocitos T y B, clulas presentadoras de antgeno

Diversidad Respuestas de memoria Discriminacin entre lo propio y lo extrao Componentes solubles de sangre o lquidos tisulares Principales tipos celulares

Barreras anatmicas
Los componentes ms conspicuos de la inmunidad innata son las barreras externas contra la invasin microbiana: piel y membranas mucosas, que incluyen los epitelios mucosos que recubren las vas respiratorias, digestivas y urogenitales y aslan el interior del cuerpo contra los patgenos del mundo exterior (fig. 3-1). La piel consta de dos capas bien definidas: una capa externa delgada, la epidermis, y una capa ms gruesa, la dermis. La epidermis contiene varias filas de clulas epiteliales estrechamente empacadas. La capa epidrmica externa consta principalmente de clulas muertas llenas de una protena hermtica al agua llamada queratina. La dermis est constituida por tejido conectivo y contiene vasos sanguneos, folculos pilosos, glndulas sebceas y glndulas sudorparas. La piel y los epitelios constituyen una especie de cubierta plstica viva que contiene y protege los dominios internos del cuerpo contra el mundo externo. Pero estas barreras anatmicas son ms que simples envolturas pasivas. Tambin montan defensas bioqumicas activas al sintetizar y desplegar pptidos y protenas con actividad antimicrobiana. Entre la multitud de tales agentes producidos por la piel del ser humano la investigacin reciente ha identificado la psoriasina, una pequea protena con potente actividad antibacteriana contra Escherichia coli. Este descubrimiento dio respuesta a la antigua pregunta de por qu la piel humana es resistente a la colonizacin por E. coli a pesar de la exposicin constante a este microorganismo. Como se muestra en la figura 3-2, la incubacin de E. coli sobre piel humana por tan slo 30 min destruye especficamente esta bacteria. (En general otras especies bacterianas son menos sensibles.) La capacidad de la piel y los epitelios de producir una amplia variedad de agentes antimicrobianos es importante, porque las soluciones de continuidad en la piel a consecuencia de rasguos, punciones o abrasiones constituyen vas de infeccin que podran ser fcilmente aprovechadas por microorganismos patgenos si no existieran las defensas bioqumicas. La piel tambin puede ser penetrada

por mordeduras y picaduras de artrpodos (p. ej., mosquitos, caros, garrapatas, pulgas y moscas), capaces de introducir microorganismos patgenos en el cuerpo cuando se alimentan. Por ejemplo, el protozoario que causa el paludismo es depositado en el cuerpo humano por mosquitos hematfagos, y lo mismo ocurre en el caso del virus que causa la fiebre del Nilo Occidental. De modo similar, la bacteria de la peste bubnica es propagada por mordeduras de pulgas, y la bacteria que causa la enfermedad de Lyme es dispersada por la mordedura de garrapatas. En vez de piel, las vas digestivas, respiratorias y urogenitales y los ojos estn cubiertos de membranas mucosas que constan de una capa epitelial externa y una capa subyacente de tejido conectivo. Muchos patgenos ingresan en el cuerpo a travs de estas membranas; a dicho ingreso se oponen varios mecanismos de defensa inespecficos. Por ejemplo, la saliva, las lgrimas y las secreciones mucosas eliminan por lavado posibles invasores y asimismo contienen sustancias antibacterianas o antivricas. El lquido viscoso llamado moco, que secretan clulas epiteliales de las mucosas, atrapa microorganismos extraos. En las vas respiratorias inferiores, la mucosa est recubierta por cilios, prolongaciones piliformes de las membranas de las clulas epiteliales. El movimiento sincrnico de los cilios expulsa de estas vas a los patgenos retenidos en el moco. Cada vez que nos alimentamos ingerimos enormes cantidades de microorganismos, pero stos deben enfrentar una batera de defensas que comienzan con los compuestos antimicrobianos presentes en la saliva y el epitelio bucal y continan con la mezcla hostil de cido y enzimas digestivas del estmago. Adems de la serie de defensas bioqumicas y anatmicas, los patgenos deben competir por los recursos del cuerpo con los muchos microorganismos no patgenos que colonizan las superficies mucosas. Esta flora bacteriana normal, altamente adaptada a su ambiente interno, suele excluir a los patgenos de la competencia por los sitios de fijacin en la superficie de las clulas epiteliales y por los nutrimentos necesarios. Algunos microorganismos han desarrollado formas de eludir las defensas de las mucosas. Por ejemplo, el virus de la gripe tie-

54

PA RT E I

INTRODUCCIN

rgano o tejido Piel Boca y parte superior del tubo digestivo Estmago Intestino delgado Intestino grueso

Mecanismos innatos que protegen piel y epitelios Pptidos antimicrobianos, cidos grasos en el sebo Enzimas, pptidos antimicrobianos y desprendimiento de la superficie por flujo direccional de lquido hacia el estmago Bajo pH, enzimas digestivas, pptidos antimicrobianos, flujo de lquido hacia el intestino Enzimas digestivas, pptidos antimicrobianos, flujo de lquido hacia el intestino grueso Competencia de la flora intestinal normal con los microorganismos invasores, expulsin de lquido y heces por el recto Barrido de moco por los cilios hacia fuera, expulsin de moco por la tos, macrfagos en alvolos pulmonares

Piel

Boca

Vas respiratorias y pulmones

Vas respiratorias Pulmones

Revestimiento epitelial de vas respiratorias y pulmones

Revestimiento epitelial del tubo digestivo

Estmago Intestino grueso Intestino delgado

FIGURA 3-1 Piel y barreras epiteliales conRecto

tra la infeccin. La piel y las capas epiteliales mucosas son protegidas contra la colonizacin microbiana por una variedad de mecanismos: qumicos (enzimas, pptidos antimicrobianos, pH), mecnicos (cilios, ujo de lquido) y celulares (macrfagos alveolares).

ne una molcula de superficie que le permite fijarse con firmeza a las clulas de las mucosas de las vas respiratorias e impide que las clulas epiteliales ciliadas eliminen el virus. De igual forma, el patgeno que causa la gonorrea tiene proyecciones de superficie con las que se une a clulas epiteliales en las mucosas de las vas urogenitales. La adherencia de las bacterias a mucosas se debe a interacciones entre las salientes piliformes en una bacteria, llamadas fimbrias o pilos, y ciertas glucoprote-

nas o glucolpidos que slo son expresados por clulas epiteliales de las mucosas de determinados tejidos (fig. 3-3). Por stas y otras razones, algunos tejidos son susceptibles a la invasin por patgenos especficos, a pesar de la eficacia general de las barreras epiteliales protectoras. Cuando esto sucede, los receptores de la inmunidad innata tienen papeles fundamentales para detectar la infeccin y desencadenar una defensa eficaz contra ella.

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

55

S. aureus

E. coli

Inoculacin 30 minutos

Placas de cultivo nuevas Incubacin

FIGURA 3-3 Micrografa electrnica de bacterias Escherichia coli en forma de bastn adheridas a la supercie de clulas epiteliales de las vas urinarias. [Tomada de N. Sharon y H. Lis, 1993,
Scientic American 268(1):85; cortesa de K. Fujita.]

FIGURA 3-2 Las psoriasinas impiden la colonizacin de la piel

por E. coli. La piel secreta psoriasina, una protena antimicrobiana que destruye a E. coli. Las yemas de los dedos de una persona sana se inocularon con Staphylococcus aureus y E. coli. Luego de 30 min, las yemas de los dedos se presionaron contra una placa de agar nutritivo y se determin el nmero de colonias de S. aureus y E. coli. Casi todos los E. coli que se inocularon haban sido destruidos; la mayora de los S. aureus sobrevivi. [Fotografa cortesa de Nature Immunology; tomada de Glser et al., 2005, Nature Immunology 6:57-64.]

Conexiones entre la inmunidad innata y la adaptativa

Una vez que un patgeno supera las barreras anatmicas y fisiolgicas inespecficas del hospedador, es posible que cause infeccin y enfermedad. El sistema inmunitario reacciona a la invasin con dos funciones crticas: detecta al invasor por medio de sensores, y lo ataca con un elaborado mecanismo de respuesta. El primer fenmeno de deteccin del sistema inmunitario ocurre cuando el invasor interacta con molculas solubles o unidas a membrana del hospedador capaces de discriminar entre lo propio (el hospedador) y lo extrao (el patgeno). Estos

sensores moleculares reconocen motivos estructurales generales con alto grado de conservacin dentro de una especie microbiana (y que suelen ser necesarios para la supervivencia) pero que comnmente estn ausentes en el hospedador. Dado que reconocen patrones moleculares generales especficos, tales molculas se denominan receptores de reconocimiento de patrn (PRR, del ingls pattern recognition receptors), y cuando tales patrones se detectan en los patgenos, se les denomina patrones moleculares relacionados con patgeno (PAMP, del ingls pathogen-associated molecular patterns). Entre los PAMP reconocidos por PRR se incluyen combinaciones de azcares, determinadas protenas, molculas portadoras de lpidos especficos, y algunos motivos (estructuras repetitivas) de cidos nucleicos. La restriccin del reconocimiento innato a patrones moleculares presentes en los microorganismos hace que el sistema innato se concentre en entidades que pueden causar infeccin ms que en sustancias que simplemente son ajenas, como una articulacin artificial de cadera. En contraste, los anticuerpos y receptores de clula T, los sensores de la inmunidad adaptativa, reconocen detalles ms finos de la estructura molecular y son capaces de discriminar con minuciosa especificidad entre antgenos que presentan slo diferencias estructurales ligeras. Tpicamente, la capacidad de los PRR de distinguir entre lo propio y lo extrao es a prueba de errores, porque el patrn molecular al que se dirige el receptor slo es producido por el patgeno y nunca por el hospedador. Esto contrasta claramente con el reconocimiento ocasional de antgenos propios por receptores de la inmunidad adaptativa, una disfuncin potencialmente peligrosa que puede ser el origen de una enfermedad autoinmunitaria. En la inmunidad innata, la deteccin de patrones moleculares relacionados con patgeno realizada por mediadores solubles y unidos a membrana pone en juego mltiples componentes inmunitarios. Entre los mediadores solubles se incluyen iniciadores del sistema del complemento, como lectina de unin a manosa (MBL, del ingls mannose-binding lectin) y protena C reactiva (CRP, del ingls C-reactive protein). Si el patgeno

56

PA RT E I

INTRODUCCIN

FIGURA 3-4 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

Efectores de las inmunorreacciones innatas a la infeccin

Fagocitos (neutrfilos, macrfagos) Receptores de reconocimiento de patrn (PRR) detectan PAMP Patrones moleculares del patgeno (PAMP)

Pptidos antimicrobianos Patgeno

Seguida por la secrecin de quimiocinas y citocinas promotoras de la inflamacin

Lectina de unin a manosa (MBL) Fagocitosis

Protena C reactiva (CRP) Protenas del complemento El dao de la membrana mata al patgeno

La opsonizacin promueve la fagocitosis Inicio innato de la respuesta adaptativa PRR de clulas dendrticas reconocen PAMP Se exhiben antgenos microbianos en molculas MHC clases I y II Migran clulas dendrticas a los ganglios linfticos Presentacin de antgeno y coestimulacin movilizan la respuesta adaptativa

Patgeno opsonizado CRP, MBL y protenas del complemento activan el complemento El complemento destruye la membrana del patgeno, estimula la inflamacin y atrae neutrfilos y otras clulas

Linfocito T

La invasin microbiana pone en accin muchos efectores de la inmunidad innata. El ingreso de invasores microbianos a travs de lesiones en las barreras epiteliales genera seales inamatorias y expone a los invasores al ataque de diferentes molculas y clulas efectoras. Los microorganismos que la protena C reactiva (CRP) o la lectina de unin a manosa (MBL) reconocen son capturados por estas molculas de opsonizacin y activacin del complemento. Algunos patgenos, como los hongos portadores de zimosn, pueden activar el complemento, con el resultado de lisis u opsonizacin directa, lo cual marca al patgeno para la fagocitosis por neutrlos o macrfagos. Las seales inamatorias hacen que fagocitos como macrfagos y neutrlos se unan a las paredes de los vasos sanguneos, experimenten extravasacin y se desplacen a los sitios de infeccin, donde fagocitan

y destruyen microorganismos infectantes. Durante la accin de estos efectores celulares y moleculares se generan seales inamatorias adicionales que intensican la respuesta al atraer ms fagocitos y mediadores solubles (CRP, MBL y complemento) desde el torrente sanguneo hasta el sitio de la infeccin. Las clulas dendrticas internalizan componentes microbianos, maduran y presentan pptidos microbianos en molculas MHC. Las clulas dendrticas migran entonces a travs de los vasos linfticos a ganglios linfticos cercanos, donde presentan antgeno a las clulas T. Los linfocitos T activados por antgeno inician entonces inmunorreacciones adaptativas contra el patgeno. Las citocinas producidas durante las inmunorreacciones innatas tambin sostienen y dirigen las inmunorreacciones adaptativas contra la infeccin.

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

57

porta PAMP que son reconocidos por estos mediadores, se activar el sistema del complemento (cap. 7). Una parte de dicho sistema es un grupo de protenas que, cuando se activan, forman agregados los cuales hacen agujeros en las membranas celulares de los microorganismos contra los que se dirigen, a los que dan muerte por lisis. El sistema del complemento tambin incluye glucoprotenas sricas que, cuando son activadas, promueven la captacin de microorganismos por fagocitos (opsonizacin). El sistema del complemento ocupa una posicin intermedia entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo: la cascada del complemento, que desemboca en la opsonizacin o lisis de los invasores, puede ser activada por molculas que reconocen PAMP (inmunidad innata) o por anticuerpos (inmunidad adaptativa) que se unen a antgenos extraos especficos. Adems, algunos de los subproductos de la activacin del complemento promueven la inflamacin y por tanto llevan leucocitos al sitio de infeccin, con lo que lanzan otro nivel de respuesta. Clulas dendrticas inmaduras y macrfagos del tejido invadido tienen diversos receptores, entre ellos el grupo ms importante de receptores innatos descubiertos a la fecha: los receptores tipo Toll (TLR, del ingls Toll-like receptors), que detectan productos microbianos. Hasta la fecha se han descrito 12 de tales receptores en el ratn y 11 en el ser humano; cada TLR reacciona con un producto microbiano especfico. Estos receptores verstiles, que se describen en detalle en una seccin posterior, hacen posible que clulas dendrticas y macrfagos detecten un amplio espectro de patgenos. Las seales iniciadas en los TLR de los macrfagos estimulan la actividad fagoctica y la produccin de agentes qumicos que resultan txicos para los microorganismos fagocitados. Los macrfagos activados tambin secretan una clase de molculas conocidas como citocinas, protenas parecidas a hormonas o factores de crecimiento que se comunican va receptores celulares para inducir actividades celulares especficas (cap. 12). Como las hormonas, las citocinas modifican el comportamiento y la fisiologa de clulas y tejidos que constituyen objetivos de ataque (blancos). Por ejemplo, los macrfagos activados secretan citocinas como interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral (TNF- , del ingls tumor necrosis factor alpha), que inducen y sustentan reacciones inflamatorias. Las clulas dendrticas inmaduras presentes en el sitio de infeccin internalizan y procesan el antgeno, maduran, y migran al tejido linfoide, donde su presentacin de antgeno a las clulas T es el paso clave en el inicio de una inmunorreaccin adaptativa a la invasin por patgenos. Por tanto, esta actividad es un puente entre los sistemas de inmunidad innata y adaptativa. Las clulas dendrticas tambin secretan una variedad de citocinas que promueven la inflamacin y ayudan a dirigir la inmunoreaccin adaptativa del hospedador. Todas las funciones inmunitarias innatas ocurren en una fase temprana de la infeccin, antes de que se generen poblaciones significativas de linfocitos T especficos de patgeno y anticuerpos de clulas B especficos de patgeno. Sin embargo, las citocinas liberadas de clulas que participan en la respuesta innata modifican la naturaleza de las inmunorreacciones adaptativas ulteriores a la infeccin. En la figura 3-4 se resumen los principales efectores moleculares y celulares utilizados por el sistema inmunitario innato para atacar la infeccin. En muchos casos, el inmunosistema es capaz de vencer y eliminar una infeccin por s solo. En

caso contrario, el patgeno enfrenta el ataque coordinado del sistema inmunitario adaptativo. Durante la respuesta adaptativa, las clulas T citotxicas detectan y destruyen patgenos que acechan en las clulas del hospedador, y los anticuerpos neutralizan la capacidad del invasor de infectar otras clulas al tiempo que elevan la probabilidad de que el invasor sea fagocitado por macrfagos y neutrfilos (captacin mediada por anticuerpo, un tipo de opsonizacin). Los anticuerpos tambin colaboran con el sistema del complemento para producir la lisis de los microorganismos patgenos. Luego de que se elimina la infeccin, algunas de las clulas B y T generadas durante la fase adaptativa de la respuesta persistirn en el hospedador largos perodos en la forma de clulas B y T de memoria. Infecciones ulteriores por el mismo patgeno se toparn con una reserva de linfocitos especficos para l, capaz de montar una respuesta rpida. Este esbozo somero presenta los principales elementos del sistema inmunitario innato y su relacin con el sistema adaptativo. En el resto del captulo se describen con ms detalle los componentes y mecanismos de la inmunidad innata.

Inamacin
Cuando los patgenos superan las barreras externas de la inmunidad innata piel y mucosas, la infeccin o lesin tisular resultante puede inducir una compleja cascada de fenmenos conocida como reaccin inflamatoria. La inflamacin puede ser aguda, por ejemplo en respuesta al dao tisular, o crnica, con consecuencias patolgicas como artritis y la emaciacin vinculada con determinados cnceres (cap. 13). La reaccin inflamatoria aguda combate las primeras fases de una infeccin y pone en marcha procesos que llevan a la reparacin del tejido daado. Las caractersticas bsicas de una reaccin inflamatoria localizada fueron descritas por primera vez por los romanos hace casi 2 000 aos: tumefaccin (del latn tumor), enrojecimiento (rubor), calor y dolor. En el siglo II dc el mdico Galeno aadi otra caracterstica de la inflamacin, la prdida de la funcin (functio laesa). Minutos despus de la lesin tisular aumenta el dimetro de los vasos sanguneos (vasodilatacin), de lo que resulta un incremento del volumen sanguneo en la zona. Un mayor volumen de sangre calienta el tejido y lo hace enrojecerse. Tambin se eleva la permeabilidad vascular, lo que ocasiona escape de lquido desde los vasos sanguneos, en particular en las vnulas poscapilares. Esto da por resultado la acumulacin de lquido (edema) que expande el tejido. En pocas horas, en la regin inflamada se adhieren leucocitos a las clulas endoteliales y atraviesan las paredes de los capilares para ingresar en los espacios tisulares, un proceso llamado extravasacin (fig. 3-5). Estos leucocitos fagocitan patgenos invasores y liberan mediadores moleculares que contribuyen a la reaccin inflamatoria y al reclutamiento y la activacin de clulas efectoras. Entre los mediadores se encuentran protenas reguladoras de bajo peso molecular de la familia de las citocinas mencionadas antes. Las citocinas son secretadas por glbulos blancos y varias otras clulas del cuerpo en respuesta a estmulos, y tienen papeles importantes en la regulacin del desarrollo y el comportamiento de las clulas efectoras inmunitarias. Las quimiocinas (cap. 13) son un subconjunto importante de citocinas cuya caracterstica distintiva es su capacidad de actuar como quimioatrayentes

58

PA RT E I

INTRODUCCIN

Dao tisular 1 El dao tisular causa la liberacin de factores vasoactivos y quimiotcticos que desencadenan un incremento local del flujo sanguneo y la permeabilidad capilar 2 La permeabilidad de los capilares permite el ingreso de lquido (exudado) y clulas Exudado (complemento, protena C reactiva) 4 Fagocitos y exudado antibacteriano destruyen las bacterias

Bacterias

3 Los fagocitos migran al sitio de inflamacin (quimiotaxis)

Neutrfilos y otros fagocitos Extravasacin Capilar

FIGURA 3-5 Reclutamiento de macrfagos y agentes antimicrobianos en el torrente sanguneo. El ingreso de bacterias a travs de heridas inicia una reaccin inamatoria que lleva sustancias

antimicrobianas y fagocitos (primero neutrlos y luego macrfagos y monocitos) al sitio de infeccin.

a)

b) 1 La bacteria es fijada a evaginaciones de la membrana llamadas seudpodos

La bacteria es ingerida, con lo que se forma un fagosoma

El fagosoma se fusiona con un lisosoma

4 Enzimas lisosmicas digieren el material capturado 5

Los productos de la digestin son expulsados de la clula

FIGURA 3-6 a) Micrografa electrnica de un macrfago (centro, rosa) al atacar a Escherichia coli (verde). Las bacterias son fagocitadas como se describe en la parte b), y se secretan productos de la destruccin. El monocito (prpura, izquierda arriba) ha

sido reclutado y llevado a la proximidad por factores solubles que el macrfago secreta. La esfera roja es un eritrocito. b), Etapas de la fagocitosis de una bacteria. [Parte a, Dennis Kunkel Microscopy/Dennis
Kunkel.]

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

59

(agentes que hacen que las clulas se desplacen hacia los sitios en que esos agentes se encuentran en mayores concentraciones). Sin embargo, no todos los quimioatrayentes son quimiocinas. Otros quimioatrayentes importantes son los subproductos del complemento (C5a, C3a) y diversos pptidos N-formilo producidos por la degradacin de protenas bacterianas durante una infeccin. La unin de quimiocinas u otros quimioatrayentes a receptores en la membrana de las clulas neutroflicas desencadena una seal activadora que induce un cambio conformacional en una molcula de la membrana del neutrfilo llamada integrina, lo que incrementa su afinidad por molculas de adhesin intercelular (ICAM, del ingls intercellular adhesion molecules) presentes en el endotelio. Aunque existen muchos quimioatrayentes distintos, las quimiocinas son los reguladores ms importantes y verstiles del trfico de leucocitos, ya que controlan de manera selectiva la adhesin, la quimiotaxis y la activacin de diversas subpoblaciones leucocitarias. Las quimiocinas inflamatorias suelen ser inducidas en respuesta a infeccin o a citocinas proinflamatorias (que promueven la inflamacin). Las quimiocinas hacen que los leucocitos ingresen en diversos sitios tisulares al inducir la adhesin de dichas clulas al endotelio vascular que recubre las paredes de los vasos sanguneos. Despus de la entrada en los tejidos, los leucocitos se desplazan por quimiotaxis hacia las mayores concentraciones localizadas de quimiocinas en el sitio de la infeccin. De este modo, los fagocitos dirigidos y las poblaciones de linfocitos efectores son atrados hacia el foco de inflamacin. Una funcin importante de las clulas atradas al sitio inflamado es la fagocitosis de los microorganismos invasores. Elie Metchnikoff describi el proceso de la fagocitosis en el decenio de 1880 y le atribuy un papel importante en la inmunidad. Formul la hiptesis de que los leucocitos que engullen y destruyen patgenos eran los principales efectores de la inmunidad, ms decisivos, segn l, que las defensas mediadas por componentes sricos (anticuerpos). Metchnikoff acert al atribuir una funcin decisiva al proceso de la fagocitosis, y ahora sabemos que la falta de esta funcin causa inmunodeficiencia grave. El proceso general de la fagocitosis de bacterias se muestra en la figura 3-6. El microorganismo es engullido y lisado dentro del macrfago, y los productos de la lisis se secretan. Entre estos productos se incluyen molculas que portan PAMP, lo cual alerta a los receptores celulares sobre la presencia del patgeno. La reunin de leucocitos en sitios de infeccin, orquestada por quimiocinas, es una fase esencial de la respuesta enfocada a la infeccin. Por ltimo, algunas seales generadas en sitios de inflamacin son llevadas de manera sistemtica a otras partes del cuerpo, donde inducen cambios que apoyan la inmunorreaccin innata (lo cual se expone ms adelante, en la seccin que aborda la reaccin de fase aguda).

trfilos el primer tipo celular en unirse al endotelio inflamado y extravasarse a los tejidos, la exposicin aqu se concentrar en su ingreso, teniendo presente que otros leucocitos utilizan mecanismos similares. La extravasacin impone al neutrfilo desafos formidables. Primero, debe reconocer el endotelio inflamado; debe adherirse fuertemente de modo que no sea barrido por el flujo de sangre; y mientras se aferra a la pared del vaso, debe penetrar la capa endotelial y acceder al tejido subyacente. La extravasacin de neutrfilos puede dividirse en cuatro pasos: a) rodamiento, b) activacin por estmulo quimioatrayente, c) detencin y adhesin y d) migracin transendotelial (fig. 3-7a). En el primer paso, los neutrfilos se fijan laxamente al endotelio mediante interaccin de baja afinidad entre glucoprotenas mucinas en los neutrfilos, selectinas en las clulas endoteliales (fig. 3-7b). En ausencia de seales adicionales, las dbiles interacciones que unen el neutrfilo a la clula endotelial son interrumpidas con rapidez por fuerzas cortantes cuando la sangre circulante fluye alrededor de la clula. A medida que las distintas regiones de la superficie del neutrfilo se unen y desprenden, el neutrfilo gira dando tumbos sobre la superficie del endotelio. Mientras el neutrfilo rueda sobre el endotelio, es posible que encuentre quimiocinas u otros quimioatrayentes que se han producido en el sitio de un proceso inflamatorio. La ulterior interaccin entre integrinas y ICAM estabiliza la adhesin del neutrfilo a la clula endotelial, lo que permite a aqul abrirse paso entre las clulas del endotelio.

Molculas solubles y receptores relacionados con membrana

El sistema inmunitario innato es polifactico; utiliza como sus efectores una variedad de molculas solubles as como receptores unidos a la membrana celular. En el lugar de infeccin o lesin se producen determinados tipos de molculas solubles y actan localmente. Entre ellas se incluyen pptidos antimicrobianos como defensinas y catelicidinas as como los interferones, un importante grupo de citocinas con accin antivrica, como se expone ms adelante y con mayor detalle en el captulo 12. Otros efectores solubles se producen en sitios distantes y llegan a sus tejidos blanco en el torrente sanguneo. Las protenas del complemento y las protenas de fase aguda corresponden a esta categora. La naturaleza de estos efectores y sus contribuciones a las defensas del hospedador se estudian ms adelante.

La extravasacin leucocitaria es un proceso altamente regulado de mltiples pasos

El proceso estrechamente regulado de la extravasacin es el responsable de que los leucocitos migren del torrente sanguneo a los sitios de infeccin. Conforme se desarrolla una respuesta inflamatoria, diversas citocinas y otros mediadores inflamatorios actan en el endotelio de los vasos sanguneos locales, induciendo una mayor expresin de molculas de adhesin celular (CAM, del ingls cell adhesion molecules). Se dice entonces que el epitelio afectado se inflama o activa. Dado que suelen ser neu-

Los pptidos antimicrobianos contribuyen a la defensa innata contra bacterias y hongos

Se han aislado pptidos con actividad antimicrobiana de fuentes tan diversas como seres humanos, ranas, moscas, nematodos y varias especies de plantas (cuadro 3-2). El que esta estrategia haya surgido en una fase temprana de la evolucin y se haya conservado, as como la identificacin de ms de 800 pptidos antimicrobianos distintos, son pruebas de su eficacia. Varan en tamao desde seis hasta 59 aminocidos, y la mayora tiene carga positiva (son catinicos), por ejemplo las magaininas presentes en la piel de las ranas y las defensinas halladas en seres humanos y otras especies. Las defensinas humanas son pptidos

60

PA RT E I

INTRODUCCIN

a) Rodamiento y extravasacin 1 Rodamiento 2 Activacin 3 Detencin y adhesin 4 Migracin transendotelial

Endotelio b) Inicio de la extravasacin

Neutrfilo

Quimiocina o receptor quimioatrayente Mucina Integrina

Selectina E

Quimiocina u otro quimioatrayente

ss ss ss ss ICAM ss

Interacciones selectina-mucina median el rodamiento

Quimiocinas y quimioatrayentes inducen cambios en las integrinas

Las integrinas se adhieren firmemente a las ICAM

FIGURA 3-7 a) Rodamiento y extravasacin de un neutrlo. b) Molculas de adhesin y quimiocinas que participan en la extravasacin de neutrlos. El rodamiento es mediado por la unin transitoria de selectinas presentes en el endotelio vascular a mucinas en el neutrlo. Quimiocinas u otros quimioatrayentes que
catinicos con 29 a 35 residuos de longitud, donde seis cistenas invariantes forman dos o tres enlaces disulfuro que dan estabilidad a estructuras tridimensionales relativamente rgidas. Las defensinas destruyen una amplia variedad de bacterias, incluidas Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, E. coli, Pseudomonas aeruginosa y Haemophilus influenzae. Los neutrfilos son fuentes abundantes de estos pptidos, pero existen otras: las clulas panosas secretan defensinas en el intestino, y las clulas epiteliales de pncreas y rin liberan defensinas en el suero. Estos pptidos destruyen microorganismos con rapidez, por lo comn en minutos. Incluso los pptidos antimicrobianos de accin lenta ejercen su accin letal en el transcurso de 90 minutos.

se unen a un receptor especco en el neutrlo activan una va de transduccin de seales, de lo que resulta un cambio conformacional en molculas de integrina que las capacitan para adherirse rmemente a molculas de adhesin intracelular en la supercie de las clulas endoteliales.

Los pptidos antimicrobianos a menudo actan rompiendo las membranas microbianas. En la actualidad existe inters por investigar el modo en que estos compuestos discriminan entre las membranas celulares microbianas y del hospedador. Si bien la rotura de la membrana es un mecanismo de accin importante, los pptidos antimicrobianos tambin producen diversos efectos intracelulares, como la inhibicin de la sntesis de DNA, RNA o protenas, y la activacin de enzimas antimicrobianas que lisan componentes del patgeno. Los pptidos antimicrobianos no slo atacan bacterias y hongos sino tambin virus, y se ha demostrado que dirigen su accin eficazmente contra la envoltura lipoprotenica de algunos virus que la poseen, como el de la gripe y algunos herpesvirus. El alcance de estas actividades, su efica-

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

61

CUADRO 3-2
Pptido Familia de defensinas Defensinas Defensinas Catelicidinas Magaininas Cercopinas Drosomicina Espinigerina

Algunos pptidos antimicrobianos

Especie productora tpica* Ser humano (en clulas panosas del intestino y en grnulos citoplsmicos de neutrlos) Ser humano (en epitelios y otros tejidos) Ser humano, bovinos Rana Mariposa de la seda Mosca de la fruta Termita Actividad microbiana tpica* Antibacteriana Antibacteriana Antibacteriana Antibacteriana; antimictica Antibacteriana Antimictica Antibacteriana; antimictica

*En muchos casos, la produccin del pptido o la familia de pptidos antimicrobianos indicados no se limita a la especie productora tpica sino que ocurre en muchas especies distintas. Asimismo, algunos miembros del pptido o la familia indicados tienen actividad antimicrobiana ms amplia que la tpica que se cita.

cia antimicrobiana demostrada y el surgimiento cada vez mayor de resistencia a los antibiticos existentes han estimulado la investigacin sobre la idoneidad de los pptidos antimicrobianos para su uso teraputico. Sin embargo, persisten las interrogantes acerca de su toxicidad, eficacia y estabilidad in vivo cuando se administran en un entorno clnico. Tambin se ha planteado preocupacin por el peligro de que las bacterias pudieran adquirir resistencia a estos antimicrobianos con rapidez si se usan ampliamente, lo cual socavara un puntal decisivo de la inmunidad innata contra la infeccin. Por estas razones, los pptidos antimicrobianos an no se encuentran en uso clnico.

sacrido presente en la superficie de especies de neumococos y fosforilcolina, que se encuentra en la superficie de muchos microorganismos. La protena C reactiva unida a estos ligandos en la superficie de un patgeno promueve la captacin por fagocitos y activa un ataque mediado por complemento contra el invasor. (En el enfoque clnico de este captulo se expone el vnculo entre el papel de la CRP en la inflamacin y enfermedad cardaca.) La lectina de unin a manosa es una protena de fase aguda que reconoce patrones moleculares que contienen manosa en los microorganismos pero no en clulas de vertebrados. Asimismo, dicha lectina dirige el ataque del complemento contra los patgenos a los que se une.

Las protenas de la reaccin de fase aguda contribuyen a la inmunidad innata

Durante los decenios de 1920 y 1930, antes de la introduccin de los antibiticos, se dedic mucha atencin al control de la neumona neumoccica. Los investigadores notaron cambios en la concentracin de varias protenas sricas durante la fase aguda de la enfermedad, la que precede a la recuperacin o la muerte. Los cambios sricos se denominaron en conjunto reaccin de fase aguda (APR, del ingls acute phase response), y las protenas cuyas concentraciones aumentan o disminuyen durante esa fase an se conocen como protenas de reaccin de fase aguda (protenas APR). Est pendiente de dilucidar la importancia fisiolgica de muchas protenas APR, pero ahora sabemos que algunas, como los componentes del sistema del complemento y la protena C reactiva, son parte de la respuesta inmunitaria innata a la infeccin. La reaccin de fase aguda (que se expone de manera completa en el cap. 13) es inducida por seales que viajan por la sangre desde sitios de lesin o infeccin. El hgado es uno de los principales sitios de sntesis de protenas APR, y las citocinas proinflamatorias TNF- , IL-1 e IL-6 son las principales seales responsables de inducir la reaccin de fase aguda. La produccin de estas citocinas es una de las respuestas tempranas de los fagocitos, y el aumento en las concentraciones de protena C reactiva y otras protenas de fase aguda como el complemento contribuye a la defensa de diversas maneras. La protena C reactiva pertenece a una familia de protenas pentamricas llamadas pentraxinas, que fijan ligandos en una reaccin dependiente de calcio. Entre los ligandos reconocidos por CRP estn un poli-

La inmunidad innata utiliza diversos receptores para detectar infeccin

Se han identificado varias molculas de reconocimiento de patrones; en el cuadro 3-3 se presentan algunos ejemplos. Los receptores tipo Toll son quiz los ms importantes de ellas, y se consideran ms adelante. Otras estn presentes en el torrente sanguneo y los lquidos tisulares en la forma de protenas circulantes solubles o unidas a las membranas de macrfagos, neutrfilos y clulas dendrticas. MBL y CRP, que se consideraron antes, son receptores solubles de reconocimiento de patrones que se unen a superficies microbianas, con lo que promueven la fagocitosis o hacen al invasor un blanco probable de la lisis mediada por complemento. Otro receptor soluble del sistema inmunitario innato, la protena de unin a lipopolisacrido (LBP, del ingls lipopolysaccharide-binding protein), es parte importante del sistema que reconoce y sealiza una respuesta a lipopolisacrido, que es un componente de la pared celular externa de las bacterias gramnegativas. Las protenas NOD (de nucleotide-binding oligomerization domain, dominio de oligomerizacin y unin a nucletido) constituyen el grupo de receptores cuya participacin en la inmunidad innata se descubri en fecha ms reciente. Estas protenas son citoslicas, y dos miembros de esta familia, NOD1 y NOD2, reconocen productos derivados de peptidoglucanos bacterianos. NOD1 se une a tripptidos producto de la degradacin de peptidoglucano, y NOD2 reconoce muramildipptido, derivado de la degradacin de peptidoglucano de las paredes celulares de bacterias grampositivas.

62

PA RT E I

INTRODUCCIN

CUADRO 3-3
Receptor (ubicacin)

Receptores del sistema inmunitario innato

Blanco (fuente) Componentes de la pared celular microbiana Carbohidratos microbianos que contienen manosa (paredes celulares) Fosfatidilcolina, polisacrido neumoccico (membranas microbianas) Lipopolisacrido bacteriano (paredes celulares de bacterias gramnegativas) Componentes microbianos no presentes en los hospedadores Componentes de la pared celular bacteriana Muchos blancos; bacterias grampositivas y gramnegativas, clulas apoptsicas del hospedador Efecto del reconocimiento Activacin del complemento, opsonizacin, lisis Activacin del complemento, opsonizacin Activacin del complemento, opsonizacin Envo a la membrana celular

Complemento (torrente sanguneo, lquidos tisulares) Lectina de unin a manosa (MBL) (torrente sanguneo, lquidos tisulares) Protena C reactiva (CRP) (torrente sanguneo, lquidos tisulares) Receptor de lipopolisacrido (LPS);* protena de unin a LPS (LBP) (torrente sanguneo, lquidos tisulares) Receptores tipo Toll (supercie celular o compartimientos internos) Receptores de la familia NOD (intracelulares) Receptores depuradores (SR) (membrana celular)

Induccin de respuestas innatas Induccin de respuestas innatas Induccin de fagocitosis o endocitosis

*El LPS se une a la membrana celular por medio de un complejo de protenas que incluye CD14, MD-2 y TLR (por lo comn TLR4). Dominio de oligomerizacin y unin a nucletido.

Entre los receptores de reconocimiento de patrones presentes en la membrana celular se incluyen receptores depuradores o receptores de basura (SR, del ingls scavenger receptors), que se encuentran en los macrfagos y muchos tipos de clulas dendrticas. Los SR participan en la unin e internalizacin de bacterias grampositivas y gramnegativas as como en la fagocitosis de clulas apoptsicas del hospedador. Se investigan activamente las funciones y los mecanismos de estos receptores.

Receptores tipo Toll

La protena Toll llam la atencin por primera vez en el decenio de 1980, cuando investigadores en Alemania observaron que en las moscas en desarrollo no se formaba un eje dorsoventral adecuado en ausencia de esa protena. (El trmino Toll, aplicado a la caprichosa configuracin anatmica de las moscas mutantes, significa raro o extravagante en slang de Alemania.) Toll es una protena receptora de seales transmembranales; algunas molculas relacionadas que participan en la inmunidad innata recibieron el nombre de receptores tipo Toll (TLR, del ingls Toll-like receptors). Tres descubrimientos recientes dieron origen a una explosin de conocimiento acerca del papel central de los TLR en la inmunidad innata. La primera observacin provino de la mosca de la fruta. En 1996, Jules Hoffman y Bruno Lemaitre descubrieron que las mutaciones en Toll, que ya se saba que participaban en el desarrollo de la mosca, hacan al insecto altamente susceptible a la infeccin letal por Aspergillus fumigatus, un hongo al que las moscas de tipo silvestre son inmunes (fig. 3-8). Este experimento seero demostr de manera convincente

FIGURA 3-8 Infeccin mictica grave en una mosca de la fruta (color) con una mutacin discapacitante en la va de transduccin de seales necesaria para la sntesis del pptido antimictico drosomicina. [Micrografa electrnica adaptada de B Lemaitre et al.,
1996, Cell 86:973; cortesa de J. A. Hoffman, Universidad de Estrasburgo.]

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

63

Clula bacteriana (E. coli)

Organizacin de la pared celular Lipopolisacrido (endotoxina)

Membrana externa Peptidoglucano Membrana interna

FIGURA 3-9 Lipopolisacrido (LPS) en la pared celular de E. coli. El LPS es un potente estmulo
de la inmunidad innata. [Micrografa de Gary Gaugler/Visuals Unlimited.]

la importancia de las inmunorreacciones desencadenadas por patgenos en un invertebrado. Un ao ms tarde, en 1997, Ruslan Medzhitov y Charles Janeway descubrieron que una protena humana, identificada por homologa entre su dominio citoplsmico y el de Toll, activaba la expresin de genes de inmunorreaccin cuando se transfectaban a una lnea experimental de clulas humanas. Dicha protena humana se bautiz ms tarde como TLR4. sta fue la primera prueba de que una va de inmunorreaccin se conservaba entre la mosca de la fruta y el ser humano. En 1998 se obtuvieron pruebas de que los TLR son parte de la fisiologa inmunitaria normal de los mamferos en estudios con ratones mutantes realizados en el laboratorio de Bruce Beutler. Los ratones homocigticos para el locus lps eran resistentes al lipopolisacrido (LPS), tambin conocido como endotoxina, que proviene de las paredes celulares de las bacterias gramnegativas (fig. 3-9). En seres humanos, la acumulacin de endotoxina en una infeccin bacteriana grave puede causar choque sptico, una condicin que pone en peligro la vida por fallo potencial de rganos vitales como encfalo, corazn, riones e hgado. Cada ao, unas 20 000 personas mueren por choque sptico causado por infecciones de gramnegativos, por lo cual fue impactante que algunas cepas mutantes de ratones fueran resistentes a las dosis letales de LPS. La determinacin de la secuencia del DNA revel que el gen murino lps codifica una forma mutante de receptor tipo Toll, TLR4, la cual difiere de la forma normal en un solo aminocido. Este trabajo constituy una demostracin inequvoca de que el TLR4 es indispensable para el reconocimiento del LPS y mostr que los TLR en efecto participan en la inmunofisiologa normal. En muy pocos aos, el trabajo de muchos investigadores ha demostrado que existen varios TLR. Hasta la fecha se han detectado 11 en seres humanos y 12 en ratones. Los receptores tipo Toll son protenas transmembranales que comparten un elemento estructural comn en su regin extracelular, segmentos repetitivos de 24 a 29 aminocidos que contienen la secuencia xLxxLxLxx (donde x es cualquier aminocido y L es leucina). Estos motivos estructurales se denominan repeticiones ricas en leucina (LRR, del ingls leucine-rich repeats) (fig. 3-10). Todos los TLR contienen varias LRR, y un

subconjunto de las LRR constituye la regin extracelular de unin a ligando del TLR. El dominio intracelular de los TLR se denomina dominio TIR (de Toll/IL-1 receptor, receptor Toll/IL-1), por alusin a la similitud entre los dominios citoplsmicos de los TLR y la regin comparable de un receptor para

Repeticiones ricas en leucina (LRR)

Dominio exterior

Modelo de cinta del dominio exterior

Membrana celular Caja 1 Caja 2 Dominio TIR Caja 3

FIGURA 3-10 Estructura de un receptor tipo Toll (TLR). Los receptores tipo Toll tienen una regin exterior que contiene muchas repeticiones ricas en leucina (LRR), un dominio transmembranal y un dominio interior llamado dominio TIR. El sitio de unin al ligando del TLR se encuentra entre las LRR. El dominio TIR interacta con los dominios TIR de otros miembros de la va de transduccin de seales por TLR; tres secuencias altamente conservadas de aminocidos llamadas cajas 1, 2 y 3 son esenciales para esta interaccin y son caractersticas de los dominios TIR.

64

PA RT E I

INTRODUCCIN

Bacterias, parsitos

Bacterias grampositivas y hongos

Bacterias gramnegativas

Bacterias flageladas

FIGURA 3-11 Receptores tipo Toll y

sus ligandos. Los TLR que interactan con ligandos extracelulares residen en la membrana plasmtica; los TLR que se unen a ligandos generados dentro de la clula se localizan en membranas intracelulares. Algunos TLR forman dmeros con otros TLR; TLR4 se dimeriza consigo mismo (y es posible que algo similar ocurra en el caso de TLR5). Tal vez otros TLR funcionen como monmeros, o bien como dmeros con compaeros an por descubrir.

Membrana celular

TLR1 TLR2 dsRNA vrico

TLR2 TLR6 ssRNA vrico

TLR4 TLR4

TLR5 TLR5?

ssRNA Elementos de vrico DNA bacteriano

TLR3 Compartimiento interno

TLR7

TLR8

TLR9

TLR TLR1 TLR2

Ligandos Triacil-lipopptidos Peptidoglucanos Protenas unidas a GPI Lipoprotenas Zimosn RNA bicatenario (dsRNA) LPS Protena F Flagelina Diacil-lipopptidos Zimosn RNA monocatenario (ssRNA) RNA monocatenario (ssRNA) Dinucletidos desmetilados CpG Dinucletidos Infeccin por herpesvirus Desconocido

Microorganismos blanco Micobacterias Bacterias grampositivas Tripanosomas Micobacterias Levaduras y otros hongos Virus Bacterias gramnegativas Virus sincicial respiratorio (RSV) Bacterias Micobacterias Levaduras y otros hongos Virus Virus DNA bacteriano Algunos herpesvirus Desconocido

TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9

TLR10,11

IL-1, una importante molcula reguladora. Como se muestra en la figura 3-10, los dominios TIR tienen tres regiones, altamente conservadas entre todos los miembros de la familia TIR, llamadas cajas (secuencias) 1, 2 y 3, las cuales sirven como sitios de unin para protenas intracelulares que participan en las vas de sealizacin mediadas por TLR. Se han determinado las funciones de nueve de los 11 TLR presentes en el ser humano. Resulta sorprendente que cada TLR detecta un repertorio distinto de molculas patgenas al-

tamente conservadas. El conjunto completo de TLR presentes en un ratn o en un ser humano es capaz de detectar una amplia variedad de virus, bacterias, hongos e incluso algunos protozoarios simples. En la figura 3-11 se presenta el conjunto de TLR humanos cuyos ligandos y funciones se han determinado. Es notable que los ligandos que se unen a TLR son componentes indispensables de los patgenos: un virus no podra funcionar sin su cido nucleico, las bacterias gramnegativas no podran formarse sin sus paredes que contienen LPS, y los hongos de-

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

65

ben incorporar el polisacrido zimosn en su pared celular. Los patgenos simplemente no tienen la opcin de mutar a formas que carecen de los componentes esenciales que son reconocidos por los TLR. Como se muestra en la figura 3-11, los TLR que reconocen ligandos extracelulares se encuentran en la superficie de las clulas, mientras que los que reconocen ligandos intracelulares, como RNA vrico o fragmentos de DNA de bacterias, se localizan en compartimientos intracelulares. Varios receptores tipo Toll, los TLR 1, 2, 4 y 6, funcionan como dmeros (en algunos casos, en el complejo formado se incorporan protenas adicionales). Uno de ellos, TLR4, se parea consigo mismo (formando un homodmero), y los otros forman complejos mixtos (heterodmeros). An no se determinan los compaeros de los TLR 3, 7, 8 y 9, que tal vez acten como monmeros, y algunos datos sugieren que TLR podra existir como heterodmero. El pareamiento de los TLR afecta su especificidad. TLR2 acoplado a TLR6 se une a una amplia variedad de clases moleculares presentes en los microorganismos, incluidos peptidoglucanos, zimosanos y lipopptidos bacterianos. Sin embargo, cuando se parea con TLR1, el TLR2 reconoce lipoprotenas bacterianas y algunas protenas de superficie caractersticas de parsitos. TLR4 es el receptor clave para la mayora de los lipopolisacridos bacterianos. TLR5 reconoce la flagelina, importante componente estructural de los flagelos bacterianos. TLR3 reconoce el RNA bicatenario (dsRNA, del ingls doublestranded RNA) que aparece en las clulas despus de la infeccin por virus de RNA, y el RNA monocatenario (ssRNA, del ingls single-stranded RNA) es el ligando de TLR8 y TLR7. Por ltimo, TLR9 reconoce la secuencia CpG (citocina desmetilada unida a guanina) del DNA e inicia una respuesta contra ella. Secuencias desmetiladas como sta abundan en el DNA microbiano y son mucho menos comunes en el DNA de los vertebrados.

drticas. En la figura 3-12 se indican las funciones de los principales tipos celulares de la inmunidad innata.

Los neutrlos se especializan en fagocitosis y matanza

Los neutrfilos son las primeras clulas en migrar de la sangre a los sitios de infeccin, y llegan con un vasto arsenal que desplegar contra los agentes infecciosos. Son esenciales para la defensa innata contra bacterias y hongos. Si bien la fagocitosis es la principal arma de los neutrfilos contra los invasores, otros mecanismos contribuyen a contener y eliminar los patgenos. Los neutrfilos exhiben varios receptores tipo Toll en su superficie. El TLR2 les permite detectar los peptidoglucanos de las bacterias grampositivas, y el TLR4 detecta el lipopolisacrido presente en las paredes celulares de los gramnegativos. Adems de los TLR, hay otros receptores de reconocimiento de patrn en la superficie del neutrfilo. Mientras los neutrfilos pueden reconocer patgenos de manera directa, la unin y la fagocitosis mejoran de modo impresionante si los microorganismos son marcados (opsonizados) por la fijacin de anticuerpo, componentes del complemento, o ambos. Aun en ausencia de anticuerpos especficos de antgeno, las protenas del complemento en el suero pueden depositar fragmentos protenicos en la superficie de los patgenos para facilitar la fijacin por neutrfilos, seguida de fagocitosis rpida. En neutrfilos, monocitos y macrfagos otros dos recursos antimicrobianos, los ataques oxidativo y no oxidativo, contribuyen a una defensa polifactica, coordinada y altamente eficaz. La rama oxidativa utiliza especies reactivas de oxgeno (ROS, del ingls reactive oxygen species) y especies reactivas de nitrgeno (RNS). Las primeras son generadas por el complejo enzimtico oxidasa fagosmica de NADPH (NADPH phox, del ingls NADPH phagosome oxidase). Los microorganismos fagocitados se internalizan en vacuolas llamadas fagosomas, donde se emplean especies reactivas de oxgeno como microbicidas. El oxgeno consumido por los fagocitos para sustentar la produccin de ROS por la enzima phox proviene de un proceso metablico conocido como explosin respiratoria, durante la cual la captacin de oxgeno por la clula aumenta varias veces. Las ROS

Tipos celulares de inmunidad innata

En las inmunorrespuestas innatas suelen participar muchos tipos celulares distintos. Los actores principales son neutrfilos, macrfagos, monocitos, clulas asesinas naturales y clulas den-

Tipo celular Funcin

Neutrfilos Fagocitosis Especies reactivas de oxgeno y de nitrgeno Pptidos antimicrobianos

Macrfagos Fagocitosis Mediadores inflamatorios Presentacin de antgeno Especies reactivas de oxgeno y de nitrgeno Citocinas Protenas del complemento

Clulas dendrticas Presentacin de antgeno Seales coestimulatorias Especies reactivas de oxgeno Interfern Citocinas

Clulas asesinas naturales Lisis de clulas infectadas por virus Interfern Activacin de macrfagos

FIGURA 3-12 Principales leucocitos que participan en la inmunidad innata. Los monocitos, no mostrados aqu, tienen muchas de las capacidades de los macrfagos.

66

PA RT E I

INTRODUCCIN

EN F O Q U E C L N I C O

La protena C reactiva es un marcador clave de riesgo cardiovascular

Las enfermedades
cardiovasculares1 son la principal causa de muerte en Estados Unidos y Europa, y a nivel mundial slo son superadas por las enfermedades infecciosas. La causa ms frecuente de enfermedad cardiovascular es la aterosclerosis, la acumulacin progresiva de lpidos y elementos brosos en las arterias. La aterosclerosis es una enfermedad compleja cuya comprensin an dista mucho de ser completa. Sin embargo, un cmulo creciente de datos identica la inamacin como un factor importante en el avance de la aterosclerosis. El vnculo entre inamacin, sistema inmunitario y arteriopata fue sugerido inicialmente por estudios en que se aliment a animales con una dieta inductora de aterosclerosis y luego se examinaron las paredes arteriales y se les compar con las de los animales testigos. La microscopia ptica revel que las paredes arteriales de los testigos estaban libres de leucocitos, mientras que las propias de los animales que recibieron la dieta inductora de aterosclerosis tenan muchos de stos rmemente adheridos. Esto caus sorpresa, porque el ujo de sangre arterial normalmente impide la adhesin rme de leucocitos a las paredes arteriales. Estudios adicionales han mostrado que los leucocitos son importantes en el desarrollo de las placas aterosclerticas. En la fase inicial de la enfermedad se adhieren monocitos a las paredes arteriales, migran a travs de la capa de clulas endoteliales y se diferencian en macrfagos. Receptores depuradores presentes en la supercie de los macrfagos capturan partculas de lipoprotena y las internalizan, con lo que acumulan gotas de lpido y adoptan un aspecto espumoso. Estos macrfagos espumosos secretan enzimas proteolticas, especies reactivas de oxgeno (ROS) y citocinas. Las proteasas degradan la matriz extracelular local, que experimenta alguna remodelacin durante el proceso reparativo. Las citocinas y ROS intensican la inamacin, y ms clulas y lpidos migran a la placa recin formada, dejando la arteria ms estrecha y susceptible al bloqueo. Tal bloqueo de arterias cardacas se denomina infarto de miocardio. Cierra el ujo sanguneo a regiones del corazn, lo cual priva de oxgeno el msculo irrigado por el vaso ocluido en lo que se denomina ataque cardaco. En un porcentaje signicativo de los casos, el primer ataque cardaco es fatal. Por ello es ventajoso identicar a los individuos en

riesgo de sufrir un primer ataque a n de poder instituir tratamientos preventivos y cambios en el modo de vida. El nexo entre inamacin y formacin de placa ha llevado a los investigadores a examinar marcadores inamatorios como predictores de problemas cardiovasculares. En un estudio reciente con varones y mujeres se midieron los valores sanguneos de varios marcadores de inamacin, incluidos interleucina 6 (IL-6), receptores solubles de factor de necrosis tumoral (TNF- ) y la protena de reaccin de fase aguda llamada protena C reactiva (CRP). Adems de los marcadores inamatorios recin mencionados, en el estudio se examin el factor de riesgo ms tradicional, colesterol, y sus marcadores relacionados LDL y HDL.2 El riesgo asociado a los marcadores inamatorios se compar con el asociado a los marcadores relacionados con colesterol. Se recabaron historias clnicas exhaustivas, y los datos se ajustaron segn el riesgo asociado a los siguientes factores de historia clnica y de modo de vida que se sabe incrementan el peligro de cardiopata:

Antecedente paterno de coronariopata antes de los 60 aos de edad Consumo excesivo de alcohol Tabaquismo Obesidad Actividad fsica insuciente Hipertensin (presin arterial elevada) Diabetes

comprenden una combinacin de anin superxido (O2), perxido de hidrgeno (H2O2) y cido hipocloroso (HOCl), el componente activo del blanqueador domstico. La fagocitosis desencadena la generacin de ROS por neutrfilos y macrfagos, y activa la oxidasa fagosmica de NADPH. Entonces el complejo enzimtico produce superxido (fig. 3-13). Las otras especies reactivas de oxgeno altamente txicas (perxido de hidrgeno y cido hipocloroso) se generan a partir del superxido. Como se muestra en la figura 3-13, la reaccin de xido ntrico con superxido genera especies reactivas de nitrgeno. As, la explosin respiratoria contribuye tanto a la produccin de ROS como a la de RNS. La importancia que para la defensa antimicrobiana tienen la oxidasa fagosmica de NADPH y sus productos, ROS y RNS, es ilustrada por el aumento impresionante de la susceptibilidad a infecciones micticas y bacterianas que se observa en pacientes que sufren de la enfermedad granulomatosa crnica, la cual es causada por un defecto en la capacidad de la phox de generar especies oxidantes. Algunos patgenos, como la levadura Candida albicans y la bacteria S. aureus, no son destruidos de manera eficaz slo por ataque oxidativo. La inclusin de defensas no oxidativas en el

arsenal de los neutrfilos (y macrfagos) incrementa en gran medida su capacidad defensiva contra los microorganismos. Las defensas no oxidativas son lanzadas cuando los grnulos neutroflicos se fusionan con los fagosomas, de modo que aaden a la mezcla su carga de pptidos y protenas antimicrobianos. Entre las segundas se encuentra la protena bactericida de incremento de la permeabilidad (BPI, del ingls bactericidal/permeabilityincreasing protein), una notable protena de 55 kDa que se une con gran afinidad al LPS de las paredes de las bacterias gramnegativas y daa la membrana interna. Otros agentes presentes en los grnulos de los neutrfilos son enzimas (p. ej., proteasas y lisozima) que hidrolizan componentes estructurales esenciales de los microorganismos. Entre los pptidos antimicrobianos se incluyen defensinas y catelicidinas, pptidos catinicos con una amplia gama de actividad antimicrobiana.

Los macrfagos despliegan varios recursos contra los patgenos

Los macrfagos en estado de reposo son activados por una variedad de estmulos. Los TLR de la superficie de los macr-

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

67

El grupo de estudio fue vigilado por seis a ocho aos, y se registr el nmero de ataques cardacos letales y no letales. De los marcadores de inamacin estudiados, slo la CRP se vincul con mayor riesgo de coronariopata. Al comparar el valor predictivo de los valores de CRP en pacientes con distintas proporciones de (colesterol total)/(colesterol unido a HDL), este marcador inamatorio se corelaciona con aumento de riesgo. De manera especca, en el estudio se observ que las altas concentraciones de CRP son un factor de ms alto riesgo para pacientes con menores proporciones (colesterol total)/(colesterol unido a HDL) que para pacientes en que esta proporcin es alta. En el ltimo decenio se ha visto el uso creciente de una clase de frmacos que reducen la concentracin de colesterol llamados estatinas. Estos frmacos inhiben la biosntesis de colesterol al tiempo que reducen la inamacin.
100 Mediana de la concentracin de CRP, mg/L

En un estudio reciente se examin si las estatinas reducen las concentraciones de CRP y si los pacientes con sndromes coronarios agudos con menores valores de CRP como resultado del tratamiento con estatinas tendran menor riesgo de un segundo ataque cardaco que quienes tenan mayores concentraciones de CRP. Los investigadores observaron que la administracin de estatinas causaba reducciones impresionantes en los valores de CRP. Tambin descubrieron que en los pacientes en quienes el tratamiento con estatina reduca los valores de CRP a 2 mg/L o menos, la frecuencia de ataques cardacos era signicativamente menor que en los pacientes cuyos valores permanecan por encima de esa cifra, y hubo un notable paralelismo entre menor CRP y concentraciones ms bajas de LDL. Las pruebas de un vnculo entre enfermedad cardiovascular e inamacin han venido acumulndose durante muchos

aos. En vista de la probada participacin de la CRP como agente de la inmunidad innata y mediador de la inamacin, el descubrimiento de que los valores de CRP son tiles para evaluar el riesgo de ataque cardaco refuerza esta hiptesis. La observacin de que el tratamiento con estatinas originalmente introducidas para reducir el colesterol tambin reduce la concentracin de CRP constituye un avance inesperado, pues apoya la hiptesis de un nexo entre inamacin y enfermedad cardiovascular.

1 Entre las enfermedades cardiovasculares se incluyen los infartos del miocardio, o ataques cardacos. 2 La lipoprotena de alta densidad (HDL, del ingls high-density lipoprotein), a menudo llamada de manera imprecisa colesterol bueno, y la lipoprotena de baja densidad (LDL, del ingls low-density lipoprotein), a menudo llamada colesterol malo, son complejos de colesterol y protena. La LDL elevada es un factor de riesgo de enfermedad cardiovascular.

10

Pravastatina Atorvastatina 1 30 das 4 meses Fin del estudio

El tratamiento con estatinas reduce las concentraciones sricas de protena C reactiva (CRP). Se someti a prueba a los sujetos con una de dos estatinas, pravastatina o atorvastatina. La reduccin de los valores de CRP fue impresionante y se mantuvo a largo plazo. [Adaptada de P. M. Ridker et al., 2005,
New England Journal of Medicine 352:20.]

fagos reconocen componentes microbianos, como LPS, peptidoglucanos y flagelinas, y receptores de citocina detectan citocinas liberadas por otras clulas como parte de la respuesta inflamatoria. Tras ser activados, los macrfagos presentan mayor actividad fagoctica, son ms capaces de destruir microorganismos ingeridos, y secretan mediadores de la inflamacin. Tambin expresan concentraciones ms altas de molculas MHC clase II, las cuales presentan antgeno a las clulas TH: otro punto importante de colaboracin entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo. Los patgenos ingeridos por macrfagos son destruidos de manera eficaz en los fagosomas por muchos de los mismos agentes microbicidas usados por los neutrfilos, con participacin tanto de especies reactivas de oxgeno como de especies reactivas de nitrgeno (fig. 3-13). Un arma qumica adicional de los macrfagos y neutrfilos ha sido bien estudiada. Despus de la activacin, mediada por receptores como TLR o la exposicin a las citocinas apropiadas, los fagocitos expresan altas concentraciones de sintetasa de xido ntrico inducible (iNOS, del ingls inducible nitric oxide synthetase), una enzima que oxida l-arginina a l-citrulina y xido ntrico (NO):

l-arginina

O2

NADPH NO
iNOS

l-citrulina

NADP

La enzima se denomina NOS inducible para distinguirla de otras formas presentes en el organismo. El xido ntrico tiene potente actividad antimicrobiana y puede combinarse con superxido para producir sustancias antimicrobianas an ms potentes. Pruebas recientes indican que el xido ntrico y algunas sustancias derivadas de l explican gran parte de la actividad antimicrobiana de los macrfagos contra bacterias, hongos, gusanos parsitos y protozoarios. Esto fue demostrado de manera impresionante con ratones en los cuales se desactivaron los genes que codifican reductasa de xido ntrico inducible. Los ratones perdieron gran parte de su capacidad de controlar las infecciones causadas por patgenos intracelulares tales como Mycobacterium tuberculosis, la bacteria productora de la tuberculosis, y Leishmania major, el protozoario parsito intracelular que causa la leishmaniasis. Adems de matar y destruir patgenos, los macrfagos tambin intervienen en la coordinacin de otras clulas y tejidos del sistema inmunitario y de otros sistemas de apoyo. Ejercen esta

68

PA RT E I

INTRODUCCIN

Especies antimicrobianas generadas a partir de oxgeno y nitrgeno Especies reactivas de oxgeno (ROS) (anin superxido) OH (radical hidroxilo) O2 H2O2 (perxido de hidrgeno) Oxgeno ClO (anin hipoclorito)
O2

Oxidasa fagosmica de NADPH

O2

Dismutasa de superxido Anin superxido H2O2 Perxido de hidrgeno Cl Ion cloruro

Mieloperoxidasa HClO Hipoclorito

Especies reactivas de nitrgeno (RNS) NO (xido ntrico) NO2 (dixido de nitrgeno) ONOO (peroxinitrito)

ONOO Peroxinitrito NO xido ntrico NO2 Dixido de nitrgeno

FIGURA 3-13 Generacin de especies reactivas de oxgeno y de nitrgeno. Dentro de los connes de los neutrlos y macrfagos, varias enzimas transforman oxgeno molecular en especies altamente reactivas de oxgeno (ROS) que tienen actividad antimiinfluencia por medio de la secrecin de una variedad de citocinas, como IL-1, TNF- e IL-6. Estas citocinas son especialmente aptas para promover respuestas inflamatorias, aunque cada uno de estos agentes tiene una variedad de efectos. Por ejemplo, la IL-1 activa linfocitos, e IL-1, IL-6 y TNF- promueven la fiebre al influir en el centro termorregulador del hipotlamo. Asimismo, estas citocinas promueven la reaccin de fase aguda considerada antes y en el captulo 13. Adems de citocinas, los macrfagos activados producen protenas del complemento que promueven la inflamacin y ayudan a eliminar patgenos. Aunque el principal sitio de sntesis de protenas del complemento es el hgado, stas tambin se producen en macrfagos y otros tipos celulares.

crobiana. Uno de los productos de esta va, el anin superxido, es capaz de interactuar con especies reactivas de nitrgeno (RNS) para producir peroxinitrito, otra RNS. El NO puede experimentar asimismo oxidacin para generar la RNS dixido de nitrgeno.

del sistema inmunitario, y por tanto moldean y modifican las defensas presentes y futuras del organismo contra el patgeno. Es notable que las clulas NK produzcan interfern y TNF- , dos potentes y verstiles citocinas inmunorreguladoras. Ambas pueden estimular la maduracin de las clulas dendrticas, los coordinadores clave de la inmunidad innata y adaptativa, que se consideran en la siguiente seccin. El interfern es tambin un potente mediador de la activacin de macrfagos y un importante regulador del desarrollo de las clulas TH, al establecer un vnculo directo entre las clulas NK y el sistema adaptativo.

Las clulas NK son una importante primera lnea de defensa contra los virus y constituyen una seal de activacin clave para otras clulas
Las clulas asesinas naturales (NK) son una primera lnea de defensa contra muchas infecciones vricas distintas. Utilizando un sistema que se considera en el captulo 14 el cual les permite distinguir entre clulas infectadas y no infectadas del hospedador, las clulas NK detectan y destruyen clulas infectadas, que son fuentes potenciales de grandes cantidades de otras partculas vricas infecciosas. La lisis mediada por clulas NK elimina de manera eficaz la infeccin o la mantiene bajo control durante das, hasta que el sistema inmunitario adaptativo ataca la infeccin con linfocitos T citotxicos y anticuerpos especficos para el virus. Sin embargo, probablemente algunas infecciones vricas son eliminadas de manera completa por mecanismos innatos como las clulas NK sin ninguna ayuda de la inmunidad adaptativa. Las clulas asesinas naturales activadas tambin son potentes productoras de diversas citocinas que regulan otras clulas

Las clulas dendrticas atacan patgenos e invocan inmunorreacciones adaptativas al activar clulas T
Las clulas dendrticas establecen un vnculo ms amplio entre la inmunidad innata y la adaptativa que las otras clulas de la inmunidad innata al interactuar tanto con clulas TH como con clulas TC. Las clulas dendrticas maduras son capaces de activar ambos tipos de linfocitos porque tienen la capacidad de presentar antgenos exgenos tanto en MHC I como en MHC II y enviar intensas seales coestimuladoras a las clulas T. Como agentes de inmunidad innata, las clulas dendrticas inmaduras utilizan una variedad de PRR, en especial TLR, para reconocer patgenos. Este reconocimiento causa la activacin de clulas dendrticas, que entonces experimentan un proceso de maduracin que incluye una mayor produccin de molculas MHC clase II y molculas coestimuladoras para la activacin de linfocitos T. Como la mayora de las clulas nucleadas, las clulas dendrticas normalmente expresan molculas MHC clase I. Entonces las DC migran a tejidos linfoides, donde presentan antgeno tanto a clulas T colaboradoras (TH) dependientes de MHC clase II como a clulas T citotxicas (TC) dependientes de MHC clase I.

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

69

La respuesta de las clulas dendrticas no se limita al papel de importancia vital de la comunicacin entre la inmunidad innata y la adaptativa. Estas verstiles clulas tambin montan ataques directos contra los patgenos que detectan. Las clulas dendrticas son capaces de generar las especies reactivas de oxgeno y xido ntrico, y se ha informado que tambin producen pptidos antimicrobianos. Por tanto, los patgenos que son fagocitados por clulas dendrticas son destruidos por muchos de los mismos agentes que los macrfagos usan. Adems, hay un subconjunto de clulas dendrticas, las DC plasmacitoides, que son potentes productoras de interferones tipo I, una familia de citocinas antivricas que en clulas infectadas por virus y otras clulas cercanas inducen un estado que es incompatible con la multiplicacin vrica. Una actividad crtica de los virus es la expresin de sus genomas en las clulas hospedadoras. El contacto de los TLR presentes en las clulas dendrticas plasmacitoides con cido nucleico extrao desencadena la produccin de los interferones tipo I que bloquean la multiplicacin vrica. Otros subconjuntos de clulas dendrticas producen interleucina 12, TNF- e IL-6, potentes inductores de la inflamacin. Uno de los miembros de este grupo, la IL-12, tiene un papel primordial en moldear las respuestas inmunoadaptativas de los linfocitos T colaboradores.

Aqu se examina una de tales vas (fig. 3-14) usada por varios TLR, la cual puede servir como ejemplo de las vas de sealizacin de otros receptores de la inmunidad innata que se enumeran en el cuadro 3-3, todos los cuales siguen un esquema general similar. La va que se considera enseguida da por resultado la induccin de varias caractersticas distintivas de la inmunidad innata, incluida generacin de quimiocinas y citocinas inflamatorias, generacin de pptidos antimicrobianos, etctera.

Inicio por interaccin de la seal con el receptor: los productos microbianos se unen a la parte extracelular del TLR (fig. 3-10). En el lado citoplsmico, un dominio protenico separado contiene los motivos estructurales del TIR altamente conservados presentes en las molculas de sealizacin de animales y plantas. El dominio TIR ofrece sitios de unin para otros componentes de la va. Montaje de los componentes de la va inducido por seales, participacin de una molcula adaptadora: las protenas adaptadoras, que a su vez contienen dominios TIR, interactan con los dominios TIR de los TLR. La protena adaptadora ms comn para TLR es MyD88, la cual promueve la asociacin de dos proteincinasas, IRAK1 e IRAK4. Fosforilacin mediada por proteincinasa: la proteincinasa IRAK4, del complejo IRAK1:IRAK4, fosforila a su compaera, IRAK1. El fosfato recin unido constituye un sitio de unin en IRAK1 para TRAF6, que se une y luego se disocia en compaa de IRAK1 para formar un complejo intermedio IRAK1:TRAF6. Otra proteincinasa, TAK1, une este complejo con varias otras protenas, de lo que resulta la activacin de la cinasa TAK1. Inicio de una cascada enzimtica: TAK1 es decisiva en la va porque su actividad de proteincinasa le permite realizar la activacin mediada por fosforilacin de otros dos mdulos de transduccin de seales. Uno de stos es la va de proteincinasa activada por mitgeno (cinasa MAP, del ingls mitogen-activated protein kinase), y el otro es la va de NF B (vase ms adelante). Las vas de cinasa MAP son cascadas enzimticas de transduccin de seales presentes en muchos tipos celulares y conservadas en toda una gama de eucariotes que va de las levaduras al ser humano. El producto final de la cascada ingresa en el ncleo y promueve la fosforilacin de uno o ms factores de transcripcin, que luego influyen en el ciclo o la diferenciacin celulares.

Vas de transduccin de seales

Los receptores de la superficie celular reciben las seales iniciales que activan respuestas complejas del inmunosistema innato. El siguiente paso, la transmisin de seales al interior de la clula o transduccin de seales, es un tema universal en los sistemas biolgicos y un rea de intensa investigacin en muchos campos ms all de la inmunologa. La respuesta a las seales requiere de tres elementos: la seal misma, un receptor, y una va de transduccin de seales que conecte los mecanismos detector y efector. Seal receptor transduccin de seales mecanismo efector Esta va general se ilustra en la figura 1-6. En el caso de la inmunidad innata, la seal ser un producto microbiano, el receptor un PRR sobre un leucocito, y la seal ser transducida por las interacciones de molculas intracelulares especficas. El mecanismo efector la accin que ocurre como consecuencia de la seal da por resultado la eliminacin del microorganismo invasor. La sealizacin y sus consecuencias son un tema recurrente en inmunologa. Aqu se delinean algunas caractersticas generales de las vas de transduccin de seales, seguidas del ejemplo de la transduccin de seales a travs de TLR.

La sealizacin por TLR es tpica de las vas de transduccin de seales

Los TLR y sus funciones en la inmunidad innata se descubrieron apenas hace poco, aunque las principales vas de transduccin de seales usadas por estos receptores ya se haban dilucidado.

TAK1 tambin fosforila la proteincinasa IKK, lo que es el paso clave en la activacin de la va de NF B. NF B es un potente factor de transcripcin cuya actividad es inhibida por la forma desfosforilada de una protena citoplsmica, I B. La NF B unida a I B desfosforilada sufre secuestro en el citoplasma. La IKK fosforila I B, causando la liberacin de NF B, que entonces puede migrar al ncleo. La NF B presente en el ncleo inicia la transcripcin de muchos genes necesarios para las funciones efectoras de la inmunidad innata. En los vertebrados, las vas dependientes de NF B generan citocinas, molculas de adhesin y otros efectores de la inmunorreaccin innata. La NF B tambin participa en algunas

70

PA RT E I

INTRODUCCIN

TLR Ligando Extracelular

1 La unin de ligando al TLR activa la asociacin de MyD88 con el dominio TIR y el ensamblaje del complejo IRAK1/IRAK4

Citoplasma MyD88 2 IRAK1 TRAF6 IRAK4 IRAK4 fosforila IRAK1, creando un sitio de unin para TRAF6

3 TAK1 (DESACTIVADA) El complejo IRAK1-TRAF6 se disocia y activa el complejo proteincinasa-TAK1

4 TAK1 (ACTIVADA) 5a TAK1 fosforila IKK para activar la va NF B; IKK fosforila entonces I B, hacindola que libere NF B 5b TAK1 tambin fosforila y activa un componente de la va de cinasa MAP (MAPK) TAK1 activa induce a su vez la activacin de dos distintas vas de transduccin de seales

IKK I B Disociacin Citoplasma NF B

Cinasas MAP

Ncleo

Transcripcin dependiente de NF B Motivo de unin a NF B

Transcripcin dependiente de la va de MAPK

6a

6b La cascada de MAPK da por resultado la transposicin de un activador de la transcripcin desde el citoplasma hacia el ncleo, donde activa la transcripcin de genes dependientes de MAPK

La NF B liberada se transpone del citoplasma al ncleo, donde sirve como un activador de la transcripcin para genes dependientes de NF B

FIGURA 3-14 Una va tpica de transduccin de seales por

TLR. Abreviaturas: MyD88, protena 88 de respuesta primaria y diferenciacin mieloide; IRAK, cinasa relacionada con IL-1R; IL-1R, receptor de interleucina 1; TRAF6, factor 6 relacionado con receptor de

factor de necrosis tumoral; TAK1, cinasa 1 activada por factor de crecimiento transformante; MAPK, proteincinasa activada por mitgeno; I B, inhibidor de factor nuclear NF B; IKK, cinasa de I B.

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

71

vas de transduccin de seales clave de clulas T y B, y por tanto reviste importancia en la inmunidad adaptativa. La activacin de vas de sealizacin por TLR tiene muchos efectos. Promueve la expresin de genes que contribuyen a la inflamacin, induce cambios en clulas presentadoras de antgeno que las hacen ms eficientes para la presentacin de antgeno, y causa la sntesis y exportacin de molculas de sealizacin intercelular las cuales influyen en el comportamiento de los leucocitos y otras clulas. La participacin de TLR puede aumentar la actividad fagoctica de macrfagos y neutrfilos y cambiar su fisiologa de manera que incrementan su capacidad de matar y eliminar patgenos. En sistemas no vertebrados, la sealizacin por TLR activa una variedad de sistemas eficaces de inmunidad. La mayora de los TLR emplean la va de transduccin de seales que se esquematiza en la figura 3-14. TLR3 usa una va que es independiente de MyD88, y TLR4 emplea tanto la va antes descrita como la va independiente de MyD88 utilizada por TLR3.

Ubicuidad de la inmunidad innata

La bsqueda decidida de anticuerpos y clulas T y B en especies de los fila de invertebrados no ha podido encontrar ningn indicio de estas caractersticas distintivas de la inmunidad adaptativa. As que a pesar de su prominencia en el sistema inmunitario de los vertebrados, sera un error concluir que estas extraordinarias molculas y verstiles clulas son esenciales para la inmunidad. Los espacios interiores de organismos tan diversos como la ascidia (un cordado sin columna vertebral), la mosca de la fruta y el tomate no albergan masivas poblaciones microbianas. En estudios cuidadosos de estos organismos y muchos otros representantes de los fila de invertebrados se han

observado sistemas bien desarrollados de inmunidad innata. Pruebas crecientes llevan a la conclusin de que algn sistema de inmunidad protege a todos los organismos multicelulares de la infeccin y la explotacin por microorganismos. El genoma de la ascidia Ciona intestinalis (fig. 3-15a) codifica muchos de los genes vinculados con la inmunidad innata, incluyendo los de las lectinas tipo complemento y de los receptores tipo Toll. En la mosca de la fruta, una va en que participa un miembro de la familia NF B es activada por infecciones por bacterias gramnegativas, lo que lleva a la produccin de diptericina, un potente pptido antibacteriano. Adems de estas vas, Drosophila y otros artrpodos tienen estrategias diversas de inmunidad innata, que incluyen la activacin de cascadas de profenoloxidasa que da por resultado el depsito de melanina alrededor de microorganismos invasores. El tomate, Lycopersicon esculentum (fig. 3-15b), como otras plantas, ha desarrollado un repertorio de inmunodefensas innatas para protegerse contra las infecciones. Esto incluye explosiones oxidativas, aumento del pH interno, muerte localizada de regiones infectadas, e induccin de diversas protenas, incluidas enzimas capaces de digerir las paredes celulares de hongos invasores (quitinasas) o de bacterias ( -1,3-glucanasa). Las plantas tambin reaccionan a la infeccin produciendo una amplia variedad de pptidos antibacterianos, as como pequeas molculas orgnicas no peptdicas, como las fitoalexinas, que tienen actividad antibitica. Las mutaciones que interrumpen la sntesis de fitoalexinas dan por resultado la prdida de resistencia a muchos patgenos de los vegetales. En algunos casos, la respuesta de las plantas a stos incluso va ms all de un ataque qumico e incluye una respuesta estructural, en que la planta asla las clulas del rea infectada reforzando las paredes de las clulas circundantes. En el cuadro 3-4 se comparan las capacidades de los sistemas inmunitarios en una amplia gama de organismos multicelulares, tanto animales como plantas.

a)

b) reino de las plantas, el tomate. [Parte a, Gary Bell/Getty Images; parte b,

George Glod, SuperStock.]

FIGURA 3-15 Inmunidad innata en especies de distintos reinos. a) Ascidias, cordados no vertebrados. b) Un miembro del

72

PA RT E I

INTRODUCCIN

CUADRO 3-4

Inmunidad en organismos multicelulares

Enzimas y cascadas enzimticas Inmunidad Inmunidad protectoras Pptidos innata adaptativa inducidas anti(inespecca) (especca) por invasin Fagocitosis microbianos + + + + + ? ? + + + + + ? ? + Receptores de reconocimiento Rechazo Clulas Antide patrn del injerto T y B cuerpos + ? ? + + + ?

Grupo taxonmico Plantas superiores Invertebrados Porferos (esponjas) Anlidos (lombrices) Artrpodos (insectos, crustceos) Vertebrados Elasmobranquios (peces cartilaginosos, p. ej., tiburones, mantarrayas) Peces telesteos y seos (p. ej., salmn, atn) Anbios Reptiles Aves Mamferos

Agentes equivalentes

Probables

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ ? ? +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

CLAVE: + = demostracin denitiva; = no se ha demostrado hasta la fecha; ? = an es necesario establecer la presencia o ausencia. FUENTES: M. J. Flajnik, K. Miller y L. Du Pasquier, 2003, Origin and Evolution of the Vertebrate Immune System, en Fundamental Immunology, 5th ed., W. E. Paul (ed.), Lippincott, Philadelphia; M. J. Flajnik y L. Du Pasquier, 2004, Trends in Immunology 25:640.

RESUMEN

Dos sistemas de inmunidad protegen a los vertebrados: la inmunidad innata, que se encuentra activada o lista para ser activada antes de la infeccin, y la inmunidad adaptativa, que es inducida por la infeccin y requiere de das a semanas para reaccionar. Los receptores de la inmunidad innata reconocen patrones moleculares relacionados con patgeno (PAMP), que son motivos moleculares presentes en los microorganismos. En contraste, los receptores de la inmunidad adaptativa reconocen detalles especficos de la estructura molecular. Los receptores de la inmunidad innata estn codificados en la lnea germinal del hospedador, pero los genes que codifican anticuerpos y receptores de clula T, caractersticos estos ltimos de la inmunidad adaptativa, se forman por un proceso de recombinacin gentica. Las reacciones inmunitarias adaptativas poseen memoria, pero no as las reacciones innatas. Piel y mucosas constituyen una barrera anatmica altamente eficaz para proteger contra la infeccin.

La inflamacin incrementa la permeabilidad vascular, lo que permite a los mediadores solubles de la defensa como complemento, lectina de unin a manosa (MBL), protena C reactiva (CRP) y anticuerpos ulteriores llegar al sitio infectado. Adems, la inflamacin causa la migracin de fagocitos y clulas antivricas por extravasacin y quimiotaxis al foco de infeccin. Los pptidos antimicrobianos son importantes efectores de la inmunidad innata y se han detectado en una amplia variedad de especies. Destruyen muchos microorganismos distintos, a menudo al romper la membrana microbiana. Muchas citocinas son generadas por el sistema inmunitario innato. Estas citocinas incluyen interferones tipo 1, con efectos antivricos, y otras, como TNF- e interfern , que ejercen intensos efectos en otras clulas y rganos. Determinadas citocinas inducen una reaccin de fase aguda, un proceso durante el cual varias protenas antimicrobianas se liberan del hgado al torrente sanguneo. Entre estas protenas se encuentran MBL, CRP y complemento, capaces de destruir microorganismos. El sistema inmunitario innato emplea receptores de reconocimiento de patrones (PRR) para detectar infeccin. Los

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

73

receptores tipo Toll (TLR) son una categora importante de PRR; cada TLR detecta un subconjunto distinto de patgenos, y el repertorio completo puede detectar una amplia gama de virus, bacterias, hongos y protozoarios.

Sitios tiles de la red

http:www.ncbi.nlm.nih.govPubMed
PubMed, la base de datos de la National Library of Medicine, con ms de 15 millones de publicaciones, es la ms amplia en el mundo para bibliografa biolgica y biomdica. Tambin es un sitio muy fcil de utilizar.

Los fagocitos emplean diversas estrategias para destruir patgenos. Estas estrategias incluyen protenas citolticas, pptidos antimicrobianos y la generacin de especies reactivas de oxgeno (ROS) y especies reactivas de nitrgeno (RNS). Las clulas dendrticas son un puente celular clave entre la inmunidad adaptativa y la innata. Los componentes microbianos adquiridos durante la respuesta innata por las clulas dendrticas son llevados del sitio de infeccin a los ganglios linfticos, y las molculas MHC exhiben antgenos microbianos y los presentan a linfocitos T; el resultado es que stos son activados y se produce una inmunorreaccin adaptativa. Los TLR usan vas de transduccin de seales comunes a las que se encuentran en todo el reino vegetal y el animal. La sealizacin por TLR inicia sucesos que capacitan a las clulas para controlar y eliminar infecciones. La inmunidad innata apareci en una fase temprana de la evolucin de los organismos multicelulares y se ha observado en todas las plantas y animales examinados a la fecha. La inmunidad adaptativa se encuentra slo en vertebrados.

http:cpmcnet.columbia.edudept curric-pathologypathologypathologypathoatlas/ GP_I_menu.html

Se muestran imgenes de las principales clulas inflamatorias que intervienen en la inflamacin aguda y crnica, as como ejemplos de enfermedades inflamatorias especficas.

http:animaldiversity.ummz.umich.edusite index.html
La Animal Diversity Web (ADW), en la University of Michigan, es una excelente base de datos exhaustiva de clasificacin animal y una fuente de informacin sobre historia natural y evolucin de los animales. Incluye un sitio con informacin sobre animales aparte del ser humano y el ratn.

Preguntas de estudio Bibliografa

Akira, S., and K. Takeda. 2004. Toll-like receptor signaling. Nature Reviews Immunology 4:499. Basset, C., et al. 2003. Innate immunity and pathogen-host interaction. Vaccine 21:s2/12. Beutler, B., and E.T. Rietschel. 2003. Innate immune sensing and its roots: the story of endotoxin. Nature Reviews Immunology 3:169. Bulet, P., R. Stocklin, and L. Menin. 2004. Antimicrobial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunological Reviews 198:169. Fang, F. C. 2004. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies. Nature Reviews Microbiology 2:820. Iwasaki, A., and R. Medzhitov. 2004. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nature Immunology 5:987. Lemaitre, B. 2004. The road to Toll. Nature Reviews Immunology 4:521. Medzhitov, R., et al. 1997. A human homologue of the Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 388:394. ONeill, A. J. 2005. Immunitys early warning system. Scientific American 292:38. Pai, J. K., et al. 2004. Inflammatory markers and the risk of coronary heart disease in men and women. New England Journal of Medicine 351:2599. Poltorak, A., et al. 1998. Defective LPS signaling in C3Hej and C57BL/10ScCr mice: mutations in TLR4 gene. Science 282:2085. Ridiker, P.M., et al. 2005. C-reactive protein and outcomes after statin therapy. New England Journal of Medicine 352:20. Ulevitch, R. J. 2004. Therapeutics targeting the innate immune system. Nature Reviews Immunology 4:512.

PREGUNTA DE ENFOQUE CLNICO

Comente sobre el papel de los procesos inflamatorios en el desarrollo y el avance de la aterosclerosis. Cmo podra la inflamacin elevar las concentraciones de CRP?

1. La inmunidad innata colabora con la inmunidad adaptativa para proteger al hospedador. Analice esta colaboracin, mencionando puntos clave de interaccin entre los dos sistemas. 2. Cules son las caractersticas distintivas de una respuesta inflamatoria localizada? Cmo contribuyen estas caractersticas al establecimiento de una inmunorreaccin innata eficaz? 3. Utilice la siguiente lista para completar los enunciados que siguen. Algunos trminos pueden usarse ms de una vez. Interfern NO TLR2 TNFClulas NK TLR4 NOD Molculas MHC clase I Fagocitosis iNOS Molculas coestimulatorias Inmunidad adaptativa PRR TLR7 Clula dendrtica TH Arginina MBL Pptidos antimicrobianos TLR8 Oxidasa fagosmica de NADPH Anticuerpo PAMP O2 Complemento Molculas MHC clase II CRP Receptores de clula T Inmunidad innata APR ROS RNS TLR9 TC Citocinas proinflamatorias NADPH

74

PA RT E I

INTRODUCCIN

a. Tanto ____________, una citocina, como las clulas _____ __________ protegen contra infecciones vricas. b. La enzima ____________ utiliza los aminocidos _______ __ y _________ para generar ____________, un gas antimicrobiano. c. La enzima ____________ utiliza ____________ para generar ____________, microbicidas, que puede combinarse con el gas antimicrobiano ____________ para producir ____________, que tambin son microbicidas. d. Durante la respuesta innata, una clula conocida como ___ _________ captura antgeno y lo exhibe en ____________ y ____________ para su presentacin a clulas _________ ___ y ____________ cuando la ____________ migra de los tejidos a un ganglio linftico. e. ____________ y ____________ son receptores de reconocimiento de patrn que pueden activar el complemento y facilitar la opsonizacin. f. La ____________ ocurre cuando ____________ tales como la ____________ y la ____________ se generan por inflamacin y llegan al hgado. g. Algunas clulas utilizan ____________ y ____________ para detectar infecciones por virus de RNA y _________

h.

i.

j. k. l.

m.

para detectar infecciones por bacterias y algunos virus de DNA. Los ____________, los receptores de la inmunidad innata, se codifican en la lnea germinal, pero ____________ y ____________, los receptores caractersticos de la inmunidad adaptativa, son codificados por genes que surgen por recombinacin somtica. Las clulas dendrticas, que tienen ____________, exhiben antgeno tanto en ____________ como en ____________ y por tanto son activadores eficientes de las clulas T colaboradoras y citotxicas. El ____________ es un ____________ intracelular que detecta componentes de la pared celular bacteriana. Los ____________ son receptores de la inmunidad innata que detectan ____________. El ____________ detecta infecciones por bacterias gramnegativas y el ____________ detecta infecciones por bacterias grampositivas. Determinados componentes de la pared celular microbiana son capaces de activar el ____________, lo cual desencadena la opsonizacin y el dao a la membrana plasmtica del patgeno.

Para usarse con la pregunta 7 Induccin de lisis mediada por complemento

Tratamiento o modicacin experimental a. Inyeccin de anticuerpos que bloquean las interacciones integrina-ICAM b. Desactivacin del gen que codica el TLR4 c. Anticuerpos que neutralizan TNFe IL-1 d. Mutacin en la enzima phox e. Ratones con desactivacin del gen que codica las molculas MHC clase II

Induccin de inmunidad adaptativa

Extravasacin de leucocitos

Reaccin de fase aguda

Induccin de inamacin

ROS y RNS

Justicaciones de las predicciones del lector a. b. c. d. e.

INMUNIDAD INNATA

C A P T UL O

75

4. Cules fueron las dos observaciones experimentales que vincularon los TLR con la inmunidad innata? 5. Cuando la inmunidad adaptativa surgi por evolucin en los vertebrados, el sistema de inmunidad innata, ms antiguo, se retuvo. Se le ocurren algunas desventajas de poseer un doble sistema de inmunidad? Podra afirmar que alguno de ellos es ms esencial? 6. Cmo podra un artrpodo, como una cucaracha o un escarabajo, protegerse contra una infeccin mictica? Compare las inmunorreacciones de un artrpodo y del ser humano. 7. Qu efectos tendran los tratamientos o modificaciones experimentales mostrados en el cuadro adjunto sobre las reacciones indicadas en un hospedador humano o murino a la primera infeccin por una bacteria grampositiva? Justifique cada una de sus respuestas.

los neutrfilos son de existencia breve, tienen un papel crtico en la inmunidad innata al actuar en el tejido infectado, donde defienden al hospedador formando especies reactivas de oxgeno, enzimas proteolticas y otros productos antimicrobianos. Franois y colaboradores incubaron neutrfilos con SN50, un inhibidor de NF B, o un testigo. Despus trataron las muestras con agonistas de TLR y determinaron una medida de la inhibicin de la apoptosis (parte a de la figura de abajo). Tambin examinaron una va de transduccin de seales activada por la unin de ligando de TLR (parte b de la misma figura). Conteste las siguientes preguntas con base en los datos que se muestran y lo que ha aprendido en este libro. a. Afecta la unin de los receptores TLR el tiempo de vida de los neutrfilos? Por qu es esto una ventaja para el hospedador? Por qu podra ser una desventaja? b. Si un ratn mutante tiene un defecto en la IKK (cinasa de I B), predecira el lector una vida media mayor o menor de los neutrfilos? (Sugerencia: Vea la fig. 3-14.) c. Cules molculas de TLR usan una va de transduccin de seales distinta de la que usa TLR4? Suponga que los agonistas empleados en el estudio son apropiados. Explique su respuesta.

ANALICE LOS DATOS

Franois y colaboradores (J. Immunol 2005, 174:363) investigaron los efectos de los agonistas del receptor tipo Toll (TLR) sobre la apoptosis de neutrfilos, que constituyen la mayor poblacin de glbulos blancos y tienen la funcin de ser los primeros en reaccionar contra las bacterias. Aunque

a) Efecto de la participacin de TLR en la apoptosis

100

b) Cantidad de fosfo-IKK despus de la participacin de TLR, medida por citometra de flujo 50 Intensidad media de fluorescencia

Testigo
90

Inhibicin de la apoptosis (%)

SN50 40

80 70 60 50 40 30 20 10 0

30

20

10

9)

2)

6) LR 2/ ge lin Lo a

84

SK

G-

P-

Cp

3C

Pa

Fl a

xo r

R-

AL

LR ib 5) in a (T LR 7)

R4

R2

ig

/8 )

Ligando LPS (unido a TLR) (TLR4)

PGN (TLR2)

R-848 CpG-DNA Pam3CSK4 MALP-2 (TLR7/8) (TLR9) (TLR1/2) (TLR2/6)

0
) ) LR (T (T L (T L R7 st LR 1/ Te (T L (T N (T 2 S A (T

LP

PG

N D

captulo 4
Antgenos y anticuerpos

as molculas emblemticas del sistema inmunitario adaptativo son el anticuerpo y el receptor de clula T. Mientras que los componentes de la inmunidad innata estn programados para el reconocimiento de patrones moleculares y por tanto identifican caractersticas compartidas por grupos de molculas extraas, las molculas de anticuerpo y las de receptor de clula T exhiben un mayor grado de especificidad, al reconocer determinantes antignicos o eptopos especficos. Los eptopos son las regiones con actividad inmunitaria de un inmungeno que se unen a receptores de membrana especficos de antgeno en los linfocitos o a anticuerpos secretados. Los anticuerpos son protenas de unin a eptopo que existen en dos formas, como constituyentes unidos a membrana de las clulas B o como molculas solubles secretadas por clulas plasmticas. Los anticuerpos unidos a membrana confieren especificidad antignica en las clulas B; la proliferacin de clonas de clulas B especficas de antgeno es inducida por la interaccin de anticuerpo de membrana con antgeno. Los anticuerpos secretados circulan en la sangre, donde actan como efectores de la inmunidad humoral al buscar antgenos y marcarlos para su eliminacin. Todos los anticuerpos comparten caractersticas estructurales, se unen a antgeno y participan en cantidad limitada de funciones efectoras. El receptor de clula T expresado en la membrana superficial de dicha clula slo reconoce fragmentos de antgeno procesados que se han integrado en un complejo con molculas MHC. Si bien en este captulo se hace hincapi en el anticuerpo y la naturaleza del reconocimiento de antgeno por la clula B, se harn comparaciones con el reconocimiento de antgeno por la clula T para desarrollar los temas generales de la antigenicidad e ilustrar el contraste entre las interacciones de linfocitos T y B con los antgenos. En los captulos 8 y 9 se cubren las caractersticas moleculares de las molculas MHC, el modo en que los antgenos son procesados y unidos a molculas MHC, y la naturaleza de los receptores de clula T que reconocen complejos antgeno-MHC. En general, la poblacin de anticuerpos producidos en respuesta a un estmulo antignico especfico es heterognea. La mayora de los antgenos es estructuralmente compleja y contiene muchos eptopos distintos, y el sistema inmunitario suele reaccionar produciendo anticuerpos contra varios de los eptopos presentes en el antgeno. En otras palabras, varias clonas distintas de clulas B son estimuladas y proliferan. La produccin de las clulas plasmticas de una misma clona de clulas B es un anticuerpo monoclonal que se une de manera especfica a un

Complementariedad entre anticuerpo y antgeno del virus de la gripe (amarillo). [Basado en datos de cristalografa con rayos X obtenidos por P. M. Colman y W. R. Tulip; tomado de G. J. V. H. Nossal, 1993, Scientific American 269(3):22.]

Inmunogenicidad y antigenicidad Eptopos Estructura bsica y funcin de los anticuerpos Sitio de unin de anticuerpos Funciones efectoras mediadas por anticuerpo Clases de anticuerpos y actividades biolgicas Determinantes antignicos en inmunoglobulinas Receptor de clula B Superfamilia de las inmunoglobulinas Anticuerpos monoclonales

mismo determinante antignico. Juntos, los productos secretados por todas las clonas de clulas B estimuladas, el grupo de anticuerpos monoclonales, constituyen la respuesta de anticuerpos sricos policlonales y heterogneos a un antgeno inmunizante. Los miembros de la familia de protenas de anticuerpo tienen caractersticas estructurales en comn y se conocen de manera colectiva como inmunoglobulinas (Ig). Y a pesar de sus semejanzas, los miembros de esta familia realizan un conjunto increblemente diverso de funciones de unin as como varias funciones efectoras bien definidas despus de la unin a antgeno. Antes de explorar la estructura y la complejidad de la familia de anticuerpos, en este captulo se analizarn la naturaleza de los antgenos y los conceptos y caractersticas de las sustancias inmungenas.

76

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

77

Los antgenos se definen de manera especfica como molculas que interactan con el receptor de inmunoglobulina de las clulas B (o con el receptor de clula T cuando se encuentra en forma de complejo con MHC). Las propiedades moleculares de los antgenos y el modo en que estas propiedades contribuyen a la activacin inmunitaria son fundamentales para comprender el sistema inmunitario. En este captulo se describen las caractersticas moleculares de los antgenos que son reconocidos por anticuerpos y se explora la contribucin que el sistema biolgico del hospedador hace a la inmunogenicidad.

Portador

Hapteno Conejo inmunizado

Anticuerpos contra el hapteno

Conjugado de hapteno y portador

Anticuerpos contra el portador

Inmunogenicidad y antigenicidad
Inmunogenicidad y antigenicidad son propiedades inmunitarias relacionadas pero distintas que a veces se confunden. La inmunogenicidad es la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria humoral o mediada por clulas, o ambas:
Clulas B antgeno clulas B clulas B efectoras de memoria Clula plasmtica secreta anticuerpo antgeno clulas T efectoras CTL, TH, etc. clulas T de memoria secretan citocinas y factores citotxicos
Inyeccin de: Hapteno (DNP) Portador protenico (BSA) Conjugado de hapteno y portador (DNP-BSA)

Anticuerpos contra el conjugado de hapteno y portador Anticuerpos formados: Ninguno AntiBSA AntiDNP (mayor) AntiBSA (menor) AntiDNP/BSA (menor)

FIGURA 4-1 Un conjugado de hapteno y portador es el inmungeno en esta ilustracin, y el hapteno es un antgeno que por s mismo no resulta inmungeno. El inmungeno contiene mltiples copias del hapteno un compuesto orgnico no inmungeno pequeo, en este caso dinitrofenol (DNP) relacionado desde el punto de vista qumico con una protena portadora grande, como la albmina srica bovina (BSA). La inmunizacin con DNP solo no activa anticuerpos anti-DNP, pero la inmunizacin con DNP-BSA da lugar a tres tipos de anticuerpo. De ellos, predomina el anticuerpo anti-DNP, lo que indica que en este caso el hapteno es el eptopo inmunodominante o determinante antignico, como sucede con frecuencia en estos conjugados.

Clulas T

Aunque una sustancia que induce una reaccin inmunitaria especfica suele llamarse antgeno, es ms apropiado denominarla inmungeno. La antigenicidad es la capacidad de combinarse de manera especfica con los productos finales de las respuestas anteriores (es decir, anticuerpos secretados, receptores de superficie en las clulas T, o ambos). Si bien todas las molculas que tienen inmunogenicidad tambin poseen antigenicidad, no sucede lo contrario. Algunas molculas pequeas, llamadas haptenos, son antignicas pero incapaces de inducir por s mismas una reaccin inmunitaria especfica. En otras palabras, carecen de inmunogenicidad.

Los haptenos son valiosos instrumentos de investigacin y diagnstico

El acoplamiento qumico de un hapteno a una protena inmungena grande, llamada portador, genera un conjugado hapteno-portador inmungeno. Los animales inmunizados con tal conjugado producen anticuerpos especficos para tres tipos de determinantes antignicos: 1) el determinante hapteno, 2) eptopos inalterados en la protena portadora y 3) nuevos eptopos formados por regiones tanto del hapteno como de la molcula portadora en combinacin (fig. 4-1). Por s mismo, un hapteno no puede funcionar como eptopo inmungeno. Pero cuando mltiples molculas de un mismo hapteno se acoplan a una protena portadora (o incluso a un homopolmero no inmungeno), el hapteno queda accesible para el sistema inmunitario y puede actuar como inmungeno. Adems de mostrar la amplia gama de eptopos que pueden encontrarse en un inmungeno individual, el sistema hapte-

no-portador constituye un instrumento que permite a los inmunlogos sondear los efectos de pequeas variaciones en las estructuras qumicas sobre la especificidad inmunitaria. El hapteno puede ser un determinante qumicamente definido que luego es modificado de manera sutil por medios qumicos para dilucidar si ello incide en el reconocimiento por anticuerpos. Una ilustracin clsica de esta estrategia se observa en el trabajo pionero de Karl Landsteiner, quien en los decenios de 1920 y 1930 cre un sistema simple qumicamente definido para estudiar la unin de un anticuerpo individual. Landsteiner emple como haptenos pequeas molculas orgnicas que son antignicas pero no inmungenas. En sus estudios, Landsteiner inmuniz conejos con conjugado hapteno-portador y luego compar la reactividad de los sueros inmunes de los conejos con la del hapteno y la de haptenos estrechamente relacionados acoplados a una protena portadora distinta. Entonces estuvo en posibilidad de medir de manera especfica la reaccin de los anticuerpos antihapteno en el suero inmune y no la de los anticuerpos contra los eptopos portadores originales. Landsteiner examin si un anticuerpo antihapteno poda unirse a otros haptenos con estructura qumica ligeramente distinta. Si ocurra la unin, se le llamaba reaccin cruzada. Observando cules modificaciones del hapteno impedan o permitan reacciones cruzadas, Landsteiner obtuvo informacin sobre la especificidad de las interacciones antgeno-anticuerpo.

78

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

CUADRO 4-1

Reactividad de antisueros con diversos haptenos

REACTIVIDAD CON NH2 NH2 COOH COOH COOH NH2 NH2

Antisuero contra Aminobenceno cido o-aminobenzoico cido m-aminobenzoico cido p-aminobenzoico

Aminobenceno (anilina) + 0 0 0

cido o-aminobenzoico 0 + 0 0

cido m-aminobenzoico 0 0 + 0

cido p-aminobenzoico 0 0 0 +

CLAVE: 0 = sin reactividad; + = reactividad potente. FUENTE: basado en K. Landsteiner, 1962. The specicity of serologic reactions, 1962, Dover Press. Modicado por J. Klein, 1982, Immunology: The science of self-nonself discrimination, Wiley.

Al usar diversos derivados del aminobenceno como haptenos, Landsteiner observ que la configuracin global de un hapteno tiene un papel importante para determinar si podr reaccionar con un anticuerpo dado. Por ejemplo, el antisuero de conejos inmunizados con aminobenceno o uno de sus derivados carboxilo (ismeros orto, meta y para del cido aminobenzoico) acoplado a una protena slo reaccionaba con el hapteno inmunizante original pero no presentaba reaccin cruzada con ninguno de los otros haptenos (cuadro 4-1). En contraste, si la configuracin global del hapteno se mantena igual y ste se modificaba en la posicin para con diversos derivados no inicos, los antisueros presentaban distintos grados de reactividad cruzada. El trabajo de Landsteiner demostr tanto la especificidad del sistema inmunitario para pequeas variaciones estructurales en los haptenos como la enorme diversidad de eptopos que dicho sistema es capaz de reconocer. Muchas sustancias de importancia biolgica, incluidos frmacos, hormonas peptdicas y hormonas esteroides, pueden funcionar como haptenos. Es posible usar conjugados de estos haptenos con grandes portadores protenicos para producir anticuerpos especficos de hapteno. Tales anticuerpos son tiles para medir la presencia de diversas sustancias en el organismo. Por ejemplo, en el estuche original para la prueba casera de embarazo se empleaban anticuerpos antihapteno a fin de determinar si la orina de una mujer contena gonadotropina corinica humana (HCG), que es un indicador de embarazo. Aunque los estudios con conjugados hapteno-portador delinean claramente la diferencia entre los conceptos de antigenicidad e inmunogenicidad, en la prctica deben considerarse mltiples factores para determinar si una sustancia con que el sistema inmunitario se topa inducir una respuesta. La inmunogenicidad depende no slo de propiedades intrnsecas del antgeno sino tambin de varias propiedades del sistema biolgico especfico con que el antgeno se encuentra y del modo en que se presenta el inmungeno. En las siguientes secciones se describen las propiedades que la mayora de los inmungenos

comparten y la contribucin que el sistema biolgico hace a la expresin de la inmunogenicidad.

Las propiedades del inmungeno contribuyen a la inmunogenicidad

La inmunogenicidad depende en parte de cuatro propiedades del inmungeno: alteridad, tamao molecular, composicin y complejidad qumicas, y capacidad de ser procesado y presentado con una molcula MHC en la superficie de una clula presentadora de antgeno o una clula propia alterada.

Alteridad
Con el objeto de inducir una respuesta inmunitaria, el sistema biolgico debe reconocer una molcula como ajena. El lado opuesto a la capacidad de reconocer lo ajeno es la tolerancia de lo propio, una falta de respuesta especfica a los antgenos propios (cap. 16). Gran parte de la capacidad de tolerar antgenos propios surge durante el desarrollo de los linfocitos, cuando los linfocitos inmaduros se exponen a componentes propios. Las clulas que reconocen componentes propios durante este proceso son desactivadas. Las sobrevivientes del proceso se liberan. Los antgenos que no se expusieron a linfocitos inmaduros durante este perodo crtico pueden ser reconocidos ms tarde como ajenos o extraos por el sistema inmunitario. Cuando se introduce un antgeno en un organismo, su grado de inmunogenicidad depende del grado de su alteridad. Por lo general, cuanto mayor es la distancia filogentica entre dos especies, tanto mayor es la disparidad estructural (y por ende la antignica) entre las molculas que las constituyen. Por ejemplo, la albmina srica bovina (BSA, del ingls bovine serum albumin), un antgeno experimental comn, no es inmungena cuando se inyecta a una vaca, pero s lo es en sumo grado si se inyecta a un conejo. Ms an, cabe esperar que la BSA muestre mayor inmunogenicidad en un pollo que en una cabra, que se relaciona ms estrechamente con los bovinos. Esta regla tiene algunas excepciones. Ciertas macromolculas (p. ej., colgena y citocromo c) se han

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

79

Lys

Ala

His

Gly

Lys Lys

Val

Leu Hlice Lmina plegada

Secuencia de aminocidos de la cadena polipeptdica ESTRUCTURA PRIMARIA

ESTRUCTURA SECUNDARIA

Dominio

Molcula polipeptdica monomrica ESTRUCTURA TERCIARIA

Molcula protenica dimrica ESTRUCTURA CUATERNARIA

FIGURA 4-2 Los cuatro niveles de estructura organizacional

de las protenas. La disposicin lineal de aminocidos constituye la estructura primaria. El plegamiento de partes de una cadena polipeptdica en estructuras regulares (p. ej., hlices y lminas plegadas ) genera la estructura secundaria. La terciaria se reere al

plegamiento de regiones entre caractersticas secundarias para dar la forma total de la molcula o partes de ella (dominios) con propiedades funcionales especcas. La estructura cuaternaria resulta de la relacin de dos o ms cadenas polipeptdicas en una molcula protenica polimrica nica.

conservado en alto grado a travs de la evolucin, y por tanto muestran muy poca inmunogenicidad entre diversas lneas de especies. Por el contrario, algunos componentes propios (p. ej., tejido corneal y semen) son secuestrados de manera eficaz del sistema inmunitario, de tal manera que si se inyectan estos tejidos incluso en el mismo animal en que se originaron actan como inmungenos.

Tamao molecular
Existe correlacin entre el tamao de una macromolcula y su inmunogenicidad. Los inmungenos ms activos tienden a presentar masa molecular de 100 000 daltons (Da) o ms. Por lo regular, las sustancias con masa molecular menor de 5 000 a 10 000 Da son inmungenas deficientes, aunque se ha demostrado que unas cuantas sustancias con masa molecular menor de 1 000 Da son inmungenas.

Composicin y heterogeneidad qumicas

El tamao y la alteridad no son, por s mismos, suficientes para que una molcula sea inmungena; se requieren adems otras propiedades. Por ejemplo, los homopolmeros sintticos (pol-

meros compuestos por mltiples copias de un aminocido o un azcar simple) tienden a carecer de inmunogenicidad sin importar cul sea su tamao. Los heteropolmeros suelen ser ms inmungenos que los homopolmeros. Estos estudios muestran que la complejidad qumica contribuye a la inmunogenicidad. Es notable que los cuatro niveles de organizacin de las protenas primario, secundario, terciario y cuaternario contribuyen a la complejidad estructural de una protena y, en consecuencia, a su inmunogenicidad (fig. 4-2). Cuando se presentan de manera apropiada, los antgenos lpidos pueden inducir reacciones de las clulas B. Por ejemplo, los lpidos pueden servir como haptenos si se unen a molculas portadoras adecuadas, como las protenas hemocianina de lapa (KLH, del ingls keyhole limpet hemocyanin) o albmina srica bovina (BSA). Mediante la inmunizacin con estos conjugados de lpido y protena es posible obtener anticuerpos muy especficos contra los lpidos blanco. Por este mtodo los cientficos han creado anticuerpos contra una amplia variedad de molculas lipdicas, incluidos esteroides, derivados complejos de cidos grasos y vitaminas liposolubles, como la E. Estos anticuerpos poseen importancia prctica considerable, puesto que muchas valoraciones clnicas para determinar la presencia y cantidad de

80

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

lpidos de relevancia mdica se basan en anticuerpo. Por ejemplo, la cuantificacin de los valores de un grupo complejo de lpidos conocido como leucotrienos puede ser til en la valoracin de los pacientes de asma (cap. 15). Los ensayos basados en el uso de anticuerpos antilpido permiten detectar cantidades de leucotrieno C4 del orden de los picogramos. Debido a que el antileucotrieno C4 tiene escasa o nula reactividad contra compuestos similares, como leucotrieno D4 o leucotrieno E4, puede usarse para detectar leucotrieno C4 en muestras que contienen este compuesto y varios otros lpidos con relacin estructural. Otra aplicacin mdica importante es la deteccin de prednisona, un esteroide inmunosupresor que a menudo se administra como parte de un programa para suprimir el rechazo de un rgano trasplantado. El mantenimiento de concentraciones sanguneas adecuadas de ste y otros frmacos inmunosupresores es importante para el xito de un trasplante, y los inmunoensayos a base de anticuerpos se usan de manera sistemtica para realizar estas evaluaciones.

generacin F1 mostr una reaccin intermedia al inmungeno. Mediante retroanlisis cruzado, el gen que controlaba la respuesta inmunitaria se rastre (mape) hasta una subregin del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC; cap. 8). Mltiples experimentos con inmungenos definidos simples han demostrado el control gentico de la reaccin inmunitaria, limitado en gran parte a genes propios del MHC. Estos datos indican que los productos gnicos MHC, que actan para presentar antgeno procesado a las clulas T, tienen un papel central en la determinacin del grado al cual responde un animal a un inmungeno. Los genes que codifican receptores de clulas B y T y los que codifican varias protenas que participan en los mecanismos reguladores inmunitarios tambin determinan la respuesta de un animal a un antgeno. La variabilidad gentica en todos estos genes afecta la inmunogenicidad de una macromolcula especfica en diferentes animales. Estas contribuciones genticas a la inmunogenicidad se analizan con mayor detalle en captulos posteriores.

Susceptibilidad al procesamiento y la presentacin de antgeno

El desarrollo de reacciones inmunitarias humorales (mediadas por anticuerpos) y mediadas por clulas T requiere la interaccin de clulas T con un antgeno procesado y presentado junto con molculas del complejo mayor de histocompatibilidad. Las macromolculas insolubles, grandes, son casi siempre ms inmungenas que las solubles, pequeas, ya que las primeras se fagocitan y procesan con mayor facilidad. Las macromolculas que no pueden degradarse y presentarse con molculas MHC son inmungenos deficientes. Lo anterior lo ilustran los polmeros de d-aminocidos, que son estereoismeros de los l-aminocidos (que ocurren de manera natural). Debido a que las enzimas degradadoras presentes dentro de las clulas presentadoras de antgeno slo pueden degradar protenas que contienen l-aminocidos, los polmeros de d-aminocidos no pueden ser procesados y, por consiguiente, constituyen inmungenos deficientes.

Dosis y va de administracin del inmungeno

Cada inmungeno experimental muestra una curva de dosisrespuesta particular, que se determina al medir la reaccin inmunitaria a diferentes dosis y distintas vas de administracin. Una respuesta de anticuerpos se cuantifica determinando la concentracin de anticuerpo que existe en el suero de animales inmunizados. Es menos sencillo valorar las reacciones de clulas T, pero puede intentarse al estimar el incremento de la cifra de clulas T que portan receptores de clula T (TCR) que reconocen al inmungeno. Alguna combinacin de dosis y va de administracin ptimas inducir una reaccin inmunitaria mxima en un animal particular. Una dosis insuficiente no estimula una reaccin inmunitaria porque no activa suficientes linfocitos o, como ocurre en algunos casos, ciertos intervalos de dosis bajas pueden inducir un estado de falta de respuesta inmunitaria, o tolerancia. Por el contrario, una dosis demasiado alta puede tambin inducir tolerancia. La reaccin inmunitaria de ratones al polisacrido capsular neumoccico purificado ilustra la importancia de la dosis. Una dosis de 0.5 mg de antgeno no genera una inmunorreaccin en ratones, en tanto que una dosis mil veces ms baja del mismo antgeno (5 10 4 mg) provoca una reaccin humoral de anticuerpo. Una dosis individual de la mayor parte de los inmungenos experimentales no activa una respuesta potente; por el contrario, suele ser necesario repetir el suministro durante un lapso de semanas. Estas administraciones repetidas, o refuerzos, aumentan la proliferacin clonal de clulas T o B especficas de antgeno y, por consiguiente, aumentan las poblaciones de linfocitos especficos para el inmungeno. Por lo general, los inmungenos experimentales se administran por va parenteral (para, alrededor; enteron, intestino), es decir, por otras vas distintas de la oral. Son comunes las siguientes vas de administracin:

El sistema biolgico contribuye a la inmunogenicidad

Incluso si una macromolcula tiene las propiedades que exige la inmunogenicidad, su capacidad de inducir una reaccin inmunitaria depende de ciertos factores del sistema biolgico que el antgeno encuentra. Entre los factores que contribuyen a la inmunogenicidad se incluyen constitucin gentica del hospedador, modo en que se presenta el material, y uso de sustancias (llamadas coadyuvantes) que acentan la inmunogenicidad.

Genotipo del animal receptor

Un factor importante que determina la reactividad inmunitaria puede ser el genotipo del receptor. La constitucin gentica (genotipo) de un animal inmunizado influye en el tipo de respuesta inmunitaria que manifiesta y, asimismo, en el grado de la reaccin. Por ejemplo, Hugh McDevitt demostr que dos diferentes cepas endogmicas de ratones reaccionan de manera muy distinta a un inmungeno polipeptdico sinttico. Una cepa produjo concentraciones altas de anticuerpo srico, en tanto que la otra cepa tuvo valores bajos. Cuando se cruzaron las dos cepas, la

Intravenosa (IV): dentro de una vena Intradrmica (ID): dentro de la piel Subcutnea (SC): debajo de la piel Intramuscular (IM): en un msculo Intraperitoneal (IP): dentro de la cavidad peritoneal

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

81

La va de administracin influye en alto grado en los rganos y poblaciones celulares inmunitarias que intervienen en la respuesta. El antgeno suministrado por va intravenosa se traslada primero al bazo, mientras que el que ingresa por va subcutnea pasa primero a los ganglios linfticos locales. Las diferencias de las clulas linfoides que pueblan estos rganos pueden reflejarse en la reaccin inmunitaria ulterior.

Coadyuvantes
Los coadyuvantes (del latn adjuvare, ayudar) son sustancias que, cuando se mezclan e inyectan con un antgeno, aumentan la inmunogenicidad de dicho antgeno. Los coadyuvantes se emplean con frecuencia para reforzar la reaccin inmunitaria cuando un antgeno tiene inmunogenicidad baja o slo se dispone de cantidades pequeas de l. Por ejemplo, la respuesta de anticuerpo de los ratones a la inmunizacin con BSA puede incrementarse cinco veces o ms si la BSA se administra con un coadyuvante. Se desconoce el modo preciso en que los coadyuvantes acentan la reaccin inmunitaria, pero en la actualidad se sabe que algunos de los coadyuvantes conocidos (p. ej., poliribonucletidos sintticos y lipopolisacridos bacterianos) son ligandos de los receptores tipo Toll presentes en la superficie de clulas dendrticas y macrfagos (cap. 3) y por tanto estimulan las inmunorreacciones a travs de la activacin del sistema inmunitario innato. En general, parece ser que los coadyuvantes ejercen uno o ms de los siguientes efectos:

timulacin y la intensificacin de la inmunorrespuesta de clulas T. As, la presentacin de antgeno y la seal coestimuladora necesaria suelen aumentar en presencia de un coadyuvante. El alumbre y los coadyuvantes de Freund estimulan asimismo una reaccin inflamatoria crnica local que atrae fagocitos y linfocitos. Por lo regular, esta infiltracin de clulas en el sitio de la inyeccin del coadyuvante tiene como resultado la formacin de una masa de clulas, densa y rica en macrfagos, llamada granuloma.

Eptopos
Como ya se mencion, las clulas inmunitarias no interactan con la totalidad de una molcula inmungena o no la reconocen; ms bien, los linfocitos identifican sitios discretos en la macromolcula llamados eptopos, o determinantes antignicos. Estudios con antgenos pequeos han revelado que las clulas B y T reconocen diferentes eptopos en la misma molcula antignica. Por ejemplo, cuando se inmunizaron ratones con glucagon, una hormona humana pequea de 29 aminocidos, se estimul la formacin de anticuerpos contra eptopos en la porcin amino terminal, en tanto que las clulas T slo reaccionaron a eptopos en la porcin carboxilo terminal. Los linfocitos pueden interactuar como un antgeno complejo a varios niveles de la estructura del antgeno. Un eptopo en un antgeno protenico puede incluir elementos de las estructuras primaria, secundaria, terciaria e incluso la cuaternaria de la protena (fig. 4-2). En los polisacridos se observan con frecuencia cadenas ramificadas, y las puntas de las ramas pueden contribuir a la conformacin de eptopos. Los linfocitos B reconocen antgeno soluble cuando se une a molculas de anticuerpo en su membrana. Dado que las clulas B captan antgeno que est libre en solucin, los eptopos que ellas reconocen tienden a ser sitios muy accesibles en la superficie expuesta del inmungeno. En el caso de los linfocitos T, los eptopos procedentes de protenas difieren en que son pptidos que suelen provenir de la digestin enzimtica de protenas de patgenos y son reconocidos por el receptor de clula T slo cuando forman complejos con antgeno y MHC. As, no es necesaria la accesibilidad en solucin, como en el caso de un eptopo de clula B. En el cuadro 4-2 se resumen las principales diferencias en la antigenicidad para clulas B y T.

Prolongacin de la persistencia del antgeno Intensificacin de seales coestimuladoras Aumento de la inflamacin local Estimulacin de la proliferacin inespecfica de linfocitos

El sulfato potsico de aluminio (alumbre) es un coadyuvante que prolonga la persistencia de antgenos, y es el nico aprobado para uso general en seres humanos. Cuando se mezcla un antgeno con alumbre, la sal precipita el antgeno. La inyeccin de este precipitado de alumbre tiene como resultado una liberacin ms lenta del antgeno del sitio de inyeccin, de tal manera que aumenta el tiempo eficaz de exposicin al antgeno de unos cuantos das sin el coadyuvante, a varias semanas con l. El precipitado de alumbre tambin incrementa el tamao del antgeno y, por consiguiente, la posibilidad de fagocitosis. Los coadyuvantes de agua en aceite tambin prolongan la persistencia del antgeno. Un preparado que se conoce como coadyuvante incompleto de Freund contiene antgeno en solucin acuosa, aceite mineral y un agente emulsificador, como monooleato de manida, que dispersa el aceite en gotitas pequeas que rodean al antgeno; a continuacin, este ltimo se libera con gran lentitud del sitio de inyeccin. Este preparado se basa en el coadyuvante completo de Freund, el primer coadyuvante formulado eficaz, que Jules Freund desarroll hace muchos aos y que contiene micobacterias muertas por calor como ingrediente adicional. El muramildipptido, un componente de la pared de la clula micobacteriana, activa clulas dendrticas y macrfagos y torna ms potente al coadyuvante completo de Freund en comparacin con la forma incompleta. Macrfagos y clulas dendrticas activados son ms fagocticos que los no activados y expresan concentraciones ms altas de las molculas que inducen la coes-

Los eptopos de clulas B tienen propiedades caractersticas

Por lo regular, los eptopos de clula B en protenas naturales (nativas) se componen de aminocidos hidrfilos en la superficie de la protena que son topogrficamente accesibles a anticuerpo unido a membrana o libre. Un eptopo de clula B debe estar al alcance a fin de que sea capaz de unirse a un anticuerpo; en general, es ms probable que se reconozcan como eptopos regiones salientes en la superficie de la protena, y estas regiones suelen constar de aminocidos predominantemente hidrfilos. Las secuencias de aminocidos ocultas en el interior de una protena a menudo consisten en aminocidos de predominio hidrfobo y no pueden funcionar como eptopos de clula B, a menos que se desnaturalice primero la protena.

82

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

CUADRO 4-2
Caracterstica

Comparacin del reconocimiento de antgeno por clulas T y B

Clulas B Incluye complejo binario de membrana Ig y Ag S No se requiere Protena, polisacrido, lpido Accesible, hidrlo, pptidos mviles que contienen aminocidos secuenciales o no secuenciales Clulas T Implica complejo ternario de receptor de clula T, Ag y molcula MHC No Se requiere para exhibir antgeno procesado Sobre todo protenas, pero tambin algunos lpidos y glucolpidos presentados en molculas parecidas a MHC Pptidos lineales internos producidos por el procesamiento de antgeno y unidos a molculas MHC

Interaccin con antgeno Unin de antgeno soluble Participacin de molculas MHC Naturaleza qumica de los antgenos Propiedades del eptopo

Los eptopos de clula B pueden estar constituidos por residuos secuenciales contiguos a lo largo de la cadena peptdica o residuos no secuenciales de segmentos de la cadena que se acercan entre s a causa de la conformacin plegada de un antgeno. La mayora de los anticuerpos inducidos por protenas globulares se une a la protena slo cuando se encuentra en su conformacin natural. Debido a que la desnaturalizacin de estos antgenos suele modificar la estructura de sus eptopos, los anticuerpos contra la protena natural no se unen a la protena desnaturalizada.

En una serie de experimentos con mioglobina de cachalote se identificaron cinco eptopos secuenciales distintos, cada uno de los cuales contena seis a ocho aminocidos contiguos. Cada uno de estos eptopos se halla en la superficie de la molcula en pliegues entre las regiones de las hlices (fig. 4-3a). La mioglobina de cachalote tambin posee varios eptopos no secuenciales, o determinantes antignicos conformacionales. Los residuos que constituyen estos eptopos estn muy separados en la secuencia primaria de aminocidos, pero muy cercanos entre s en la estructura terciaria de la molcula. Tales eptopos slo

FIGURA 4-3 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS

a) (145) 146151 COOH Hem b)

5662

1521 (22) NH2 113119

Los antgenos protenicos suelen contener eptopos de clula B secuenciales y no secuenciales. a) Diagrama de la mioglobina de cachalote que muestra las localizaciones de los cinco eptopos de clula B secuenciales (azul). b) Diagrama de listn de la lisozima de la clara de huevo de gallina que ilustra los residuos que componen un eptopo no secuencial (conformacional). Los residuos que entran en contacto con cadenas ligeras o pesadas

(o ambas) de anticuerpos se muestran en rojo, azul, y blanco, respectivamente. Estos residuos estn espaciados con amplitud en la secuencia de aminocidos, pero se aproximan entre s por el plegamiento de la protena. [Parte a adaptada de M. Z. Atassi y A. L.
Kazim, 1978, Advances in Experimental Medicine and Biology 98:9; parte b tomada de W. G. Laver et al., 1999, Cell 61:554.]

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

83

a) Lisozima de clara de huevo de gallina Enlace disulfuro

b) Pptidos de asa sintticos 80

CYS

80 COOH H2N
CYS

CYS

H2N COOH

64

CYS

64 Asa abierta 64 80

Asa cerrada

c) Inhibicin de la reaccin entre el asa de HEL y el antisuero antiasa 100

FIGURA 4-4 Demostracin experimental del hecho de que la unin de anticuerpo a determinantes conformacionales en la lisozima de la clara de huevo de gallina (HEL) depende de la conservacin de la estructura terciaria de los eptopos por enlaces disulfuro intracadena. a) Diagrama de la estructura primaria de la HEL, donde los crculos representan aminocidos. El asa (crculos azules) formada por los enlaces disulfuro entre los residuos cistena en las posiciones 64 y 80 constituye uno de los determinantes conformacionales de la lisozima de la clara de huevo de gallina. b) Pptidos sintticos de las asas abierta y cerrada que corresponden al eptopo en asa de la lisozima de la clara de huevo de gallina. c) Inhibicin de la unin entre el eptopo en asa de HEL y el antisuero antiasa. Este ltimo se incub primero con la secuencia del asa natural, el pptido sinttico de asa cerrada o el pptido sinttico de asa abierta; a continuacin, se midi la capacidad del antisuero de unir la secuencia del asa natural. La ausencia de cualquier inhibicin por el pptido de asa abierta indica que no se une al antisuero antiasa.
[Adaptada de D. Benjamin et al., 1984, Annual Review of Immunology 2:67.]

80

Inhibicin, %

60

40 Asa natural Asa sinttica cerrada Asa sinttica abierta

20

0 8 16 Razn entre el inhibidor de asa y el antisuero antiasa

estn presentes cuando la protena se encuentra en su conformacin nativa. En la figura 4-3b se muestra un eptopo no secuencial bien caracterizado en la lisozima de la clara de huevo de gallina (HEL, del ingls hen egg-white lysozyme). Aunque los residuos que componen este eptopo de HEL estn separados en la secuencia primaria de aminocidos, se acercan entre s debido al plegamiento terciario de la protena. Por lo general, los eptopos secuenciales y no secuenciales actan de manera distinta cuando se desnaturaliza, fragmenta o reduce una protena. Por ejemplo, la fragmentacin apropiada de la mioglobina de cachalote puede dar lugar a cinco fragmentos, que conservan cada uno un eptopo secuencial, como se demostr al observar que el anticuerpo puede unirse a cada fragmento. Por otra parte, la fragmentacin de una protena o la reduccin de sus enlaces disulfuro suele destruir los eptopos no secuenciales. Por ejemplo, la HEL tiene cuatro enlaces disulfuro intracadena, lo que establece la configuracin final de la protena (fig. 4-4a). Muchos anticuerpos contra HEL reconocen varios eptopos y un anticuerpo preciso identifica cada uno de los ocho diferentes eptopos; cada uno de los ocho eptopos distintos se ha identificado por medio de un anticuerpo distinto. La mayora de estos eptopos son determinantes conformacionales que dependen de la estructura total de la protena. Si los enlaces

disulfuro intracadena de la HEL se reducen con mercaptoetanol, se pierden los eptopos no secuenciales; por ello, el anticuerpo contra HEL natural no se une a la HEL reducida. El experimento de inhibicin que se muestra en las figuras 4-4b y c ilustra muy bien este punto. Un anticuerpo contra un determinante conformacional, en este caso un asa peptdica que se encuentra en la HEL natural, pudo unirse al eptopo slo si estaba intacto el enlace disulfuro que conserva la estructura del asa. La informacin sobre los requerimientos estructurales del sitio de combinacin de anticuerpo se obtuvo al examinar la capacidad de molculas estructuralmente parecidas al antgeno natural de unirse a ese anticuerpo. Si la molcula estructuralmente similar tiene los eptopos esenciales que se encuentran en el antgeno natural, se unir al sitio de combinacin del anticuerpo y en consecuencia impedir su ocupacin por el antgeno natural. En esta prueba de inhibicin, la capacidad del asa cerrada (fig. 4-4b, derecha) de inhibir la unin mostr que dicha asa es lo suficientemente similar a la HEL para que el anticuerpo anti-HEL natural la reconociera. Incluso si el asa abierta (fig. 4-4b, izquierda) tuviera la misma secuencia de aminocidos que el asa cerrada, carece de los eptopos que el anticuerpo reconoce y por tanto es incapaz de bloquear la unin de la HEL (fig. 4-4c).

84

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

Los eptopos de clula B tienden a localizarse en regiones flexibles de un inmungeno y a menudo muestran movilidad de sitio. John A. Tainer y colaboradores analizaron los eptopos de varios antgenos protenicos (miohemeriterina, insulina, citocromo c, mioglobina y hemoglobina) comparando las posiciones de los eptopos de clula B conocidos con la movilidad de los mismos residuos. Su anlisis revel que los principales determinantes antignicos en estas protenas por lo general se localizaban en las regiones ms mviles. Estos investigadores propusieron que la movilidad de sitio de los eptopos maximiza la complementariedad con el sitio de unin de anticuerpo; al parecer los eptopos ms rgidos se unen con menor eficacia. Sin embargo, en virtud de la prdida de entropa originada por la unin a un sitio flexible, la unin de anticuerpo a un eptopo flexible suele ser de afinidad ms baja que la unin de anticuerpo a un eptopo rgido. Las protenas complejas contienen mltiples eptopos de clula B superpuestos, algunos de los cuales son inmunodominantes. Durante muchos aos, un dogma de la inmunologa sealaba que cada protena globular tena un nmero pequeo de eptopos, limitado cada uno a una regin muy accesible y determinado por la conformacin total de la protena. Sin embargo, en fecha ms reciente se demostr que la mayor parte de la superficie de una protena globular tiene potencial antignico. Esto se demostr al comparar los perfiles de unin de antgeno de diferentes anticuerpos monoclonales a diversas protenas globulares. Por ejemplo, cuando se compararon 64 diferentes anticuerpos monoclonales contra BSA por su capacidad de unirse a un grupo de 10 albminas de mamferos diferentes, surgieron 25 perfiles distintos de unin de antgeno superpuestos, lo que llev a pensar que estos 64 diferentes anticuerpos reconocieron un mnimo de 25 distintos eptopos en la albmina srica bovina (BSA). Por consiguiente, la superficie de una protena posee un gran nmero de posibles sitios antignicos. El subconjunto de sitios antignicos en una protena particular reconocida por el sistema inmunitario de un animal es mucho ms pequeo que el posible repertorio antignico y vara de una especie a otra, e incluso entre los miembros individuales de una especie dada. En un animal, ciertos eptopos de un antgeno son reconocidos como inmungenos, pero otros no. Ms an, algunos eptopos, llamados inmunodominantes, inducen una reaccin inmunitaria ms intensa que otros eptopos en un animal particular. Es muy probable que las propiedades topogrficas intrnsecas del eptopo as como los mecanismos reguladores del animal influyan en la inmunodominancia de los eptopos.

anticuerpo que les permiten realizar sus dos funciones principales: 1. Fijar antgenos extraos encontrados por el hospedador 2. Mediar funciones efectoras para neutralizar o eliminar invasores externos Desde finales del siglo XIX se sabe que los anticuerpos residen en el suero sanguneo. (A mediados del siglo XX se demostr que tambin hay anticuerpos en otras secreciones corporales: leche, lgrimas, saliva, bilis, etc.) Al centrifugar la sangre pueden separarse una fraccin lquida y otra celular. La primera es el plasma y la segunda contiene glbulos rojos, leucocitos y plaquetas. El plasma comprende todas las molculas pequeas y macromolculas solubles de la sangre, incluidas la fibrina y otras protenas necesarias para la formacin de cogulos sanguneos. Si se deja coagular la sangre o el plasma, la fase lquida que permanece se denomina suero. La primera prueba de que los anticuerpos estn contenidos en fracciones protenicas sricas particulares se obtuvo de un clsico experimento que llevaron a cabo Arne Tiselius y Elvin A. Kabat en 1939. Estos cientficos inmunizaron conejos con la protena ovalbmina (la albmina de la clara de huevo) y a continuacin dividieron el suero de los conejos inmunizados en dos alcuotas. La electroforesis de una alcuota identific cuatro picos, correspondientes a la albmina y las globulinas , y . Antes de la electroforesis, la otra alcuota srica se mezcl con el antgeno inmunizante (ovalbmina), para permitir la formacin de un inmunoprecipitado (complejo de antgeno y anticuerpo) el cual se extrajo para dejar slo las

+ Albmina Globulinas Absorbancia

Distancia de migracin

Estructura bsica y funcin de los anticuerpos

El reconocimiento de un inmungeno por los anticuerpos de superficie de la clula B inicia la proliferacin y diferenciacin en linfocitos B de memoria y clulas plasmticas (cap. 11). Las clulas plasmticas secretan molculas de anticuerpo solubles con idntica especificidad de antgeno a la del receptor de superficie de la clula B original. En las siguientes secciones se describen las caractersticas estructurales de las molculas de

FIGURA 4-5 Demostracin experimental que indica que la

mayor parte de los anticuerpos se encuentra en la fraccin gammaglobulina de las protenas sricas. Despus de inmunizar conejos con ovalbmina (OVA), se reuni su antisuero y se someti a electroforesis, que separ las protenas sricas segn su carga elctrica y masa. La lnea azul muestra el patrn electrofortico del antisuero no tratado. La lnea negra seala el patrn de antisuero que se incub con OVA para eliminar el antisuero anti-OVA y a continuacin se someti a electroforesis. [Adaptada de A. Tiselius y E. A.
Kabat, 1939, Journal of Experimental Medicine 69:119, con autorizacin del titular del copyright, Rockefeller University Press.]

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

85

protenas sricas restantes, que no reaccionaron con el antgeno. Una comparacin de los perfiles electroforticos de estas dos alcuotas sricas revel un decremento considerable del pico de la globulina (gammaglobulina) en la alcuota que reaccion con antgeno (fig. 4-5). De esta manera, se identific que la fraccin globulnica contena los anticuerpos sricos, a los que se denomin inmunoglobulinas, con objeto de diferenciarlos de cualquier otra protena que pudiera incluirse en la fraccin de la globulina . Los primeros experimentos de Kabat y Tiselius reunieron las protenas sricas en tres picos mayores que no eran de albmina: , y . Hoy en da se sabe que si bien la inmunoglobulina G (IgG), la principal clase de molculas de anticuerpo, en efecto se encuentra en su mayor parte en la fraccin globulina , existen cantidades significativas de ella y otras clases importantes de molculas de anticuerpo en las fracciones y del suero.

NH N
+ H3

+ 3

NH
S VH
H

3+

NH

Bisagra
1 CH
H1

3+

S
S

VL S CL

V
C
L

CH2

21

Cadena pesada , , , o CHO

CO

S S S S S S S S

CO

S S S S CH2

O
Actividad efectora

CHO C H3

Cadena ligera o

446

COO

COO

Los anticuerpos son heterodmeros

Las molculas de anticuerpo tienen una estructura comn de cuatro cadenas peptdicas (fig. 4-6). Esta estructura se integra con dos cadenas ligeras (L) (del ingls light) idnticas, consistentes en polipptidos de unos 22 000 Da, y dos cadenas pesadas (H) (del ingls heavy), polipptidos ms grandes de unos 55 000 Da o ms. Cada cadena ligera est unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro y por interacciones no covalentes, como puentes salinos, enlaces de hidrgeno e interacciones hidrfobas, para formar un heterodmero (H-L). Las dos combinaciones idnticas de cadena pesada y ligera (H-L) estn unidas entre s por interacciones no covalentes similares y por puentes disulfuro para formar la estructura de anticuerpo bsica de cuatro cadenas (H-L)2, un dmero de dmeros. Como se ver ms adelante, el nmero exacto y las posiciones precisas de estos enlaces disulfuro intercadenas difieren entre las clases y subclases de anticuerpo. Aproximadamente los 110 primeros aminocidos de la regin amino terminal de una cadena ligera o pesada varan mucho entre anticuerpos de distinta especificidad. Estos segmentos de secuencia muy variable se conocen como regiones V: VL en las cadenas ligeras y VH en las pesadas. Todas las diferencias de especificidad que poseen los distintos anticuerpos pueden seguirse hasta variaciones en las secuencias de aminocidos de las regiones V. De hecho, la mayor parte de las diferencias entre los anticuerpos se encuentra dentro de reas de las regiones V llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR); estas CDR, tanto en la cadena ligera como en la pesada, son las que constituyen los sitios de unin de antgeno en la molcula de anticuerpo. En contraste, dentro de cada clase especfica de anticuerpo se observan mucho menos diferencias cuando se comparan secuencias a lo largo del resto de la molcula. Las regiones de secuencia relativamente constante ms all de las regiones variables se han designado regiones C: CL en la cadena ligera y CH en la pesada. Los anticuerpos son glucoprotenas; con pocas excepciones, los sitios de fijacin de carbohidratos estn restringidos a la regin constante. No se comprende por completo el papel de la glucosilacin de anticuerpos, pero es probable que incremente la solubilidad de las molculas. La glucosilacin inapropiada, o la falta

FIGURA 4-6 Diagrama esquemtico de la estructura de las inmunoglobulinas deducida por anlisis de las secuencias de aminocidos. Cada cadena pesada y ligera en una molcula de inmunoglobulina contiene una regin variable (V) amino terminal (color agua y pardo, respectivamente), que incluye 100 a 110 aminocidos, y diere de un anticuerpo al siguiente. El resto de cada cadena en la molcula las regiones constantes (C) (colores prpura y rojo) muestra una variacin limitada que dene los dos subtipos de cadena ligera y las cinco subclases de cadena pesada. Algunas cadenas pesadas ( , y ) contienen asimismo una regin de bisagra rica en prolina (negro). Las porciones amino terminales, que corresponden a las regiones V, se unen a antgeno; los otros dominios median las funciones efectoras. Las cadenas pesadas y , que carecen de una regin de bisagra, contienen un dominio adicional en la parte media de la molcula. CHO indica un grupo carbohidrato unido a la cadena pesada.

de ella, afecta la rapidez con que se eliminan anticuerpos del suero y disminuye la eficiencia de la interaccin entre el anticuerpo y otras protenas.

Mtodos qumicos y enzimticos revelaron la estructura bsica del anticuerpo

El conocimiento de la estructura bsica del anticuerpo deriv de una diversidad de observaciones experimentales. Cuando la fraccin globulnica del suero se separa en fracciones de peso molecular alto y bajo, los anticuerpos de alrededor de 150 000 Da, que se designan en conjunto como inmunoglobulina G (IgG), se encuentran en la fraccin de peso molecular bajo. En un experimento fundamental, la digestin breve de IgG con la enzima papana produjo tres fragmentos, dos de los cuales eran idnticos y un tercero muy diferente (fig. 4-7). Los dos fragmentos idnticos (cada uno de 45 000 Da) tenan actividad de unin de antgeno y se denominaron fragmentos Fab (del ingls fragment antigen binding, fragmento de unin de antgeno). El otro fragmento (50 000 Da) careca por completo de actividad de unin de antgeno. Debido a que se observ que se cristalizaba durante el almacenamiento en fro, se llam fragmento Fc

S
Unin de antgeno

CH3

86

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

Enlaces disulfuro

Cadena L

SS

SS SS

SS

F(ab')2 Cadena H Digestin con pepsina

SS

+ Fragmentos Fc

SS SS

SS

Digestin con papana Fab Fab

Reduccin con mercaptoetanol + + + SH SH Cadenas L SH + SH

SS

SS

HS

HS SH SH

SS SS

Fc Cadenas H

FIGURA 4-7 Estructura prototpica de la IgG que muestra la conguracin de la cadena y los enlaces disulfuro intercadena. Se indican los fragmentos que se producen mediante digestin enzimtica con pepsina o papana o por escisin de los enlaces disulfuro con mercaptoetanol. Las cadenas ligeras (L) se indican en gris y las pesadas (H) en azul.

(del ingls fragment crystallizable, fragmento cristalizable). La digestin con pepsina, una enzima proteoltica diferente, tambin demostr que las propiedades de unin de antgeno de un anticuerpo pueden separarse del resto de la molcula. La digestin con pepsina gener un fragmento nico de 100 000 Da, compuesto por dos subunidades parecidas al Fab, al que se denomin fragmento F(ab')2, que une antgeno. El fragmento Fc no se recuper de la digestin con pepsina porque se escindi en mltiples pptidos pequeos. Un fenmeno fundamental para inferir la estructura multicatenaria de la IgG se observ al someter la molcula a reduccin con mercaptoetanol y alquilacin, un tratamiento qumico que rompe de manera irreversible enlaces disulfuro pero no enlaces peptdicos. Si despus del tratamiento la muestra se somete a cromatografa en una columna que separa molculas por tamao, es evidente que la molcula de IgG intacta de 150 000 Da est compuesta, de hecho, por subunidades. Cada molcula de IgG contiene dos cadenas polipeptdicas ms grandes de unos 50 000 Da, que se designan cadenas pesadas (H), y dos cadenas ms pequeas, de unos 22 000 Da, que se denominan cadenas ligeras (L) (fig. 4-7). Los anticuerpos en s se utilizaron para determinar cmo se relacionaban los productos de la digestin enzimtica Fab, F(ab )2 y Fc con los de la reduccin de las cadenas pesada y ligera. Esta duda se resolvi al emplear antisuero de cabras inmunizadas con cualesquiera de los fragmentos Fab o Fc de

IgG de conejo. El anticuerpo contra el fragmento Fab reaccion con las cadenas H y L, en tanto que el anticuerpo anti-Fc slo lo hizo con la cadena H. Estas observaciones llevaron a concluir que el fragmento Fab consiste en una porcin de una cadena pesada ms una cadena ligera intacta, y que el Fc slo contiene componentes de cadena pesada. Con base en estos resultados y los mencionados con anterioridad, se dedujo la estructura de la IgG que se muestra en la figura 4-6. Segn este modelo, la molcula de IgG se integra con dos cadenas H y dos L idnticas enlazadas por puentes disulfuro. Era de esperar que el paso siguiente en la obtencin de una imagen de la estructura de los anticuerpos fuera determinar su secuencia de aminocidos, pero entonces surgi otro problema. La poblacin de anticuerpos en la fraccin de gammaglobulina srica consta de un espectro heterogneo de anticuerpos: muchos anticuerpos distintos, cada uno presente en pequeas cantidades. Incluso si la inmunizacin se realiza con un conjugado hapteno-portador, la poblacin de anticuerpos creados contra el hapteno es heterognea, porque mltiples anticuerpos reconocen diferentes eptopos del hapteno. Sin embargo, para el anlisis de la secuencia de aminocidos se requiere una muestra pura de la molcula en estudio. Este obstculo para el anlisis de la secuencia fue superado mediante el uso de inmunoglobulinas de pacientes con mieloma mltiple, un cncer de clulas plasmticas productoras de anticuerpos. Las clulas plasmticas de una persona normal son clulas en etapa final que secretan una especie molecular de anticuerpo nica por un perodo limitado y a continuacin mueren. En contraste, una clona de clulas plasmticas en una persona con mieloma mltiple escapa a los controles normales de su lapso de vida y proliferacin y no constituye una clula en etapa final; por el contrario, las clulas se dividen una y otra vez sin regulacin y no requieren ninguna activacin por antgeno que las induzca a proliferar. Aunque esta clula plasmtica cancerosa, llamada clula de mieloma, se ha transformado, no lo hacen su maquinaria de sntesis de protenas ni sus funciones secretorias; por consiguiente, la clula secreta an anticuerpo homogneo desde el punto de vista molecular. Este anticuerpo no se diferencia de las molculas normales de anticuerpo, aunque se denomina protena de mieloma para indicar su origen. En un sujeto afectado con mieloma mltiple, la protena de mieloma puede constituir 95% de las inmunoglobulinas sricas. En muchos enfermos, las clulas de mieloma secretan asimismo cantidades excesivas de cadenas ligeras. La profusin de estas ltimas se descubri por primera vez en la orina de pacientes con mieloma y se les llam protenas de Bence-Jones, en honor de quienes las descubrieron. El mieloma mltiple afecta tambin a otros animales. En ratones puede surgir de manera espontnea, al igual que en el ser humano; tambin es posible crear condiciones que favorecen la induccin de un mieloma al inyectar aceite mineral en la cavidad peritoneal. Las clonas de clulas plasmticas malignas que se desarrollan se conocen como plasmacitomas y muchas de ellas se designan MOPC, trmino que alude a la induccin de clulas de plasmacitoma con aceite mineral (mineral-oil induction of plasmacytoma cells). En la actualidad, la American Type-Culture Collection conserva un gran nmero de lneas de MOPC de ratn que secretan diferentes clases de inmunoglobulinas, como un almacn de lneas celulares sin costo

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

87

que se utilizan con regularidad en la investigacin. En el mtodo para producir anticuerpos monoclonales de una especificidad deseada, cuyos pioneros fueron Georges Khler y Cesar Milstein (vase ms adelante), se hace uso de las lneas de plasmacitoma. Esta tecnologa de hibridoma permite la produccin de anticuerpos homogneos para estudios estructurales y funcionales y para una variedad de aplicaciones clnicas.

CUADRO 4-3
Cadena pesada

Cadenas de las cinco clases de inmunoglobulina humana

Subclases 1, 2, 3, 4 Ninguna Cadena ligera o o Frmula molecular
22 22

Clase* IgG IgM

La determinacin de las secuencias de la cadena ligera revel regiones constantes y variables

Cuando se compararon las secuencias de aminocidos de varias protenas de Bence-Jones (cadenas ligeras) de diferentes individuos surgi un patrn notable. Se encontr que la mitad amino terminal de la cadena, que inclua 100 a 110 aminocidos, variaba entre diferentes protenas de Bence-Jones. Esta rea se denomin regin variable (V). La mitad carboxilo terminal de la molcula, llamada regin constante (C), tena dos secuencias de aminocidos bsicas. Esto llev a reconocer que haba dos tipos de cadena ligera, y . En el ser humano, 60% de las cadenas ligeras son y 40% son , en tanto que en el ratn, 95% de las cadenas ligeras son y slo 5% son . Una molcula de anticuerpo normal slo contiene un tipo de cadena ligera, sea o , nunca ambas. Las secuencias de aminocidos de las regiones constantes de las cadenas ligeras muestran diferencias menores que se utilizan para clasificarlas en subtipos. En ratones y en el ser humano existen cuatro subtipos ( 1, 2, 3 y 4). Sustituciones de aminocidos slo en unas cuantas posiciones son la causa de las diferencias de subtipo.

( 2 2)n ( 2 2)n n=1o5 ( 2 2)n ( 2 2)n n = 1, 2, 3 o 4

2 2 2 2

IgA

1, 2

IgE IgD

Ninguna Ninguna

o o

2 2 2 2

*Vanse en la gura 4-1 las estructuras generales de las cinco clases de anticuerpos.

Diferencias menores en las secuencias de aminocidos de las cadenas pesadas y condujeron a una clasificacin adicional de las cadenas pesadas en subisotipos que establecieron la subclase de molculas de anticuerpo que constituyen. En el ser humano hay dos subisotipos de cadenas pesadas 1 y 2 (y por consiguiente dos subclases, IgA1 e IgA2) y cuatro subisotipos de cadenas pesadas : 1, 2, 3 y 4 (y en consecuencia cuatro subclases, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). En ratones existen cuatro subisotipos, 1, 2a, 2b y 3 y las subclases correspondientes.

Existen cinco clases principales de cadenas pesadas

En los estudios de secuenciacin de la cadena pesada se redujeron las protenas de mieloma con mercaptoetanol y se alquilaron y separaron las cadenas pesadas mediante filtracin en gel en un solvente desnaturalizador. Cuando se compararon las secuencias de aminocidos de varias cadenas pesadas de protenas de mieloma surgi un patrn similar al de las cadenas ligeras. La porcin amino terminal de la cadena, que posea 100 a 110 aminocidos, mostr una gran variacin de secuencia entre las cadenas pesadas del mieloma y, por consiguiente, se denomin regin variable (V). La parte restante de la protena evidenci cinco patrones de secuencia bsicos, que correspondieron a cinco diferentes regiones constantes (C) de cadena pesada ( , , , y ). Cada una de estas cinco distintas cadenas pesadas se conoce como isotipo. La longitud de las regiones constantes es de unos 330 aminocidos para , y y de 440 aminocidos para y . Las cadenas pesadas de una molcula de anticuerpo particular determinan la clase de ese anticuerpo: IgM ( ), IgG ( ), IgA ( ), IgD ( ) o IgE ( ). Las cadenas H de cada clase pueden parearse con cadenas ligeras o . Una molcula individual de anticuerpo posee dos cadenas pesadas idnticas y dos ligeras idnticas entre s, H2L2, o un mltiplo (H2L2)n de esta estructura bsica de cuatro cadenas (cuadro 4-3).

Las inmunoglobulinas poseen mltiples dominios con base en el plegamiento de la inmunoglobulina

La estructura global de la molcula de inmunoglobulina la determinan las organizaciones primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de la protena. La estructura primaria, la secuencia de aminocidos, da lugar a las regiones variable y constante de las cadenas pesada y ligera. La estructura secundaria consta del pliegue de la cadena polipeptdica extendida sobre s misma en una serie de lminas plegadas antiparalelas (fig. 4-8). Despus, las cadenas se pliegan en una estructura terciaria de dominios globulares compactos, que estn unidos a dominios contiguos por continuaciones de la cadena polipeptdica entre regiones de lmina plegada . Por ltimo, los dominios globulares de cadenas polipeptdicas pesadas y ligeras adyacentes interactan en la estructura cuaternaria (fig. 4-9) y forman dominios funcionales que permiten que la molcula fije de manera especfica antgeno y, al mismo tiempo, lleve a cabo varias funciones biolgicas efectoras. El anlisis cuidadoso de las secuencias de aminocidos de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina demostr que ambas cadenas contienen varias unidades homlogas de unos 110 residuos aminocidos. Dentro de cada unidad, denominada dominio, un enlace disulfuro intracadena forma un asa de unos 60 aminocidos. Las cadenas ligeras contienen un dominio va-

88

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T R C C O N C R R O C C O C R N H C N C O C R H O C N H C C O N C R R O C N H C N C O C R H O C N H R C C O N C R R O C N H C N C O C R H O C N H R C C O N H O C N C H R R O C N H C R C

H C N

FIGURA 4-8 Frmula estructural de una hoja plegada

que contiene dos hileras antiparalelas. La estructura est unida entre s por puentes de hidrgeno entre enlaces peptdicos de extensiones contiguas de cadenas polipeptdicas. Los grupos laterales de

aminocidos (R) estn dispuestos de modo perpendicular al plano del papel. [Adaptada de H. Lodish et al., 1995, Molecular Cell Biology, 4th
ed., Scientic American Books, New York; reimpreso con autorizacin de W. H. Freeman and Company.]

a) Sitio de unin de antgeno

Dominio VH

Dominio CL

Dominio VH CH1

Sitio de unin de antgeno Dominio VL CH2 Dominio VL Cadena de carbohidratos

Cadenas pesadas

CH3

FIGURA 4-9 Dos representaciones de una molcula de anticuerpo intacta. Las interacciones entre dominios en las cadenas separadas de la molcula de inmunoglobulina son decisivas para su estructura cuaternaria. a) Modelo de molcula de IgG, basado en anlisis cristalogrco con rayos X, que muestra relaciones entre dominios de las cadenas separadas de una molcula de inmunoglobulina. Dichas relaciones son crticas para la estructura cuaternaria de la molcula. Cada esfera slida representa un residuo (aminocido); las esferas de color pardo ms grandes son carbohidratos. Obsrvese que los dominios CH2 sobresalen por la presencia de carbohidrato en el interior. La saliente torna a este dominio ms accesible para otras molculas, por ejemplo ciertos componentes del complemento. Se muestran las dos cadenas ligeras en tonos rojos y las dos pesadas en tonos azules. b) Diagrama esquemtico que muestra los dominios de interaccin de las cadenas pesada y ligera. [Parte a de
E. W. Silverton et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 74:5140.]

b) VH VL CL S S C2 C2 Carbohidrato C3 C1 VH VL

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

89

a) , ,
22

b) ,
V
H

S
H1

S
C

Unin de antgeno

88 4 13 144

S S

4 19 200

S
2 14

S
S S S S
261

S
L

Bisagra

S S

Actividad biolgica

S S

FIGURA 4-10 a) Las cadenas pesadas y ligeras estn plegadas en dominios y cada una contiene alrededor de 110 aminocidos y un enlace disulfuro intracadena que forma un asa de 60 aminocidos. Los dominios amino terminal, que corresponden a

riable (VL) y uno constante (CL); las cadenas pesadas tienen un dominio variable (VH) y tres o cuatro constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4), segn la clase de anticuerpo (fig. 4-10). El anlisis cristalogrfico con rayos X revel que los dominios de la inmunoglobulina estn plegados en una estructura compacta caracterstica llamada pliegue de la inmunoglobulina. Esta estructura consiste en un sndwich de dos lminas plegadas, cada una con cadenas (hileras) antiparalelas de aminocidos, que estn conectadas por asas de diversas longitudes (fig. 4-11). Las hileras dentro de una lmina son estabilizadas por enlaces de hidrgeno que conectan los grupos amino (NH) de una hilera con los grupos carbonilo de una hilera adyacente (fig. 4-8). Las hileras se caracterizan por aminocidos hidrfobos e hidrfilos alternados, cuyas cadenas laterales estn dispuestas de forma perpendicular al plano de la lmina; los aminocidos hidrfobos estn orientados hacia el interior del sndwich y los aminocidos hidrfilos hacia fuera. Las dos lminas dentro de un pliegue de inmunoglobulina son estabilizados por las interacciones hidrfobas entre ellas y por un enlace disulfuro conservado. Aunque los dominios variable y constante tienen estructura similar, existen diferencias sutiles entre ellos. El dominio V es apenas ms largo que el C y contiene un par adicional de hileras dentro de la estructura de la lmina , as como la secuencia en asa adicional que conecta este par de hileras (fig. 4-11). La estructura bsica del pliegue de inmunoglobulina contribuye a la estructura cuaternaria de las inmunoglobulinas al facilitar interacciones no covalentes entre dominios a travs de las caras de las lminas (fig. 4-8). Las interacciones forman enlaces entre dominios idnticos (p. ej., CH2/CH2, CH3/CH3 y CH4/CH4) y entre dominios no idnticos (como VH/VL y CH1/ CL). La estructura del pliegue de inmunoglobulina hace posible asimismo longitudes y secuencias variables de aminocidos que forman las asas que conectan las hileras . Como se explica en

S S

S S

CHO

Ausencia de regin de bisagra Dominio adicional

CH2 CH3 C H4

S S S S

CH2 CHO

321 367

CH3

425 446

las regiones V, se unen a antgeno; los otros dominios median las funciones efectoras. b) Las cadenas pesadas y contienen un dominio adicional que reemplaza la regin de bisagra.

la seccin siguiente, algunas de las secuencias en asa de los dominios VH y VL contienen aminocidos variables y constituyen el sitio de unin a antgeno de la molcula.

Sitio de unin de anticuerpos

Las molculas de anticuerpo tienen dos funciones, unin a antgeno y mediacin de funciones efectoras. La unin a antgeno es realizada por las porciones amino terminal, y las funciones efectoras por las regiones carboxilo terminales. Las caractersticas estructurales relacionadas con estas funciones se consideran en secciones posteriores. Comparaciones detalladas de las secuencias de aminocidos de un gran nmero de dominios VL y VH revelaron que la variacin de la secuencia se concentra en unas cuantas regiones discretas de esos dominios. El patrn de esta variacin se resume mejor mediante una grfica cuantitativa de la variabilidad en cada posicin de la cadena polipeptdica. La variabilidad se define como Nmero de diferentes aminocidos en una posicin determinada Variabilidad = Frecuencia del aminocido ms comn en una posicin determinada Por consiguiente, si una comparacin de las secuencias de 100 cadenas pesadas mostr que una serina se encontraba en la posicin 7 en 51 de las secuencias (frecuencia de 0.51), se sera el aminocido ms comn. Si el examen de las otras 49 secuencias demuestra que la posicin 7 estaba ocupada por glutamina, histidina, prolina o triptfano, la variabilidad en esa posicin sera de 9.8 (5/0.51). Las grficas de variabilidad de los dominios VL y

90

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

a)

Dominio C L Hileras

Dominio VL Asas

COOH

Enlace disulfuro b) Disposicin de la hilera

NH2

CDR

COOH

COOH

NH2

NH2 CDR

FIGURA 4-11 a) Diagrama de una cadena ligera de inmunoglobulina que muestra la estructura del pliegue de inmunoglobulina de sus dominios variable y constante. Las dos lminas plegadas en cada dominio se conservan juntas por interacciones hidrfobas y el enlace disulfuro se mantiene. Las hileras que componen cada lmina se muestran en colores diferentes. Las secuencias de aminocidos en las tres asas de cada dominio variable muestran una considerable diferencia; estas regiones hipervariables (azul) constituyen el sitio de unin de antgeno. Las regiones hiperVH de anticuerpos humanos revelan que la variacin mxima se observa en las porciones de la secuencia que corresponden a las asas que unen las hileras (fig. 4-12). Estas reas se denominaron de manera inicial regiones hipervariables en reconocimiento a su gran variabilidad. Las regiones hipervariables forman el sitio de unin a antgeno de la molcula de anticuerpo. Debido a que el sitio de unin a antgeno es complementario a la estructura del eptopo, estas reas se llaman en la actualidad regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las CDR de tres cadenas pesadas y tres ligeras se hallan en las asas que conectan las hileras de los dominios VH y VL. El resto de los dominios VH y VL muestran bastante menos variacin; estos tramos se conocen como regiones armazn (FR, del ingls framework regions). La amplia gama de especificidades que poseen los anticuerpos se debe a variaciones de la longitud y secuencia de aminocidos de las seis CDR en cada fragmento Fab. La regin armazn acta

variables suelen denominarse CDR (regiones determinantes de complementariedad). Los dominios de cadena pesada tienen la misma estructura caracterstica. b) Las lminas plegadas se abrieron para mostrar la relacin de las hileras individuales y las asas de unin. Obsrvese que el dominio variable contiene dos hileras ms que el dominio constante. [Parte a adaptada de M. Schiffer et al., 1973, Biochemistry 12:4620; reimpreso con autorizacin; parte b adaptada de A. F. Williams y A. N. Barclay, 1988, Annual Review of Immunology 6:381.]

como un esqueleto que confiere soporte a estas seis asas. Las estructuras tridimensionales de las regiones armazn de casi todos los anticuerpos analizados hasta la fecha pueden superponerse entre s; en contraste, las asas hipervariables (es decir, las CDR) son esencialmente exclusivas de cada anticuerpo.

Las CDR unen antgeno

El descubrimiento de que las CDR son las regiones de unin a antgeno de los anticuerpos se confirm de modo directo sometiendo complejos de antgeno y anticuerpo a cristalografa con rayos X de alta resolucin. Se ha completado el anlisis cristalogrfico de muchos fragmentos Fab de anticuerpos monoclonales en complejo con antgenos protenicos globulares grandes o con varios antgenos ms pequeos, incluidos carbohidratos, cidos nucleicos, pptidos y haptenos pequeos. Adems, se ha determinado la estructura completa de varios anticuerpos

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

91

CDR1 150

Dominio VH CDR2

Dominio VL CDR3 CDR1 150 CDR2 CDR3

120 100 Variabilidad Variabilidad 50 30 0 0 20 40 60 80 100 Nmero de posicin del residuo 120 60

25 50 75 100 Nmero de posicin del residuo

FIGURA 4-12 Variabilidad de aminocidos en los dominios VL y VH de anticuerpos humanos con diferentes especicidades. Se presentan tres regiones hipervariables (HV), tambin llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), tanto en los dominios V de cadena pesada como en los de cadena ligera. Como
monoclonales intactos. El anlisis de difraccin de rayos X de complejos de antgeno y anticuerpo demostr que varias CDR pueden entrar en contacto con el antgeno, y se han observado varios complejos en que las seis CDR estn en contacto con el antgeno. Al parecer, en las CDR de la cadena pesada ms residuos hacen contacto con antgeno que en las CDR de la cadena ligera. En otras palabras, el dominio VH a menudo contribuye ms a la unin de antgeno que el dominio VL. La funcin dominante de la cadena pesada en la unin de antgeno se demostr en un estudio en el que una cadena pesada individual especfica para un antgeno glucoprotenico del virus de la inmunodeficiencia

se muestra en la gura 4-11 (derecha), las tres regiones HV en el dominio V de cadena ligera se aproximan entre s en la estructura plegada. Lo mismo se observa en el dominio V de la cadena pesada.
[Basada en E. A. Kabat et al., 1977, Sequence of Immunoglobulin Chains, U.S. Dept. of Health, Education, and Welfare.]

humana (VIH) se combin con diversas cadenas ligeras de diferente especificidad antignica (cap. 20). Todos los anticuerpos hbridos se unieron al antgeno glucoprotenico del VIH, lo que indic que la cadena pesada sola fue suficiente para conferir especificidad. Sin embargo, no debe concluirse que la cadena ligera es en gran parte irrelevante; en algunas reacciones de anticuerpo y antgeno, la cadena ligera lleva a cabo la mayor contribucin. Las imgenes generadas por computadora de la interaccin entre un antgeno del virus de la gripe y anticuerpo revelan de manera impresionante la naturaleza de la superficie de contacto entre anticuerpo y antgeno (fig. 4-13). Los contactos entre un

a)

b)

<Pg. 91, Fig. 4-13> 1. Antgeno 2. Anticuerpo

Antgeno

Anticuerpo

FIGURA 4-13 Simulacin por computadora de una interaccin entre anticuerpo y antgeno del virus de la inuenza, una protena globular. a) Se muestra el antgeno (amarillo) en interaccin con la molcula de anticuerpo; la regin variable de la cadena pesada es roja y la regin variable de la cadena ligera es azul. b) La

complementariedad de las dos molculas se revela al separar en 8 el antgeno del anticuerpo. [Basada en datos de cristalografa con rayos X
obtenidos por P. M. Colman y W. R. Tulip. Tomado de G. J. V. H. Nossal, 1993, Scientic American 269(3):22.]

92
a)

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

HyHel-5 b)

HyHel-10

D1/3

McPC603 c)

BV04

17/9

superficiales de interaccin son bastante grandes, en el intervalo aproximado de 650 2 a ms de 900 2. Dentro de esta rea, unos 15 a 22 aminocidos del anticuerpo entran en contacto con una cantidad similar de residuos en el antgeno protenico. En la figura 4-14 se observa que antgenos protenicos globulares y pequeos antgenos peptdicos o haptenos interactan con anticuerpos de distintos modos. Tpicamente, grandes reas de los antgenos protenicos embonan en grandes reas del sitio de unin del anticuerpo (fig. 4-14a). Antgenos ms pequeos, por ejemplo peptdicos, ocupan menos espacio y pueden ajustar en bolsillos o hendiduras en el sitio de unin (fig. 4-14b). La interaccin de un pptido derivado de proteasa del VIH y un fragmento Fab de un anticuerpo antiproteasa ilustra de manera atractiva la ntima complementariedad entre anticuerpo y antgeno de menor tamao (fig. 4-14c).

La unin de antgeno puede inducir cambios conformacionales

A medida que se completaron ms anlisis cristalogrficos con rayos X de fragmentos Fab, result evidente que en algunos casos la unin de antgeno induce cambios de conformacin en el anticuerpo, el antgeno, o ambos. Un notable efecto de cambio conformacional se observa en la formacin del complejo entre el fragmento Fab y su eptopo peptdico que se ilustra en la figura 4-15. Con la unin ocurren cambios estructurales signifi-

H3 L1 H2 H1

FIGURA 4-14 Sitios de unin a anticuerpo. En general, los sitios

de unin para molculas pequeas son bolsillos profundos, mientras que para protenas grandes son supercies ms planas y onduladas. a, b) Modelos de los dominios variables de seis fragmentos Fab con sus regiones de unin de antgeno en prpura. Los tres anticuerpos de la parte superior son especcos para lisozima, una protena globular grande. Los tres anticuerpos inferiores son especcos para molculas ms pequeas o segmentos muy pequeos de macromolculas: McPC603 para fosfocolina; BV04 para un segmento pequeo de una molcula de DNA monocatenario; y 17/9 para un pptido de hemaglutinina, una protena de envoltura del virus de la inuenza. c) Acercamiento del complejo entre un pptido derivado de proteasa de VIH y un fragmento Fab de un anticuerpo antiproteasa. [a, b Tomadas de I.
A. Wilson y R. L. Staneld, 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:113; c) de J. Lescar et al., 1997, Journal of Molecular Biology 267:1207, por cortesa de G. Bentley, Institute Pasteur.]

L2

L3

antgeno protenico globular grande y el anticuerpo ocurren en una superficie ancha y ondulada, a menudo bastante plana. En el rea de contacto, protuberancias o depresiones en el antgeno parecen embonar de manera complementaria con depresiones o protuberancias en la superficie de unin del anticuerpo, formadas por CDR. En el caso del bien estudiado sistema lisozima/antilisozima, estudios cristalogrficos han mostrado que las reas

FIGURA 4-15 Cambio conformacional que ocurre al unirse el antgeno y el anticuerpo. Se ilustra el mismo complejo que en la gura 4-14c, entre un pptido derivado de la proteasa del VIH y un fragmento Fab de un anticuerpo antiproteasa, para comparar la estructura del Fab antes y despus de la unin del pptido. La lnea roja muestra la estructura del fragmento Fab antes de que se una al pptido, y la lnea azul muestra su estructura cuando se ha unido. Ocurren cambios conformacionales signicativos en las CDR del Fab al unirse el antgeno. Tales cambios son especialmente pronunciados en la CDR1 de cadena ligera (L1) y la CDR3 de cadena pesada (H3).
[Tomada de J. Lescar et al., 1997, Journal of Molecular Biology 267:1207; por cortesa de G. Bentley, Institute Pasteur.]

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

93

cativos en el Fab. La regin CDR1 de la cadena ligera se mueve hasta 1 , y la CDR3 de la cadena pesada se mueve 2.7 . Por lo tanto, adems de la variabilidad de la longitud y composicin de aminocidos de las asas de la CDR, la capacidad de estas asas de cambiar en grado significativo de conformacin durante la unin del antgeno permite que los anticuerpos adopten una forma complementaria ms eficaz con la de sus eptopos. Como se coment, los cambios conformacionales despus de la unin de antgeno no necesitan limitarse al anticuerpo. Aunque no se muestra en la figura 4-15, la conformacin del pptido proteasa unido al Fab no evidencia similitud estructural con el eptopo correspondiente en la proteasa natural del VIH. Se ha sugerido que la inhibicin de la actividad de proteasa por este anticuerpo antiproteasa de VIH es un resultado de la distorsin de la conformacin de la enzima natural.

interaccin VH/VL. Estas consideraciones tienen implicaciones de importancia para crear un repertorio diverso de anticuerpos. Como se comenta en el captulo 5, los reordenamientos aleatorios de los genes de inmunoglobulina generan secuencias VH y VL nicas para las cadenas pesada y ligera expresadas por cada linfocito B; la asociacin de las secuencias VH y VL crea entonces un sitio exclusivo de unin a antgeno. Al parecer, la presencia de los dominios CH1 y CL aumenta el nmero de interacciones VH y VL estables que son posibles, lo cual contribuye a la diversidad total de molculas de anticuerpo que puede expresar un animal.

Regin de bisagra
Las cadenas pesadas , y contienen una secuencia peptdica extendida entre los dominios CH1 y CH2 que carece de homologa con los otros dominios (fig. 4-10). Esta zona, llamada regin de bisagra, es rica en residuos de prolina y es flexible, por lo que suministra a IgG, IgD e IgA flexibilidad segmentaria. Como resultado, los dos brazos Fab pueden asumir varios ngulos entre s cuando se unen a antgeno. Esta flexibilidad de la regin de bisagra puede observarse en micrografas electrnicas de complejos de antgeno y anticuerpo. Por ejemplo, cuando una molcula que contiene dos grupos dinitrofenol (DNP) reacciona con anticuerpo anti-DNP y se captura el complejo en una parrilla teida negativamente, al microscopio electrnico se reconocen complejos grandes (p. ej., dmeros, trmeros, tetrmeros). El ngulo entre los brazos de las molculas de anticuerpo en forma de Y difiere en los distintos complejos, lo que refleja la flexibilidad de la regin de bisagra (fig. 4-16). Dos aminocidos prominentes en la regin de bisagra son prolina y cistena. El gran nmero de residuos prolina en dicha

Dominios de regin constante

Los dominios de regin constante de la inmunoglobulina intervienen en varias funciones biolgicas determinadas por la secuencia de aminocidos de cada dominio.

Dominios CH1 y CL
Los dominios CH1 y CL sirven para extender los brazos Fab de la molcula de anticuerpo, lo que facilita as la interaccin con antgeno e incrementa la rotacin mxima de los brazos Fab. Adems, estos dominios de regin constante ayudan a conservar juntos los dominios VH y VL (fig. 4-10). Los dominios CH1 y CL pueden contribuir a la diversidad de anticuerpos al permitir ms asociaciones aleatorias entre los dominios VH y VL de las que ocurriran si las asociaciones se debieran slo a la

a) NO2 Ligando de DNP O2N N 25 Anti-DNP

SS

b) NO2 N NO2

SS
SS

Ligando de DNP Regin de bisagra

SS

SS

SS

Trmero Ag-Ac

SS

FIGURA 4-16 Demostracin experimental de la exibilidad de la regin de bisagra en las molculas de anticuerpo. a) Un hapteno en el cual estn sujetos dos grupos dinitrofenilo (DNP) por un grupo espaciador de unin corto reacciona con anticuerpos anti-DNP para formar trmeros, tetrmeros y otros complejos de antgeno y anticuerpo ms grandes. Se muestra un trmero en forma esquemtica. b) En una micrografa electrnica de un prepara-

SS

SS

do de estos complejos, teido de modo negativo, se reconocen con claridad dos estructuras trimricas triangulares. La protena del anticuerpo se destaca como una estructura clara contra el fondo electrodenso oscuro. Debido a la exibilidad de la regin de bisagra, vara el ngulo entre los brazos de las molculas de anticuerpo. [Fotografa
de R. C. Valentine y N. M. Green, 1967, Journal of Molecular Biology 27:615; reimpresa con autorizacin de Academic Press Inc. (Londres) Ltd.]

94

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

regin le da una conformacin polipeptdica extendida, que la torna en particular vulnerable a la rotura por enzimas proteolticas; esta regin es la que se segmenta con papana o pepsina (fig. 4-7). Los residuos cistena forman enlaces disulfuro intercadenas que mantienen unidas las dos cadenas pesadas. El nmero de enlaces disulfuro intercadenas en la regin de bisagra vara considerablemente entre las distintas clases de anticuerpos y entre las especies. Aunque las cadenas y carecen de una regin de bisagra, poseen un dominio adicional de 110 aminocidos (CH2/CH2) que tiene caractersticas de bisagra.

Otros dominios de la regin constante

Como ya se dijo, las cadenas pesadas en IgA, IgD e IgG contienen tres dominios de regin constante y una regin de bisagra, en tanto que las cadenas pesadas en IgE e IgM incluyen cuatro dominios de regin constante y ninguna regin de bisagra. Los dominios correspondientes de los dos grupos son:
IgA, IgD, IgG CH1/CH1 Regin de bisagra CH2/CH2 CH3/CH3 IgE, IgM CH1/CH1 CH2/CH2 CH3/CH3 CH4/CH4

La longitud de la secuencia transmembranal es constante entre todos los isotipos de inmunoglobulina, mientras que las longitudes de la secuencia espaciadora extracelular y la cola citoplsmica varan. Las clulas B expresan diferentes clases de mIg en distintas etapas del desarrollo. La clula B inmadura, llamada preclula B (o, ms a menudo, clula pre-B), slo expresa mIgM; ms adelante en la maduracin, aparece mIgD y se coexpresa con IgM en la superficie de clulas B maduras antes que las active un antgeno. Una clula B de memoria puede expresar mIgG, mIgA o mIgE. Incluso cuando se expresan de forma secuencial diferentes clases en una sola clula, es idntica la especificidad antignica de todas las molculas de anticuerpo de membrana expresadas por una misma clula, de tal manera que cada molcula de anticuerpo se une al mismo eptopo. En el captulo 5 se describe el mecanismo gentico que permite que una clula B aislada exprese mltiples isotipos de inmunoglobulina, todos con la misma especificidad antignica.

Funciones efectoras mediadas por anticuerpo

Adems de fijar antgeno, los anticuerpos participan en una extensa gama de otras actividades biolgicas. Cuando se considera la funcin del anticuerpo en las defensas contra una enfermedad, es importante recordar que los anticuerpos casi nunca destruyen o eliminan patgenos con slo unirse a ellos. Para que sean eficaces contra los microorganismos, los anticuerpos no slo deben reconocer antgeno, sino tambin activar reacciones funciones efectoras que tienen como resultado la eliminacin del antgeno y la muerte del patgeno. Si bien las regiones variables del anticuerpo son los nicos agentes de unin a antgenos, la regin constante de la cadena pesada (CH) tiene a su cargo una diversidad de interacciones colaboradoras con otras protenas, clulas y tejidos, que dan por resultado las funciones efectoras de la reaccin humoral. Debido a que estas funciones efectoras son consecuencia de interacciones entre regiones constantes de cadena pesada y otras protenas sricas o receptores de membrana celular, no todas las clases de inmunoglobulinas poseen las mismas propiedades funcionales. Aqu se presenta una revisin general de cuatro funciones efectoras principales mediadas por dominios de la regin constante. Ms adelante se describe una quinta funcin nica de la IgE, la activacin de clulas cebadas, eosinfilos y basfilos.

Aunque los dominios CH2/CH2 en IgE e IgM ocupan la misma posicin en las cadenas polipeptdicas que la regin de bisagra en las otras clases de inmunoglobulina, an no se determina una funcin para este dominio adicional. Los anlisis cristalogrficos con rayos X han revelado que los dos dominios CH2 de IgA, IgD e IgG (y los dominios CH3 de IgE e IgM) estn separados por cadenas laterales de oligosacrido que impiden el contacto entre los dominios unidos entre s (fig. 4-9b); como resultado, estos dos dominios globulares son mucho ms accesibles que los otros para el ambiente acuoso. Tal accesibilidad es uno de los elementos que contribuyen a la actividad biolgica de estos dominios en la activacin de los componentes del complemento por IgG e IgM. El dominio carboxilo terminal se designa CH3/CH3 en IgA, IgD e IgG y CH4/CH4 en IgE e IgM. Las cinco clases de anticuerpo y sus subclases pueden expresarse como inmunoglobulina secretada (sIg) o inmunoglobulina unida a membrana (mIg). El dominio carboxilo terminal de la inmunoglobulina secretada difiere tanto en la estructura como en la funcin del dominio correspondiente en la inmunoglobulina unida a membrana. La inmunoglobulina secretada tiene una secuencia de aminocidos hidrfila de longitud variable en el extremo carboxilo terminal. Ms adelante se describen las funciones de este dominio en las diversas clases de anticuerpos secretados. En la inmunoglobulina unida a membrana, el dominio carboxilo terminal contiene tres regiones:

El anticuerpo promueve la opsonizacin

La opsonizacin, que es la promocin de la fagocitosis de antgenos por macrfagos y neutrfilos, es un factor importante en las defensas antibacterianas. En las superficies de macrfagos y neutrfilos, as como de otras clulas que no intervienen en la fagocitosis, se encuentran molculas protenicas llamadas receptores Fc (FcR), que pueden unir la regin constante de molculas de inmunoglobulina (Ig). La unin de receptores Fc

Una secuencia espaciadora hidrfila extracelular compuesta de 26 residuos Una secuencia transmembranal hidrfoba Una cola citoplsmica corta

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

95

del fagocito por varias molculas de anticuerpo que forman un complejo con el mismo antgeno blanco, como una clula bacteriana, produce una interaccin que fija el agente patgeno a la membrana del fagocito. Este enlace cruzado del FcR por la unin a un conjunto de regiones Fc del anticuerpo inicia una va de transduccin de seales que desemboca en la fagocitosis del complejo de antgeno y anticuerpo. Dentro del fagocito, los patgenos se constituyen en el blanco de varios procesos destructores que incluyen digestin enzimtica, dao oxidativo y efectos desorganizadores de la membrana de pptidos antibacterianos.

Los anticuerpos activan el complemento

La IgM, y en el ser humano casi todas las subclases de IgG, pueden activar un conjunto de glucoprotenas sricas llamado sistema del complemento, que incluye un grupo de protenas capaces de perforar membranas celulares. Un subproducto importante de la va de activacin del complemento es un fragmento protenico denominado C3b, que se une de manera inespecfica a complejos clula-anticuerpo y antgeno-anticuerpo cerca del sitio en que se activ el complemento. Muchos tipos celulares por ejemplo glbulos rojos y macrfagos tienen receptores para C3b y de esa manera fijan clulas o complejos a los cuales se adhiri C3b. La unin de C3b adherente por macrfagos da lugar a la fagocitosis de las clulas o complejos moleculares unidos a C3b. La unin de complejos de antgeno y anticuerpo por los receptores C3b de un glbulo rojo posibilita que el eritrocito lleve los complejos al hgado o el bazo, donde los macrfagos residentes los eliminan sin destruir el glbulo rojo. Para la desactivacin y eliminacin de antgenos y la destruccin de patgenos es importante la colaboracin entre el anticuerpo y el sistema del complemento. En el captulo 7 se describe con detalle el proceso de activacin del complemento.

portacin a la leche materna, requiere el paso de inmunoglobulinas a travs de capas epiteliales, un proceso llamado transcitosis. La capacidad de experimentar este transporte depende de propiedades de la regin constante. En el ser humano y los ratones, la IgA es la principal especie de anticuerpo que lleva a cabo dicha transcitosis, aunque tambin puede transportarse IgM a superficies mucosas. Algunas especies de mamferos, como el ser humano y el ratn, transfieren asimismo cantidades considerables de la mayor parte de las subclases de IgG de la madre al feto. Debido a que los sistemas circulatorios materno y fetal estn separados, el anticuerpo debe ser transportado a travs del tejido placentario que separa a la madre y el feto. En seres humanos, dicha transferencia ocurre durante el tercer trimestre del embarazo. La consecuencia relevante es que el feto en desarrollo recibe una muestra del repertorio de anticuerpos de la madre como una dotacin protectora contra patgenos. Al igual que las otras funciones efectoras descritas aqu, la capacidad de experimentar el transporte transplacentario depende de las propiedades de la regin constante de la molcula de anticuerpo. La transferencia de IgG de la madre al feto es una forma de inmunizacin pasiva, que es la adquisicin de inmunidad por la recepcin de anticuerpos preformados en lugar de la produccin activa de anticuerpos despus de la exposicin a antgeno. La capacidad de transferir inmunidad de una persona a otra por la transferencia de anticuerpos es la base de la teraputica con anticuerpos, un procedimiento mdico importante que se practica con amplitud (vase el enfoque clnico).

Clases de anticuerpos y actividades biolgicas

Ya se mencionaron brevemente los diversos isotipos y clases de inmunoglobulina. Cada clase se distingue por secuencias de aminocidos nicas en la regin constante de la cadena pesada que confieren propiedades estructurales y funcionales especficas de clase. En esta seccin se describen con mayor detalle la estructura y las funciones efectoras de cada clase. En el cuadro 4-4 se resumen las propiedades moleculares y las actividades biolgicas de las diferentes clases de inmunoglobulina. En la figura 4-17 se esquematizan las estructuras de las cinco clases principales.

La citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpo (ADCC) destruye otras clulas
El enlace de anticuerpo unido a clulas blanco (p. ej., clulas del hospedador infectadas por virus) con los receptores Fc de varios tipos celulares, en particular las clulas asesinas naturales (NK), puede dirigir las actividades citotxicas de la clula efectora contra la clula blanco. En este proceso, conocido como citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpo (ADCC, del ingls antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), el anticuerpo acta como un receptor recin adquirido que permite que la clula atacante reconozca y destruya la clula blanco. El fenmeno de ADCC se considera en el captulo 14.

Inmunoglobulina G (IgG)
La IgG, la clase ms abundante en el suero, constituye alrededor de 80% del total de las inmunoglobulinas sricas. La molcula de IgG consta de dos cadenas pesadas y dos ligeras o (fig. 4-17a). Existen cuatro subclases de IgG humana, que se reconocen por diferencias en la secuencia de la cadena y se numeran conforme a sus concentraciones sricas promedio decrecientes: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (cuadro 4-3). Diferentes genes CH de la lnea germinal, cuyas secuencias de DNA son 90 a 95% homlogas, codifican las secuencias de aminocidos que caracterizan a las cuatro subclases de IgG. Los rasgos estructurales que diferencian a estas subclases entre s son el tamao de la regin de bisagra y el nmero y la posicin

Algunos anticuerpos pueden cruzar capas epiteliales por transcitosis

El transporte de anticuerpo a las superficies mucosas de las vas respiratorias, digestivas y urogenitales, as como su ex-

96

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

CUADRO 4-4

Propiedades y actividades biolgicas* de las clases y subclases de las inmunoglobulinas sricas humanas
IgG1 IgG2 150 000 2 3 23 IgG3 150 000 3 1 8 IgG4 150 000 4 0.5 23 IgA1 150 000 600 000 1 3.0 6 IgA2 150 000 600 000 2 0.5 6 1.5 5 0.0003 2.5 0.03 3 IgM 900 000 IgE 190 000 IgD 150 000

Peso molecular Componente de cadena pesada Valor srico normal (mg/ml) Vida media srica in vivo (das) Activa vas del complemento clsicas Cruza la placenta Se encuentran en la membrana de clulas B maduras Se une a receptores Fc de fagocitos Transporte por mucosas Induce desgranulacin de clulas cebadas

150 000 1 9 23

*Los valores de la actividad se indican como sigue: ++ = alto; + = moderado; +/ = mnimo; = ninguno; ? = dudoso.

IgG, IgE e IgD siempre existen como monmeros; IgA puede ser monmero, dmero, trmero o tetrmero. La IgM unida a membrana es un monmero pero secretada en suero es un pentmero. IgM es el primer isotipo producido por el recin nacido y en una reaccin inmunitaria primaria.

de los enlaces disulfuro intercadenas entre las cadenas pesadas (fig. 4-18). Las sutiles diferencias de aminocidos entre las subclases de IgG afectan la actividad biolgica de la molcula:

IgG1, IgG3 e IgG4 cruzan con facilidad la placenta y tienen un papel importante en la proteccin del feto en desarrollo. IgG3 es el activador del complemento ms eficaz, seguida por IgG1; la IgG2 es menos eficiente y la IgG4 no es capaz de activar complemento en absoluto. IgG1 e IgG3 se unen con gran afinidad a receptores Fc en clulas fagocticas y, por consiguiente, median la opsonizacin. La IgG4 tiene afinidad intermedia por receptores Fc, y la IgG2 tiene afinidad en extremo baja.

Inmunoglobulina M (IgM)
La IgM representa 5 a 10% del total de la inmunoglobulina srica, con concentracin srica promedio de 1.5 mg/ml. La IgM monomrica (180 000 Da) se expresa como un anticuerpo unido a membrana en clulas B. Las clulas plasmticas secretan

IgM en la forma de un pentmero en el cual cinco unidades monmero se conservan unidas entre s por enlaces disulfuro que unen sus dominios de cadena pesada carboxilo terminal (C 4/C 4) y sus dominios C 3/C 3 (fig. 4-17e). Las cinco subunidades monomricas estn dispuestas con sus regiones Fc en el centro del pentmero y los 10 sitios de unin a antgeno en la periferia de la molcula. Cada pentmero contiene un polipptido adicional unido a Fc llamado cadena J (del ingls joining, de unin), que enlaza el disulfuro al carboxilo terminal del residuo cistena de dos de las 10 cadenas . Al parecer, la cadena J es necesaria para la polimerizacin de los monmeros a fin de formar IgM pentamrica; se aade inmediatamente antes de la secrecin del pentmero. La IgM es la primera clase de inmunoglobulina que se produce en una respuesta primaria a antgeno y tambin es la primera inmunoglobulina que sintetiza el recin nacido. Debido a su estructura pentamrica con 10 sitios de unin a antgeno, la IgM srica tiene valencia ms alta que los otros isotipos. Una molcula de IgM puede unir 10 molculas de hapteno pequeas; sin embargo, debido al impedimento estrico, slo suelen unirse de modo simultneo cinco o menos molculas de antgenos ms grandes. En virtud de su alta valencia, la IgM

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

97

a) IgG VL CL C1 Regin de bisagra C2 C3 VH

b) IgD VL CL C1 VH

c) IgE VL CL C2 C2 C3 C3 C4 C1 VH

d) IgA (dmero) VH C1 CL VL

e) IgM (pentmero) VL CL Enlace disulfuro Regin de bisagra C1 C2 C3 C4 Cadena J VH

C2 C3 Cadena J

FIGURA 4-17 Estructuras generales de las cinco clases principales de anticuerpo secretado. Se muestran cadenas ligeras en tonos rosas y los enlaces disulfuro en lneas negras gruesas. Obsrvese que las cadenas pesadas de IgG, IgA e IgD (azul, naranja y verde, respectivamente) contienen cuatro dominios y una regin de bisagra, en tanto que las cadenas pesadas de IgM e IgE (prpura y amarillo, respectivamente) incluyen cinco dominios, pero carecen de regin de bisagra. Las formas polimricas de IgM e IgA contienen

un polipptido, llamado cadena J, que est unido por dos enlaces disulfuro a la regin Fc en dos monmeros diferentes. La IgM srica siempre es un pentmero; casi toda la IgA srica existe como monmero, aunque en ocasiones se forman dmeros, trmeros e incluso tetrmeros. En estas guras no se muestran los enlaces disulfuro intracadena y los enlaces disulfuro que unen cadenas ligeras y pesadas (vase g. 4-6).

pentamrica es ms eficiente que otros isotipos para unir antgenos con muchos eptopos repetidos, como partculas vricas y glbulos rojos. Por ejemplo, cuando se incuban eritrocitos con un anticuerpo especfico, se agrupan entre s en grandes agregados en un proceso llamado aglutinacin. Se requieren 100 a 1 000 veces ms molculas de IgG que de IgM para lograr el mismo grado de aglutinacin. Se observa un fenmeno similar con partculas vricas: se necesita menos IgM que IgG para neutralizar la infectividad vrica. La IgM tambin es ms eficiente que la IgG para activar complemento. La activacin del complemento requiere dos regiones Fc en proximidad cer-

cana, y la estructura pentamrica de una molcula aislada de IgM satisface este requerimiento. En virtud de su gran tamao, la IgM no se difunde bien y por tanto se encuentra en concentraciones muy bajas en los lquidos intercelulares de los tejidos. La presencia de la cadena J permite que la IgM se una a receptores en clulas secretorias, que la transportan a travs de recubrimientos epiteliales para penetrar en las secreciones externas que baan superficies mucosas. Aunque la IgA es el isotipo mayor que se halla en estas secreciones, la IgM tiene una funcin accesoria de importancia como inmunoglobulina secretoria.

98

PA RT E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

EN F O Q U E C L N I C O

Teraputica pasiva con anticuerpo

En 1890, Emil Behring y Shibasaburo Kitasato noticaron un experimento extraordinario. Inmunizaron conejos con ttanos y a continuacin obtuvieron suero de estos animales. Luego inyectaron 0.2 ml del suero inmunitario en la cavidad abdominal de seis ratones. Despus de 24 h infectaron a los animales tratados y testigos no tratados con bacteria tetnica viva virulenta. Todos los ratones testigos murieron en el transcurso de las 48 h siguientes a la infeccin, en tanto que los tratados no slo sobrevivieron sino que no mostraron efectos de la infeccin. Este experimento sobresaliente demostr dos puntos importantes. Uno: despus de la inmunizacin aparecieron sustancias en el suero que pudieron proteger a un animal contra los patgenos. Dos: la inmunidad poda adquirirse de modo pasivo. Poda transferirse inmunidad de un animal a otro al extraer suero de un animal inmune e inyectarlo en otro no inmune. Estos experimentos y otros posteriores pasaron inadvertidos. Ambos investigadores recibieron al nal ttulos (Behring se convirti en von Behring y Kitasato en el barn Kitasato). Algunos aos despus, en 1901, se concedi a von Behring el primer premio Nobel de medicina. Estas observaciones iniciales y otras abrieron el camino para la inmunizacin pasiva en la prctica clnica. Durante las dcadas de 1930 y 1940 se utiliz la inmunoterapia pasiva, esto es, la dotacin
de resistencia a patgenos mediante la transferencia del agente de inmunidad de un donador inmunizado a un receptor no inmunizado, para prevenir o modicar el curso del sarampin y la hepatitis A. En el transcurso de los siguientes aos, la experiencia clnica y los adelantos en la tecnologa de elaboracin de inmunoglobulinas para inmunizacin pasiva determinaron que este mtodo fuera una prctica mdica estndar. La inmunizacin pasiva, basada en la transferencia de anticuerpos, se utiliza de manera amplia en el tratamiento de enfermedades de inmunodeciencia y para proteger contra la exposicin prevista a agentes infecciosos contra los cuales la persona no tiene inmunidad. La inmunoglobulina para inmunizacin pasiva se elabora a partir de fondos comunes de plasma de miles de donadores. En efecto, los receptores de estos preparados de anticuerpo reciben una muestra de los anticuerpos producidos por muchas personas a una extensa diversidad de diferentes patgenos. De hecho, un gramo de inmunoglobulina intravenosa (IGIV) contiene alrededor de 1018 molculas de anticuerpo (sobre todo IgG) y puede incorporar ms de 107 diferentes especicidades de anticuerpo. Durante el curso del tratamiento, los pacientes reciben cantidades importantes de IGIV, por lo general 200 a 400 mg por kilogramo de peso corporal. Eso signica que un paciente inmunodecien-

te que pesa 70 kg recibir 14 a 28 g de IGIV cada tres a cuatros semanas. Un producto derivado de la sangre de un nmero de donadores tan considerable conlleva el riesgo de contener patgenos, en particular virus. El riesgo es minimizado por los procesamientos que se utilizan para producir la inmunoglobulina intravenosa. La fabricacin de IGIV incluye el tratamiento con solventes, como alcohol, y el uso de detergentes muy ecaces para desactivar virus como VIH y el de la hepatitis. Adems de eliminar o desactivar agentes infecciosos, el proceso de produccin tambin debe suprimir inmunoglobulina aadida, ya que los agregados de anticuerpo pueden desencadenar la activacin masiva de la va del complemento y provocar analaxis grave, incluso letal. El anticuerpo administrado de manera pasiva ejerce su accin protectora de varias formas. Una de las ms importantes es la incorporacin de la va del complemento para destruir o eliminar un patgeno. En infecciones bacterianas, la unin de anticuerpo a supercies bacterianas promueve opsonizacin, fagocitosis y destruccin de invasores por macrfagos y neutrlos. Es posible unir y neutralizar por anticuerpo toxinas y virus, incluso cuando el anticuerpo marca el patgeno para eliminarlo del cuerpo mediante fagocitosis y por rganos como el hgado y los riones. Con el inicio de la citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpo (ADCC), los anticuerpos tambin pueden mediar la destruccin de clulas blanco por poblaciones de clulas citotxicas, como clulas asesinas naturales.

IgG1

IgG2

IgG3

IgG4

Enlace disulfuro

FIGURA 4-18 Estructura general de las cuatro subclases de

IgG humana, que dieren en el nmero y ordenamiento de los enlaces disulfuro intercadena (lneas negras gruesas) que unen

las cadenas pesadas. Los 11 enlaces disulfuro intercadena son una caracterstica notable de la IgG3 humana.

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

99

Inmunoglobulina A (IgA)
Pese a que la IgA slo constituye 10 a 15% del total de las inmunoglobulinas sricas, es la clase de inmunoglobulina que predomina en secreciones externas, como leche materna, saliva, lgrimas y moco de las vas bronquiales, genitourinarias y digestivas. En el suero, la IgA existe sobre todo como un monmero, pero en ocasiones se observan formas polimricas (dmeros, trmeros y algunos tetrmeros), y todas incluyen un polipptido de cadena J (fig. 4-17d). La IgA de secreciones externas, llamada IgA secretoria, consta de un dmero o tetrmero, un polipptido de cadena J y una cadena polipeptdica

a) Estructura de la IgA secretoria Cadena J

Componente secretorio b) Formacin de IgA secretoria Submucosa

Clulas epiteliales Luz

Clula plasmtica

IgA dimrica

Receptor poli-Ig Escisin enzimtica IgA secretoria

Vescula

FIGURA 4-19 Estructura y formacin de la IgA secretoria. a) La IgA secretoria consiste en cuando menos dos molculas de IgA, que estn unidas de manera covalente entre s a travs de una cadena J y tambin enlazadas de forma covalente con el componente secretorio. Este ltimo contiene cinco dominios parecidos a Ig y est unido a IgA dimrica por un enlace disulfuro entre su quinto dominio y una de las cadenas pesadas de IgA. b) La IgA secretoria se forma durante el transporte a travs de clulas epiteliales de las mucosas. Se une IgA dimrica a un receptor poli-Ig en la membrana basolateral de una clula epitelial y se internaliza por endocitosis mediada por receptor. Despus del transporte del complejo receptor-IgA a la supercie luminal, se segmenta de manera enzimtica el receptor poli-Ig y libera el componente secretorio unido a la IgA dimrica.

llamada componente secretorio (fig. 4-19a). Como se explica ms adelante, el componente secretorio deriva del receptor que tiene a su cargo transportar la IgA polimrica a travs de membranas celulares. El polipptido de cadena J en la IgA es idntico al que se encuentra en la IgM pentamrica y tiene la funcin similar de facilitar la polimerizacin de la IgA srica y la IgA secretoria. El componente secretorio es un polipptido de 70 000 Da producido por clulas epiteliales de las mucosas. Consiste en cinco dominios parecidos a inmunoglobulina que se unen a los dominios de regin Fc del dmero de inmunoglobulina A (IgA). Esta interaccin es estabilizada por un enlace disulfuro entre el quinto dominio del componente secretorio y una de las cadenas de la IgA dimrica. La produccin diaria de IgA secretoria es mayor que la de cualquier otra clase de inmunoglobulinas. Las clulas plasmticas que secretan IgA estn concentradas a lo largo de superficies mucosas. Por ejemplo, en toda la extensin del yeyuno hay ms de 2.5 1010 clulas plasmticas que secretan IgA, una cifra superior a la poblacin total de clulas plasmticas de mdula sea, linfa y bazo en conjunto. Todos los das, un ser humano libera 5 a 15 g de IgA secretoria hacia secreciones mucosas. Las clulas B que producen IgA migran de manera preferencial a tejidos subepiteliales y se alojan en ellos, en donde la IgA secretada se une estrechamente a un receptor para molculas de inmunoglobulina polimricas (fig. 4-19b). Este receptor poli-Ig se expresa en la superficie basolateral de la mayor parte de los epitelios mucosos (p. ej., el recubrimiento de los tractos digestivo, respiratorio y genital) y los epitelios glandulares en las glndulas mamarias, salivales y lagrimales. Una vez que se une IgA polimrica al receptor poli-Ig, el complejo receptor-IgA es transportado a travs de la barrera epitelial a la luz. Dicho transporte incluye endocitosis mediada por receptor hacia depresiones cubiertas y transporte dirigido de la vescula a travs de la clula epitelial hasta la membrana luminal, en donde la vescula se fusiona con la membrana plasmtica. A continuacin el receptor poli-Ig se escinde de manera enzimtica de la membrana y se torna en el componente secretorio, que est unido a IgA polimrica y se libera junto con ella hacia las secreciones mucosas. El componente secretorio oculta sitios susceptibles de segmentacin por proteasa en la regin de bisagra de la IgA secretoria y permite que la molcula polimrica exista ms tiempo en el ambiente mucoso rico en proteasa de lo que sera posible de otra manera. La IgM pentamrica tambin es transportada a las secreciones mucosas por este mecanismo, aunque constituye un porcentaje mucho ms bajo de anticuerpo en las secreciones mucosas que la IgA. El receptor poli-Ig interacta con la cadena J de los anticuerpos polimricos IgA e IgM. La IgA secretoria tiene una funcin efectora relevante en las superficies mucosas, que son los principales sitios de entrada de la mayor parte de los microorganismos patgenos. Debido a que es polimrica, la IgA secretoria puede formar enlaces cruzados con antgenos grandes que poseen mltiples eptopos. La unin de IgA secretoria a antgenos de superficie bacterianos y vricos impide la fijacin de los patgenos a las clulas mucosas e inhibe, en consecuencia, las infecciones vricas y la formacin de colonias bacterianas. Los complejos de IgA secretoria y antgeno quedan atrapados con facilidad en el moco, y luego son eliminados por las clulas epiteliales ciliadas de las vas respiratorias o

100

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

el peristaltismo intestinal. Se ha demostrado que la IgA secretoria constituye una importante lnea de defensa contra bacterias como Salmonella, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae y virus como los de la poliomielitis y la gripe as como el reovirus. La leche materna contiene IgA secretoria y muchas otras molculas que ayudan a proteger al recin nacido contra infecciones durante el primer mes de vida. Debido a que el sistema inmunitario de los lactantes no funciona a plenitud, la lactancia materna tiene un papel esencial en la conservacin de la salud de los recin nacidos.

Alergeno IgE Receptor Fc especfico para IgE

Grnulo Clula cebada

Inmunoglobulina E (IgE)
La actividad biolgica potente de la IgE permiti identificarla en el suero a pesar de su concentracin srica promedio en extremo baja (0.3 g/ml). Los anticuerpos IgE median las reacciones de hipersensibilidad inmediata que causan los sntomas de fiebre del heno, asma, urticaria y choque anafilctico. En 1921 K. Prausnitz y H. Kustner demostraron por primera vez la presencia de un componente srico que provoca reacciones alrgicas; estos investigadores inyectaron por va intradrmica suero de una persona alrgica a un individuo no alrgico. Cuando se inyect despus el antgeno apropiado en el mismo sitio, se present una reaccin de roncha y rubor (como en la urticaria). Esta reaccin, denominada reaccin P-K (en honor de sus descubridores), fue la base para la primera valoracin biolgica de la actividad de IgE. La identificacin real de la IgE la llevaron a cabo en 1966 K. y T. Ishizaka, quienes obtuvieron suero de una persona alrgica e inmunizaron conejos con l a fin de obtener antisuero antiisotipo. A continuacin se hizo reaccionar el antisuero de conejo con cada clase de anticuerpo humano conocido en esa poca (es decir, IgG, IgA, IgM e IgD). De este modo se precipit y extrajo del antisuero de conejo cada uno de los anticuerpos antiisotipo conocidos. La porcin restante fue un anticuerpo antiisotipo especfico para una clase de anticuerpo no identificado. El resultado fue que este anticuerpo bloque por completo la reaccin P-K. El nuevo anticuerpo se denomin IgE (en referencia al antgeno E del polen de la ambrosa, que es un inductor potente de esta clase de anticuerpo). La IgE se une a receptores Fc en las membranas de basfilos sanguneos y clulas cebadas de los tejidos. El enlace cruzado por antgeno (alergeno) de molculas de IgE unidas al receptor induce a los basfilos y las clulas cebadas a llevar sus grnulos a la membrana plasmtica y liberar su contenido en un ambiente extracelular, un proceso que se conoce como desgranulacin. Como resultado, se libera una diversidad de mediadores farmacolgicamente activos y aparecen manifestaciones alrgicas (fig. 4-20). La desgranulacin de clulas cebadas localizadas inducida por la IgE tambin suele liberar mediadores que facilitan la acumulacin de diversas clulas necesarias para la defensa antiparasitaria (cap. 15).

Desgranulacin y liberacin del contenido de los grnulos

Histamina y otras sustancias que median reacciones alrgicas

FIGURA 4-20 El enlace cruzado del alergeno de IgE unido a

receptor en clulas cebadas induce desgranulacin y da lugar a la liberacin de sustancias (puntos azules) que median manifestaciones alrgicas.

con esta protena del mieloma, los antisueros resultantes se utilizaron para identificar la misma clase de anticuerpo a concentraciones bajas en suero humano normal. La nueva clase, denominada IgD, tiene una concentracin srica de 30 g/ml y constituye alrededor de 0.2% de la inmunoglobulina total en suero. Junto con la IgM, la IgD es la principal inmunoglobulina unida a membrana que expresan clulas B maduras, y se investiga su funcin en la fisiologa de las clulas B. An no se identifica una funcin biolgica efectora de la IgD.

Determinantes antignicos en inmunoglobulinas

Debido a que los anticuerpos son glucoprotenas, pueden funcionar por s mismos como inmungenos potentes para inducir una reaccin de anticuerpo. Estos anticuerpos anti-Ig son instrumentos potentes para el estudio del desarrollo de la clula B y las respuestas inmunitarias humorales. Los determinantes antignicos o eptopos en las molculas de inmunoglobulina corresponden a tres categoras principales: los determinantes isotpico, alotpico e idiotpico, que se localizan en porciones caractersticas de la molcula (fig. 4-21).

Inmunoglobulina D (IgD)
La IgD se descubri por primera vez cuando un paciente desarroll un mieloma mltiple cuya protena de mieloma no reaccion con antisuero antiisotipo contra los isotipos conocidos entonces: IgA, IgM e IgG. Cuando se inmuniz a conejos

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

101

a) Determinantes isotpicos 1

IgG1 de ratn b) Determinantes alotpicos 1

IgM de ratn

a otra, se reconocen los determinantes isotpicos como extraos e inducen una reaccin de anticuerpo a los determinantes isotpicos del anticuerpo extrao. El anticuerpo antiisotipo se emplea de manera sistemtica con fines de investigacin para precisar la clase o subclase de anticuerpo srico que se produce durante una respuesta inmunitaria o con el fin de caracterizar la clase de anticuerpo unido a membrana que se encuentra en clulas B.

Alotipo

IgG1 de ratn (cepa A) c) Determinantes idiotpicos Idiotopos

IgG1 de ratn (cepa B)

Idiotopos

1 IgG1 de ratn contra antgeno a

1 IgG1 de ratn contra antgeno b

FIGURA 4-21 Determinantes antignicos de inmunoglobulina. Se muestra para cada tipo de determinante su localizacin general dentro de la molcula de anticuerpo (izquierda) y se incluyen dos ejemplos (centro y derecha). a) Los determinantes isotpicos son determinantes de regin constante que distinguen cada clase y subclase de Ig dentro de una especie. b) Los determinantes alotpicos son diferencias sutiles de aminocidos codicadas por distintos alelos de genes de isotipo. Pueden reconocerse las diferencias alotpicas al comparar la misma clase de anticuerpo entre diferentes cepas endogmicas. c) Los determinantes idiotpicos se generan por la conformacin de las secuencias de aminocidos de las regiones variables de cadenas pesada y ligera especcas para cada antgeno. Cada determinante individual se llama idiotopo, y la suma de los idiotopos individuales es el idiotipo.

Aunque todos los miembros de una especie heredan el mismo conjunto de genes de isotipo, existen mltiples alelos para algunos de los genes (fig. 4-21b). Estos alelos codifican diferencias sutiles de aminocidos, llamadas determinantes alotpicos, que ocurren en algunos miembros de una especie. La suma de los determinantes alotpicos individuales que muestra un anticuerpo establece su alotipo. En el ser humano se han caracterizado los alotipos para las cuatro subclases de IgG, una subclase de IgA y la cadena ligera . Los alotipos de cadena se denominan marcadores Gm. Se han identificado cuando menos 25 diferentes alotipos Gm; se designan por la clase y subclase seguidas por el nmero de alelo, por ejemplo G1m(1), G2m(23), G3m(11), G4m(4a). De las dos subclases de IgA, slo la IgA2 tiene alotipos, A2m(1) y A2m(2). La cadena ligera tiene tres alotipos, que se designan m(1), m(2) y m(3). Cada uno de estos determinantes alotpicos posee diferencias en uno a cuatro aminocidos que codifican distintos alelos del mismo gen. Es posible producir anticuerpo contra determinantes alotpicos al inyectar anticuerpos de un individuo a otro de la misma especie que tiene diferentes determinantes alotpicos. En ocasiones, la madre produce durante el embarazo anticuerpo contra determinantes alotpicos en respuesta a determinantes alotpicos paternos en las inmunoglobulinas fetales. Los anticuerpos contra determinantes alotpicos tambin pueden formarse por una transfusin sangunea.

Idiotipo
La secuencia de aminocidos nica de los dominios VH y VL de un anticuerpo determinado puede funcionar no slo como un sitio de unin de antgeno, sino tambin como un grupo de determinantes antignicos. Los determinantes idiotpicos se forman a partir de la secuencia de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. Cada determinante antignico individual de la regin variable se conoce como idiotopo (fig. 4-21c). Cada anticuerpo presentar mltiples idiotopos, algunos de los cuales son el verdadero sitio de unin de antgeno, mientras que otros comprenden secuencias de regin variable fuera del sitio de unin. La suma de los idiotopos individuales se denomina idiotipo del anticuerpo. Debido a que los anticuerpos producidos por clulas B individuales derivadas de la misma clona tienen secuencias de regin variable idnticas, todos poseen el mismo idiotipo. El anticuerpo antiidiotipo se forma al inyectar anticuerpos que tienen una variacin mnima en sus isotipos y alotipos, de tal manera que es factible reconocer la diferencia idiotpica. Con frecuencia se utiliza un anticuerpo homogneo, como la pro-

Isotipo
Los isotpicos son determinantes de regin constante que en conjunto definen cada clase y subclase de cadena pesada y cada tipo y subtipo de cadena ligera dentro de una especie (fig. 4-21a). Un gen de regin constante separado codifica cada isotipo, y todos los miembros de una especie llevan los mismos genes de regin constante (que pueden incluir mltiples alelos). Dentro de una especie, cada individuo normal expresa todos los isotipos en el suero. Las diferentes especies heredan genes de regin constante distintos y por consiguiente expresan diferentes isotipos. As, cuando se inyecta el anticuerpo de una especie

102

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

tena de mieloma o un anticuerpo monoclonal. La inyeccin de dicho anticuerpo a un receptor genticamente idntico al donador induce la formacin de anticuerpo antiidiotipo contra los determinantes idiotpicos.

mIg
S
S S

S
S

Receptor de clula B
Desde hace tiempo, los inmunlogos parecen confundidos acerca de la forma en que la mIg media una seal de activacin despus del contacto con un antgeno. El dilema radica en que todos los isotipos de la mIg tienen colas citoplsmicas muy cortas: las colas citoplsmicas de mIgM y mIgD slo contienen tres aminocidos, la cola de mIgA 14 aminocidos y las colas de mIgG y mIgE 28 aminocidos. En cada caso, la cola citoplsmica es muy corta para ser capaz de relacionarse con molculas intracelulares de sealizacin (p. ej., tirosincinasas y protenas G). La respuesta a este acertijo es que la mIg no constituye la totalidad del receptor de unin de antgeno en las clulas B. Ms bien, el receptor de clula B (BCR) es un complejo protenico transmembranal compuesto de mIg y heterodmeros enlazados por disulfuro llamados Ig- /Ig- . Las molculas de este heterodmero se vinculan con una molcula de mIg para formar un BCR (fig. 4-22). La cadena de Ig- presenta una cola citoplsmica larga que contiene 61 aminocidos; la cola de la cadena de Ig- posee 48 aminocidos. Las colas de Ig- e Ig- son lo bastante largas para interactuar con molculas intracelulares de sealizacin. El descubrimiento del heterodmero Ig- /Ig- por Michael Reth y colaboradores, al inicio de la dcada de 1990, ampli en grado notable el conocimiento de la activacin de la clula B, que se analiza con detalle en el captulo 11.
S S S S

S S S S

Ig- Ig-
S S S S

S S

S S

S S

S S

Membrana plasmtica Cola de 48 aa Cola de 61 aa

Colas citoplsmicas

FIGURA 4-22 Estructura general del receptor de clula B

(BCR). Este receptor que une antgeno se integra con inmunoglobulina unida a membrana (mIg) y heterodmeros enlazados por disulfuro llamados Ig-a/Ig-b. Cada heterodmero contiene la estructura de pliegue de inmunoglobulina y colas citoplsmicas mucho ms largas que las de mIg. Como se muestra, una molcula mIg se relaciona con un heterodmero Ig-a/Ig-b. [Adaptada de A. D. Keegan y
W. E. Paul, 1992, Immunology Today 13:63; y M. Reth, 1992, Annual Review of Immunology 10:97.]

Los receptores Fc se enlazan con regiones Fc de anticuerpos

Aunque la biosntesis y la expresin superficial de inmunoglobulinas es exclusiva del linaje de clulas B, muchas clulas poseen glucoprotenas de membrana llamadas receptores Fc (FcR), con afinidad por las porciones Fc de las molculas de anticuerpo secretadas. Estos receptores son esenciales para muchas de las funciones biolgicas de los anticuerpos. Los receptores Fc tienen a su cargo el paso de anticuerpos a travs de las membranas celulares y la transferencia de IgG de la madre al feto a travs de la placenta. Dichos receptores tambin permiten la adquisicin pasiva de anticuerpos por muchos tipos de clulas, entre ellos linfocitos B y T, neutrfilos, clulas cebadas, eosinfilos, macrfagos y clulas asesinas naturales. En consecuencia, los receptores Fc proporcionan un medio por el cual los anticuerpos los productos del sistema inmunitario adaptativo pueden incorporar elementos celulares fundamentales de la inmunidad innata como macrfagos y clulas asesinas naturales. La inclusin de antgenos unidos a anticuerpo por los receptores Fc de macrfagos o neutrfilos proporciona una seal eficaz para la fagocitosis eficiente (opsonizacin) de complejos de antgenos y anticuerpos. Adems de desencadenar funciones efectoras como opsonizacin o ADCC, el enlace cruzado (mediado por antgeno) de receptores Fc de anticuerpos unidos a FcR puede

generar seales inmunorreguladoras que afectan la activacin celular, inducen diferenciacin y en algunos casos disminuyen las respuestas celulares. Existen muchos receptores Fc diferentes (fig. 4-23). El receptor poli-Ig es esencial para el transporte de inmunoglobulinas polimricas (IgA polimrica y en alguna medida IgM pentamrica) a travs de las superficies epiteliales. En seres humanos, el receptor Fc neonatal (FcRN) transfiere IgG de la madre al feto durante el embarazo y tambin acta en la regulacin de las concentraciones sricas de IgG. Se han descubierto receptores Fc para muchas clases de inmunoglobulina (Ig). As, en el ser humano se encuentran un receptor Fc R que une IgA, un Fc R que une IgE (vase tambin fig. 4-20), y algunas variedades de Fc R (RI, RII-A, RII-BI, RII-B2, RIII) capaces de unir IgG y sus subclases. En muchos casos, el enlace cruzado de estos receptores por la unin de complejos de antgeno y anticuerpo tiene como resultado el inicio de cascadas de transduccin de seales que originan fenmenos como fagocitosis o citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (ADCC). El receptor Fc suele ser parte de un complejo de transduccin de seales que incluye la

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

103

Receptor poli-Ig
S S

S S

FcRI
S S

S S

FcRII
S S

FcRIII
S S

FcR
S S

Fc RI
S S

FcRN
S S S S

S S

S S

S S

S S

S S

2m

S S

S S

S S

S S

S S

CD64

CD32

CD16

CD89

FIGURA 4-23 Estructura de varios receptores Fc humanos. Se muestran en azul los polipptidos de unin Fc y, cuando existen, los polipptidos accesorios de transduccin de seales, en verde. Las asas en estas estructuras representan porciones de la molcula con la estructura caracterstica de pliegue de inmunoglobulina. Estas molculas aparecen en la membrana plasmtica como antgenos de

supercie celular y, como se indica en la gura, a muchas se les ha asignado la sigla CD (del ingls clusters of differentiation, grupos de diferenciacin; vase Apndice 1). El Fc RII tiene tres formas distintas, A, B1 y B2, que dieren en sus regiones intracelulares. [Adaptada
de M. Daeron, 1999, en The antibodies, M. Zanetti y J. D. Capra, eds., vol. 5, p. 53, Harwood Academic Publishers, Amsterdam.]

participacin de otras cadenas polipeptdicas accesorias. Como se muestra en la figura 4-23, esto puede incluir un par de cadenas o, en el caso del receptor IgE, un ensamblaje ms complejo de dos cadenas y una . En el receptor de clulas B se observ la relacin de un receptor extracelular con una unidad intracelular transductora de seales (fig. 4-22), y es una caracterstica central del complejo receptor clula T (cap. 9).

dominio de las inmunoglobulinas. Cada una de estas protenas de membrana se clasifica como un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Se utiliza el trmino superfamilia para referirse a protenas cuyos genes correspondientes derivaron de un gen primordial comn que codific la estructura de dominio bsica. Estos genes evolucionaron de manera independiente y no comparten una ligadura gentica o funcin. Adems de las propias inmunoglobulinas, las protenas siguientes son miembros representativos de la superfamilia de las inmunoglobulinas (fig. 4-24):

Superfamilia de las inmunoglobulinas

Las estructuras de las diversas cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas descritas con anterioridad comparten varias caractersticas, lo que sugiere que poseen un ancestro evolutivo comn. En particular, todas las clases de cadenas pesadas y ligeras tienen la estructura del dominio del pliegue de inmunoglobulina (fig. 4-8). La presencia de esta estructura caracterstica en todas las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas indica que los genes codificadores provienen de un gen primordial comn que codifica un polipptido de unos 110 aminocidos. La duplicacin del gen y la divergencia ulterior pudieron generar entonces los diversos genes de cadenas pesada y ligera. Se ha demostrado que existe un gran nmero de protenas de membrana que poseen uno o ms homlogos de regin para un

Heterodmero Ig- /Ig- , parte del receptor de clulas B. Receptor poli-Ig, que aporta el componente secretorio a IgA e IgM secretorias. Receptores de clula T. Protenas accesorias de clulas T, que incluyen CD2, CD4, CD8, CD28 y las cadenas , y de CD3. Molculas MHC clases I y II. Microglobulina 2, una protena invariable relacionada con molculas MHC clase I. Varias molculas de adhesin celular, incluidas VCAM-1, ICAM-1, ICAM-2 y LFA-3. Factor de crecimiento derivado de plaquetas.

104

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

Inmunoglobulina (IgM) V
S S
S

V
S S

C
S S

C
S S

S S

V
S

S S

S S
S S

V C Molculas MHC Receptor de clula T CHO Clase I Clase II

S S

C C Heterodmero Ig-/Ig- C
S S SS S S S S S S

S S

S S

S S

S S

V
S S

S S

S S

S S S S

S S

C C

S S

S S

Microglobulina 2 C C

S S

S S

Molculas de adhesin

VCAM-1
C
S S

Receptor poli-Ig Protenas accesorias de clula T

S S

ICAM-1
V
S S

CD4 V
S S

S S

C
S S

S S

S S

S S

CD2 C
S S

CD3 V

S S

S S

S S

ICAM-2 C
S S

S S

LFA3 C
S S

C
S S

C
S S

S S

CD8 V
S S S S

V
V

S S

S S

S S

S S

S S

S S

S S

S S

S S

S S

FIGURA 4-24 Algunos miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas, un grupo de glucoprotenas casi siempre unidas a membrana, se relacionan desde el punto de vista
A la superfamilia de las inmunoglobulinas pertenecen asimismo muchas otras protenas, algunas de las cuales se comentan en otros captulos. An no se lleva a cabo el anlisis cristalogrfico con rayos X de todos los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. No obstante, la secuencia primaria de aminocidos de

estructural. Excepto en la microglobulina 2, en todos los casos que se muestran aqu el extremo carboxilo terminal de la molcula est jado a la membrana.

estas protenas sugiere que todas contienen el dominio tpico del pliegue de inmunoglobulina. De manera especfica, todos los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas contienen cuando menos una o ms extensiones de alrededor de 110 aminocidos, capaces de disponerse en lminas plegadas de hileras antiparalelas, por lo general con un enlace disul-

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

105

furo intracadena invariable que cierra un asa que abarca 50 a 70 residuos. Casi ninguno de los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas puede unir antgeno. Por consiguiente, la estructura caracterstica del pliegue de Ig que se encuentra en tantas protenas de membrana debe tener alguna funcin aparte de unir antgeno. Una posibilidad es que dicho pliegue facilite las interacciones entre protenas de membrana. Como ya se describi, pueden ocurrir interacciones entre las caras de lminas plegadas de dominios homlogos de la inmunoglobulina (p. ej., interaccin CH2/CH2) y dominios no homlogos (como interacciones VH/VL y CH1/CL).

Anticuerpos monoclonales
Como ya se dijo, la mayora de los antgenos ofrece mltiples eptopos y por consiguiente induce la proliferacin y diferenciacin de una variedad de clonas de clulas B, derivadas todas de una clula B que reconoce un eptopo particular. Los anti-

cuerpos sricos resultantes son heterogneos y comprenden una mezcla de anticuerpos, cada uno especfico para un eptopo (fig. 4-25). Esta respuesta de anticuerpo policlonal facilita la localizacin, fagocitosis y lisis de antgeno mediada por complemento; por lo tanto, tiene ventajas claras para el organismo in vivo. Por desgracia, la heterogeneidad de anticuerpos que aumenta la proteccin inmunitaria in vivo suele reducir la eficacia de un antisuero para varios usos in vitro. Para casi todos los propsitos de investigacin, diagnsticos y teraputicos, son preferibles anticuerpos monoclonales, derivados de una sola clona y, por consiguiente, especficos para un solo eptopo. No es factible la purificacin bioqumica directa del anticuerpo monoclonal a partir de un preparado de anticuerpo policlonal. En 1975, Georges Khler y Cesar Milstein disearon un mtodo para obtener anticuerpo monoclonal, que se constituy con rapidez en una de las tecnologas fundamentales de la inmunologa. Mediante la fusin de una clula B productora de anticuerpo activada de modo normal con una clula de mieloma (una clula plasmtica cancerosa) pudieron obtener una clula hbrida, llamada hibridoma, que posea las propiedades de crecimiento inmortal de la clula de mieloma y secretaba el

4
Antgeno

Eptopos 1

3 2 Aislamiento de clulas esplnicas

1 Hibridacin 2 3 4

1 Seleccin 2 3 4 Clulas de mieloma Hibridomas

1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4

Aislamiento de suero

Clulas plasmticas

Clonas Ab-4

Ab-1 Ab-1 Ab-2 Ab-3 Ab-4 Ab-1 Ab-3 Ab-2 Ab-3 Ab-4

Ab-2

Antisuero policlonal

Anticuerpos monoclonales

FIGURA 4-25 El antisuero policlonal ordinario que se produce

en respuesta a un antgeno complejo contiene una mezcla de anticuerpos monoclonales, cada uno especco para uno de los cuatro eptopos que se muestran en el antgeno (recuadro). En

contraste, un anticuerpo monoclonal, que se deriva de una clula plasmtica nica, es especco para un eptopo en un antgeno complejo. Se ilustra aqu el esbozo del mtodo bsico para obtener un anticuerpo monoclonal.

106

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

anticuerpo producido por la clula B (fig. 4-25). Las clonas resultantes de clulas de hibridoma, que secretan grandes cantidades de anticuerpo monoclonal, pueden cultivarse de manera indefinida. El desarrollo de tcnicas para producir anticuerpos monoclonales, cuyos detalles se comentan en el captulo 22, proporcion a los inmunlogos un instrumento de investigacin poderoso y verstil. La importancia del trabajo de Khler y Milstein se reconoci cuando ambos recibieron el premio Nobel.

Las abzimas son anticuerpos monoclonales que catalizan reacciones

La unin de un anticuerpo a su antgeno es similar en muchos sentidos a la unin de una enzima a su sustrato. En ambos casos, la unin incluye interacciones no covalentes y dbiles, muestra una especificidad alta y con frecuencia una gran afinidad. Lo que distingue una interaccin de anticuerpo y antgeno de la interaccin de una enzima y sustrato es que el anticuerpo no altera el antgeno, en tanto que la enzima cataliza un cambio qumico en su sustrato. Sin embargo, al igual que las enzimas, los anticuerpos de especificidad apropiada pueden estabilizar el estado de transicin de un sustrato unido y reducir as la energa de activacin para la modificacin qumica del sustrato. Las similitudes entre interacciones de antgeno y anticuerpo y de sustrato y enzima suscitaron la pregunta sobre la posibilidad de que algunos anticuerpos puedan actuar como enzimas y catalizar reacciones qumicas. Con objeto de investigar esta posibilidad, se sintetiz un complejo de hapteno y portador en el cual el hapteno semejaba estructuralmente el estado de transicin de un ster sometido a hidrlisis. Se fusionaron clulas esplnicas de ratones inmunizados con este anlogo de estado de transicin con clulas de mieloma para generar anticuerpos monoclonales antihapteno monoclonal. Cuando se incubaron estos anticuerpos monoclonales con un sustrato ster, algunos de ellos aceleraron la hidrlisis alrededor de 1 000 veces, es decir, actuaron como la enzima que en condiciones normales cataliza la hidrlisis del sustrato. La actividad cataltica de estos anticuerpos fue muy especfica; es decir, slo hidrolizaron steres cuya estructura en estado de transicin semejaba de modo estrecho el anlogo de estado de transicin utilizado como un hapteno en el conjugado inmunizante. Estos anticuerpos catalticos se denominaron abzimas en alusin a su funcin doble de anticuerpo y enzima. Un objetivo central de la investigacin del anticuerpo cataltico es la obtencin de un grupo de abzimas que corten enlaces peptdicos en residuos de aminocidos especficos, tal y como las enzimas de restriccin cortan DNA en sitios especficos. Estas abzimas podran ser instrumentos inestimables en el anlisis estructural y funcional de protenas. Adems, quiz sea posible generar abzimas con capacidad de disolver cogulos sanguneos o segmentar glucoprotenas vricas en sitios especficos y bloquear, en consecuencia, la infectividad del virus. Por desgracia, ha resultado en extremo difcil obtener anticuerpos catalticos que rompan enlaces peptdicos de protenas. Gran parte de la investigacin que se lleva a cabo en la actualidad en este campo est encaminada a solucionar este importante pero difcil problema.

Los anticuerpos monoclonales tienen usos clnicos importantes

Los anticuerpos monoclonales estn siendo muy tiles como reactivos diagnsticos, imagenolgicos y teraputicos en medicina clnica. Al principio se emplearon sobre todo como reactivos diagnsticos in vitro. Entre los mltiples reactivos diagnsticos de anticuerpo monoclonal disponibles en la actualidad se encuentran productos para detectar embarazo, diagnosticar mltiples microorganismos patgenos, medir las concentraciones sanguneas de varios frmacos, valorar la compatibilidad de antgenos de histocompatibilidad y reconocer antgenos liberados por ciertos tumores. Tambin es posible usar in vivo anticuerpos monoclonales radiomarcados con el fin de identificar o localizar antgenos tumorales y posibilitar el diagnstico ms temprano de algunos tumores primarios o metastsicos. Por ejemplo, se marca con yodo-131 el anticuerpo monoclonal contra clulas de cncer de mama y se introduce en la sangre para detectar la diseminacin de un tumor a ganglios linfticos regionales. Esta tcnica de imagen monoclonal puede revelar metstasis de cncer de mama que no se reconoceran mediante otras tcnicas de estudio menos sensibles. Como se expone en el enfoque clnico (vase antes), el uso de anticuerpos como agentes teraputicos tiene una larga historia. En fechas recientes la disponibilidad de anticuerpos monoclonales y la posibilidad de humanizarlos por tcnicas de ingeniera gentica ha dado nuevo mpetu a este campo. Los primeros intentos de usar anticuerpos monoclonales murinos para tratar a seres humanos enfrentaban la posibilidad de una intensa reaccin contra estas protenas extraas. En la actualidad, los productos se obtienen en sistemas humanos o mediante ingeniera gentica (cap. 5) para incorporar regiones V o CDR de anticuerpos no humanos en regiones C y armazones de anticuerpos humanos, lo que minimiza la posibilidad de inducir una inmunorreaccin a ellos. Hay un nmero creciente de anticuerpos teraputicos aprobados, y ms de cien nuevos se encuentran en proceso de desarrollo. stos representan varios miles de millones de dlares anuales en ventas. Las principales reas en que la terapia con anticuerpos ha sido til son el tratamiento del cncer y el alivio de trastornos artrticos. Los productos rituximab para el tratamiento del linfoma no Hodgkin e infliximab o adalimumab para la artritis reumatoide estn entre los ms ampliamente usados. Los nombres genricos de los frmacos indican el tipo de anticuerpo; por ejemplo, el sufijo -umab denota un anticuerpo monoclonal humano, mientras que -imab denota un anticuerpo quimrico, con secuencias de ser humano y de otras especies.

RESUMEN

Todos los inmungenos son antgenos, pero no todos los antgenos son inmungenos. Por ejemplo, los haptenos son antgenos de molcula pequea, pero slo pueden inducir una inmunorreaccin (son inmungenos) cuando se conjugan con una molcula grande. La inmunogenicidad depende de muchos factores que incluyen alteridad, tamao molecular, composicin qumica, complejidad, dosis, susceptibilidad a procesamiento y presentacin

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

107

de antgeno, genotipo del animal receptor (en particular los genes de MHC), va de administracin y coadyuvantes.

Los anticuerpos reconocen una amplia variedad de determinantes antignicos, o eptopos. Los antgenos pequeos a menudo se fijan a estrechos surcos o profundos bolsillos del anticuerpo; los antgenos grandes, como las protenas globulares, interactan con una superficie complementaria ms grande y plana en la molcula de anticuerpo. Una molcula de anticuerpo consta de dos cadenas ligeras idnticas y dos cadenas pesadas idnticas entre s. Las cadenas ligeras estn unidas a las pesadas por enlaces disulfuro, y las pesadas se unen entre s por el mismo tipo de enlaces. Cada cadena de anticuerpo consta de una regin variable amino terminal y una regin constante carboxilo terminal. En cualquier molcula de anticuerpo dada, la regin constante contiene una de las cinco secuencias bsicas de cadenas pesadas, llamadas isotipos, que determinan la clase de anticuerpo ( , IgM; , IgG; , IgD; , IgA; , IgE) y una o dos secuencias bsicas de cadenas ligeras ( o ) llamadas tipos. Las cinco clases de anticuerpo tienen diferentes funciones efectoras, concentraciones sricas promedio y vida media. Cada uno de los dominios en la molcula de inmunoglobulina tiene una estructura terciaria caracterstica llamada pliegue de inmunoglobulina. La presencia de un dominio de pliegue de inmunoglobulina identifica asimismo muchas otras protenas que no son anticuerpo como miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Dentro del dominio variable amino terminal de cada cadena pesada y ligera se encuentran tres regiones determinantes de complementariedad (CDR). Estas regiones polipeptdicas contribuyen al sitio de unin de antgeno de un anticuerpo y establecen su especificidad. Las inmunoglobulinas se expresan de dos formas: anticuerpo secretado que producen clulas plasmticas y anticuerpo unido a membrana que se relaciona con heterodmeros Ig- /Igpara formar el receptor de antgeno de la clula B que se encuentra en la superficie de los linfocitos B. Las tres funciones efectoras principales de los anticuerpos son 1) opsonizacin, que promueve la fagocitosis de antgeno por macrfagos y neutrfilos; 2) activacin del complemento, que activa una va que conduce a la generacin de un conjunto de protenas capaces de perforar membranas celulares, y 3) citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpo (ADCC), que puede destruir clulas blanco unidas a anticuerpo. A diferencia de los anticuerpos policlonales que proceden de muchas clonas de clulas B y tienen un conjunto heterogneo de sitios de unin, un anticuerpo monoclonal deriva de una clona de clulas B nica y es un conjunto homogneo de sitios de unin.

Demotz, S., H. M. Grey, E. Appella, and A. Sette. 1989. Characterization of a naturally processed MHC class II-restricted T-cell determinant of hen egg lysozyme. Nature 342:682. Frazer, J. K., and J. D. Capra. 1999. Immunoglobulins: structure and function. In Fundamental Immunology, 4th ed. W. E. Paul, ed. Lippincott-Raven, Philadelphia. Grey, H. M., A. Sette, and S. Buus. 1989. How T cells see antigen. Scientific American 261 (5):56. Immunology Today: The Immune Receptor Supplement, 2nd ed. 1997. Elsevier Trends Journals, Cambridge, UK (ISSN 12181365). Kindt, T. J., and J. D. Capra. 1984. The Antibody Enigma. Plenum Press, New York. Khler, G., and Milstein. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495. Kraehenbuhl, J. P., and M. R. Neutra. 1992. Transepithelial transport and mucosal defence II: secretion of IgA. Trends in Cell Biology 2:134. Landsteiner, K. 1945. The Specificity of Serological Reactions. Harvard University Press, Cambridge, MA. Laver, W. G., G. M. Air, R. G. Webster, and S. J. Smith-Gill. 1990. Epitopes on protein antigens: misconceptions and realities. Cell 61:553. Reth, M. 1995. The B-cell antigen receptor complex and coreceptor. Immunology Today 16:310. Stanfield, R. L., and I. A. Wilson. 1995. Protein-peptide interactions. Current Opinion in Structural Biology 5:103. Tainer, J. A., et al. 1985. The atomic mobility component of protein antigenicity. Annual Review of Immunology 3:501. Wedemayer, G. J., et al. 1997. Structural insights into the evolution of an antibody combining site. Science 276:1665. Wentworth, P., and K. Janda. 1998. Catalytic antibodies. Current Opinion in Chemical Biology 8:138. Wilson, I. A., and R. L. Stanfield. 1994. Antibody-antibody interactions: new structures and new conformational changes. Current Opinion in Structural Biology 4:857

Sitios tiles de la red

http://www.umass.edu/microbio/rasmol/
RasMol es un software gratuito para visualizar estructuras moleculares que puede correrse en PC basadas en Windows, Macintosh o Unix. En l pueden observarse estructuras tridimensionales de muchos tipos de molculas, incluidos protenas y cidos nucleicos.

http://www.expasy.ch/
Excelente y amplio portal del Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), que contiene extensa informacin sobre la estructura de las protenas. De l pueden obtenerse secuencias y estructuras tridimensionales de protenas, as como el verstil programa Swiss-PdbViewer, que tiene varias capacidades avanzadas que no se encuentran en RasMol.

Bibliografa
Berzofsky, J. A., and J. J. Berkower. 1999. Immunogenicity and antigen structure. In Fundamental Immunology, 4th ed., W. E. Paul, ed. Lippincott-Raven, Philadelphia.

108

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

http://www.bioinf.org.uk/abs/
El sitio de red Antibodies: Structure and Sequence resume informacin til sobre la estructura y secuencia de anticuerpos. Proporciona informacin general sobre anticuerpos y estructuras cristalinas e incluye enlaces con otras pginas relacionada con anticuerpos.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
La Molecular Modeling Database (MMDB) contiene estructuras tridimensionales determinadas mediante cristalografa con rayos X y espectroscopia de NMR. Los datos de la MMDB se obtienen del Protein Data Bank (PDB). El National Center for Biotechnology Information (NCBI) tiene datos estructurales enlazados en forma cruzada con informacin bibliogrfica, bases de datos de secuencias de protenas y cido nucleico y la base de datos de taxonoma animal del NCBI. Este ltimo desarroll un visor de estructuras en tercera dimensin, Cn3D, para la fcil visualizacin interactiva de estructuras moleculares.

b. Por lo general, un antgeno protenico grande puede combinarse con muchas molculas de anticuerpo diferentes. c. Un hapteno puede estimular la formacin de anticuerpo pero no combinarse con molculas de anticuerpo. d. Los genes MCH tienen un papel importante en la determinacin del grado de reactividad inmunitaria a un antgeno. e. Los eptopos de clula T son casi siempre aminocidos accesibles que pueden combinarse con el receptor de clula T. f. Muchos eptopos de clula B son aminocidos no secuenciales que quedan prximos entre s por la conformacin terciaria de un antgeno protenico. g. Todos los antgenos tambin son inmungenos. h. Los anticuerpos pueden unir compuestos hidrfilos o hidrfobos, pero los receptores de clula T slo pueden unir complejos de pptido y complejo mayor de histocompatibilidad. i. Los eptopos de clula B pueden deducirse con gran exactitud a partir de la estructura primaria de una protena. 2. Para cada par de antgenos que se menciona a continuacin, indique cul es probable que sea ms inmungeno cuando se inyecta a un conejo. Explique la respuesta. a. Albmina srica bovina (BSA) natural BSA desnaturalizada por calor b. Lisozima de clara de huevo de gallina (HEL) Colgena de gallina c. Una protena con peso molecular de 30 000 Una protena con peso molecular de 150 000 d. BSA en coadyuvante completo de Freund BSA en coadyuvante incompleto de Freund 3. Indique cules de los siguientes enunciados acerca de los haptenos y portadores son verdaderos. a. Los haptenos son molculas protenicas grandes, como la albmina srica bovina (BSA). b. Cuando se inyecta en un animal un complejo de hapteno y portador que contiene mltiples molculas de hapteno, la mayora de los anticuerpos inducidos son especficos para el hapteno. c. Slo se requieren portadores si se desea inducir una respuesta mediada por clulas. d. Es necesario inmunizar con un complejo de hapteno y portador a fin de obtener anticuerpos dirigidos contra el hapteno. e. Los portadores incluyen molculas pequeas como dinitrofenol y cido penicilnico (derivado de la penicilina). 4. Para cada una de las afirmaciones siguientes, indique si es verdadera slo para eptopos de clulas B (B), slo para eptopos de clulas T (T) o para ambos tipos de eptopos (BT) dentro de un antgeno grande. a. Casi siempre consiste en una secuencia lineal de aminocidos. b. Suelen localizarse en el interior de un antgeno protenico. c. Por lo general se localizan en la superficie de un antgeno protenico. d. Cuando un antgeno protenico se desnaturaliza por calor pierde su inmunogenicidad.

http://www.umass.edu/microbio/chime/pe/protexpl/ frntdoor.htm
Protein Explorer es un programa de visualizacin molecular creado por Eric Martz de la University of Massachusetts, Amherst, con el apoyo de la National Science Foundation para facilitar a estudiantes, maestros y cientficos el uso de tcnicas de visualizacin molecular interactivas y dinmicas.

http://imgt.cines.fr
IMGT, la base de datos internacional ImMunoGeneTics creada por Marie-Paule Lefranc, es un sistema de informacin bien organizado, poderoso y amplio que se especializa en inmunoglobulinas, receptores de clulas T y molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de todas las especies de vertebrados.

Preguntas de estudio
PREGUNTA DE ENFOQUE CLNICO
Dos compaas farmacuticas producen inmunoglobulina intravenosa (IGIV). La compaa A elabora su producto a partir de fondos comunes de 100 000 donadores obtenidos slo de la poblacin de Estados Unidos. La compaa B prepara el frmaco de fondos comunes de 60 000 donadores obtenidos en cantidades iguales de Estados Unidos, Europa, Brasil y Japn. a. Qu producto cabra esperar que tenga el espectro ms amplio de reactividades a patgenos? Por qu? b. Si se supone que los pacientes que reciben el anticuerpo a) nunca saldrn de Estados Unidos o b) viajarn a muchas partes del mundo, cul de los dos productos elegira para cada uno de estos grupos de pacientes? Explique sus elecciones. 1. Indique si cada una de las afirmaciones siguientes es verdadera o falsa. Si piensa que una afirmacin es falsa, explique por qu. a. La mayora de los antgenos inducen una respuesta de ms de una clona.

ANTGENOS Y ANTICUERPOS

C A P T U L O

109

e. Las molculas MHC expresadas por un individuo determinan en parte los eptopos inmunodominantes. f. Casi siempre proceden de protenas. g. Pueden existir mltiples eptopos diferentes en el mismo antgeno. h. Su inmunogenicidad suele depender de la estructura tridimensional del antgeno. i. La reaccin inmunitaria a ellos puede incrementarse por la administracin concurrente de coadyuvante completo de Freund. 5. Indique si cada una de las afirmaciones siguientes es verdadera o falsa. Si piensa que es falsa, explique por qu. a. Un conejo inmunizado con IgG3 humana elabora anticuerpo que reacciona con todas las subclases de IgG en seres humanos. b. Todas las molculas de inmunoglobulina en la superficie de una clula B determinada tienen el mismo idiotipo. c. Todas las molculas de inmunoglobulina en la superficie de una clula B determinada tienen el mismo isotipo. d. Todas las molculas de protena de mieloma derivadas de una misma clona de mieloma tienen los mismos idiotipo y alotipo. e. Aunque la IgA es la principal especie de anticuerpo que lleva a cabo la transcitosis, la IgM polimrica, pero no la IgA monomrica, tambin puede experimentarla. f. Las regiones hipervariables hacen contacto considerable con el eptopo. g. La IgG funciona con mayor eficacia que la IgM en la aglutinacin bacteriana. h. Aunque a menudo se prefieren anticuerpos monoclonales para investigacin y con fines diagnsticos, tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales pueden ser muy especficos. i. En condiciones normales, todos los isotipos se encuentran en cada individuo de una especie. j. La regin variable de cadena pesada (VH) tiene el doble de largo que la regin variable de cadena ligera (VL). 6. El lector es un entusiasta estudiante de inmunologa y asla una protena X, que tal vez sea un nuevo isotipo de la inmunoglobulina humana. a. Qu caractersticas estructurales debe tener la protena X para clasificarse como inmunoglobulina? b. Usted elabora antisueros de conejo para la IgG humana completa y las cadenas humanas y . Si se supone que la protena X es en realidad un nuevo isotipo de inmunoglobulina, a cules de estos antisueros se unira? Por qu? c. Disee un procedimiento experimental para elaborar un antisuero especfico para la protena X. 7. Segn la teora de la seleccin clonal, todas las molculas de inmunoglobulina en una clula B individual tienen la misma especificidad antignica. Explique por qu la presencia de IgM e IgD en la misma clula B no viola la inespecificidad implicada por la seleccin clonal. 8. La IgG, que contiene cadenas pesadas , apareci en un momento mucho ms temprano de la evolucin que la IgM, que

contiene cadenas pesadas . Describa dos ventajas y dos desventajas que tiene la IgG en comparacin con la IgM. 9. Aunque los cinco isotipos de inmunoglobulina comparten muchas caractersticas estructurales comunes, las diferencias en sus estructuras afectan sus actividades biolgicas. a. Esquematice una molcula de IgG tpica e indique cada una de las partes siguientes: cadenas H, cadenas L, enlaces disulfuro intercadena, enlaces disulfuro intracadena, dominios de bisagra, Fab, Fc y todos los dominios. Indique cules son los dominios que participan en la unin de antgeno. b. Cmo tendra que modificarse el diagrama de la IgG para mostrar una molcula de IgA aislada de la saliva? c. Cmo tendra que modificarse el diagrama de la IgG para representar IgM srica? 10. Llene el cuadro adjunto que relaciona las propiedades de las molculas de IgG y sus diversas partes. Escriba ( ) si la molcula o parte de ella muestra la propiedad; ( ) si no es as; y ( / ) si slo la muestra dbilmente.

Propiedad Unin de antgeno Unin bivalente de antgeno Unin a receptores Fc Complemento jo en presencia de antgeno Dominios V Dominios C

IgG entera

Cadena H

Cadena L

Fab F(ab )2

Fc

11. Debido a que las molculas de inmunoglobulina poseen determinantes antignicos, pueden funcionar por s mismas como inmungenas e inducir la formacin de anticuerpos. Para cada uno de los casos de inmunizacin siguientes indique si se formaran anticuerpos antiinmunoglobulina contra determinantes isotpico (IS), alotpico (AL) o idiotpico (ID): a. Se inyectan a un ratn C57BL/6 anticuerpos anti-DNP producidos en un ratn BALB/c. b. Se inyectan a un ratn BALB/c anticuerpos monoclonales anti-BGG de otro ratn BALB/c. c. Se inyectan a un conejo anticuerpos anti-BGG producidos en un ratn BALB/c. d. Se inyectan a un ratn exogmico anticuerpos anti-DNP producidos en un ratn BALB/c. e. Los anticuerpos anti-BGG producidos en un ratn BALB/c se inyectan al mismo ratn.

110

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

12. Escriba S o NO en el cuadro adjunto para indicar si los antisueros de conejo indicados en la parte superior reaccionan con los componentes de anticuerpo de ratn que se enumeran a la izquierda.

Cadena Cadena Fragmento Fragmento Cadena Fab de IgG Fc de IgG J Cadena de ratn Cadena de ratn IgM entera de ratn Fragmento Fc de IgM de ratn

con tres preparados de clulas de mieloma que difieren en sus genotipos de inmunoglobulina como sigue: a) H , L ; b) H , L ; c) H , L . Para cada hibridoma, prediga cuntos sitios de unin de antgeno nicos, compuestos de una cadena H y una L, podran producirse en teora, y muestre la estructura de cadena de las posibles molculas de anticuerpo. Para cada posible molcula de anticuerpo, indique si las cadenas se originaran en el bazo (S) o el compaero de fusin de mieloma (M) (p. ej., HSLS/HmLm). 18. Para cada isotipo de inmunoglobulina (a-e), elija la o las descripciones que se indica abajo (1-12) que describen ese isotipo. Cada descripcin puede utilizarse una vez, ms de una vez o ninguna vez; para algunos isotipos puede aplicarse ms de una descripcin. Isotipos a. ______ IgA b. ______ IgD c. ______ IgE d. ______ IgG e. ______ IgM

13. La estructura caracterstica de los dominios de inmunoglobulina conocida como pliegue de inmunoglobulina se observa tambin en numerosas protenas de membrana que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas. a. Describa las caractersticas tpicas que definen la estructura del dominio del pliegue de inmunoglobulina. b. Considere las protenas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Qu tienen todas estas protenas en comn? Describa dos miembros diferentes de la superfamilia de las Ig que unen antgeno. Identifique cuatro miembros de la superfamilia de las Ig que no unen antgeno. 14. Dnde se localizan las regiones CDR en una molcula de anticuerpo y cules son sus funciones? 15. La variacin en la secuencia de aminocidos en cada posicin de una cadena polipeptdica puede expresarse por una cantidad denominada variabilidad. a. Cules son los valores ms grandes y ms pequeos posibles de la variabilidad? b. En qu esperara que difirieran la grfica de variabilidad de una enzima presente en mltiples especies de mamferos y la de un grupo de inmunoglobulinas humanas? 16. Una investigadora deseaba obtener un antisuero de conejo especfico para IgG de ratn. Inyect a un conejo IgG murina purificada y obtuvo un antisuero que reaccion intensamente con IgG de ratn. Sin embargo, para su desaliento, el antisuero tambin reaccion con cada uno de los otros isotipos murinos. Explique por qu obtuvo este resultado. Cmo podra hacer que el antisuero de ratn fuera especfico para IgG murina? 17. Se fusionan clulas esplnicas que tienen un genotipo normal para cadenas pesadas (H) y ligeras (L) de inmunoglobulina

Descripciones 1) La forma secretada es un pentmero de la unidad bsica H2L2 2) Se une a receptores Fc en clulas cebadas 3) Las formas multimricas tienen una cadena J 4) Se encuentra en la superficie de clulas B maduras no cebadas 5) El isotipo ms abundante en suero 6) Principal anticuerpo en secreciones como saliva, lgrimas y leche materna 7) Se encuentra en la superficie de clulas B inmaduras 8) El primer anticuerpo srico que se produce en una respuesta inmunitaria primaria 9) Tiene un papel importante en la hipersensibilidad inmediata 10) Tiene un papel primario en la proteccin contra patgenos que invaden a travs de la mucosa intestinal o respiratoria 11) Las formas multimricas pueden contener un componente secretorio 12) El isotipo menos abundante en suero 19. El lector acaba de producir un anticuerpo monoclonal contra un receptor de superficie celular ligado a tirosincinasa. Cuando el anticuerpo se une al receptor expresado en sus clulas, usted observa que stas son estimuladas en lugar de ser inhibidas. Es decir, el anticuerpo no bloquea al receptor sino que da por resultado una mayor sealizacin por el receptor. D una posible explicacin de este resultado. Cmo podra modificar el anticuerpo para eliminar la reaccin de estimulacin, y de este modo determinar si su anticuerpo bloquea la unin de ligando? 20. La IgG se transfiere de la madre al feto en desarrollo, lo cual confiere inmunoproteccin contra antgenos a los que la madre se exponga en el primer trimestre. De qu otras maneras una madre da proteccin inmunitaria a su hijo despus del nacimiento?

captulo 5
Organizacin y expresin de los genes de inmunoglobulina
L V J J 5 C 3 Poliadenilacin Empalme de RNA L V J C (A)n

na de las caractersticas ms notables del sistema inmunitario de los vertebrados es su capacidad de reaccionar a un conjunto al parecer ilimitado de antgenos extraos. A medida que se acumularon datos sobre la secuencia de la inmunoglobulina (Ig) se encontr que, casi sin excepcin, cada molcula de anticuerpo estudiada contena una secuencia nica de aminocidos en su regin variable, pero slo una de un nmero limitado de secuencias invariantes en su regin constante. La base gentica de esta combinacin de constancia y enorme variacin en una molcula de protena aislada estriba en la organizacin de los genes de inmunoglobulina. En el DNA de la lnea germinal, mltiples segmentos gnicos codifican porciones de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina aislada. Estos segmentos gnicos se encuentran en las clulas germinales, pero no pueden transcribirse y traducirse en cadenas completas mientras no se reordenen como genes funcionales. Durante la maduracin de la clula B en la mdula sea, algunos de estos segmentos gnicos son dispuestos de manera aleatoria por un sistema gentico dinmico capaz de crear ms de 106 combinaciones. Procesos ulteriores incrementan la diversidad del repertorio de sitios de unin de anticuerpo a un nmero muy grande, mayor de 108. Durante el desarrollo de la clula B, la maduracin de una clula B progenitora avanza por una secuencia ordenada de reordenamientos de los genes que codifican la Ig, junto con modificaciones de los genes que contribuyen a la diversidad del producto final. Hacia el trmino de este proceso, una clula B madura inmunocompetente contendr secuencias codificadoras para una regin variable de cadena pesada y una regin variable de cadena ligera funcionales. As, una clula B individual surge con su especificidad ya determinada. Despus de la estimulacin antignica de una clula B madura en rganos linfoides perifricos, el reordenamiento adicional de segmentos gnicos en la regin constante puede generar cambios en el isotipo expresado, que producen a su vez cambios en las funciones biolgicas efectoras de la molcula de inmunoglobulina sin modificar su especificidad. Por consiguiente, las clulas B maduras contienen DNA cromosmico que ya no es idntico al DNA de la lnea germinal. Si bien se concibe el DNA genmico como un plano bsico gentico estable, el linaje de clulas linfocticas no conserva una copia intacta de este plano bsico. El reordenamiento genmico es una caracterstica esencial de la diferencia-

Los genes de la cadena ligera se reordenan y empalman para generar el mensaje completo.

Diseo de un modelo gentico compatible con la estructura de la inmunoglobulina Organizacin multignica de genes de inmunoglobulina Reordenamientos gnicos de regin variable Mecanismo de los reordenamientos de DNA de regin variable Generacin de diversidad de anticuerpos Cambio de clase entre genes de la regin constante Expresin de genes de inmunoglobulina Sntesis, ensamblaje y secrecin de inmunoglobulinas Regulacin de la transcripcin de genes de inmunoglobulina Genes de anticuerpos e ingeniera de anticuerpos

cin de linfocitos, y no se ha demostrado que ningn otro tipo de clula de los vertebrados lleve a cabo este proceso. En este captulo se describe primero la organizacin detallada de los genes de inmunoglobulina, el proceso de reordenamiento del gen de Ig y los mecanismos por los que el sistema gentico dinmico de la inmunoglobulina genera ms de 108 diferentes especificidades antignicas. Acto seguido se analizan el mecanismo del cambio de clase, el papel del procesamiento diferencial del RNA en la expresin de genes de inmunoglobulina y la regulacin de la transcripcin de estos genes. El captulo

111

112

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

FIGURA 5-1 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

CLULA Clula madre hematopoytica

Desarrollo de la clula B
Ig EXPRESADA Ninguna

Clula linfoide

Ninguna

Reordenamiento parcial del gen de cadena pesada Clula pro-B Mdula sea Ninguna

Reordenamiento completo del gen de cadena pesada Clula pre-B Reordenamiento del gen de cadena ligera Clula B inmadura Cambio en el procesamiento del RNA Clula B madura Estimulacin con antgeno Clula B activada Diferenciacin mIgM + mIgD mIgM Cadena pesada + cadena ligera sustituta

rganos linfoides perifricos

Clulas plasmticas que secretan IgM Cambio de clase IgM

Clulas B de memoria de diversos isotipos

Clulas plasmticas que secretan diversos isotipos

IgG

IgA

IgE

Los fenmenos que ocurren durante la maduracin en la mdula sea no requieren antgeno, pero s la activacin y diferenciacin de clulas B maduras en rganos linfoides perifricos. Los

nombres mIgM y mIgD se reeren a inmunoglobulinas relacionadas con membrana. IgG, IgA e IgE son inmunoglobulinas secretadas.

concluye con la aplicacin de los conocimientos de la biologa molecular de los genes de inmunoglobulina a la ingeniera de molculas de anticuerpo para aplicaciones teraputicas y de investigacin. En el captulo 11 se cubre en detalle el proceso completo del desarrollo de las clulas B desde los primeros reordenamientos gnicos en clulas B progenitoras hasta la diferenciacin final en clulas B de memoria y clulas plasmticas que secretan anticuerpo. En la figura 5-1 se delinean las etapas secuenciales del desarrollo de la clula B, muchas de las cuales resultan de reordenamientos crticos.

Diseo de un modelo gentico compatible con la estructura de la inmunoglobulina

Los resultados de los estudios de determinacin de la secuencia de aminocidos (secuenciacin, para abreviar) de la inmunoglobulina descritos en el captulo 4 revelaron varias caractersticas de la estructura de la inmunoglobulina que resultaron difciles de conciliar con los modelos genticos clsicos. Cualquier modelo

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

113

viable de los genes de inmunoglobulina tena que tomar en cuenta las siguientes propiedades de los anticuerpos:

La vasta diversidad de especificidades de anticuerpo La presencia en las cadenas pesadas y ligeras de la Ig de una regin variable en el extremo amino terminal y una regin constante en el extremo carboxilo terminal La existencia de isotipos con la misma especificidad antignica, que resultan de la asociacin de una regin variable dada con diferentes regiones constantes de cadena pesada

fenmeno similar en conejos, y encontr que un marcador alotpico particular en la regin variable de la cadena pesada podra vincularse con las regiones constantes de cadena pesada , y . Numerosas pruebas adicionales confirmaron que una secuencia nica de la regin variable, que defina una especificidad antignica particular, poda relacionarse con mltiples secuencias de la regin constante de la cadena pesada; en otras palabras, pueden expresarse diferentes clases o isotipos de anticuerpo (p. ej., IgG, IgM) con secuencias de regin variable idnticas.

Modelos de lnea germinal y de variacin somtica propuestos para explicar la diversidad de anticuerpos
Durante varias dcadas, los inmunlogos trataron de idear un mecanismo gentico que explicara la enorme diversidad de estructuras del anticuerpo. Surgieron as dos grupos diferentes de hiptesis. Las teoras de la lnea germinal sostenan que el genoma, al que contribuan las clulas germinales, vulo y espermatozoide, contena un gran repertorio de genes de inmunoglobulina; por consiguiente, estas teoras no incluan mecanismos genticos especiales para explicar la diversidad de anticuerpos. Aducan que el inmenso valor del sistema inmunitario para la supervivencia justificaba la asignacin de un segmento considerable del genoma a la codificacin de anticuerpos. En cambio, las teoras de la variacin somtica sostenan que el genoma posea una cantidad relativamente pequea de genes de inmunoglobulina, a partir de los cuales se generaba un gran nmero de especificidades de anticuerpo en las clulas somticas por mutacin o recombinacin. A medida que se determinaron las secuencias de aminocidos de ms y ms inmunoglobulinas, result obvio que deban existir mecanismos no slo para crear la diversidad de anticuerpos sino tambin para conservar la constancia. Ya fuera que la diversidad se generara por la lnea germinal o por mecanismos somticos, persista una paradoja: cmo podra conservarse la estabilidad en la regin constante (C) mientras algn tipo de mecanismo diversificador generaba la regin variable (V)? Ni quienes proponan la lnea germinal ni los que proclamaban la variacin somtica podan ofrecer una explicacin razonable para esta caracterstica central de la estructura de la inmunoglobulina. Para los seguidores de la lnea germinal era difcil hallar un mecanismo evolutivo que explicara la diversidad en la parte variable de los mltiples genes de cadenas pesada y ligera y que al mismo tiempo preservara sin cambio la regin constante de cada uno. Para los que se inclinaban por la variacin somtica era tambin difcil concebir un mecanismo que pudiera diversificar la regin variable de un gen de cadenas pesada o ligera individual en las clulas somticas sin permitir la alteracin de la secuencia de aminocidos codificada por la regin constante. Se formul una tercera caracterstica estructural que deba ser explicada cuando la secuenciacin de aminocidos de la protena del mieloma humano, la denominada Ti1, revel que secuencias idnticas de la regin variable se relacionaban con las regiones constantes de cadena pesada y . C. Todd observ un

Dreyer y Bennett propusieron un revolucionario modelo de dos genes-un polipptido

En un intento de desarrollar un modelo gentico que conciliara los hechos conocidos sobre la estructura de las inmunoglobulinas, W. Dreyer y J. Bennett sugirieron, en su artculo terico clsico de 1965, que dos genes separados codificaban una misma cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, un gen para la regin V (regin variable) y el otro para la regin C (regin constante). Sealaron que estos dos genes de alguna manera deban reunirse a nivel del DNA para formar un mensaje continuo que pudiera transcribirse y traducirse a una cadena pesada o ligera de Ig nica. En ese tiempo era generalmente aceptado que un gen codificaba un polipptido, de modo que su propuesta result revolucionaria. Ms an, propusieron que en la lnea germinal haba cientos o miles de genes de regin V, en tanto que slo era necesario que existieran copias nicas de genes de clase y subclase de la regin C. El valor de este tipo de modelo de recombinacin (que fusionaba elementos de la lnea germinal y teoras de la variacin somtica) resida en que era capaz de explicar aquellas inmunoglobulinas en las que una regin V individual se combinaba con varias regiones C. Al postular un gen de regin constante nico para cada clase y subclase de inmunoglobulina, el modelo tambin pudo explicar la conservacin de funciones efectoras biolgicas necesarias al tiempo que permita la diversificacin evolutiva de genes de la regin variable. Al principio, el apoyo para la hiptesis de Dreyer y Bennett fue indirecto. Estudios pioneros de cintica de hibridacin del DNA mediante una sonda radiactiva de DNA de regin constante indicaron que la sonda se hibridaba con tan slo uno o dos genes, lo que confirmaba la prediccin del modelo, que indicaba que nicamente existan una o dos copias de cada clase y subclase de la regin constante. Sin embargo, la prueba indirecta no fue suficiente para vencer la obstinada resistencia de la comunidad cientfica sobre la hiptesis de Dreyer y Bennett. La sugerencia de que dos genes codificaban un polipptido individual contradeca el principio prevaleciente de un gen-un polipptido y no tena precedente en ningn sistema biolgico conocido. Como sucede con frecuencia en la ciencia, la comprensin terica e intelectual de la organizacin del gen de Ig progres ms que la metodologa disponible. Aunque el modelo de Dreyer y Bennett proporcionaba un marco terico para resolver el dilema entre los datos de la secuencia de Ig y la organizacin gnica, la validacin real de su hiptesis tuvo que esperar a que ocurrieran varios adelantos tecnolgicos importantes en el campo de la biologa molecular.

114

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

Lnea germinal ER ER Vn 5 V2 ER V1 J Sonda Digestin con ER C 3 Reordenamiento ER ER ER Eliminado 5 Vn ER

Reordenado ER V2 V1 J Sonda Digestin con ER C 3 ER ER

Lnea germinal

Reordenado

Southern blot

FIGURA 5-2 Bases experimentales para el diagnstico del reordenamiento en un locus de inmunoglobulina. El nmero y tamao de fragmentos de restriccin generados por el tratamiento del DNA con una enzima de restriccin dependen de la secuencia del DNA. La digestin de DNA reordenado con una enzima de restriccin (ER) proporciona un patrn de fragmentos de restriccin que dieren de los obtenidos mediante digestin de un locus no reordenado con la misma ER. Los fragmentos suelen analizarse mediante la tcnica de Southern blotting. En este ejemplo se utiliz una sonda con un segmento gnico J para identicar la digestin de fragmentos con ER que incluye todo este segmento o porciones de l. Como se muestra, el reordenamiento tiene como resultado la eliminacin de un segmento de DNA de la lnea germinal y la prdida de los sitios de restriccin que incluye. Otra consecuencia es la unin de segmentos gnicos, en este caso un segmento V y

uno J, que estn separados en la lnea germinal. Por lo tanto, los fragmentos dependientes de la presencia de este segmento para su generacin no existen en el DNA digerido con enzima de restriccin del locus reordenado. Ms an, el DNA reordenado origina fragmentos nuevos que no existen en el DNA digerido en la conguracin de la lnea germinal. Este hecho puede ser til porque tanto las clulas B como las no B tienen dos loci de inmunoglobulina. Uno de ellos se reordena y el otro no. Por consiguiente, a menos que un accidente gentico ocasione la prdida del locus de la lnea germinal, la digestin del DNA de una clona de clulas de mieloma o clulas B normal crea un patrn de restriccin que incluye todos los productos digeridos de una lnea germinal aunados a cualquier fragmento nuevo que se genere por el cambio en la secuencia de DNA que acompaa al reordenamiento. Obsrvese que slo se muestra uno de los varios segmentos gnicos J que existen.

La bomba de Tonegawa: los genes de la inmunoglobulina se reordenan

En 1976, S. Tonegawa y N. Hozumi encontraron la primera prueba directa indicativa de que genes separados codificaban las regiones V y C de las inmunoglobulinas y que los genes se reordenaban en el curso de la diferenciacin de la clula B. Tonegawa y Hozumi seleccionaron DNA de clulas embrionarias y clulas de mieloma adultas (clulas en etapas muy diferentes de desarrollo), y utilizaron varias endonucleasas de restriccin para generar fragmentos de DNA. Despus separaron estos fragmentos por tamao y analizaron su capacidad de hibridarse con una sonda de mRNA radiomarcada. Dos fragmentos de restriccin separados procedentes del DNA embrionario se hibridaron con el mRNA, en tanto que slo un fragmento de restriccin aislado procedente del DNA del mieloma adulto lo hizo con la misma sonda. Tonegawa y Hozumi sugirieron que, durante la diferenciacin de los linfocitos desde la etapa embrionaria hasta la etapa de clula plasmtica del todo diferenciada (representada en su sistema por las clulas de mieloma), los genes V y C experimentan reordenamiento. En el embrin, los genes V

y C estn separados por un segmento grande de DNA que contiene un sitio de endonucleasa de restriccin; durante la diferenciacin, los genes V y C se acercan entre s y se elimina la secuencia intermedia de DNA. Este trabajo cambi el campo de la inmunologa, y en 1987, Tonegawa recibi el premio Nobel. En los experimentos pioneros de Tonegawa y Hozumi se empleaba un procedimiento tedioso y tardado que ms adelante se sustituy por el mtodo mucho ms potente del anlisis Southern blot. Este mtodo, en la actualidad de uso universal para investigar el reordenamiento de los genes de inmunoglobulina, elimina la necesidad de eluir los fragmentos de restriccin de DNA separados de cortes de gel antes del anlisis mediante hibridacin con una sonda de segmento gnico de inmunoglobulina. La figura 5-2 muestra la deteccin del reordenamiento en el locus de la cadena ligera comparando los fragmentos producidos por digestin de DNA de una clona de clulas de linaje B con el patrn que se obtiene por digestin de clulas no B (p. ej., semen o clulas hepticas). El reordenamiento de un gen V elimina una seccin extensa de DNA de la lnea germinal y por tanto crea diferencias entre loci de Ig reordenados y no reordenados en la distribucin y el nmero de sitios de restriccin. Esto genera diferentes pa-

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

115

trones de restriccin por loci reordenados y no reordenados. La aplicacin extensa de este mtodo demostr que el modelo de dos genes de Dreyer y Bennett un gen que codifica la regin variable y otro la regin constante se aplicaba tanto a los genes de cadena pesada como a los de cadena ligera.

Organizacin multignica de genes de inmunoglobulina

A medida que se llev a cabo la clonacin y secuenciacin del DNA de cadenas ligeras y pesadas, se descubri una complejidad an mayor que la anticipada por Dreyer y Bennett. Familias multignicas separadas situadas en diferentes cromosomas codifican las cadenas ligeras y y las cadenas pesadas (cuadro 5-1). En el DNA de la lnea germinal, cada una de estas familias multignicas contiene varias secuencias de codificacin llamadas segmentos gnicos, separadas por regiones que no codifican. Durante la maduracin de la clula B estos segmentos se reordenan y se acercan entre s para formar genes de inmunoglobulina funcionales.

Cada familia multignica tiene caractersticas distintas

Las familias de las cadenas ligeras y contienen segmentos gnicos V, J y C; los segmentos VJ reordenados codifican la regin variable de las cadenas ligeras. La familia de la cadena pesada posee segmentos gnicos V, D, J y C; los segmentos gnicos VDJ reordenados codifican la regin variable de la cadena pesada. En cada familia de genes los segmentos gnicos C codifican las regiones constantes. A cada segmento gnico V lo precede en su extremo 5 un exn pequeo que codifica un pptido seal o lder (L) corto, el cual gua la cadena pesada o ligera a travs del retculo endoplsmico. El pptido seal se escinde (separa) de las cadenas ligera y pesada nacientes antes del ensamblaje de la molcula de inmunoglobulina terminada. As, los aminocidos codificados por esta secuencia lder no aparecen en la molcula de inmunoglobulina terminada.

su secuencia de nucletidos completa. Cuando se compar la secuencia nucleotdica con la secuencia de aminocidos conocida de la regin variable de la cadena se advirti una discrepancia inusitada. Aunque los primeros 97 aminocidos de la regin variable de la cadena correspondieron a la secuencia nucleotdica del codn, los 13 aminocidos restantes carboxilo terminal de la regin variable de la protena no coincidieron. Result que a muchos pares de bases (pb) de distancia, un segmento gnico separado de 39 pb llamado J (del ingls joining, unin) codificaba los 13 aminocidos restantes de la regin variable de la cadena . En consecuencia, un gen de la regin variable funcional contiene dos segmentos de codificacin un segmento V 5 y otro J 3 separados por una secuencia de DNA no codificadora en el DNA de la lnea germinal no reordenado. La familia multignica en la lnea germinal del ratn contiene dos segmentos gnicos funcionales V , tres J y dos C (fig. 5-3a). Adems de las versiones funcionales de estos genes, algunas formas son seudogenes, genes defectuosos incapaces de codificar protena; tales genes se indican con la letra griega . Como hecho interesante, el compaero de la regin constante de J 4, C 4, es un gen por completo funcional. El segmento V y los tres segmentos gnicos funcionales J codifican la regin variable de la cadena ligera, y cada uno de los tres segmentos gnicos C funcionales codifica la regin constante de uno de los tres subtipos de cadena ( 1, 2 y 3). En el ser humano el locus es ms complejo. Existen 30 segmentos gnicos funcionales V y cuatro J ; hay siete segmentos C , de los cuales slo cuatro son funcionales. Adems de los segmentos gnicos funcionales, el complejo humano contiene muchos seudogenes V y J .

Familia multignica de la cadena

En el ratn, la familia multignica de la cadena contiene alrededor de 75 segmentos gnicos V , cada uno de ellos con una secuencia lder adyacente a una corta distancia corriente arriba (es decir, en el lado 5 ). Existen cinco segmentos gnicos J (uno de los cuales es un seudogn no funcional) y un segmento gnico C nico (fig. 5-3b). Al igual que en la familia multignica , los segmentos gnicos V y J codifican la regin variable de la cadena ligera , y el segmento gnico C codifica la regin constante. Debido a que slo hay un segmento gnico C , no hay subtipos de cadenas ligeras . La comparacin de las partes a y b de la figura 5-3 muestra que el ordenamiento de los segmentos gnicos es muy distinto en las familias gnicas y . La familia multignica de la cadena del ser humano, que tiene una organizacin similar a la del ratn, contiene unos 40 segmentos gnicos V , cinco J y uno C .

Familia multignica de la cadena

La primera prueba de que en realidad dos segmentos gnicos codificaban la regin variable de la cadena ligera se obtuvo cuando Tonegawa clon el DNA de la lnea germinal que codifica la regin variable de la cadena ligera de ratn y determin

CUADRO 5-1

Localizaciones cromosmicas de los genes de inmunoglobulina en seres humanos y ratones

CROMOSOMA Ser humano 22 2 14 Ratn 16 6 12

Familia multignica de la cadena pesada

La organizacin de los genes de la cadena pesada de la inmunoglobulina es similar a la de los genes de las cadenas ligeras y , pero ms compleja (fig. 5-3c). Un segmento gnico adicional codifica parte de la regin variable de la cadena pesada. Leroy Hood y colaboradores propusieron por primera vez la existencia de este segmento gnico; esos investigadores compararon la secuencia de aminocidos de la regin variable de la cadena pesada con las secuencias de nucletidos de VH y JH. Se encontr que el segmento gnico VH codifica los aminocidos 1 a 94 y el segmento gnico JH los aminocidos 98 a 113; empero, ninguno

Gen Cadena ligera Cadena ligera Cadena pesada

116

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

FIGURA 5-3 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

Organizacin de los segmentos gnicos de la lnea germinal de la inmunoglobulina en el ratn: a) cadena ligera , b) cadena ligera y c) cadena pesada
J 2 C2 J 4

a) DNA de cadena L V2 5 70 kb 1.2 kb 2.0 kb C4 L V1 19 kb J3 1.4 kb C3 1.7 kb J1 1.3 kb C1 3 1.3 kb

b) DNA de cadena n = 85 L V1 L V2 5

L V n 23 kb

C 3 2.5 kb

c) DNA de cadena pesada n = 134 DH1 DH13 JH1 L VH1 L VHn 5

JH4 6.5 kb

C 4.5 kb

C 55 kb

C 3 34 kb

C 1 21 kb

C 2b 15 kb

C 2a 14 kb

C 12 kb

C 3

Los segmentos gnicos V, J y C codican las cadenas ligeras y y los segmentos gnicos V, D, J y C la cadena pesada. Abajo del diagrama de cada cadena se muestran las distancias en kilobases

(kb) que separan los diversos segmentos gnicos en el DNA de la lnea germinal del ratn.

de estos segmentos gnicos llevaba informacin para codificar los aminocidos 95 a 97. Cuando se determin la secuencia de nucletidos para un DNA de mieloma reordenado y se compar con la secuencia de DNA de la lnea germinal, se reconoci una secuencia de nucletidos adicional entre los segmentos gnicos VH y JH. Esta secuencia de nucletidos correspondi a los aminocidos 95 a 97 de la cadena pesada. A partir de estos resultados, Hood y colaboradores propusieron que para codificar la regin variable completa de las cadenas pesadas, un tercer segmento gnico de la lnea germinal debe unirse con los segmentos gnicos VH y JH. Este segmento gnico, que codifica aminocidos dentro de la tercera regin determinante de complementariedad (CDR3), se design D por diversidad, en virtud de su contribucin a la generacin de la diversidad de anticuerpos. Tonegawa y colaboradores localizaron segmentos gnicos D dentro del DNA de la lnea germinal del ratn con una sonda de cDNA complementaria a la regin D, que se hibrid con una extensin del DNA situada entre los segmentos gnicos VH y JH. Mediante secuenciacin directa del DNA se demostr que la familia multignica de cadena pesada en el cromosoma humano 14 contiene 39 segmentos gnicos VH localizados corriente arriba de un grupo de 23 segmentos gnicos DH funcionales. Tal y como sucede con los genes de cadena ligera, a cada segmento gnico VH lo precede una secuencia lder a una distancia corta corriente arriba. Corriente abajo de los segmentos gnicos DH

se encuentran seis segmentos gnicos funcionales JH seguidos por una serie de segmentos gnicos CH. Cada segmento gnico CH codifica la regin constante de un isotipo de cadena pesada de inmunoglobulina. Los segmentos gnicos CH consisten en exones de codificacin e intrones que no codifican. Cada exn codifica un dominio separado de la regin constante de la cadena pesada. En el ratn se encuentra una organizacin similar del gen de cadena pesada. La conservacin de funciones biolgicas efectoras importantes de la molcula de anticuerpo se debe al nmero limitado de genes de regin constante de la cadena pesada. En el ser humano y los ratones, los segmentos gnicos CH estn dispuestos de modo secuencial en el orden C , C , C , C , C (fig. 5-3c). Este ordenamiento secuencial no es fortuito: suele relacionarse con la expresin secuencial de las clases de inmunoglobulina en el curso del desarrollo de la clula B y la respuesta inicial de IgM de la clula B a su primer encuentro con un antgeno.

Reordenamientos gnicos de regin variable

En las secciones previas se demostr que los genes funcionales que codifican las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina se ensamblan mediante fenmenos de recombinacin a nivel

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

117

del DNA. Estos fenmenos, y los acontecimientos paralelos que incluyen los genes del receptor de clula T, son los nicos reordenamientos de DNA especficos de sitio conocidos en vertebrados. Los reordenamientos gnicos de la regin variable ocurren en una secuencia ordenada durante la maduracin de la clula B en la mdula sea. Primero se reordenan los genes de la regin variable de la cadena pesada y luego los genes de la regin variable de la cadena ligera. Al final de este proceso, cada clula B contiene una nica secuencia funcional de DNA de regin variable para su cadena pesada y otra para su cadena ligera. El proceso de reordenamiento del gen de la regin variable produce clulas B maduras inmunocompetentes; cada una de estas clulas tiene la funcin de producir anticuerpo con un sitio de unin codificado por la secuencia particular de sus genes V reordenados. Como se describe ms adelante en este captulo, los reordenamientos de los genes de la regin constante de la cadena pesada (un proceso llamado cambio o conmutacin de clase) inducen ms cambios en la clase de inmunoglobulina (isotipo) expresada por una clula B, pero estos cambios no afectan la especificidad antignica de las clulas. Las etapas del reordenamiento del gen de regin variable tienen una secuencia ordenada, pero para los fines de esta exposicin pueden considerarse fenmenos aleatorios cuyo resultado es la determinacin al azar de la especificidad de la clula B. En esta seccin se describen el orden, el mecanismo y las consecuencias de estos reordenamientos.
DNA de cadena L V1 de la lnea germinal 5 L V 23 L V n

El DNA de la cadena ligera experimenta reordenamientos VJ

La expresin de las cadenas ligeras y requiere el reordenamiento de los segmentos gnicos V y J de la regin variable. En el ser humano, cualesquiera de los genes V funcionales se combina con cualesquiera de las cuatro combinaciones J -C funcionales. En el ratn, los acontecimientos son un poco ms complicados. El reordenamiento de DNA puede unir el segmento gnico V 1 con el J 1 o el J 3, o bien el segmento gnico V 2 puede unirse con el segmento gnico J 2. En el DNA de la cadena ligera del ser humano o el ratn, cualesquiera de los segmentos gnicos V puede unirse con cualesquiera de los segmentos gnicos J funcionales. Los genes y reordenados contienen las regiones siguientes en orden desde el extremo 5 al 3 : un exn lder (L) corto, una secuencia no codificadora (intrn), un segmento gnico VJ unido, un segundo intrn y la regin constante. Corriente arriba de cada segmento lder est una secuencia promotora. A la secuencia de la cadena ligera reordenada la transcribe la polimerasa de RNA desde el exn L a travs del segmento C hasta la seal de detencin (alto o stop), lo que da por resultado un transcrito primario de RNA de cadena ligera (fig. 5-4). Los intrones en el transcrito primario son eliminados por enzimas de procesamiento del RNA, y los RNA mensajeros de cadena ligera resultantes salen a continuacin del ncleo. El mRNA de cadena ligera se une a ribosomas y se traduce en la protena
J

C 3

Unin V-J DNA de cadena reordenado L V1 5 Transcripcin Transcrito primario de RNA L V J J 5 C 3 Poliadenilacin Empalme de RNA mRNA L V J C (A)n Traduccin Polipptido naciente L V J C Cola poli-A L V J J C 3

Cadena ligera

V J C

FIGURA 5-4 Reordenamiento gnico de la cadena ligera y fenmenos del procesamiento del RNA necesarios para generar

una protena de cadena ligera . En este ejemplo, el reordenamiento une V 23 y J 4.

118

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

DNA de cadena H de la lnea germinal

L VH1 5

L VHn

DH1 DH7 DH13

JH

C 3

C 1

C 2b

C 2a

C 3

Unin D-J L VH1 5 Unin V-DJ DNA de cadena H 5 reordenado L VH1 L VH20 L V D J JH C C C 3 C 1 C 2b C 2a C C 3 Transcripcin L V DJ Transcrito primario de RNA 5 C C 3 Poliadenilacin Empalme de RNA L V D J C (A)n o bien Traduccin L V D J C Polipptido naciente V D J C o bien Cadena pesada Cadena pesada o bien V D J C (A)n Traduccin L V D J C L VH21 L VHn DH1 DH6 DH JH C C C 3 C 1 C 2b C 2a C C 3

L V D J C mRNA

FIGURA 5-5 Reordenamiento del gen de cadena pesada y fenmenos de procesamiento del RNA necesarios para generar las protenas de las cadenas pesadas o terminadas. Se requieren dos uniones de DNA para generar un gen de cadena pesada funcional: una unin DH con JH y una unin de VH con DHJH. En este ejemplo estn unidos VH21, DH7 y JH3. Aunque la expresin de genes

de cadena pesada funcionales suele ser similar a la expresin de genes de cadena ligera, incluye un procesamiento diferencial del RNA que crea varios productos diferentes, incluidas las cadenas pesadas o . Cada gen C se dibuja como una secuencia de codicacin nica; en realidad, cada uno est organizado como una serie de exones e intrones.

de cadena ligera. La secuencia lder en el extremo amino terminal dirige la cadena polipeptdica creciente hacia la luz del retculo endoplsmico rugoso y en seguida se escinde, de modo que no existe en el producto protenico de cadena ligera terminado.

El DNA de cadena pesada experimenta reordenamientos VDJ

La generacin de un gen de cadena pesada de inmunoglobulina funcional requiere dos fenmenos de reordenamiento separados dentro de la regin variable. Como se ilustra en la figura 5-5, primero un segmento gnico DH se une a un segmento JH; a continuacin, el segmento DHJH resultante se une a un segmento VH para crear una unidad VHDHJH que codifica la totalidad de la regin variable. En el DNA de cadena pesada, el reordenamiento de la regin variable produce un gen reordenado que consta de las siguientes secuencias, a partir del extremo 5 : un

exn L corto, un intrn, un segmento VDJ unido, otro intrn y una serie de segmentos gnicos C. Tal y como se observa con los genes de cadena ligera, a una distancia corta corriente arriba de cada secuencia lder de la cadena pesada se halla una secuencia promotora. Una vez que termina el reordenamiento del gen de cadena pesada, la polimerasa de RNA puede unirse a la secuencia promotora y transcribir la totalidad del gen de cadena pesada, incluidos los intrones. Al inicio se transcriben los segmentos gnicos C y C . La poliadenilacin diferencial y el empalme de RNA eliminan los intrones y procesa el transcrito primario para generar mRNA, incluyendo el transcrito C o el C . A continuacin se traducen estos dos mRNA y se escinde el pptido lder del polipptido naciente que resulta, lo que crea cadenas y terminadas. La produccin de dos diferentes mRNA de cadena pesada permite que la clula B madura, inmunocompetente, exprese IgM e IgD con idntica especificidad de antgeno en su superficie.

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

119

Mecanismo de los reordenamientos de DNA de regin variable

Una vez expuestos los resultados de los reordenamientos de la regin variable, se examina ahora con detalle el modo en que sucede este proceso durante la maduracin de las clulas B.

a un segmento JL y no a otro segmento VL; asimismo, garantiza que los segmentos VH, DH y JH se unan en un orden apropiado y que segmentos del mismo tipo no se unan entre s.

Los segmentos gnicos se unen mediante recombinasas

La recombinacin V(D)J, que se lleva a cabo en las uniones entre RSS y secuencias de codificacin, son catalizadas por enzimas que se denominan en conjunto recombinasa V(D)J. La identificacin de las enzimas que catalizan la recombinacin de los segmentos gnicos V, D y J se inici a fines de la dcada de 1980 y an se encuentra en curso. En 1990 David Schatz, Marjorie Oettinger y David Baltimore publicaron por primera vez la identificacin de dos genes activadores de la recombinacin, designados RAG-1 y RAG-2, cuyas protenas codificadas actan de forma sinrgica y son necesarias para mediar la unin V(D)J. Las protenas RAG-1 y RAG-2 son los nicos productos gnicos especficos linfoides que se ha demostrado que participan en el reordenamiento V(D)J. La recombinacin de segmentos gnicos de la regin variable consiste en las etapas siguientes, catalizadas por un sistema de enzimas recombinasa (fig. 5-7): 1. Reconocimiento de secuencias seal de recombinacin (RSS) por enzimas recombinasa, seguida por sinapsis en la que se colocan en proximidad dos secuencias seal y las secuencias de codificacin adyacentes (segmentos gnicos). 2. Escisin de una cadena de DNA por RAG-1 y RAG-2 en las uniones de las secuencias seal y las secuencias de codificacin. 3. Una reaccin catalizada por RAG-1 y RAG-2 en la que el grupo OH 3 libre en la cadena de DNA cortada ataca el enlace fosfodister que une la cadena opuesta a la secuencia seal, lo que produce de manera simultnea una estructura en horquilla en el extremo cortado de la secuencia de codificacin y una rotura a ras de la doble cadena fosforilada 5 en la secuencia seal.

Secuencias seal dirigen la recombinacin

El descubrimiento de dos secuencias relacionadas de manera estrecha conservadas en el DNA de la lnea germinal de la regin variable inici el camino para comprender de modo ms amplio el mecanismo de los reordenamientos gnicos. Estudios de secuenciacin del DNA revelaron la presencia de secuencias seal de recombinacin (RSS, del ingls recombination signal sequences) nicas, que flanquean cada segmento gnico V, D y J de la lnea germinal. Una RSS se ubica en el lado 3 de cada segmento gnico V, en el lado 5 de cada segmento gnico J y a ambos lados de cada segmento gnico D. Estas secuencias funcionan como seales para el proceso de recombinacin que reordena los genes. Cada RSS contiene un heptmero palindrmico conservado y una secuencia nonmera rica en AT conservada, separada por una secuencia intermedia de 12 a 23 pares de bases (pb) (fig. 5-6a). Las secuencias intermedias de 12 y 23 pb corresponden, respectivamente, a uno y dos giros de la hlice de DNA; por ello las secuencias se denominan secuencias seal de recombinacin de un giro y secuencias seal de dos giros. La secuencia seal V tiene un espaciador de un giro, y la secuencia seal J , uno de dos giros. En el DNA de la cadena ligera este orden se invierte; es decir, la secuencia seal V tiene un espaciador de dos giros y la secuencia de J uno de un giro. En el DNA de cadena pesada, las secuencias seal de los segmentos gnicos VH y JH tienen espaciadores de dos giros y las seales a cada lado del gen DH poseen espaciadores de un giro (fig. 5-6b). Las secuencias seal que tienen un espaciador de un giro slo pueden unirse a secuencias que poseen un espaciador de dos giros (la llamada regla de unin un giro-dos giros). Esta regla de unin asegura, por ejemplo, que un segmento VL slo se una
a) Secuencia nucleotdica de RSS CACAGTG GTGTCAC Heptmero 23 bp 23 bp ACAAAAACC TGTTTTTGG Nonmero GGTTTTTGT CCAAAAACA Nonmero

12 bp 12 bp

CACTGTG GTGACAC Heptmero

FIGURA 5-6 Dos secuencias conservadas en el DNA que codica las cadenas ligera y pesada funcionan como secuencias seal de recombinacin (RSS). a) Ambas secuencias seal consisten en un heptmero palindrmico conservado y un nonmero conservado rico en AT, ambos separados por espaciadores no conservados de 12 o 23 pares de bases. b) Los dos tipos de RSS designados como RSS de un giro y RSS de dos giros tienen localizaciones caractersticas dentro del DNA de la lnea germinal que codica las cadenas y y cadenas pesadas. Durante el reordenamiento del DNA, los segmentos gnicos adyacentes a la RSS de un giro slo pueden unirse con segmentos adyacentes a la RSS de dos giros.

RSS de dos giros

RSS de un giro

b) Localizacin de RSS en el DNA de inmunoglobulina de lnea germinal L V DNA de cadena 5 L V DNA de cadena 5 L VH DNA de cadena pesada 5 DH J C 3 JH CH 3 J C 3

120

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

b) Unin por inversin

a) Unin por delecin L V 5 RSS J 3

V L 5

J 3

4. Corte de la horquilla con objeto de generar sitios para la adicin de nucletidos de regin P, seguido del recorte de algunos cuantos nucletidos de la secuencia de codificacin por una endonucleasa de cadena nica. 5. Adicin hasta de 15 nucletidos, llamados nucletidos de regin N, en los extremos cortados de las secuencias de codificacin V, D y J de la cadena pesada por la enzima transferasa de desoxinucleotidilo terminal. 6. Reparacin y ligadura para unir secuencias de codificacin y para enlazar las secuencias seal, catalizadas por enzimas reparadoras de roturas de doble cadena normal (DSBR). La recombinacin tiene como consecuencia la formacin de una unin codificadora (o de codificacin), situada entre las secuencias de codificacin, y una unin seal, entre las secuencias seal de recombinacin (RSS). La orientacin transcripcional de los segmentos gnicos por unir determina el destino de la unin seal y el DNA intermedio. Cuando los dos segmentos gnicos se encuentran en la misma orientacin transcripcional, la unin da lugar a la eliminacin de la unin seal y el DNA intermedio como un producto de escisin circular (fig. 5-8). Con menos frecuencia, los dos segmentos gnicos tienen orientaciones opuestas. En este caso, se observa la unin por inversin del DNA, cuyo efecto es la retencin tanto de la unin codificadora como de la unin seal (y el DNA intermedio) en el cromosoma. En el locus humano, alrededor de la mitad de los segmentos gnicos V estn invertidos con respecto a J y, por consiguiente, su unin ocurre por inversin.

1 Reconocimiento de RSS por RAG-1/2 y sinapsis 3

5 2 Segmentacin de DNA monocatenario por RAG-1/2 3

3 Formacin de horquilla y rotura del DNA bicatenario por RAG-1/2

4 La segmentacin aleatoria de la horquilla por endonucleasa genera sitios para la adicin de nucletidos P

Reparacin y 5 ligadura de Unin secuencias Unin de codificacin de codificacin seal y de seal para + formar uniones por enzimas DSBR

V J

5 Adicin opcional a segmentos de cadena H de nucletidos N por TdT 3 Unin de codificacin

= RSS de un giro Unin seal = RSS de dos giros

FIGURA 5-7 El modelo que muestra el proceso general de recombinacin de los segmentos gnicos de inmunoglobulina se ilustra con V y J . a) La unin por eliminacin (delecional) ocurre cuando los segmentos gnicos por unirse poseen la misma orientacin transcripcional (indicada por echas azules horizontales). Este proceso proporciona dos productos: una unidad VJ reordenada que incluye la unin codicadora y un producto de escisin circular que se integra con las secuencias seal de recombinacin (RSS), la unin seal y el DNA intermedio. b) Ocurre la unin por inversin cuando los segmentos gnicos tienen orientaciones transcripcionales opuestas. En este caso se retienen las RSS, la unin seal y el DNA intermedio y se invierte la orientacin de uno de los segmentos unidos. En ambos tipos de recombinacin pueden eliminarse o agregarse unos cuantos nucletidos en los extremos cortados de las secuencias de codicacin antes que se unan de nueva cuenta.

FIGURA 5-8 DNA circular aislado de timocitos en el que se

reorden el DNA que codica las cadenas del receptor de clula T (TCR) en un proceso parecido al que ocurre en los genes de inmunoglobulina. El aislamiento de este producto de escisin circular es una prueba directa del mecanismo de unin por eliminacin que se muestra en la gura 5-7. [Tomada de Okazaki K, et al.,
1987, Cell 49:477.]

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

121

RSS CACTGTG 5 3 4 1 2 GAGGATGCTCC V Reordenamientos productivos

J GTGGACTAGG Flexibilidad de unin

CACAGTG RSS Glu Asp Ala Thr Arg

GAGGATGCGACTAGG Glu Asp Gly Thr Arg

VJ o VDJ resultante contenga mltiples codones de detencin, que interrumpen la traduccin (fig. 5-9). Cuando se unen en fase segmentos gnicos, se conserva el marco de lectura. En este reordenamiento productivo, la unidad VJ o VDJ resultante puede traducirse en su totalidad y producir un anticuerpo completo. En reordenamientos improductivos de un alelo, una clula B puede ser capaz an de reordenar el otro alelo de manera productiva. Si no se producen un gen de cadena pesada y uno de cadena ligera reordenados en fase, la clula B muere por apoptosis. Se estima que slo uno de cada tres intentos de las uniones VL-JL y VH-DHJH es productivo. Como resultado, progresan hacia la madurez menos de 1/9 (11%) de las clulas pre-B en etapa temprana en la mdula sea y salen de ella como clulas B inmunocompetentes maduras.

GAGGATGGGACTAGG Glu Asp Trp Thr Arg

La exclusin allica asegura la especicidad antignica nica

Al igual que todas las clulas somticas, las clulas B son diploides y contienen cromosomas maternos y paternos. Aunque una clula B es diploide, expresa los genes de cadena pesada y ligera reordenados slo de un cromosoma. El proceso por el cual se lleva a cabo lo anterior, llamado exclusin allica, asegura que las clulas B funcionales nunca contengan ms de una unidad VHDHJH y una VLJL (fig. 5-10). Por supuesto, esto es esencial para la especificidad antignica de la clula B, ya que la expresin de

3 Reordenamientos improductivos

GAGGATTGGACTAGG Glu Asp Ala Asp Alto

GAGGATGCGGACTAGG Glu Val Asp Alto

GAGGTGGACTAGG

FIGURA 5-9 La exibilidad de unin en la unin de los segmentos gnicos de inmunoglobulina se ilustra con V y J . En la unin en fase (echas 1, 2 y 3) se genera un reordenamiento productivo, que puede traducirse en una protena. La unin fuera de fase (echas 4 y 5) conduce a un reordenamiento improductivo que contiene codones de detencin y no se traduce en una protena.

Cromosomas maternos Cromosomas paternos

HH

Los reordenamientos del gen de inmunoglobulina (Ig) pueden ser productivos o improductivos
Una de las caractersticas notables de la recombinacin de segmentos gnicos es la diversidad de las uniones codificadoras que se forman entre dos segmentos gnicos cualesquiera. Aunque las roturas del DNA de doble cadena que inician los reordenamientos V(D)J se introducen de manera precisa en las uniones de secuencias seal y secuencias de codificacin, la unin ulterior de estas ltimas no es precisa. La diversidad de enlace en las uniones de codificacin VJ y VDJ se generan por varios mecanismos: variacin en el corte de la horquilla para generar nucletidos P, diferencias en el recorte de las secuencias de codificacin, variacin en la adicin del nucletido N y flexibilidad en la unin de las secuencias de codificacin. La introduccin de aleatoriedad en el proceso de unin ayuda a generar la diversidad de anticuerpos, lo que contribuye a la hipervariabilidad del sitio de unin de antgeno. (Este fenmeno se comenta con mayor detalle ms adelante, en la seccin sobre generacin de la diversidad de anticuerpos.) Otras consecuencias de la unin imprecisa es que los segmentos gnicos pueden unirse fuera de fase, de tal manera que no se preserva el marco de lectura de tripletes para la traduccin. En este reordenamiento improductivo es probable que la unidad

Reordenamiento del gen

Cadena H materna Cadena materna

*
H

* *
H

Cadena H materna

Cadena paterna

FIGURA 5-10 Debido a la exclusin allica, slo se expresan

los genes de cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina de un cromosoma parental por clula. Este proceso asegura que las clulas B tengan una especicidad antignica nica. El alelo seleccionado para reordenamiento se elige de manera aleatoria. Por consiguiente, la inmunoglobulina expresada puede contener una cadena materna y una paterna, o bien derivar ambas cadenas de un solo progenitor. nicamente las clulas B y T muestran exclusin allica. Los asteriscos (*) indican los alelos expresados.

122

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

ambos alelos tornara la clula B en multiespecfica. El fenmeno de exclusin allica sugiere que una vez que ocurren un reordenamiento productivo VH-DH-JH y uno VL-JL se apaga la maquinaria de recombinacin, de manera que no se expresan los genes de cadenas pesada y ligera en los cromosomas homlogos. G. D. Yancopoulos y F. W. Alt propusieron un modelo para explicar la exclusin allica (fig. 5-11). Estos investigadores sugirieron que una vez que se logra un reordenamiento productivo, su protena codificada se expresa y la presencia de esta protena acta como una seal para evitar un reordenamiento gnico adicional. Segn este modelo, la presencia de cadenas pesadas indica a la clula B en maduracin que suspenda el reordenamiento del otro alelo de cadena pesada y que inicie el reordenamiento de los genes de cadena ligera . Si ocurre un reordenamiento productivo, se introducen cadenas ligeras y se parean con cadenas pesadas para constituir una molcula de anticuerpo completa. La presencia de este anticuerpo suprime entonces cualquier reordenamiento ulterior de cadena ligera. Si el reordenamiento es improductivo para ambos alelos ,

se inicia el reordenamiento de los genes de cadena . Si ninguno de los alelos se reordena de manera productiva, tal vez la clula B deje de madurar y muera pronto por apoptosis. Dos estudios con ratones transgnicos apoyan la hiptesis segn la cual los productos protenicos codificados por genes de cadenas pesada y ligera reordenados regulan el reordenamiento de los alelos restantes. En un estudio se crearon ratones transgnicos portadores de un transgn de cadena pesada reordenado. El producto del transgn fue expresado por un gran porcentaje de las clulas B, y se bloque el reordenamiento de los genes de cadena pesada de inmunoglobulina endgena. De igual forma, las clulas de un ratn transgnico que portaba un transgn de cadena ligera no reordenaron los genes endgenos de cadena cuando el transgn se expres y se asoci a una cadena pesada para formar inmunoglobulina completa. Estos estudios sugirieron que la expresin de las protenas de cadenas pesada y ligera puede prevenir en realidad el reordenamiento gnico de los alelos restantes y, por consiguiente, explicar su exclusin allica.

La cadena pesada inhibe el reordenamiento del alelo # 2 e induce el reordenamiento

Las cadenas + inhiben el reordenamiento del alelo # 2 y el reordenamiento Ig Las cadenas + inhiben el reordenamiento Las cadenas + inhiben el reordenamiento del alelo # 2

DH JH

+ Alelo productivo # 1

VH

DH JH

Alelo V J productivo # 1

Clula B progenitora

DH VH JH

V J

Alelo productivo # 2 V J

Alelo improductivo # 1

FIGURA 5-11 Modelo que explica la exclusin allica. Primero se reordenan los genes de cadena pesada, y una vez que ocurre el reordenamiento productivo de un gen de cadena pesada, el elemento protenico impide el reordenamiento del otro alelo de cadena pesada e inicia el reordenamiento del gen de cadena ligera. En el ratn, el reordenamiento de los genes de cadena ligera precede al de los genes , como se muestra aqu. En el ser humano pue-

VH DH JH

+ Alelo productivo # 1 V J

Alelo productivo # 2

Alelo improductivo # 1

+ Alelo productivo # 2

Alelo improductivo # 2

VH

Alelo improductivo # 2

JH DH

Alelo improductivo # 1

Alelo improductivo # 2

Muerte celular

Muerte celular

de ocurrir el reordenamiento o una vez que tiene lugar el reordenamiento productivo de cadena pesada. La formacin de una inmunoglobulina completa inhibe el reordenamiento adicional del gen de cadena ligera. Si sucede un reordenamiento improductivo para un alelo, entonces la clula intenta reordenar el otro alelo. [Adaptada de
G. D. Yancopoulos y F. W. Alt., 1986, Annual Review of Immunology 4:339.]

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

123

Generacin de diversidad de anticuerpos

A medida que se descifr la organizacin de los genes de inmunoglobulina, comenzaron a dilucidarse los orgenes de la inmensa diversidad de la regin variable. La teora de la lnea germinal, mencionada con anterioridad, argumentaba que la totalidad del repertorio de la regin variable se codifica en la lnea germinal del organismo y se transmite de los padres a la descendencia a travs de las clulas germinales (vulo y espermatozoide). La teora de la variacin somtica sostena que la lnea germinal contiene un nmero limitado de genes variables, que se diversifican en las clulas somticas mediante fenmenos de mutacin o de recombinacin durante el desarrollo del sistema inmunitario. Con la clonacin y secuenciacin de los genes de inmunoglobulina se justificaron en parte ambos modelos. Hasta la fecha se han identificado en ratones y el ser humano siete medios de diversificacin de anticuerpos:

La unin combinatoria VJ y VDJ genera diversidad

La contribucin de mltiples segmentos gnicos de la lnea germinal a la diversidad de anticuerpos es amplificada por el reordenamiento aleatorio de estos segmentos en clulas somticas. Es posible calcular cmo es factible lograr tanta diversidad mediante reordenamientos gnicos (cuadro 5-2). En el ser humano, la capacidad de cualesquiera de los 48 segmentos gnicos VH de combinarse con alguno de los 23 segmentos DH y cualesquiera de los seis segmentos JH permite obtener una considerable cifra de diversidad de genes de cadena pesada (48 23 6 6 624 combinaciones posibles). De igual forma, los 41 segmentos gnicos V combinados de modo aleatorio con los cinco segmentos J tienen el potencial de generar 205 posibles combinaciones en el locus , en tanto que 34 segmentos gnicos V y cinco J posibilitan hasta 170 combinaciones en el locus humano. Es importante reconocer que stos son clculos mnimos de la diversidad potencial. Como se mencion, la flexibilidad de la unin y la adicin de nucletidos P y N, y en especial la hipermutacin somtica, que se describe ms adelante, en conjunto contribuyen enormemente a la diversidad de anticuerpos. Aunque no es posible hacer un clculo exacto de su contribucin, la mayora de los investigadores en este campo acepta que aumentan el potencial para la diversidad de sitios de combinacin de anticuerpos en el ser humano a mucho ms de 1010. Ello no significa que, en cualquier momento determinado, un individuo aislado tenga un repertorio de 1010 diferentes sitios de combinacin de anticuerpo. Estas cifras muy considerables describen el conjunto de posibles variaciones, de las cuales cada sujeto lleva un subconjunto que es ms pequeo en varios rdenes de magnitud.

Mltiples segmentos gnicos de la lnea germinal Unin combinatoria V(D)J Flexibilidad de unin Adicin de nucletido de regin P (adicin P) Adicin de nucletido de regin N (adicin N) Hipermutacin somtica Asociacin combinatoria de cadenas ligeras y pesadas

Aunque no se conoce la contribucin exacta de cada una de estas vas de diversificacin para la diversidad total de anticuerpos, cada una contribuye de manera significativa al nmero inmenso de distintos anticuerpos que es capaz de generar el sistema inmunitario de los mamferos.

La exibilidad de unin contribuye a la diversidad

La enorme diversidad creada por las combinaciones V, D y J se incrementa de modo adicional por efecto de un fenmeno llamado flexibilidad de unin. Como ya se describi, la recombinacin comprende tanto la unin de secuencias seal de recombinacin para formar una unin seal como la unin de secuencias de codificacin para crear una unin codificadora (fig. 5-7). Si bien las secuencias seal siempre se unen de manera precisa, muchas veces la unin de las secuencias de codificacin es imprecisa. Por ejemplo, en un estudio se analiz la unin de las secuencias de codificacin V 21 y J 1 en varias lneas de clula pre-B. El anlisis de secuencia de las uniones seal y codificadora revel el contraste en la precisin de la unin (fig. 5-12). Como ya se ilustr, la flexibilidad de unin conduce a muchos reordenamientos improductivos, pero tambin genera combinaciones productivas que codifican aminocidos alternativos en cada unin codificadora (fig. 5-9), lo que incrementa la diversidad de anticuerpos. Se ha demostrado que la variacin de la secuencia de aminocidos creada por la flexibilidad de unin en las uniones codificadoras se sita dentro de la tercera regin hipervariable (CDR3) en el DNA de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina (cuadro 5-3). Debido a que a menudo la CDR3 contribuye en gran medida a la unin de antgeno por la molcula de anticuerpo, los cambios de aminocidos inducidos por la flexibilidad de unin son importantes para generar diversidad de anticuerpos.

Existen numerosos segmentos gnicos V, D y J de la lnea germinal

Un inventario de los segmentos gnicos funcionales V, D y J en el DNA de la lnea germinal de una persona revel 48 VH, 23 D, 6 JH, 41 V , 5 J , 34 V y 5 J segmentos gnicos. Adems de estos segmentos funcionales, existen muchos seudogenes. Debe recordarse que estas cifras proceden en gran parte de un sobresaliente estudio que secuenci el DNA de los loci de inmunoglobulina de un solo individuo. Los loci de inmunoglobulina de otras personas pueden contener cifras ligeramente distintas de tipos particulares de segmentos gnicos. Aunque en el ratn las cifras se conocen con menos precisin que en el ser humano, al parecer hay alrededor de 85 segmentos gnicos V y 134 VH, cuatro segmentos JH funcionales, cuatro J funcionales, tres J funcionales y 13 segmentos gnicos DH estimados, pero slo tres segmentos gnicos V . Aunque el nmero de genes de la lnea germinal que se encuentran en seres humanos o ratones es mucho menor que el predicho por quienes propusieron al principio el modelo de lnea germinal, es claro que mltiples segmentos gnicos V, D y J de la lnea germinal promueven la diversidad de los sitios de unin de antgeno en los anticuerpos.

124

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

CUADRO 5-2

Diversidad combinatoria de anticuerpos en seres humanos y ratones

CADENAS LIGERAS

Mltiples segmentos de lnea germinal

Cadena pesada NMERO ESTIMADO DE SEGMENTOS EN SERES HUMANOS*

V D J Unin combinatoria VDJ y VJ (posible nmero de combinaciones) Posibles relaciones combinatorias de las cadenas pesada y ligera V D J Unin combinatoria VDJ y VJ (posible nmero de combinaciones) Posibles relaciones combinatorias de las cadenas pesada y ligera 101 13 48 23

48 23 6 6 6 624 6 624 41 (205

41 0 5 5 170) 205 2.48 106 34

34 0 5 5 170

NMERO ESTIMADO DE SEGMENTOS EN RATONES* 134 13 4 4 5 252 5 252 85 (340 85 0 4 4 6) 340 1.82 106 2 2 0 3 3 6

*Estas cifras se determinaron a partir de estudios de sujetos aislados; es posible que se observen ligeras diferencias entre distintos individuos. Asimismo, en el caso de los seres humanos, slo se incluyeron en la lista segmentos gnicos funcionales. El genoma contiene segmentos adicionales incapaces de reordenarse, que presentan codones de detencin, o ambas cosas. Debido a la diversidad aportada por la exibilidad de unin, la adicin del nucletido de regin P, la adicin del nucletido de regin N y la maduracin somtica, el potencial real excede estas estimaciones en varios rdenes de magnitud.

J1 RSS 5. . . C A C T G T G G T G G A C G T T . . . 3 V21 RSS 5. . . G G A T C C T C C C C A C A G T G . . . 3 Lneas de Uniones de codificacin clulas pre-B (V21J1) Lnea celular 5-GGATCCGGACGTT-3 #1 Lnea celular 5-GGATCTGGACGTT-3 #2 Uniones seal (RSS/RSS)
5-CACTGTGCACAGTG-3

CUADRO 5-3

5-CACTGTGCACAGTG-3

Orgenes de la variacin de secuencias en genes de cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina en regiones que determinan la complementariedad
CDR1 Segmento V CDR2 Segmento V CDR3 Unin VL-JL; uniones VH-DH-JH

Lnea celular 5-GGATCCTCGTGGACGTT-3 5-CACTGTGCACAGTG-3 #3 Lnea celular 5-GGATCCTTGGACGTT-3 #4

5-CACTGTGCACAGTG-3

Origen de la variacin Secuencia codicada por: Flexibilidad de la unin Adicin de nucletido P Adicin de nucletido N* Hipermutacin somtica

FIGURA 5-12 Prueba experimental de la exibilidad de unin

en el reordenamiento del gen de inmunoglobulina. Las secuencias nucleotdicas laterales a las uniones de codicacin entre V 21 y J 1 y las secuencias de unin seal correspondientes se determinaron en cuatro lneas de clulas pre-B. La constancia de secuencia en las uniones seal contrasta con la variabilidad de secuencia en las uniones de codicacin. Los colores rosa y amarillo indican nucletidos derivados de V 21 y J 1, respectivamente, y los colores prpura y anaranjado corresponden a nucletidos de las dos secuencias seal de recombinacin (RSS).

*La adicin del nucletido N slo ocurre en el DNA de cadena pesada.

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

125

La adicin P aade diversidad a secuencias palindrmicas

Como se describi, despus de la escisin inicial del DNA monocatenario en la unin de un segmento gnico de regin variable y la secuencia seal unida, los nucletidos en el extremo de la secuencia de codificacin se vuelven para formar una estructura en horquilla (fig. 5-7), que ms adelante es escindida por una endonucleasa. Esta segunda rotura ocurre en ocasiones en una posicin que deja una cadena nica corta al final de la secuencia codificadora. La adicin ulterior de nucletidos complementarios a este filamento (adicin P) por las enzimas reparadoras crea una secuencia palindrmica en la unin de codificacin y, por ello, estos nucletidos se denominan nucletidos P (fig. 5-13a). La variacin de la posicin en que se corta la horquilla conduce por tanto a una variacin de la secuencia de la unin codificadora.

Es posible aadir hasta 15 nucletidos N a las uniones DH-JH y VH-DHJH. Por consiguiente, una unidad VHNDHNJH codifica una regin variable de cadena pesada completa. La diversidad adicional de la cadena pesada generada con la adicin del nucletido en la regin N es muy grande, toda vez que al parecer las regiones N consisten en secuencias por completo aleatorias. Debido a que esta diversidad ocurre en las uniones de codificacin VDJ, se localiza en la CDR3 de los genes de cadena pesada.

La hipermutacin somtica agrega diversidad en segmentos gnicos ya reordenados

Toda la diversidad de anticuerpos descrita hasta el momento se debe a mecanismos que operan durante la formacin de regiones variables especficas por reordenamientos gnicos. Se crea una diversidad adicional de anticuerpos en unidades gnicas de regin variable reordenadas por un proceso conocido como hipermutacin somtica. Como resultado de esta ltima, nucletidos individuales en unidades VJ o VDJ se sustituyen por otros, lo cual modifica potencialmente la especificidad de las inmunoglobulinas codificadas. En condiciones normales, la hipermutacin somtica slo ocurre dentro de centros germinales (cap. 11), estructuras que se forman en rganos linfoides secundarios en el transcurso de una semana tras la inmunizacin con un antgeno que activa una respuesta de clula B dependiente de clula T. La hipermutacin somtica se dirige a regiones V reordenadas situadas dentro de una secuencia de DNA que contiene alrededor de 1 500 nucletidos, incluida la totalidad del segmento VJ o VDJ. La hipermutacin somtica ocurre a una frecuencia aproximada de 10 3 por par de bases por generacin. Este ritmo es cuando menos 100 000 veces ms alto (de all el nombre hipermutacin) que el ndice de mutacin espontnea, cercano a 10 8/pb/generacin, en otros genes. Debido a que la longitud combinada de los genes de regin variable de las cadenas H y L tiene alrededor de 600 pb, cabra esperar
b) Adicin de nucletido N Horquilla TC D AG TA AT J La escisin de la horquilla genera sitios para la adicin de nucletidos P D TCGA A T A T J TdT aade nucletidos N Las enzimas de reparacin aaden nucletidos complementarios T TA TCGA D AGCT AGT A A A T J TCA T

La adicin N promueve una considerable diversidad por la agregacin de nucletidos

Se ha probado que las uniones de codificacin de la regin variable en genes de cadena pesada reordenados contienen secuencias cortas de aminocidos que no son codificados por los segmentos gnicos V, D o J de la lnea germinal. A estos aminocidos los codifican nucletidos que se aaden durante el proceso de unin de DJ y V a DJ en una reaccin catalizada por una transferasa de desoxinucleotidilo terminal (TdT) (fig. 5-13b). Las pruebas que sealan que la adicin de estos nucletidos N depende de la TdT provienen de estudios de transfeccin de fibroblastos. Cuando se transfectaron fibroblastos con los genes RAG-1 y RAG-2 ocurrieron reordenamientos VDJ pero no hubo nucletidos N en las uniones de codificacin. Sin embargo, cuando los fibroblastos se transfectaron tambin con el gen que codifica la enzima TdT, entonces el reordenamiento VDJ se acompa de la adicin de nucletidos N.
a) Adicin de nucletido P Horquilla TC D AG TA AT J La escisin de la horquilla genera sitios para la adicin de nucletidos P D TCGA A T A T J Las enzimas de reparacin aaden nucletidos complementarios TCGA T TA D AGCT A A A T J T

FIGURA 5-13 Adicin de nucletidos P y N durante la

unin. a) Si la escisin del intermediario en horquilla produce un extremo de doble cadena en la secuencia de codicacin, entonces no ocurre la adicin de un nucletido P. Sin embargo, en muchos casos la escisin proporciona un extremo monocatenario. Durante la reparacin ulterior se aaden nucletidos complementarios llamados nucletidos P para producir secuencias palindrmicas (indicadas

entre parntesis). En este ejemplo se encuentran cuatro pares de bases adicionales (azul) en la unin de codicacin como resultado de la adicin del nucletido P. b) Adems de la adicin del nucletido P, durante la unin de la secuencia codicadora de cadena pesada puede ocurrir la adicin de nucletidos N aleatorios (rojo) por una transferasa de desoxinucleotidilo terminal (TdT).

126

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

que la hipermutacin somtica introdujera cuando menos una mutacin por cada dos divisiones celulares en el par de genes VH y VL que codifican un anticuerpo. Durante la hipermutacin somtica, la mayora de las mutaciones son sustituciones de nucletidos ms que deleciones o inserciones. La hipermutacin somtica introduce estas sustituciones de una manera en gran medida aleatoria. Determinados motivos en las secuencias de nucletidos y ciertas secuencias palindrmicas dentro de las regiones VH y VL son especialmente susceptibles a la hipermutacin somtica y se denominan puntos calientes. Ocurren hipermutaciones somticas a todo lo largo de los segmentos VJ o VDJ, pero en clulas B maduras estn agrupadas dentro de las CDR de las secuencias VH y VL, en donde es ms probable que modifiquen la afinidad total para antgenos. Despus de la exposicin a un antgeno se seleccionan de manera preferencial para sobrevivir las clulas B con los receptores de afinidad ms alta. El resultado de esta seleccin diferencial es un incremento de la afinidad por antgeno de una poblacin de

clulas B. El proceso total, llamado maduracin de afinidad, se lleva a cabo dentro de centros germinales y se describe con mayor amplitud en el captulo 11. En un experimento ya clsico, Claudia Berek y Cesar Milstein demostraron la realidad y el curso de la hipermutacin somtica durante una respuesta inmunitaria a un conjugado de hapteno y portador. Estos investigadores pudieron establecer la secuencia de mRNA que codificaba anticuerpos desarrollados contra un hapteno en respuesta a las inmunizaciones primaria, secundaria o terciaria (primera, segunda o tercera exposiciones) con un conjugado de hapteno y portador. El hapteno que eligieron fue 2-fenil-5-oxazolona (phOx), acoplado a un portador protenico. Seleccionaron este hapteno porque se haba demostrado antes que la mayor parte de los anticuerpos que induca eran codificados por segmentos gnicos VH y V de la lnea germinal nicos. Berek y Milstein inmunizaron ratones con el conjugado phOx-portador y en seguida utilizaron clulas de bazo de ratn para formar hibridomas que secretaron anticuerpos monoclonales especficos para el hapteno phOx. A continuacin se

Subclase de clona de hibridoma 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Regiones V de cadena pesada CDR1 CDR2 CDR3 J3 (D)

Regiones V de cadena ligera CDR1 CDR2 CDR3 J5

Kd 107M

Primaria

J4 J4 J4 J2

J4

2.8 2.8 2.8 3.7 3.6 4.0 3.3 0.5 6.0 4.0 0.9 3.4 0.7 0.4 0.1 0.2 1.4 0.6

Da 7

J2 J2 J4 J4

Da 14

Secundaria

J4 J2 J4

0.9 0.02 1.1 0.1 0.4 0.02 1.0

Terciaria

J4 J4

0.03 0.03 0.03 0.15 0.2

FIGURA 5-14 Prueba experimental de la mutacin somtica en regiones variables de los genes de inmunoglobulina. El diagrama compara las secuencias de mRNA de cadenas pesadas y ligeras de hibridomas especcos para el hapteno phOx. Las lneas horizontales continuas representan las secuencias de lnea germinal VH y V Ox-1; las lneas discontinuas indican secuencias derivadas de otros genes de lnea germinal. La sombra azul muestra las reas en que se agrupan las mutaciones; los crculos azules con lneas verticales sealan las localizaciones de mutaciones que codican un aminocido diferente del de la secuencia de la lnea germinal. Estos

datos demuestran que la frecuencia de mutacin 1) aumenta en el curso de la respuesta primaria (das 7 contra 14) y 2) es ms alta despus de inmunizaciones secundarias y terciarias que tras la inmunizacin primaria. Ms an, la constante de disociacin (Kd) de los anticuerpos anti-phOx disminuye durante la transicin de la respuesta primaria a la terciaria, lo que indica un incremento de la anidad total del anticuerpo. Obsrvese asimismo que la mayor parte de las mutaciones se agrupan dentro de CDR1 y CDR2, tanto de las cadenas pesadas como de las ligeras. [Adaptada de C. Berek y C. Milstein
1987, Immunology Review 96:23.]

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

127

determin la secuencia de mRNA para la cadena H y la cadena ligera de cada hibridoma a fin de identificar desviaciones respecto de las secuencias de la lnea germinal. En la figura 5-14 se muestran los resultados de este experimento. De los 12 hibridomas obtenidos en ratones siete das despus de la inmunizacin primaria, todos emplearon un VH particular, el segmento gnico VH Ox-1 y, con excepcin de uno, los restantes usaron el mismo segmento gnico VL, V Ox-1. Ms an, en estos hibridomas slo existan unas cuantas mutaciones en la secuencia de la lnea germinal. Alrededor de 14 das despus de la inmunizacin primaria, el anlisis de ocho hibridomas revel que seis utilizaban an el segmento gnico VH Ox-1 de la lnea germinal y todos empleaban todava el segmento gnico V Ox-1. Sin embargo, todos estos hibridomas incluan una o ms mutaciones de la secuencia de la lnea germinal. Los hibridomas analizados a partir de las respuestas secundaria y terciaria mostraron un porcentaje ms grande que utilizaba segmentos gnicos VH de la lnea germinal aparte del gen VH Ox-1. En las clonas de hibridomas que usaban segmentos gnicos VH Ox-1 y V Ox-1, casi todas las mutaciones estaban agrupadas en las regiones hipervariables CDR1 y CDR2. Despus de las inmunizaciones primaria, secundaria y terciaria, aument de modo progresivo el nmero de mutaciones en los hibridomas anti-phOx, al igual que la afinidad total de los anticuerpos contra phOx.

Un origen ltimo de la diversidad es la asociacin combinatoria de cadenas pesada y ligera

En el ser humano existe el potencial de generar 6 624 genes de cadena pesada y 375 de cadena ligera como resultado de reordenamientos del gen de la regin variable. Si se supone que cada uno de los posibles genes de cadenas pesada y ligera puede aparecer de modo aleatorio en la misma clula, el nmero posible de combinaciones de cadenas pesada y ligera es de 2 484 000. Es probable que esta cifra sea ms alta que la cantidad de diversidad combinatoria creada en realidad en un individuo, ya que no es probable que todos los VH y VL formen pares entre s. Ms an, el proceso de recombinacin no es del todo aleatorio; no se utilizan con la misma frecuencia todos los segmentos gnicos VH, D o VL. Algunos se usan con frecuencia, otros de manera ocasional y algunos ms casi nunca. Aunque es difcil calcular con precisin el nmero de diferentes sitios de combinacin de anticuerpo que puede generar el sistema inmunitario, se sabe que es muy alto. Debido a que la gran cantidad de nuevas secuencias creadas por la flexibilidad de unin y la adicin de nucletidos P y N se hallan dentro de la tercera CDR, su disposicin modifica la estructura del sitio de unin de anticuerpo. Adems de estas causas de diversidad de anticuerpos, el fenmeno de hipermutacin somtica contribuye enormemente al repertorio despus de la estimulacin por antgeno.

La diversicacin de los genes de inmunoglobulina diere entre las especies

En seres humanos y ratones, el repertorio primario de genes de inmunoglobulina es creado de manera somtica por el reorde-

namiento combinatorio de una extensa biblioteca de segmentos gnicos V, (D) y J de la lnea germinal. Adems, en esas especies la generacin de un repertorio primario ocurre principalmente en la mdula sea. Como se expondr en detalle en el captulo 11, en la mayora del resto de los vertebrados se observa una desviacin respecto de este patrn. De hecho, la mdula sea no es un sitio de desarrollo de clulas B, y en aves, conejos, ovinos, bovinos y algunas otras especies, gran parte de este proceso clave ocurre en tejidos linfoides intestinales (GALT). Asimismo, muchas especies utilizan mecanismos distintos (o adicionales) del reordenamiento combinatorio de genes V, (D) y J de la lnea germinal para generar un repertorio primario diversificado de genes de anticuerpo. Se observan dos diferencias importantes entre muchas otras especies y ser humano y ratn. En primer lugar, algunas especies utilizan slo un reordenamiento (o unos pocos de ellos) de genes V(D)J de la lnea germinal. Esto contrasta con los muchos reordenamientos tpicos de seres humanos y ratones. En segundo lugar, en otras especies se emplea la hipermutacin somtica u otro proceso llamado conversin gnica para diversificar ampliamente los genes reordenados, mientras que en las especies humana y murina el repertorio primario de genes reordenados no es diversificado adicionalmente por mutacin somtica o conversin gnica. Durante la conversin gnica, que es un caso especial de mutacin somtica, porciones de la secuencia de un gen, el receptor, se modifican para asumir la secuencia correspondiente de un gen donante. El gen donante, cuya secuencia permanece sin cambio, acta como plantilla para la conversin de una parte de la secuencia del receptor. De hecho, la conversin gnica, que slo ocurre entre genes muy similares en su secuencia (>80% idnticos), algunas veces se denomina mutacin somtica en plantilla porque el donante acta como una plantilla para la modificacin de una regin homloga del receptor a fin de hacerla igual a la secuencia del gen donante. En pollos, la lnea germinal contiene un solo gen funcional para VL, VH y (D)J el cual puede experimentar reordenamiento, y grandes cantidades de seudogenes V y VH los cuales no pueden reordenarse (fig. 5-15). Despus del reordenamiento mediado por RAG de su repertorio drsticamente limitado de genes V(D)J de la lnea germinal, que produce una sola unidad V(D)J, las clulas B de los pollos migran a un rgano llamado bolsa de Fabricio, que es parte del GALT en esa especie. En microambientes especializados de la bolsa, esas clulas experimentan rpida proliferacin y extensa diversificacin (mediada por conversin gnica) de sus genes de inmunoglobulina reordenados. El gran nmero de seudogenes corriente arriba actan como donantes para la conversin de cortos tramos del receptor V(D)J reordenado. Como se muestra en la figura 5-15, varios seudogenes pueden actuar como donantes para un solo gen V(D)J reordenado, de manera que modifican su secuencia de la lnea germinal en varios lugares. Adems de la conversin gnica, los pollos experimentan algo de hipermutacin somtica ordinaria. Los conejos tambin reordenan muy pocos genes para VH de cadena ligera y diversifican el repertorio de anticuerpos por conversin gnica e hipermutacin somtica. En ellos, al igual que en los pollos, estos procesos ocurren en el GALT, particularmente en microambientes especializados del apndice. Rumiantes como la vaca y la oveja diversifican sus repertorios de anticuerpos por hipermutacin somtica en la placa de Peyer ileal, un tipo de GALT.

128

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

Seudogenes VH

VH

DH

JH

Loci Ig de la lnea germinal del pollo

Seudogenes V

VDJH Reordenamiento inicial del V(D)J funcional individual

FIGURA 5-15 En pollos, la diversicaVJ C

VDJH Diversificacin del receptor V(D)J reordenado por los seudogenes V donantes

VJ

cin de la inmunoglobulina ocurre por conversin gnica. En la lnea germinal del pollo, los genes de inmunoglobulina VH y V funcionales individuales son precedidos por muchos seudogenes. El reordenamiento crea un V(D)J reordenado funcional nico. La conversin gnica introduce diversidad en los segmentos V de los genes V(D)J reordenados usando seudogenes V corriente arriba como plantilla.

Cambio de clase entre genes de la regin constante

Despus de la estimulacin antignica de una clula B, el DNA de cadena pesada puede experimentar un reordenamiento adicional en el que la unidad VHDHJH suele combinarse con cualquier segmento gnico CH. An no se aclara el mecanismo exacto de este proceso, llamado cambio de clase o cambio de isotipo, pero incluye secuencias laterales de DNA (conocidas como regiones de cambio) ubicadas 2 a 3 kb (kilobases) corriente arriba de cada segmento de CH (excepto C). Estas regiones de cambio, aunque bastante grandes (2 a 10 kb), se integran con mltiples copias de repeticiones cortas (GAGCT y TGGGG). Una hiptesis seala que una protena o sistema de protenas que constituyen la recombinasa de cambio reconocen estas repeticiones y al unirse llevan a cabo la recombinacin del DNA, lo que tiene como resultado el cambio de clase. Las protenas reguladoras intercelulares, que se conocen como citocinas, actan como factores de cambio y tienen funciones relevantes en la determinacin de la clase particular de inmunoglobulina que se expresa como una consecuencia del cambio. Por ejemplo, la interleucina 4 (IL-4) induce un cambio de clase de C a C 1 o C . En algunos casos se advierte que IL-4 provoca un cambio de clase en una forma sucesiva: primero de C a C 1 y a continuacin de C 1 a C (fig. 5-16). El examen de los productos de escisin del DNA obtenidos durante el cambio de clase de C a C 1 indica que se cre un producto de escisin circular que contena C junto con el extremo 5 de la regin de cambio 1 (S 1) y el extremo 3 de la regin de cambio (S ). Ms an, el cambio de C 1 a C dio lugar a productos de escisin circulares que contenan C 1 junto con porciones de las regiones de cambio , y . En general, el cambio de clase depende de la interrelacin de tres elementos: regiones de cambio, una recombinasa de cambio, las seales de citocina que determinan el isotipo al cual cambia la clula B, y una enzima llamada desaminasa de citidina

inducida por activacin (AID, del ingls activation-induced cytidine deaminase), cuyo papel decisivo se analiza en la siguiente seccin. En el captulo 11 se describe con ms detalle la funcin de las citocinas en el cambio de clase.

La desaminasa de citidina inducida por activacin (AID) media tanto la hipermutacin somtica como el cambio de clase
En este captulo se han presentado tres tipos distintos de modificacin de genes de inmunoglobulina de seres humanos y ratones: recombinacin V(D)J, hipermutacin somtica y recombinacin por cambio de clase. (Tambin se describi la conversin gnica, que ocurre en otras especies.) El reordenamiento y el ensamblaje de segmentos gnicos de la lnea germinal durante la recombinacin V(D)J forma un gen de inmunoglobulina funcional. La hipermutacin somtica introduce cambios en la regin variable de los genes de Ig los cuales pueden modificar las propiedades de unin a antgeno de los anticuerpos codificados por esos genes. La recombinacin por cambio de clase permite a una unidad V(D)J dada unirse a diferentes regiones constantes, lo cual determina la funcin efectora de la molcula de Ig. Los genes activadores de la recombinacin, RAG1 y RAG2, son responsables de la recombinacin de V(D)J. En estudios recientes se ha demostrado que una enzima, la desaminasa de citidina inducida por activacin (AID, del ingls activation-induced cytidine deaminase) es la mediadora clave de hipermutacin somtica, conversin gnica y recombinacin por cambio de clase. La AID pertenece a una familia de enzimas llamada enzimas editoras de RNA. La AID desamina citosinas selectas en determinados mRNA al cambiar las citosinas por uracilos y por tanto modificar (editar) las instrucciones de codificacin de protenas del RNA mensajero blanco. Existen informes de que esta enzima tambin es capaz de modificar DNA directamente por medio de

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

129

L V DJ 5 S

C S 3

C 3 S 1

C 1 S 2b

C 2b S 2a

C 2a S

C S

C 3

Formacin de asa de DNA S 3 C 3 C

L V DJ 5 S

S 1

C C 1 S 2b Recombinacin en S y S1

C 2b S 2a

C 2a S

C S S 3

C 3

L V D J 5S 3S 1 5

C 1 S 2b

C 2b S 2a

C 2a S

C S

C 3

C 3

+
5S 1 3S C

Formacin de asa de DNA y recombinacin en S1 y S L V DJ 5 C S C 2b C 3

+
S 2a C 2a

S 2b

5S 3S 1

C 1

FIGURA 5-16 Mecanismo propuesto para el cambio de clase inducido por interleucina 4 en los genes de cadena pesada de la inmunoglobulina reordenados. Un sitio de cambio se localiza corriente arriba de cada segmento CH, excepto C . La identicacin
la desaminacin de citosina, cuyo resultado es nuevamente la formacin de uracilo, el cual no es uno de los nucletidos habituales en el DNA. El sitio de desaminacin puede ser reparado despus para formar un par A-T en vez de G-C, o de manera alternativa es posible que el uracilo se elimine y sustituya por cualesquiera de las cuatro bases del DNA. Aunque an se investiga activamente el mecanismo preciso de accin de la AID, es bastante clara su importancia tanto para la hipermutacin somtica como para la recombinacin por cambio de clase (fig. 5-17a). En un impresionante experimento realizado en la Universidad de Kioto, en Japn, Tasuku Honjo y sus colegas generaron ratones con el gen para AID desactivado. Compararon la capacidad de estos ratones (AID / ) de realizar cambio de clase e hipermutacin somtica con la de ratones que conservaban una copia funcional del gen para AID (AID / ). Los datos de la figura 5-17b muestran que a medida que se desarrollaba una inmunorreaccin despus de inmunizaciones sucesivas, los ratones con una copia funcional del gen para AID producan primero anticuerpos IgM y luego IgG contra el an-

de los productos circulares de escisin indicados que contienen porciones de los sitios de cambio sugiere que IL-4 induce un cambio de clase secuencial de C a C 1 a C .

tgeno blanco. Sin embargo, en los ratones con el gen para AID desactivado slo se generaban anticuerpos IgM en respuesta a la inmunizacin con el mismo antgeno. Para buscar indicios de hipermutacin somtica, los investigadores examinaron el RNA mensajero que codificaba las regiones variables de cadena pesada de anticuerpos contra el antgeno de ambos ratones (AID / ) y (AID / ). Descubrieron que mientras que los ratones (AID / ) tenan niveles normales de hipermutacin, los ratones con la desactivacin gnica no presentaban hipermutacin somtica en absoluto. Este sorprendente resultado demostr que la misma protena, AID, era esencial tanto para la hipermutacin somtica como para el cambio de clase. En estudios ulteriores de estos investigadores, el gen para AID se introdujo en fibroblastos, los cuales se sabe que no realizan hipermutacin somtica ni cambio de clase. Ambas funciones se activaron cuando la AID se expres en estas clulas no linfoides. Este descubrimiento altamente significativo demostr que la AID es el nico factor necesario para realizar cualesquiera de estos procesos distintivos de la clula B.

130

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

a) IgM en respuesta a la inmunizacin Primera Segunda inmunizacin inmunizacin 0.6 Unidades arbitrarias $ 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 15 30 AID AID / /

IgG en respuesta a la inmunizacin Primera Segunda inmunizacin inmunizacin 0.4 0.3 0.2 0.1 0 15 30

0 Da b) Mutaciones en el mRNA de regin variable 80 AID ( / ) CDR1

FIGURA 5-17 Demostracin experimental

CDR2

40

0 40 AID ( / )

del papel de la enzima AID en el cambio de clase y la hipermutacin somtica. a) Un grupo de ratones que expresaban AID ( / ) y otro con desactivacin de ese gen ( / ) se inmunizaron dos veces con un conjugado hapteno-portador, y las respuestas de anticuerpo contra hapteno se midieron y gracaron en unidades arbitrarias. Se detectaron respuestas de IgM en ambos tipos de ratones. La produccin de IgG, que requiere cambio de clase, ocurri slo en los ratones que expresaban AID ( / ). b) Se determin la secuencia del RNA mensajero que codicaba las regiones variables de anticuerpos reactivos a antgeno en ratones inmunizados de ambos grupos, y se grac la posicin y frecuencia de mutaciones. En los ratones que expresan AID se observan muchas mutaciones; en cambio, en los ratones con desactivacin del gen para AID slo se observaron niveles de mutacin de fondo. [Adaptada de
M. Muramatsu et al., 2000, Cell 102:560.]

RNA mensajero de VH N terminal

Expresin de genes de inmunoglobulina

Como ocurre en muchos genes, para obtener mRNA funcionales se requiere el procesamiento postranscripcional de los transcritos primarios de la inmunoglobulina (figs. 5-4 y 5-5). Los transcritos primarios producidos por genes de cadena pesada y reordenados contienen secuencias de DNA intermedias que incluyen intrones que no codifican y segmentos gnicos J que no se pierden durante el reordenamiento de V(D)J. Adems, como se coment, los segmentos gnicos C de cadena pesada estn organizados como una serie de exones de codificacin e intrones que no codifican. Cada exn de un segmento gnico CH corresponde a un dominio de regin constante o una regin en bisagra del polipptido de cadena pesada. El transcrito primario debe procesarse para eliminar las secuencias de DNA intermedias y los exones restantes conectarse por un proceso llamado empalme de RNA. Secuencias de empalme cortas moderadamente conservadas (sitios de empalme) que se hallan en los lmites de intrones y exones dentro de una transcripcin primaria sealan las posiciones en que ocurre el empalme. El procesa-

miento del transcrito primario en el ncleo elimina cada una de estas secuencias intermedias para formar el producto final, mRNA. A continuacin el mRNA sale del ncleo y es traducido por ribosomas en cadenas H o L completas.

Los transcritos primarios de cadena pesada experimentan procesamiento diferencial del RNA
El procesamiento de un transcrito primario de cadena pesada de inmunoglobulina puede generar diferentes mRNA, lo que explica cmo una clula B aislada puede crear formas secretadas o unidas a membrana de una inmunoglobulina particular y expresar de manera simultnea IgM e IgD.

Expresin de inmunoglobulina de membrana o secretada

Como se explica en el captulo 3, una inmunoglobulina particular puede existir en una forma unida a membrana o secretada. Las dos variedades difieren en la secuencia de aminocidos de los dominios carboxilo terminales de la cadena pesada (CH3/ CH3 en IgA, IgD e IgG y CH4/CH4 en IgE e IgM). La forma

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

131

a) T G K P T L Y N V S L I M S D T G G T C Y

556 +

C4

Clave: Hidrfilo Hidrfobo

C4 T 556 E G E N V E A E E G F 568 E N L F I W V T T S A T L F S T T L Y LV F L S T L F 594 + K V + K 597 COOH

556 563 Codificado por el exn S de C 576 COOH Codificado por los exones M1 y M2 de C

556 Exterior 568

CHO

576 Membrana

Puente SS

575 576

COOH secretada C b) Transcrito primario de cadena H L VDJ J 1 2 3 4 S

594 597 Citoplasma

COOH

de membrana C M1 M2

Sitio 1 poli-A

Sitio 2 poli-A

Sitio 3 poli-A

Sitio 4 poli-A

Poliadenilacin Sitio 1 Sitio 2

Transcrito de RNA para secretada 1 2 3 4 S L V DJ J (A)n Empalme de RNA L V D J 1 2 3 4 S (A)n Cadena secretada codificada por mRNA

Transcrito de RNA para de membrana 1 2 3 4 S M1 M2 L V DJ J (A)n

L V D J 1 2 3 4 M1 M2 (A)n Cadena de membrana codificada por mRNA

FIGURA 5-18 Expresin de las formas secretada y de membrana de la cadena pesada por procesamiento alternativo del RNA. a) Secuencia de aminocidos del extremo carboxilo terminal de las cadenas pesadas secretadas y de membrana. Los residuos se indican por el cdigo de aminocidos de una letra. Los residuos y regiones hidrlos e hidrfobos estn indicados por los colores prpura y anaranjado, respectivamente, y los aminocidos
secretada tiene una secuencia hidrfila de unos 20 aminocidos en el dominio carboxilo terminal; en la forma unida a membrana la reemplaza una secuencia de alrededor de 40 aminocidos que contiene un segmento hidrfilo que se extiende fuera de la

con carga se indican por medio de los signos o . Las regiones blancas de las secuencias son idnticas en ambas formas. b) Estructura de un transcrito primario de un gen de cadena pesada reordenado que muestra los sitios de exones C y poli-A. La poliadenilacin del transcrito primario en los sitios 1 y 2 y el empalme ulterior (sealada por lneas en forma de V) generan mRNA que codican cadenas secretadas o de membrana.

clula, un segmento hidrfobo transmembranal y un segmento hidrfilo corto en el extremo carboxilo terminal que se extiende hacia el interior del citoplasma (fig. 5-18a). Durante algn tiempo la existencia de estas dos formas pareci incompatible con

132

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

la estructura del DNA de la cadena pesada de la lnea germinal, que incluye un segmento gnico CH nico correspondiente a cada clase y subclase. La respuesta a este acertijo provino de la secuenciacin del DNA del segmento gnico C , el cual posee cuatro exones (C 1, C 2, C 3 y C 4) que corresponden a los cuatro dominios de la molcula de inmunoglobulina M (IgM). El exn C 4 contiene una secuencia nucleotdica (llamada S) en su extremo 3 que codifica la secuencia hidrfila en el dominio CH4 de la IgM secretada. Dos exones adicionales llamados M1 y M2 se localizan 1.8 kb corriente abajo del extremo 3 del exn C 4. El exn M1 codifica el segmento transmembranal y el M2 codifica el segmento citoplsmico del dominio CH4 en la IgM unida a membrana. La secuenciacin del DNA revel que todos los elementos gnicos CH tienen dos exones M1 y M2 adicionales corriente abajo que codifican los segmentos transmembranales y citoplsmico. El transcrito primario producido por la transcripcin de un gen de cadena pesada reordenado incluye dos secuencias seal de poliadenilacin, o sitios poli-A, en el segmento C . El sitio uno se localiza en el extremo 3 del exn C 4 y el sitio dos en el extremo 3 del exn M2 (fig. 5-18b). Si ocurre la escisin

del transcrito primario y la adicin de la cola poli-A en el sitio uno, se pierden los exones M1 y M2. La escisin de los intrones y el empalme de los exones restantes crean entonces mRNA que codifica la forma secretada de la cadena H. Si, en lugar de ello, la segmentacin y poliadenilacin del transcrito primario suceden en el sitio dos, entonces resulta un patrn de superposicin diferente. En este caso, la superposicin elimina la secuencia S en el extremo 3 del exn C 4, que codifica el extremo carboxilo terminal (hidrfilo) de la forma secretada y une el resto del exn C 4 con los exones M1 y M2, lo que produce mRNA para la forma membranal de la cadena pesada. As, el procesamiento diferencial de un transcrito primario comn determina si se obtiene la forma secretada o de membrana de una inmunoglobulina. Como se coment con anterioridad, las clulas B vrgenes maduras slo liberan anticuerpo unido a membrana, en tanto que las clulas plasmticas diferenciadas elaboran anticuerpos secretados. An es necesario establecer con precisin la forma en que las clulas B vrgenes y las clulas plasmticas dirigen el procesamiento del RNA de modo preferencial hacia la produccin de mRNA al codificar una forma o la otra.

a) Transcrito primario de cadena H C L 5 6.5 kb Sitio 1 poli-A Sitio 2 poli-A Sitio 3 poli-A VDJ J 1 2 3 4 S M1 M2 1 2 C 3 S M1M2 3 Sitio 4 poli-A

b) Poliadenilacin del transcrito primario en el sitio 2 m C L Transcrito m 5 Empalme L mRNA de m 5 VDJ 1 2 3 4 M1 M2 (A)n VDJ J S M1 M2 (A)n

c) Poliadenilacin de transcrito primario en el sitio 4 VDJ J

m C M1 M2 1 2 3 S M1 M2 (A)n

L Transcrito m 5

4 S

Empalme L mRNA de m VDJ 1 2 3 M1 M2 (A)n

FIGURA 5-19 Expresin de las formas de membrana de cadenas pesadas y por procesamiento alternativo de RNA. a) Estructura del gen de cadena pesada reordenado que muestra exones C y C y sitios poli-A. b) Estructura del transcrito m y del mRNA

de m que resulta de la poliadenilacin en el sitio 2 y el empalme. c) Estructura del transcrito m y del mRNA de m creada por la poliadenilacin en el sitio 4 y el empalme. Ambas vas de procesamiento pueden proseguir en cualquier clula B determinada.

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

133

Expresin simultnea de IgM e IgD

El procesamiento diferencial del RNA tambin sustenta la expresin simultnea de IgM e IgD unidas a membrana por clulas B maduras. Como se mencion, la transcripcin de genes de cadena pesada reordenados en clulas B maduras crea transcritos primarios que contienen segmentos gnicos C y C . Estos ltimos estn cerca entre s en el gen reordenado (separados slo por unas 5 kb), y la ausencia de un sitio de cambio entre ellos posibilita que se transcriba toda la regin VDJC C en un transcrito de RNA primario nico de unas 15 kb de largo, que contiene cuatro sitios poli-A (fig. 5-19). Los sitios uno y dos se vinculan con C , como se describi en la seccin previa; los sitios tres y cuatro se ubican en lugares similares en los segmentos gnicos C . Si se escinde y poliadenila el transcrito de cadena pesada en el sitio dos despus de los exones C , entonces el mRNA codifica la forma de membrana de la cadena pesada (fig. 5-19b); si en lugar de ello la poliadenilacin ocurre corriente abajo en el sitio cuatro, despus de los exones C , entonces la superposicin de RNA anula los exones C intermedios y produce mRNA que codifica la forma de membrana de la cadena pesada (fig. 5-19c). Debido a que la clula B madura expresa tanto IgM como IgD en su membrana, deben concurrir ambas vas de procesamiento de manera simultnea. Asimismo, la escisin y poliadenilacin del transcrito de cadena pesada primario en el sitio poli-A uno o tres en clulas plasmticas y la superposicin ulterior dan lugar a la forma secretada de las cadenas pesadas o , respectivamente (fig. 5-18b).

Sntesis, ensamblaje y secrecin de inmunoglobulinas

La produccin de anticuerpos plantea problemas nicos relacionados con la variabilidad del producto y la cantidad que se genera. Un repertorio extraordinariamente diverso de anticuerpos resulta de los mecanismos de reordenamientos gnicos, unin imprecisa de segmentos V(D)J, adicin de nucletidos a los extremos escindidos de estos segmentos y, en muchos casos, hipermutacin somtica, pero un subproducto costoso de toda esta variabilidad es la generacin de una cantidad significativa de genes de anticuerpo que contienen codones de detencin prematura o producen inmunoglobulinas que no se pliegan o ensamblan correctamente. Un segundo problema surge de la escala de produccin de anticuerpo por clulas plasmticas. Adems de las protenas requeridas para todas sus actividades metablicas normales, las clulas plasmticas elaboran y secretan ms de 1 000 molculas de anticuerpo por clula por segundo. El simple hecho de desplazar hasta la membrana plasmtica para su descarga las vesculas intracelulares llenas de anticuerpo constituye un colosal desafo para el control y la coordinacin del trfico intracelular. Como todas las protenas destinadas a incorporarse en membranas o descargarse en el ambiente extracelular, los polipptidos de inmunoglobulina se sintetizan en el retculo endoplsmico rugoso (RER). Los mRNA de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina se trasladan en polirribosomas del RER separados (fig. 5-20). Las cadenas recin sintetizadas contienen una secuencia lder amino terminal, que gua las cadenas

hacia la luz del RER, donde se escinde entonces la secuencia seal. El orden de ensamblaje de cadenas ligeras (L) y pesadas (H) vara entre las clases de inmunoglobulina. En el caso de la IgM, las cadenas H y L se ensamblan dentro del RER para formar medias molculas, y a continuacin se ensamblan dos medias molculas para formar la molcula completa. En el caso de la IgG, se forman dos cadenas H, luego un H2L intermedio, y finalmente se configura la molcula H2L2 completa. Enzimas presentes en el RER catalizan la formacin de los enlaces disulfuro intercadena necesarios para ensamblar polipptidos de inmunoglobulina, as como los enlaces S-S intracadena que aseguran el plegamiento de los dominios de Ig. La glucosilacin de molculas de anticuerpo tambin es tarea de enzimas del RER. Los anticuerpos son enviados a sus destinos (ya sea secretado o unido a membrana) dependiendo de la presencia de dominios carboxilo terminales hidrfobos o hidrfilos en sus cadenas pesadas, que se mencionaron antes. Los anticuerpos unidos a membrana contienen la secuencia hidrfoba, que se ancla en la membrana de una vescula secretoria. Cuando la vescula se fusiona con la membrana plasmtica, el anticuerpo toma residencia en esta ltima (fig. 5-20, recuadro superior). Los anticuerpos que contienen la secuencia hidrfila caracterstica de las inmunoglobulinas secretadas se transportan como molculas libres en vesculas secretorias y se liberan de la clula cuando dichas vesculas se fusionan con la membrana plasmtica. El ER tiene mecanismos de control de calidad (fig. 5-21), los cuales aseguran que slo se exporten molculas de anticuerpo completamente ensambladas y promueven la destruccin de molculas de Ig incompletas o mal ensambladas. Un mediador de estas funciones es la protena de unin a cadenas pesadas de inmunoglobulina (BiP, del ingls immunoglobulin heavy chain binding protein), que se une a molculas de anticuerpo que no se ensamblaron por completo pero se disocia de las completas. Una secuencia especfica de aminocidos en la BiP (lisina-glutamatoaspartato-leucina) causa su retencin en el retculo endoplsmico, lo que impide que salgan del ER molculas de anticuerpo incompletas a las cuales se ha unido. Las molculas de anticuerpo mal plegadas o retenidas en el ER finalmente son marcadas para su destruccin cuando a ellas se une una protena llamada ubicuitina. Las protenas as marcadas son extradas del ncleo y sometidas a protelisis por proteosomas, grandes complejos multienzimticos que se considerarn con mayor detalle en el captulo 7.

Regulacin de la transcripcin de genes de inmunoglobulina

Los genes de inmunoglobulina slo se expresan en clulas del linaje B, e incluso dentro de este linaje los genes se expresan en diferentes proporciones durante las distintas etapas del desarrollo. Tal y como se observa con otros genes eucariticos, dos clases principales de secuencias reguladoras cis en el DNA controlan la transcripcin de genes de inmunoglobulina:

Promotores: secuencias de nucletidos relativamente cortas, extendidas alrededor de 200 pb corriente arriba respecto del sitio de inicio de la transcripcin, que promueven el comienzo de la transcripcin de RNA en un sentido especfico.

134

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

Ig de membrana Degradacin por proteasoma Fusin con membrana Vescula secretoria Exportacin al citosol Segmento transmembranal BiP Desensamblaje Retencin en el ER unida a BiP Ig secretada Plegamiento y ensamblaje normales Ubicuitina Ubicuitinacin

Plegamiento o ensamblaje aberrantes

Oligosacridos

Vesculas secretorias

Retculo de Golgi trans

Ig naciente (escindida por la secuencia lder)

FIGURA 5-21 Control de calidad durante la sntesis de

Golgi trans

Golgi cis

anticuerpo. Las molculas de Ig que no se pliegan o ensamblan correctamente permanecen unidas a la protena BiP (una carabina). La interaccin con BiP y otros factores hace que el anticuerpo defectuoso se desensamble, exporte desde el ER y marque para su degradacin por conjugacin con ubicuitina, tras lo cual es degradado por proteasoma.

Intensificadores: secuencias nucleotdicas situadas a cierta distancia corriente arriba o abajo de un gen que activan la transcripcin de la secuencia promotora en una forma independiente de la orientacin.

RER Lder

Traduccin de cadena ligera

Ig naciente Traduccin de cadena pesada (escindida por la secuencia lder)

FIGURA 5-20 Sntesis, ensamblaje y secrecin de la molcula de inmunoglobulina. Las cadenas pesada y ligera se sintetizan en polirribosomas (polisomas) separados. El ensamblaje de las cadenas, la formacin de los enlaces disulfuro intracatenarios e intercatenarios y la adicin de carbohidrato ocurren todos en el retculo endoplsmico rugoso (RER). El transporte vesicular lleva la Ig al aparato de Golgi, por el que transita, y se acumula en vesculas que se fusionan con la membrana celular. La gura principal muestra el ensamblaje de un anticuerpo secretado. El recuadro muestra un anticuerpo unido a membrana, que contiene el segmento carboxilo terminal transmembranal. Esta forma se ja en la membrana de vesculas secretorias y luego se inserta en la membrana de la clula cuando las vesculas se fusionan con la membrana.

En la figura 5-22 se muestran las localizaciones de los elementos reguladores en el DNA de inmunoglobulina de la lnea germinal. Todos estos elementos reguladores tienen agrupaciones de secuencia caractersticas que pueden unirse de manera especfica a una o ms protenas nucleares. Cada segmento gnico VH y VL tiene un promotor localizado justo corriente arriba de la secuencia lder. Adems, el agrupamiento J y cada uno de los genes DH del locus de cadena pesada son precedidos por promotores. Al igual que otros promotores, los de la inmunoglobulina poseen una secuencia rica en AT altamente conservada la cual recibe el nombre de secuencia (caja o vagn) TATA, que sirve como sitio para la unin de varias protenas necesarias para el inicio de la transcripcin del RNA. El proceso real de transcripcin se lleva a cabo mediante la polimerasa II de RNA, que comienza a transcribir DNA desde el sitio de inicio, situado alrededor de 25 pb corriente abajo de la caja TATA. Los promotores de Ig tambin contienen un octmero esencial y conservado que confiere especificidad de clula B en el promotor. El octmero une dos factores de transcripcin, oct-1, que se encuentra en muchos tipos de clulas, y oct-2, que slo existe en clulas B.

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

135

DNA de cadena H P 5 L VH P L VH DH JH E C C C 3 C 1 C 2b C 2a C C 3 E 3

DNA de cadena P 5 L V P L V P L V J

Clave: E C 3E 3 Promotor = Intensificador =

DNA de cadena P 5 L V2 J2 C2 J4

C4

24E

L V 1

J 3 C 3

J 1 C 1

31E 3

FIGURA 5-22 Localizacin de promotores (rojo oscuro) e

intensicadores (verde) en DNA de lnea germinal de cadena pesada, cadena ligera y cadena ligera de ratn. El reordenamiento del DNA de la regin variable mueve un intensicador

lo bastante cerca de un promotor para que el intensicador pueda activar la transcripcin del promotor. En este diagrama se omitieron con nes de claridad los promotores que preceden al agrupamiento DH, varios de los genes C y el grupo J .

Si bien an queda mucho por aprender acerca de la funcin de los intensificadores, constituyen sitios de unin para varias protenas, muchas de las cuales son factores de transcripcin. Una funcin en particular importante la efectan dos protenas codificadas por el gen E2A; stas pueden experimentar empalme alternado para generar dos protenas colaboradoras, que se unen ambas a los intensificadores intrnicos y . Tales protenas son esenciales para el desarrollo de la clula B; los ratones con desactivacin de E2A producen cantidades normales de clulas T pero muestran ausencia total de clulas B. Como hecho interesante, la transfeccin de estas protenas de unin intensificadoras dentro de una lnea de clulas T dio por resultado un notable incremento de la transcripcin de mRNA de cadena e indujo incluso a la clula T a experimentar reordenamiento DH JH DHJH. Un intensificador de cadena pesada se localiza dentro del intrn, entre el ltimo segmento gnico J (3 ) y el primer segmento C, C (5), que codifica la cadena pesada . Debido a que este intensificador de cadena pesada (E ) se ubica en sentido 5 respecto del sitio de cambio S cerca de C , puede continuar funcionando despus de que ocurre un cambio de clase. Se ha detectado otro intensificador de cadena pesada (3 E) en sentido 3 respecto del segmento gnico C . Un intensificador de cadena ligera (E ) se sita entre el segmento J y el segmento C , y otro intensificador (3 E) se localiza en sentido 3 del segmento C . Los intensificadores de cadena ligera se hallan en sentido 3 de C 4 y 3 de C 1.

El reordenamiento del DNA acelera en gran medida la transcripcin

Los promotores vinculados con segmentos gnicos V de la inmunoglobulina unen polimerasa II de RNA muy dbilmente, y los intensificadores de la regin variable en el DNA de la lnea germinal estn muy distantes de los promotores (alrededor de 250 a 300 kb), demasiado alejados para influir de manera significativa en la transcripcin. Por ello es insignificante el ndice

de transcripcin de las regiones codificadoras de VH y VL en el DNA de la lnea germinal no reordenado. El reordenamiento gnico de la regin variable coloca un promotor y un intensificador a 2 kb uno del otro, lo bastante cerca para que el intensificador modifique la transcripcin del promotor cercano. Como resultado, la intensidad de transcripcin de una unidad VLJL o VHDHJH reordenada es hasta de 104 veces la de segmentos VL o VH no reordenados. Este efecto se demostr de forma directa en un estudio en el cual las clulas B transfectadas con genes de cadena pesada reordenados, de los cuales se haba eliminado el intensificador, no transcribieron los genes, en tanto que las clulas B transfectadas con genes similares que contenan el intensificador transcribieron los genes transfectados con gran rapidez. Estos resultados destacan la importancia de los intensificadores en la transcripcin normal de los genes de inmunoglobulina. Los genes que regulan la proliferacin celular o impiden la muerte de las clulas algunas veces se transponen hacia los loci de las cadenas pesadas o ligeras de la inmunoglobulina. Aqu, bajo la influencia de un intensificador de inmunoglobulina, es elevada en grado significativo la expresin de estos genes y tiene como consecuencia altos valores de protenas que promueven la proliferacin o inhiben la muerte celular. Las transposiciones de los oncogenes c-myc y bcl-2 se han relacionado cada una con linfomas malignos de clula B. La transposicin de c-myc conduce a la expresin constitutiva de c-Myc y a un linfoma de clulas B agresivo, muy proliferativo, llamado linfoma de Burkitt. La transposicin de bcl-2 suspende la muerte celular programada en clulas B y da lugar al linfoma folicular de clulas B. Estas transposiciones que promueven la aparicin del cncer se comentan con mayor detalle en el captulo 21.

En las clulas T est inhibida la expresin de los genes de inmunoglobulina

Como se coment, la mutacin especfica de sitio en las clulas B tiene un paralelismo en las clulas T. El DNA de la lnea germinal que codifica el receptor de clula T (TCR) experimenta un reor-

136

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

denamiento V(D)J para crear genes TCR funcionales. El reordenamiento del DNA de la lnea germinal de la inmunoglobulina y del TCR ocurre por procesos de recombinacin similares mediados por RAG-1 y RAG-2 e incluye secuencias seal de recombinacin con espaciadores de uno o dos giros (fig. 5-7). A pesar de la similitud de los procesos, el reordenamiento completo de las cadenas H y L de los genes de Ig slo ocurre en clulas B, y el reordenamiento completo del gen de TCR se limita a clulas T. Hitoshi Sakano y colaboradores obtuvieron resultados que sugieren que una secuencia dentro de los intensificadores 3 de la cadena (3 E) sirve para regular la unin de V a J en clulas B y T. Cuando se mut una secuencia conocida como sitio de unin PU.1 dentro del intensificador 3 de la cadena , estos investigadores encontraron que tuvo lugar la unin V -J en clulas T y asimismo en clulas B. Propusieron que la unin de una protena expresada por clulas T (pero no por clulas B) al intensificador de la cadena no mutada previene en condiciones normales la unin V -J en clulas T. An es necesario determinar la identidad de esta protena de unin de DNA en clulas T. Procesos similares pueden prevenir el reordenamiento del DNA de cadena pesada y de cadena en clulas T.

Al capturar una muestra significativa de todos los genes de la regin variable de cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina mediante la incorporacin en bibliotecas de bacterifagos, se han logrado reconstrucciones notables y tiles de la totalidad de los repertorios de anticuerpos de individuos. (En las siguientes secciones se describe cada uno de estos tipos de ingeniera gentica de anticuerpos.) Por ltimo, al reemplazar los loci de inmunoglobulina de una especie por los de otra, se ha dotado a los animales de una especie, como el ratn o la vaca, de la capacidad de responder a inmunizaciones elaborando anticuerpos codificados por los genes de Ig del donante trasplantados por medios genticos desde seres humanos.

Los anticuerpos monoclonales quimricos y humanizados poseen un gran potencial clnico

Un mtodo para la ingeniera de anticuerpos consiste en clonar DNA recombinante que contiene las secuencias promotora, lder y de regin variable de un gen de anticuerpo de ratn y los exones de regin constante de un gen de anticuerpo humano (fig. 5-23). El anticuerpo codificado por este gen recombinante es una quimera de ratn y ser humano que se conoce habitualmente como anticuerpo quimrico. Su especificidad antignica, que depende de la regin variable, deriva del DNA de ratn; su isotipo, determinado por la regin constante, procede del DNA humano. Debido a que los genes humanos codifican las regiones constantes de estos anticuerpos quimricos, los anticuerpos poseen menos determinantes antignicos de ratn y son mucho menos inmungenos cuando se administran a personas que los anticuerpos monoclonales murinos (fig. 5-23a). Uno de estos anticuerpos quimricos humano y de ratn se emple para el tratamiento de pacientes con variedades del linfoma no Hodgkin de clulas B (vase el enfoque clnico). Sin embargo, dado que las regiones enteras VH y VL del ratn se retienen en los anticuerpos quimricos, contienen cantidades significativas de la secuencia de Ig murina, lo que puede causar respuestas HAMA. Por fortuna, es posible disear anticuerpos en los cuales toda la secuencia es humana excepto las CDR, que se toman de anticuerpo monoclonal murino con la especificidad de antgeno deseada. Estos anticuerpos humanizados se esquematizan en la figura 5-23b. Los anticuerpos humanizados retienen las funciones efectoras biolgicas del anticuerpo humano y son ms eficaces que los anticuerpos murinos para desencadenar la activacin del complemento y los procesos mediador por receptor Fc en seres humanos, como la fagocitosis. Sin embargo, son menos inmungenos en el ser humano que los anticuerpos quimricos murino-humano. Los anticuerpos monoclonales quimricos tambin pueden adaptarse para que acten como inmunotoxinas. Por ejemplo, el dominio de regin constante terminal de un anticuerpo especfico de tumor puede hacerse altamente radiactivo por conjugacin con una marca radiactiva como itrio 90, o puede sustituirse por una toxina (o conjugarse con ella) como la diftrica (fig. 5-23c). Estas inmunotoxinas se seleccionan por su capacidad de unirse a clulas tumorales, lo cual las hace altamente especficas como reactivos teraputicos. Los heteroconjugados, o anticuerpos biespecficos, son hbridos de dos molculas de anticuerpo diferentes (fig. 5-23d). Pueden formarse mediante el enlace cruzado qumico de dos diferentes anticuerpos o al sintetizarlos en hibridomas que

Genes de anticuerpos e ingeniera de anticuerpos

En muchas aplicaciones clnicas podra ser til la extraordinaria especificidad de un anticuerpo monoclonal de ratn. Sin embargo, cuando se introducen anticuerpos monoclonales de ratn en seres humanos son reconocidos como extraos y precipitan una respuesta de anticuerpo antimurino humano (HAMA, del ingls human antimouse antibody) que elimina con rapidez del torrente sanguneo el anticuerpo monoclonal murino. Los complejos circulantes de anticuerpos murinos y humanos pueden causar reacciones alrgicas, y en algunos casos la acumulacin de estos complejos en rganos como los riones ocasiona reacciones graves e incluso letales. Es claro que un modo de evitar estas reacciones indeseables consiste en utilizar anticuerpos monoclonales humanos para aplicaciones clnicas. No obstante, el uso de tecnologa de hibridomas para elaborar anticuerpos monoclonales humanos se ha visto plagada de mltiples problemas tcnicos, y la generacin de hibridomas que secreten anticuerpos humanos sigue siendo un gran desafo. Para vencer estas dificultades se han desarrollado mtodos alternativos de ingeniera de anticuerpos en que se usa tecnologa de DNA recombinante. El conocimiento de las secuencias de los genes de anticuerpo y la estructura de los anticuerpos se ha unido con tcnicas de biologa molecular para hacer posible lo que Cesar Milstein, uno de los inventores de la tecnologa de anticuerpo monoclonal, denomin anticuerpos artificiales. Hoy en da es posible disear y construir genes que codifican molculas de inmunoglobulina en las cuales las regiones variables provienen de una especie, como el ratn, y las regiones constantes provienen de otra especie, como el ser humano. Se han creado nuevos genes que unen secuencias nucleotdicas codificadoras de protenas que no son anticuerpos con secuencias que codifican regiones variables de anticuerpo especficas para antgenos particulares. Estos hbridos moleculares, o quimeras, pueden llevar toxinas potentes a blancos antignicos particulares, como las clulas tumorales.

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA a) Ratn b) Ratn

C A P T UL O

137

Ser humano Anticuerpo quimrico ratnser humano

Ser humano Anticuerpo humanizado con CDR injertadas

Anticuerpo monoclonal de ratn (antitumoral) c) d)

Anticuerpo antitumoral

Antirreceptor de clula T Toxina

Inmunotoxina quimrica

Heteroconjugado

FIGURA 5-23 Ingeniera de anticuerpos mediante tecnologa de DNA recombinante. a) Anticuerpo monoclonal quimrico ratn-ser humano que contiene los dominios VH y VL de un anticuerpo monoclonal de ratn (azul) y los dominios CL y CH de un anticuerpo monoclonal humano (gris). b) Un anticuerpo monoclonal humanizado que slo contiene las CDR de un anticuerpo monoclonal de ratn (bandas azules) injertadas dentro de las regiones armazn de un anticuerpo monoclonal humano. c) Anticuerpo monoclonal quimrico en el cual se reemplaza el dominio Fc terminal por cadenas de toxina (blanco). d) Heteroconjugado en el que la mitad de la molcula de anticuerpo de ratn es especca para un antgeno de tumor y la otra mitad es especca para el complejo CD3/receptor de clula T.
poseen dos lneas celulares fusionadas diferentes que crean anticuerpo monoclonal. Estos dos mtodos generan mezclas de anticuerpos monoespecficos y biespecficos, de los cuales debe purificarse la molcula biespecfica deseada. Un mtodo ms simple y elegante consiste en usar ingeniera gentica para construir genes que codifiquen molculas slo con las dos especificidades deseadas. Se han diseado varias molculas biespecficas en las cuales una mitad del anticuerpo tiene especificidad para una clula tumoral y la otra mitad la tiene para una molcula de superficie en una clula efectora inmunitaria, por ejemplo una clula NK o un linfocito T citotxico (CTL), de modo que promueve la destruccin de la clula tumoral por la clula efectora.

generacin de inmunoglobulina funcional, los animales tampoco generan clulas B. Sin embargo, la capacidad de producir clulas B y anticuerpo puede restablecerse mediante la introduccin de loci funcionales para Ig de la lnea germinal murina en lneas de ratones con desactivacin de los genes para Ig. Algunos investigadores ingeniosos han mostrado que tambin la introduccin de porciones de loci H y L de la lnea germinal humana puede restablecer el desarrollo de clulas B, y da por resultado ratones que producen anticuerpos humanos. Sin embargo, los loci Ig de la lnea germinal completos son tramos muy largos de DNA (el locus H humano tiene 1.5 Mb, y el humano tiene 1 Mb), y algunas dificultades tcnicas impiden la introduccin de los loci H y L humanos enteros en ratones. Slo podran introducirse segmentos parciales de los loci, y en consecuencia no todos los elementos de estos loci grandes y complejos pueden expresarse. Un nuevo enfoque para abordar este problema surgi cuando Isao Ishida y sus colegas en la empresa farmacutica Kirin, de Japn generaron un cromosoma humano artificial (HAC) que porta los loci humanos completos de las cadenas pesada y . Despus introdujeron el HAC en clulas madre embrionarias derivadas de ratones con desactivacin de las cadenas H y L, y usaron las clulas transgnicas HAC para obtener lneas de ratones transgnicos que reaccionaban a la inoculacin de antgeno produciendo anticuerpos humanos especficos de antgeno (fig. 5-24). La inmunizacin de estos ratones transgnicos HAC con albmina srica humana indujo una respuesta consistente en anticuerpos humanos contra esa albmina. Uno de los puntos fuertes de este mtodo, as como de otros enfoques para trasplantar loci humanos de Ig de la lnea germinal en ratones, es que estos anticuerpos completamente humanos son producidos en clulas del linaje de los linfocitos B murinos, a partir de los cuales es fcil obtener por fusin celular hibridomas secretores de anticuerpo. Por tanto, este mtodo ofrece una solucin al problema de producir anticuerpos monoclonales humanos de cualquier especificidad deseada. Una ventaja nica adicional del enfoque HAC es la facilidad con que puede usarse para transferir loci de inmunoglobulina humanos completos a especies distintas del ratn. En fechas recientes se ha demostrado que bovinos transgnicos HAC clonados producen anticuerpos policlonales humanos. Dado que los bovinos tienen grandes volmenes de sangre (unos 60 litros), la recoleccin de su suero tiene el potencial de producir grandes cantidades de anticuerpos policlonales humanos. Como se expone en el enfoque clnico del captulo 4, los anticuerpos policlonales humanos tienen un papel importante y creciente en la prevencin y el tratamiento de enfermedades, y las estrategias para producirlos en huspedes no humanos de manera econmica y a gran escala revisten considerable inters biomdico.

Se han creado ratones con loci de inmunoglobulina humana

Por medio de tecnologa de desactivacin gnica es posible anular la capacidad de un ratn de reordenar sus loci de cadenas pesada y ligera de la lnea germinal. Estos ratones desactivados no producen Ig, y dado que el desarrollo de clulas B requiere la

Las bibliotecas de exhibicin en fago permiten producir anticuerpos monoclonales sin necesidad de inmunizacin
Otro mtodo para generar anticuerpos monoclonales evita por completo la tecnologa de hibridoma. Comenzando con una poblacin de clulas B, se aslan segmentos gnicos para los dominios reordenados VH y VL de los anticuerpos de clulas B. El resultado es una biblioteca extensa y diversa de genes para VH y VL que representa el repertorio de genes V reordenados

138

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

Clulas madre embrionarias (ES) murinas Loci H y L de ratn con desactivacin gnica

Cromosoma humano artificial (HAC)

Clulas ES con desactivacin del gen para Ig

Las clulas ES incorporan miniloci H y L humanos Transferencia a blastocisto murino

Blastocisto

Ratn quimrico Intercruzamiento de ratn quimrico

Ratn con desactivacin del gen para Ig murina, transgnico en HAC Inmunizacin con antgeno X

presentes en la fuente de la poblacin de clulas B. Estos genes para VH y VL se unen entonces entre s, junto con una secuencia peptdica de unin intermedia, para generar un conjunto de genes que codifican polipptidos llamados unidades variables de fragmentos de cadena sencilla (scFv) (fig. 5-25a). En cada unidad scFv, un dominio VH se parea con uno VL para crear una unidad de unin a antgeno mnima. Cuando se construyen scFv para la creacin de una biblioteca de fagos, cualquier gen VL puede unirse con cualquier gen VH, con lo que se crea una enorme diversidad de especificidades de anticuerpo; se han obtenido bibliotecas fgicas que contienen ms de 1011 miembros nicos. Este nivel de diversidad es comparable al repertorio humano in vivo, y tales bibliotecas altamente diversas contienen sitios de unin a anticuerpo especficas para una gama extraordinariamente amplia de antgenos. Un protocolo denominado tecnologa de exhibicin en fago (fig. 5-25b) hace posible dominar el poder de una gran biblioteca de genes para unidades scFv. Los fagos (abreviatura de bacterifagos) son virus bacterianos que constan de un genoma y una cubierta protenica. Mediante ingeniera gentica se unen genes que codifican unidades scFv con el gen que codifica una de las protenas de cubierta expresadas en la superficie del fago. El fago genticamente transformado produce entonces protenas de cubierta modificadas que exhiben la unidad scFv (dominios VH y VL unidos por un pptido) en la superficie fgica. Mediante clonacin en fagos es posible capturar repertorios muy grandes (106 a 109 sitios de unin a anticuerpo distintos) de genes scFv, con lo que se produce una biblioteca de exhibicin en fago. Las poblaciones de fagos se amplifican introduciendo stos en E. coli. Despus es posible buscar especificidad en la progenie de fagos incubando la biblioteca con un antgeno inmovilizado. Los fagos que no fijan antgeno son barridos por lavado, mientras que permanecen los que expresan unidades scFv que se unen de manera especfica al antgeno, as como algunos fagos que se unen a la placa de manera inespecfica. Para enriquecer an ms la poblacin de fago especfico de antgeno, se repite la infeccin de E. coli con fagos recuperados, a lo que siguen ciclos ulteriores de seleccin. Repitiendo los procesos de cultivo, seleccin antignica y cosecha, es posible aislar incluso un fago entre 109 fagos especficos de antgeno. Una vez que se identifican fagos portadores de sitios de unin deseables, es posible usar tcnicas de ingeniera gentica para recuperar las regiones codificadoras de VH y VL a partir del genoma fgico, las cuales se injertan entonces en los genes

FIGURA 5-24 Produccin de anticuerpo humano por ratones

Clulas de mieloma Clulas del bazo

Hibridomas

Mab1 Mab2 Mab3 Anticuerpos anti-X humanos monoclonales

que portan un cromosoma humano articial (HAC) que incluye loci completos de cadenas pesada y ligera humanas. Un cromosoma humano articial portador de los loci completos no reordenados de cadenas pesada y ligera humanas se introdujo en clulas madre embrionarias (ES) de ratn, donde los loci de cadenas pesadas y ligeras y haban sido desactivados. Las clulas ES modicadas se introdujeron en blastocistos, los cuales se transrieron a madres sustitutas y se les permiti generar ratones quimricos. El intercruzamiento de los ratones quimricos produjo individuos que producan anticuerpos humanos pero no Ig murina. La inmunizacin de estos ratones permiti la generacin de antisuero especco de antgeno que slo contena anticuerpos humanos, o la generacin de hibridomas que secretaban anticuerpos monoclonales humanos especcos de antgeno.

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

139

que codifican las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Cuando los genes para cadenas pesadas y ligeras modificados por ingeniera gentica se expresan en clulas, se produce un anticuerpo monoclonal especfico para el antgeno deseado. Por tanto, es posible evitar por completo la inmunizacin y producir un anticuerpo til sin recurrir a la tecnologa de hibridomas. Adems, si la biblioteca de fagos

se produce usando linfocitos B humanos como fuente de VH y VL y estos fragmentos se injertan en regiones constantes H e I humanas, el anticuerpo producido es del todo humano. De hecho, esta tecnologa se ha empleado con xito para generar un anticuerpo monoclonal humano contra la citocina inflamatoria TNF- . Dicho anticuerpo fue aprobado por la FDA y ahora es de uso clnico para el tratamiento de la artritis reumatoide.

a) VH

b) n Biblioteca gnica de unidades scFv VL Fago 1 Unin del gen para scFv al gen para la cubierta protenica del fago Unidades scFv Genoma fgico

Poblacin de clulas B

Anticuerpo Aislamiento de segmentos gnicos para dominios VH y VL de clulas B Fago transformado 2 Cultivo del fago en E. coli

Muchos segmentos gnicos para VH y VL

Recombinacin al azar con segmento gnico peptdico conector

3 Recuperacin del fago 4 Incubacin sobre antgeno inmovilizado 5 Lavado para eliminar fago no fijado

n Expresin

VH Pptido conector

6 Recuperacin de fago unido, recultivo de E. coli, incubacin sobre antgeno

VL

Unidad scFv

FIGURA 5-25 Generacin de bibliotecas fgicas que contienen sitios de unin a anticuerpo. a) Formacin de una biblioteca de scFv. b) La biblioteca de scFv se clona en fagos que se usan para infectar clulas de E. coli. El cultivo de las bacterias infectadas por fago genera una biblioteca fgica, la cual se estudia sobre placas cubiertas de antgeno en busca de la presencia de fagos que se unan al antgeno deseado. Mediante ciclos repetidos de uninelucin-recultivo se logra el enriquecimiento de las poblaciones de fago para especicidad antignica. Es posible aislar clonas de fago especco de antgeno y usar los mtodos de la tecnologa de DNA recombinante a n de injertar los genes para los dominios VH y VL de fagos seleccionados en el andamiaje de regin constante de un anticuerpo, y de este modo disear un anticuerpo monoclonal con la especicidad de antgeno deseada. [Adaptada de J. Marks, 2004.
Monoclonal antibodies from display libraries, en Molecular Biology of B Cells. T. Honjo, F. Alt, and M. Neuberger, eds. Elsevier, Amsterdam.]

Segundo ciclo: enriquecimiento de 103

Tercer ciclo: enriquecimiento de 103 7 Aislamiento de segmentos gnicos VH y VL del fago, modificacin de anticuerpo Fago de la especificidad antignica deseada Anticuerpo monoclonal de la especificidad deseada

140

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

EN F O Q U E C L N I C O

Teraputica del linfoma no Hodgkin y otras enfermedades mediante anticuerpos elaborados por ingeniera gentica
Los linfomas son cnceres del tejido
linftico en los que las clulas tumorales tienen un origen linfoctico. Existen dos formas principales de linfomas: Hodgkin y no Hodgkin. La forma menos comn es el linfoma de Hodgkin, llamado as en honor de su descubridor, Thomas Hodgkin, un mdico ingls. Este anatomopatlogo excepcionalmente dotado, que trabaj sin los benecios de un microscopio, identic este padecimiento en varios pacientes y describi por primera vez las caractersticas anatmicas de la enfermedad en 1832. Puesto que muchos especmenes de tejidos obtenidos de pacientes con afeccin de Hodgkin que se sospechaba que padecan la enfermedad se conservaron en el Gordon Museum of Guys Hospital en Londres, fue posible que las generaciones posteriores juzgaran la precisin de sus diagnsticos. Hodgkin razon con certeza. Estudios de estos tejidos preservados conrman que estuvo acertado en alrededor de 60% de los casos, un logro sorprendente si se toma en cuenta la tecnologa de esa poca. En la actualidad, casi todos los linfomas son de tipo no Hodgkin e incluyen alrededor de 10 variedades diferentes de la enfermedad. Los linfomas de clulas B son una fraccin importante de ellos. Durante algunos aos, los principales tratamientos contra los linfomas han consistido en radiacin, quimioterapia o una combinacin de ambos. Si bien estas terapias benecian a un gran nmero de pacientes, con incremento de la supervivencia, son comunes las recadas despus del tratamiento y muchos enfermos tratados experimentan efectos secundarios debilitantes. Los efectos secundarios son una consecuencia esperada de estas teraputicas porque destruyen o daan gravemente una amplia gama de clulas normales y tumorales. Una de las grandes esperanzas de la terapia del cncer es el descubrimiento de tratamientos que slo afecten clulas tumorales sin lesionar las normales. Si los tipos particulares de clulas cancerosas tuvieran antgenos que fueran especcos de tumor, estos antgenos seran los blancos ideales para un combate inmunitario. Por desgracia se conocen muy pocas de esas molculas. Sin embargo, se han reconocido varios antgenos que se restringen al linaje celular en el cual se origina el tumor y que se expresan en las clulas tumorales. Se han identicado muchos antgenos especcos de linaje celular para linfocitos B y linfomas B, incluida la inmunoglobulina, la caracterstica distintiva de la clula B, y CD20, una fosfoprotena unida a membrana. La CD20 ha surgido como un candidato atractivo para la inmunoterapia mediada por anticuerpo porque se encuentra en linfomas B y el enlace cruzado mediado por anticuerpo no la disminuye ni internaliza. De hecho, hace algunos aos se elaboraron anticuerpos monoclonales de ratn contra CD20 y uno de ellos form la base para la inmunoterapia antilinfoma de clulas B. Al parecer, este mtodo ya est listo para ocupar un sitio como coadyuvante o alternativa de la radiacin y la quimioterapia. El desarrollo de este anticuerpo antitumoral es un excelente estudio de casos de la aplicacin combinada de la informacin inmunolgica y la biologa molecular para disear un agente teraputico novedoso. El anticuerpo anti-CD20 original era un anticuerpo monoclonal de ratn con cadenas pesadas y cadenas ligeras murinas. Mediante reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se amplicaron las secuencias de DNA de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de este anticuerpo. A continuacin se cre un gen quimrico al sustituir las secuencias gnicas de CDR de una cadena pesada humana 1 con las de la cadena pesada murina. En una maniobra similar, se ligaron las CDR murinas en un gen humano. Luego los genes quimricos creados se incorporaron en vectores que permitieron valores altos de expresin en clulas de mamferos. Cuando se cotransfect una lnea celular apropiada con estos dos productos, se produjeron anticuerpos quimricos que contenan CDR de origen murino junto con armazones de regin variable y regiones cons-

tantes humanas. Despus de puricarlo, se valor la actividad biolgica del anticuerpo, primero in vitro y a continuacin en un modelo de primate. Los resultados iniciales fueron muy alentadores. La regin constante humana injertada apoy las funciones efectoras como la lisis mediada por complemento o la citotoxicidad mediada por clulas dependientes de anticuerpo de clulas linfoides B humanas. Ms an, las inyecciones semanales del anticuerpo en monos dieron por resultado la reduccin rpida y sostenida de clulas B de sangre perifrica, ganglios linfticos e incluso mdula sea. Cuando se suspendieron las infusiones de anticuerpo anti-CD20, la diferenciacin de nuevas clulas B de poblaciones progenitoras permiti que se recuperaran al nal poblaciones de clula B y se alcanzaran valores normales. A partir de estos resultados, aument la esperanza de que este anticuerpo quimrico inmunolgicamente activo pudiera utilizarse para eliminar del cuerpo poblaciones completas de clulas B, incluidas las clulas B de linfoma, de un modo que respete otras poblaciones celulares. Esto llev a estudiar el anticuerpo en pacientes humanos. Los estudios clnicos en personas incluyeron a enfermos con linfoma de clulas B que haban recado despus de la quimioterapia o el tratamiento con radiacin. Estas investigaciones se enfocaron en tres aspectos importantes: ecacia, seguridad e inmunogenicidad. Si bien no todos los individuos reaccionaron a la teraputica con anti-CD20, casi 50% de ellos mostr una remisin completa o parcial. Por consiguiente, se demostr la ecacia, ya que este grado de respuesta es comparable a la tasa de xitos con mtodos tradicionales en los que se utilizan frmacos citotxicos o radiacin, lo que representa un tratamiento en verdad alternativo. En algunos sujetos se observaron efectos secundarios como nuseas, presin arterial baja y disnea (por lo general durante el inicio del tratamiento o poco despus de comenzarlo); en su mayor parte, no fueron importantes ni pusieron en peligro la vida. En consecuencia, el tratamiento con el anti-CD20 quimrico es al parecer seguro. Los pacientes se observaron muy de cerca en busca de la aparicin de respuestas de anticuerpos humanos anti-Ig de ratn (HAMA) y anticuerpo humano antiquimrico (HACA). No se advirtieron estas reacciones. Por lo tanto, el anticuerpo no era inmungeno. La ausencia de estas respuestas demostr

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

141

que los anticuerpos pueden manipularse con ingeniera gentica para minimizar o incluso evitar reacciones inmunitarias indeseables. Otra razn para humanizar anticuerpos murinos es la vida media muy corta (unas cuantas horas) de los anticuerpos IgG de ratn en seres humanos en comparacin con la vida media de tres semanas de sus equivalentes humanos o humanizados. La ingeniera de anticuerpos ha contribuido asimismo al tratamiento de otras afecciones malignas como cncer de mama, que se diagnostica en ms de 180 000 mujeres estadounidenses cada ao. Un poco ms de la cuarta parte del total de pacientes con cncer mamario padece cnceres que expresan exceso de un receptor de factor de crecimiento denominado HER2 (receptor 2 de factor de crecimiento epidrmico humano). Muchos tumores que expresan en exceso HER2 crecen con mayor rapidez y representan una amenaza ms grave que los

que evidencian valores normales de esta protena en su supercie. Se crea mediante ingeniera gentica un anticuerpo monoclonal anti-HER2 quimrico en el que, con excepcin de las CDR, todas las protenas son de origen humano. De modo especco, se tomaron secuencias de DNA para las CDR de cadenas pesadas y ligeras de genes de ratn clonados que codicaban un anticuerpo monoclonal anti-HER2. Al igual que en la estrategia anti-CD20 antes descrita, se utiliz cada uno de los segmentos gnicos de CDR del ratn para reemplazar segmentos gnicos de CDR humano correspondientes en genes del ser humano que codicaban la cadena pesada de IgG1 y la cadena ligera humanas. Cuando este anticuerpo se emplea combinado con un frmaco quimioterpico, es muy ecaz contra el cncer de mama metastsico. Se compararon los efectos en sujetos que slo recibieron un medicamento quimioterpico con los de personas en quienes

se usaron este ltimo y el anticuerpo antiHER2 modicado. La combinacin del tratamiento anti-HER2/quimioterapia demostr tasas signicativamente reducidas de progresin del tumor, un porcentaje ms alto de pacientes que respondieron y una tasa de supervivencia a un ao ms alta. El tratamiento con trastuzumab, como se denomina a este anticuerpo monoclonal de diseo, se convirti ya en parte del repertorio estndar de los tratamientos para el cncer de mama. El desarrollo de anticuerpos monoclonales de diseo y mtodos ordinarios es una de las reas ms activas en la industria farmacutica. El cuadro adjunto es una recopilacin parcial de los anticuerpos monoclonales aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) para utilizarse en el tratamiento de la enfermedad en seres humanos. Muchos ms progresos se encuentran en diversas etapas de desarrollo y evaluacin.

Algunos anticuerpos monoclonales utilizados en clnica

Anticuerpo monoclonal (mAB) Muromonab-CD3 Naturaleza del anticuerpo mAB de ratn Blanco (especicidad de anticuerpo) Clulas T (CD3, un antgeno de clula T) Receptor de coagulacin de plaquetas (GP IIb/IIIa) Tratamiento para Rechazo agudo de trasplantes de hgado, corazn y rin Coagulacin sangunea durante angioplastia y otros procedimientos cardacos Rechazo agudo de trasplantes de rin Artritis reumatoide y enfermedad de Crohn Infeccin por RSV en nios, en particular lactantes Leucemia mieloide aguda (LMA)

Abciximab

Quimrico humano-ratn

Daclizumab

mAB humanizado

Clulas T activadas (subunidad del receptor IL-2) Factor de necrosis tumoral (TNF), un mediador de la inamacin (TNF) Virus sincicial respiratorio (RSV) (protena F, un componente del RSV) Muchas clulas de linaje mieloide (CD33, una molcula de adhesin) Muchos tipos de leucocitos (CD52, un antgeno de supercie celular) Un receptor de factor de crecimiento epidrmico (receptor HER2) Clulas B (CD20, un antgeno de supercie de clula B) Clulas B (CD20, un antgeno de supercie de clula B)

Iniximab

Quimrico humano-ratn mAB humanizado

Palivizumab

Gemtuzumab

mAB humanizado

Alemtuzumab

mAB humanizado

Leucemia linfoctica crnica de clulas B Cnceres de mama avanzados positivos para receptor HER2 Linfoma no Hodgkin recidivante o resistente Linfoma no Hodgkin recidivante o resistente

Trastuzumab Rituximab Ibritumomab

mAB humanizado Quimrico humano-ratn mAB de ratn

FUENTE: Adaptado de Carter P. Improving the efcacy of antibody-based cancer therapies. Nature Reviews/Cancer 2001;1:118.

142

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

RESUMEN

Tres familias multignicas separadas codifican las cadenas ligeras y pesadas y de la inmunoglobulina; cada una contiene numerosos segmentos gnicos y se localiza en distintos cromosomas. Los genes funcionales de las cadenas ligera y pesada se generan por reordenamientos aleatorios de segmentos gnicos de la regin variable en el DNA de la lnea germinal. Los genes activadores de recombinasa, RAG-1 y RAG-2, adems de la participacin de otras enzimas y protenas, catalizan la unin V(D)J. La unin de los segmentos se dirige mediante secuencias seal de recombinacin (RSS), secuencias de DNA conservadas a los lados de cada segmento gnico V, D y J. Cada secuencia seal de recombinacin contiene una secuencia heptmera conservada, una secuencia nonmera conservada y un espaciador de 12 pb (un giro) o 23 pb (dos giros). Durante el reordenamiento, los segmentos gnicos con un espaciador de un giro a ambos lados slo se unen a segmentos con un espaciador de dos giros a ambos lados, lo que asegura la unin apropiada de VL-JL y VH-DH-JH. Los reordenamientos del gen de inmunoglobulina ocurren de manera secuencial: primero reordenamientos de cadena pesada, seguidos de reordenamientos de cadena ligera. La exclusin allica es una consecuencia del reordenamiento funcional del DNA de la inmunoglobulina slo de un cromosoma parental y es necesaria para asegurar que una clula B exprese inmunoglobulina con especificidad antignica nica. Los principales orgenes de la diversidad de anticuerpos, que pueden generar >1010 posibles sitios de combinacin de anticuerpos, son: unin aleatoria de mltiples segmentos gnicos de las lneas germinales V, J y D; relacin aleatoria de cadenas pesada y ligera; flexibilidad de unin; adicin P; adicin N, y mutacin somtica. Sin embargo, en algunas especies, como aves y rumiantes, los procesos de diversificacin somtica son generadores importantes de diversidad de repertorio primaria. Despus de la inmunizacin, la hipermutacin somtica es un factor importante para generar anticuerpos con mayor afinidad por el antgeno inmunizante. Despus de la estimulacin antignica de clulas B maduras, el cambio de clase tiene como resultado la expresin de diferentes clases de anticuerpo (IgG, IgA, IgE) con la misma especificidad antignica. La desaminasa de citidina inducida por activacin (AID) es esencial para la hipermutacin somtica, la conversin gnica y el cambio de clase. El procesamiento diferencial de RNA del transcrito primario de la cadena pesada de la inmunoglobulina genera anticuerpo unido a membrana en clulas B maduras, anticuerpo secretado en clulas plasmticas y expresin simultnea de IgM e IgD por clulas B maduras. Al menos dos tipos de secuencias reguladoras del DNA regulan la transcripcin de genes de inmunoglobulina: promotoras e intensificadoras. El conocimiento creciente de la biologa molecular de los genes de inmunoglobulina ha hecho posible obtener por in-

geniera gentica anticuerpos para investigacin y teraputica. Los mtodos incluyen anticuerpos quimricos, bibliotecas de genes de Ig basadas en fagos, y trasplante de loci completos de inmunoglobulina humana en ratones y bovinos para generar anticuerpos humanos.

Bibliografa
Dreyer, W. J., and J. C. Bennet. 1965. The molecular basis of antibody formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54:864. Eichmann, K. 2005. Khlers Invention. Birkhuser, Boston. Flajnik, M. F. 2002. Comparative analyses of immunoglobulin genes: Surprises and portents. Nature Reviews Immunology 2:688 Fugmann, S. D., et al. 2000. The RAG proteins and V(D)J recombination: Complexes, ends and transposition. Annual Review of Immunology 18:495. Hozumi, N., and S. Tonegawa. 1976. Evidence of somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 73:3628 Hudson, P. J., and C. Souriau. 2003. Engineered antibodies. Nature Medicine 9:129. Maizels, N., and M. D. Scharff. 2004. Molecular mechanism of hypermutation. In Molecular Biology of B Cells. T. Honjo, F. Alt, and M. Neuberger, eds. Elsevier, Amsterdam. Maloney, D. G., et al. 1997. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkins lymphoma. Blood 90:2188. Marks, J. D. 2004. Monoclonal antibodies from display libraries. In Molecular Biology of B Cells. T. Honjo, F. W. Alt, and M. S. Neuberger, eds. Elsevier, Amsterdam. Matsuda, F., et al. 1998. The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. Journal of Experimental Medicine 188:2151. Max, E. E. 2004. Immunoglobulins: molecular genetics. In Fundamental Immunology, 5th ed., W. E. Paul, ed. Lippincott-Raven, Philadelphia. Mostoslavsky, R., F. W. Alt, and K. Rajewsky. 2004. The lingering enigma of the allelic exclusion mechanism. Cell 118:539. Muramatsu, M., et al. 2000. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell 102:553. Oettinger, M. A., et al. 1990. RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. Science 248:1517. Tonegawa, S. 1983. Somatic generation of antibody diversity. Nature 302:575.

Sitios tiles de la red

http://www.clinicaltrials.gov/
Este sitio proporciona informacin actualizada acerca de pruebas clnicas con fondos federales y privados en seres humanos (voluntarios). Presenta informacin sobre finalidad,

ORGANIZACIN Y EXPRESIN DE LOS GENES DE INMUNOGLOBULINA

C A P T UL O

143

normas para reclutamiento de participantes, ubicaciones y nmeros telefnicos para obtener ms detalles. En este sitio puede consultarse informacin ms puntual sobre calificaciones de ensayos clnicos con anticuerpos monoclonales.

http://www.google.com
Select Google Groups es un servicio gratuito de comunidad en lnea y grupo de discusin que ofrece un archivo extenso sobre anuncios en Usenet sobre muchos temas. En el sitio Google Group, al seleccionar antibody o phage display se accede a una multitud de sitios con informacin til sobre ingeniera de anticuerpos.

3. Considere slo la unin combinatoria de segmentos gnicos y la relacin de cadenas ligera y pesada. Cuntas molculas de anticuerpo diferentes podra generar un DNA de lnea germinal que contiene 500 segmentos gnicos VL, cuatro JL, 300 VH, 15 DH y cuatro JH? 4. Por cada una de las afirmaciones incompletas siguientes (a-g), elija la o las frases que completan de modo correcto la aseveracin. Puede ser correcta ms de una eleccin. a. La recombinacin de segmentos gnicos de la inmunoglobulina sirve para: 1) Promover la diversificacin de inmunoglobulinas (Ig) 2) Ensamblar una secuencia completa de codificacin de inmunoglobulina (Ig) 3) Permitir cambios en la informacin codificadora durante la maduracin de la clula B 4) Aumentar la afinidad de la inmunoglobulina por anticuerpo 5) Todas las anteriores b. La mutacin somtica de los genes de inmunoglobulina origina: 1) Exclusin allica 2) Cambio de clase de IgM a IgG 3) Maduracin de afinidad 4) Todas las anteriores 5) Ninguna de las anteriores c. La frecuencia de mutacin somtica en genes de Ig es mayor durante: 1) La diferenciacin de clulas pre-B en clulas B maduras 2) La diferenciacin de clulas pre-T en clulas T maduras 3) La generacin de clulas de memoria 4) La secrecin de anticuerpo por clulas plasmticas 5) Ninguna de las anteriores d. Los genes de cadenas ligeras y : 1) Se localizan en el mismo cromosoma 2) Se relacionan slo con un tipo de cadena pesada 3) Pueden ser expresados por la misma clula B 4) Todas las anteriores 5) Ninguna de las anteriores e. La generacin de diversidad combinatoria entre inmunoglobulinas incluye: 1) Empalme de mRNA 2) Reordenamiento de DNA 3) Secuencias seal de recombinacin 4) Regla de unin de un giro-dos giros 5) Sitios de cambio f. Una clula B se torna inmunocompetente: 1) Despus del reordenamiento productivo de segmentos gnicos de cadena pesada de la regin variable en el DNA de lnea germinal 2) Despus del reordenamiento productivo de segmentos gnicos de las cadenas pesadas y ligeras de la regin variable en el DNA de la lnea germinal 3) Despus del cambio de clase 4) Durante la maduracin de afinidad 5) Despus de la unin de citocinas TH a sus receptores en la clula B g. El mecanismo que permite que las inmunoglobulinas se sinteticen en forma unida a membrana o secretada es: 1) Exclusin allica 2) Expresin codominante

http://imgt.cines.fr/
El sitio IMGT contiene una coleccin de bases de datos de genes importantes para el sistema inmunitario. La base de datos IMGT/LIGM contiene secuencias pertenecientes a la superfamilia de inmunoglobulinas y secuencias del receptor de antgeno de la clula T.

Preguntas de estudio
PREGUNTA DE ENFOQUE CLNICO
La seccin de enfoque clnico incluye un cuadro de anticuerpos monoclonales aprobados para uso clnico. Dos de ellos, rituximab e ibritumomab, se utilizan para el tratamiento del linfoma no Hodgkin. Ambos se dirigen a CD20, un antgeno de superficie de las clulas B. Ibritumomab es modificado qumicamente por la fijacin de istopos radiactivos (itrio-90, un emisor , o indio-111, un emisor de alta energa) que irradian con dosis letales clulas a las cuales se une anticuerpo monoclonal. Los experimentos iniciales encontraron que ibritumomab sin un istopo radiactivo unido era un agente teraputico ineficaz, en tanto que rituximab no marcado, un anticuerpo monoclonal humanizado, era efectivo. Ms an, rituximab con un istopo radiactivo unido era muy txico; ibritumomab, que llevaba el mismo istopo en cantidades equivalentes, fue mucho menos txico. Explique estos resultados. (Sugerencia: cuanto ms tiempo permanece un istopo radiactivo en el cuerpo, tanto mayor es la dosis de radiacin que absorbe el cuerpo.)

1. Indique si cada una de las afirmaciones siguientes es verdadera o falsa. Si piensa que una afirmacin es falsa explique por qu. a. Los segmentos gnicos V se unen en ocasiones a segmentos gnicos C . b. Con excepcin de un cambio a IgD, el reordenamiento del DNA media el cambio de clase de inmunoglobulinas. c. Los exones separados codifican la porcin transmembranal de cada inmunoglobulina de membrana. d. Aunque cada clula B lleva dos alelos que codifican las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, slo se expresa un alelo. e. Los transcritos primarios son procesados en mRNA funcional mediante eliminacin de intrones, eliminacin de la secuencia inicial y adicin de una cola poli-A. f. El transcrito primario es un complemento en RNA de la cadena codificadora del DNA e incluye intrones y exones. 2. Explique por qu un segmento VH no puede unirse de manera directa con un segmento JH en el reordenamiento del gen de cadena pesada.

144

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

3) Cambio de clase 4) Regla de unin de un giro-dos giros 5) Procesamiento diferencial de RNA 5. Qu mecanismos generan las tres regiones hipervariables (regiones determinantes de la complementariedad) de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina? Por qu es ms variable la tercera regin hipervariable (CDR3) que las otras dos (CDR1 y CDR2)? 6. Se proporciona una lnea de clulas de mieloma clonada que secreta IgG con la frmula molecular 2 2. Los genes derivados del alelo 1 codifican tanto la cadena pesada como la ligera en esta lnea celular. Indique la o las formas en que existira cada uno de los genes que se indican a continuacin en esta lnea celular mediante los smbolos siguientes: G forma de lnea germinal; R forma reordenada de modo productivo; NP forma reordenada de modo improductivo. Indique el motivo de su eleccin en cada caso. a. Alelo 1 de cadena pesada b. Alelo 2 de cadena pesada c. Alelo 1 de cadena d. Alelo 2 de cadena e. Alelo 1 de cadena f. Alelo 2 de cadena

c. ________________ Uniones de codificacin d. ________________ RSS e. ________________ Nucletidos P f. ________________ Nucletidos N g. ________________ Promotores h. ________________ Intensificadores Descripciones 1) Uniones entre segmentos gnicos de inmunoglobulina formados durante el reordenamiento 2) Origen de la diversidad de cadenas pesadas de anticuerpos 3) Secuencias reguladoras del DNA 4) Secuencias de DNA conservadas, adyacentes a los segmentos V, D y J que ayudan al reordenamiento directo del gen 5) Enzimas expresadas en clulas B en desarrollo 6) Enzimas expresadas en clulas B maduras 7) Secuencias de nucletido localizadas cerca de cada segmento lder en los genes de inmunoglobulina a los cuales se une la polimerasa de RNA 8) Producto de escisin por endonucleasa de intermediarios de horquilla en el reordenamiento del gen de inmunoglobulina 9) Enzimas defectuosas en el ratn con SCID 10) Secuencias de nucletidos que aumentan mucho la intensidad de transcripcin de genes de inmunoglobulina reordenados comparadas con el DNA de lnea germinal 11) Nucletidos aadidos por la enzima TdT 13. Muchos linfomas de clula B expresan inmunoglobulina de superficie en sus membranas plasmticas. Es posible aislar este anticuerpo de linfoma y obtener un anticuerpo murino antiidiotipo monoclonal muy especfico de alta afinidad contra l. Qu medidas deben llevarse a cabo para hacer que este anticuerpo monoclonal de ratn sea ms adecuado para utilizarse en pacientes? Es muy probable que, una vez formado, este anticuerpo de diseo sea til en general para pacientes con linfoma? 14. A qu nivel, de RNA o DNA, son determinadas cada una de las siguientes actividades? a. b. c. d. e. Anticuerpo de membrana o secretado IgM o IgG Unin VJ IgA o IgE Unin VDJ

7. Un linfoma de clula B ha llevado a cabo reordenaciones no productivas para ambos alelos de cadena pesada. Cul es el reordenamiento de este DNA de cadena ligera? Por qu? 8. Indique si cada uno de los cambios de clase que se indican a continuacin puede ocurrir (S) o no (No). a. IgM a IgD b. IgM a IgA c. IgE a IgG d. IgA a IgG e. IgM a IgG

9. Describa una ventaja y una desventaja de la adicin de nucletidos N durante el reordenamiento de los segmentos gnicos de cadena pesada de la inmunoglobulina. 10. Un anlisis de cristalografa con rayos X de muchas molculas de anticuerpo unidas a sus antgenos respectivos revel que la CDR3, tanto de la cadena pesada como de la ligera, puede estar en contacto con el eptopo. Ms an, el anlisis de secuencia mostr que la variabilidad de la CDR3 es mayor que la de CDR1 o CDR2. Qu mecanismos explican la mayor diversidad en CDR3? 11. Cuntas posibilidades tiene una clula B en desarrollo de generar un gen de cadena ligera de inmunoglobulina funcional? 12. Relacione los trminos mencionados a continuacin (a-h) con las descripciones siguientes (1-11). Cada descripcin puede utilizarse una vez, ms de una vez o ninguna vez; puede aplicarse ms de una descripcin a algunos trminos. Trminos a. ________________ RAG-1 y RAG-2 b. ________________ Enzimas reparadoras de rotura de doble cadena (DSBR)

15. La tendencia a la alergia puede ser hereditaria, debido a una predisposicin gentica que favorece la produccin de anticuerpos IgE. Sin embargo, el antgeno al que un individuo es alrgico (el alergeno) no se hereda. Dado que el lector sabe cmo se produce la especificidad de anticuerpo, explique esta aparente contradiccin.

captulo 6
Interacciones antgeno-anticuerpo: principios y aplicaciones

a interaccin antgeno-anticuerpo es una relacin bimolecular parecida a la interaccin enzimasustrato, con una diferencia importante: no conduce a una alteracin qumica irreversible en el anticuerpo ni en el antgeno. La relacin entre un anticuerpo y un antgeno incluye varias interacciones no covalentes entre el determinante antignico, o eptopo, del antgeno y el dominio de regin variable (VH/VL) de la molcula del anticuerpo, en particular las regiones hipervariables, o regiones determinantes de complementariedad (RDC). La minuciosa especificidad de las interacciones antgeno-anticuerpo condujo al desarrollo de una diversidad de pruebas inmunolgicas, que pueden utilizarse para detectar la presencia de anticuerpo o de antgeno. Los inmunoensayos han sido de vital importancia en el diagnstico de enfermedades, la vigilancia del grado de respuesta inmunitaria humoral y la identificacin de molculas de inters biolgico o mdico. Estas valoraciones difieren en su rapidez y sensibilidad; algunas son estrictamente cualitativas, otras son cuantitativas. En este captulo se examina la naturaleza de la interaccin antgenoanticuerpo y se describen diversas pruebas inmunitarias que miden o aprovechan esta interaccin.

La tincin fluorescente del anticuerpo revela inmunoglobulina intracelular. [H. A. Schreuder et al., 1997, Nature 386:196; cortesa de H. Schreuder, Hoechst Marion Roussel.]

Potencia de las interacciones antgeno-anticuerpo Reactividad cruzada Resonancia de plasmones superciales Reacciones de precipitacin Reacciones de aglutinacin Radioinmunoensayo Ensayo de inmunosorbente ligado a enzima Western blotting Inmunoprecipitacin Inmunouorescencia Citometra de ujo y uorescencia Alternativas a las reacciones antgeno-anticuerpo Microscopia inmunoelectrnica

Potencia de las interacciones antgeno-anticuerpo

Las interacciones no covalentes que forman la base de la unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ab) incluyen enlaces de hidrgeno, enlaces inicos, interacciones hidrfobas e interacciones de van der Waals (fig. 6-1). Puesto que estas interacciones son dbiles a nivel individual (comparadas con un enlace covalente), se necesita un gran nmero de ellas para formar una interaccin Ag-Ab potente. Ms an, cada una de estas interacciones no covalentes opera a una distancia muy corta, por lo general de alrededor de 1 10 7 mm (1 angstrom, ); en consecuencia, una interaccin Ag-Ab potente depende de un ajuste muy estrecho entre el antgeno y el anticuerpo. Este ajuste requiere un grado alto de complementariedad entre el antgeno y el anticuerpo, una exi-

gencia que sustenta la especificidad exquisita que caracteriza las interacciones antgeno-anticuerpo.

La anidad de anticuerpo es una medida cuantitativa de la fuerza de la unin

La fuerza combinada de las interacciones no covalentes entre un sitio de unin de antgeno nico en un anticuerpo y un eptopo

145

146
ANTGENO

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

ANTICUERPO NH2

CH2 CH2

OH O

CH2

CH2 Enlace de hidrgeno CH2 CH2 Enlace inico

CH2 NH3+ O C O

CH2 CH CH3 CH3 CH3 CH3 CH CH CH O CH2 C O

+H 3N

constante de asociacin, Ka (es decir, k1/k 1 Ka), una medida de afinidad. En inmunologa, Ka se denomina constante de afinidad. Como Ka es la constante de equilibrio para la reaccin de un sitio de unin del anticuerpo con el antgeno y como la concentracin molar de un sitio de unin individual es igual a la concentracin del anticuerpo, Ka puede calcularse a partir de la relacin de la concentracin molar del complejo Ag-Ab con las concentraciones molares de antgeno y anticuerpo no unidos en equilibrio como sigue: Ka [Ag-Ab] [Ab][Ag]

Interacciones hidrfobas CH2 Interacciones de van der Waals

CH3 CH3 CH CH3

CH2

Enlaces inicos

FIGURA 6-1 La interaccin entre un anticuerpo y un antgeno depende de cuatro tipos de fuerzas no covalentes: 1) enlaces de hidrgeno, en los que dos tomos electronegativos comparten un tomo de hidrgeno; 2) enlaces inicos entre residuos de carga opuesta; 3) interacciones hidrfobas, en las que el agua fuerza la unin de grupos hidrfobos, y 4) interacciones de van der Waals entre las nubes de electrones externos de dos o ms tomos. En un ambiente acuoso, las interacciones no covalentes son en extremo dbiles y dependen de la complementariedad cercana de las formas del anticuerpo y el antgeno.

nico es la afinidad del anticuerpo por ese eptopo. Los anticuerpos de afinidad baja unen antgeno de manera dbil y tienden a disociarse con facilidad, en tanto que los de afinidad alta unen antgeno con ms firmeza y la unin se mantiene por ms tiempo. La relacin entre el sitio de unin en un anticuerpo (Ab) y un antgeno (Ag) monovalente puede describirse mediante la ecuacin Ag k1 Ab ERF Ag-Ab k 1

El valor de Ka vara para diferentes complejos Ag-Ab y depende tanto de k1, que se expresa en unidades de litros/mol/segundo (L/mol/s), como de k 1, que se expresa en unidades de 1/s. Para haptenos pequeos, la constante de velocidad hacia la derecha puede ser en extremo alta; en algunos casos k1 puede ser tan alta como 4 108 L/mol/s, prxima al lmite superior terico de las reacciones limitadas por difusin (109 L/mol/s). Sin embargo, para antgenos protenicos ms grandes k1 es ms pequea, con valores en el intervalo de 105 L/mol/s. La velocidad con que el antgeno unido deja un sitio de unin a anticuerpo (es decir, la constante de velocidad de disociacin, k 1) tiene una funcin importante en determinar la afinidad del anticuerpo por un antgeno. El cuadro 6-1 ilustra el papel de k 1 para determinar la constante de asociacin Ka para varias interacciones Ag-Ab. Por ejemplo, la k1 para el sistema DNP-llisina es alrededor de un quinto de la del sistema de fluorescena, pero su k 1 es 200 veces mayor; en consecuencia, la afinidad Ka del anticuerpo antifluorescena por el sistema de fluorescena es unas 1 000 veces mayor que la del anticuerpo anti-DNP. Los complejos Ag-Ab de afinidad baja poseen valores Ka entre 104 y 105 L/mol; los complejos de afinidad alta pueden tener valores de Ka tan altos como 1011 L/mol. La disociacin del complejo antgeno-anticuerpo tiene inters para algunos propsitos: Ag-Ab ERF Ag Ab

La constante de equilibrio para esta reaccin de disociacin es Kd, la constante de disociacin, que es el recproco de Ka: Kd [Ab][Ag] [Ab-Ag] 1/Ka

donde k1 es la constante de velocidad hacia la derecha (asociacin) y k 1 es la constante de rapidez hacia la izquierda (disociacin). En trminos bioqumicos, la relacin k1/k 1 es la

Los complejos muy estables tienen valores muy bajos de Kd; los menos estables tienen valores ms altos. Aunque Kd no es la

CUADRO 6-1
Anticuerpo Anti-DNP Antiuorescena

Constantes de velocidad hacia la derecha y hacia la izquierda (k1 y k1) y constantes de asociacin y disociacin (Ka y Kd) para tres interacciones de ligando y anticuerpo
Ligando -DNP-L-lisina Fluorescena Dansil-BSA 8 4 3 k1 107 108 10
5

k 1 5 2

Ka 1 108 1011 10
8

Kd 1 1 5.9 10 10
8 11 9

10 10

3 3

1 1.7

Antialbmina srica de bovino (BSA)

10

FUENTE: Adaptado de H. N. Eisen, 1990, Immunology, 3rd ed., Harper & Row Publishers.

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

147

a) Testigo: ausencia de anticuerpo (el ligando se equilibra por igual en ambos lados)

b) Testigo
100

B B
50

Concentracin de ligando, M

Estado inicial

Equilibrio

Experimental: anticuerpo en A (en equilibrio ms ligando en A por la unin de Ab) A B A B

Experimental
100
A

Anticuerpo

Ligando radiomarcado

50
B

Ligando unido por anticuerpo

Estado inicial

Equilibrio

4 6 Tiempo, h

FIGURA 6-2 Determinacin de la anidad del anticuerpo

mediante dilisis de equilibrio. a) La cmara de dilisis contiene dos compartimientos (A y B) separados por una membrana semipermeable. Se aade anticuerpo a un compartimiento y un ligando radiomarcado al otro. Una vez en equilibrio, se mide la concentra-

cin de radiactividad en ambos compartimientos. b) Grca de la concentracin de ligando en cada compartimiento con el tiempo. En equilibrio, la diferencia en la concentracin de ligando radiactivo en los dos compartimientos representa la cantidad de ligando unido al anticuerpo.

constante de afinidad, por supuesto sta, Ka, puede calcularse fcilmente a partir de Kd como sigue: Ka 1/Kd. La constante de afinidad, Ka, que antes se determinaba mediante dilisis de equilibrio, ahora se deduce por mtodos ms modernos, en especial resonancia de plasmones superficiales (SPR, del ingls surface plasmon resonance), que se considera en una seccin posterior. Dado que la dilisis de equilibrio ilustra importantes principios y para algunos inmunlogos sigue siendo el estndar contra el cual se evalan otros mtodos, se describe aqu. En este procedimiento se utiliza una cmara de dilisis que contiene dos compartimientos iguales separados por una membrana semipermeable. En un compartimiento se coloca el anticuerpo y en el otro un ligando marcado radiactivamente que es lo bastante pequeo para pasar a travs de una membrana semipermeable (fig. 6-2). Entre los ligandos convenientes se incluyen haptenos, oligosacridos y oligopptidos. En ausencia de anticuerpo, el ligando aadido al compartimiento B se equilibra en ambos lados de la membrana (fig. 6-2a). Sin embargo, en presencia de anticuerpo, parte del ligando marcado se une al anticuerpo en equilibrio, atrapando el ligando en el lado del recipiente en que se encuentra el anticuerpo, en tanto que el ligando unido se distribuye por igual en ambos compartimientos. De este modo, la concentracin total del ligando es mayor en el compartimiento que contiene anticuerpo (fig. 6-2b). La diferencia de concentracin del ligando en los dos compartimientos representa la concentracin de ligando unido al anticuerpo

(es decir, la concentracin del complejo Ag-Ab). Cuanto ms alta la afinidad del anticuerpo, tanto ms ligando se une. Puesto que se conoce la concentracin de anticuerpo en la cmara de dilisis de equilibrio, la concentracin de complejos antgeno-anticuerpo puede determinarse por medio de [AbAg]/n, donde n es el nmero de sitios de unin por molcula de anticuerpo. La constante de equilibrio o constante de afinidad, Ka, para un sitio de unin individual es Kd [Ab-Ag]/[Ab][Ag] r c (n r)

donde r es igual al cociente de la concentracin de ligando unido sobre la concentracin total de anticuerpo, c es la concentracin de ligando libre y n sigue siendo el nmero de sitios de unin por molcula de anticuerpo. Esta expresin puede reordenarse para obtener la ecuacin de Scatchard: r c Kan Kar

Es posible obtener valores para r y c mediante la repeticin de la dilisis de equilibrio con la misma concentracin de anticuerpo pero con diferentes concentraciones de ligando. Si Ka es una constante, es decir, si todos los anticuerpos dentro de la cmara de dilisis tienen la misma afinidad por el ligando, entonces una grfica de Scatchard de r/c contra r da una lnea recta con

148

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

a) Anticuerpo homogneo #1 4.0 #2 3.0 r 108 c 2.0 Pendiente = Ka

b) Anticuerpo heterogneo 4.0 #4 3.0 r 108 c 2.0 Pendiente en r de 1/2 n = K0 #3

1.0

Abscisa al origen = n

1.0

Abscisa al origen = n

2.0 r

1.0 r

2.0

FIGURA 6-3 Las grcas de Scatchard se basan en dilisis de equilibrio repetidas con una concentracin constante de anticuerpo y variable de ligando. En estas grcas r equivale a los moles de ligando unido/mol de anticuerpo y c es la concentracin de ligando libre. A partir de una grca de Scatchard es posible obtener tanto la constante de equilibrio (Ka) como el nmero de sitios de unin por molcula de anticuerpo (n), o su valencia. a) Si todos los anticuerpos tienen la misma anidad, entonces una grca de Scatchard produce una lnea recta con pendiente de Ka. La abscisa al origen es n, la valencia del anticuerpo, que es 2 para la IgG y otras Ig divalentes. Para la IgM, que es pentamrica, n 10, y para la IgA

dimrica, n 4. En esta grca el anticuerpo nmero 1 tiene anidad ms alta que el anticuerpo nmero 2. b) Si el preparado de anticuerpo es policlonal y tiene una gama de anidades, una grca de Scatchard produce una lnea curva cuya pendiente cambia constantemente. La constante de anidad promedio K0 puede calcularse al determinar el valor de Ka cuando la mitad de los sitios de unin est ocupada (cuando r 1 en este ejemplo). En esta grca el antisuero nmero 3 tiene anidad ms alta (K0 2.4 108) que el antisuero nmero 4 (K0 1.25 108). Obsrvese que las curvas que se muestran en a) y b) son para anticuerpos divalentes como IgG.

pendiente Ka (fig. 6-3a). Conforme la concentracin de ligando c no unido aumenta, r/c tiende a 0 y r tiende a n, la valencia, igual al nmero de sitios de unin por molcula de anticuerpo. La mayora de los preparados de anticuerpos son policlonales y presentan una mezcla heterognea de anticuerpos con una gama de afinidades. Una grfica de Scatchard de anticuerpo heterogneo da una lnea curva cuya pendiente cambia de manera constante, lo que refleja esa heterogeneidad de anticuerpo (fig. 6-3b). Este tipo de grfica de Scatchard permite hallar la constante de afinidad promedio, K0, determinando el valor de Ka cuando la mitad de los sitios de unin a antgeno est ocupada. Ello se efecta en forma conveniente al determinar la pendiente de la curva en el punto en que la mitad de los sitios de unin a antgeno est ocupada.

cuantificar la capacidad de unin de un anticuerpo dentro de los sistemas biolgicos (p. ej., la reaccin de un anticuerpo con determinantes antignicos sobre un virus o una clula bacteriana). La avidez es la constante de equilibrio, Keq, para la interaccin entre el anticuerpo intacto y el antgeno; la afinidad es la constante de equilibrio para la reaccin entre un sitio de unin individual del anticuerpo y el antgeno. En condiciones ideales la avidez ser el producto de las afinidades de los sitios de unin individuales de un anticuerpo. Para una molcula de IgG, que tiene dos sitios de unin con afinidades idnticas, en condiciones ideales la avidez sera Avidez Ka Ka (Ka)2 Keq [Ab-Ag] [Ab] [Ag]

La avidez del anticuerpo incorpora la anidad de mltiples sitios de unin

La afinidad de un sitio de unin no siempre refleja la verdadera potencia de la interaccin antgeno-anticuerpo. Cuando se mezclan antgenos complejos que contienen mltiples determinantes antignicos repetidos con anticuerpos que incluyen mltiples sitios de unin, la interaccin de una molcula de anticuerpo con una molcula de antgeno en un sitio incrementa la probabilidad de reaccin entre esas dos molculas en un segundo sitio. La fuerza de estas interacciones mltiples entre un anticuerpo y un antgeno multivalentes se denomina avidez. La avidez es una medida ms adecuada que la afinidad para

Esta ecuacin representa un mximo terico para la avidez; los valores reales de sta siempre son varios rdenes de magnitud menores que el producto de las afinidades. La diferencia se debe principalmente a la geometra de la unin Ab-Ag. El sitio de unin de un anticuerpo en contacto con un eptopo individual de un antgeno puede estar orientado de manera ptima para el mejor ajuste, mientras que la unin a eptopos mltiples en el antgeno blanco puede requerir de una configuracin geomtrica un tanto tensa e interacciones de unin menos ptimas. A pesar de las barreras geomtricas para el logro de los valores tericos mximos de avidez, la avidez es mayor que la afinidad. As, una avidez alta a menudo puede compensar una afinidad baja. Por ejemplo, con frecuencia los sitios de unin de las molculas de IgM (pentamricas) secretadas tienen afinidad

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

149

significativamente ms baja que los de la IgG, monomrica, pero la alta avidez de la IgM, que resulta de su valencia ms alta, le permite unir antgeno de manera eficaz. De hecho, en el caso de un antgeno con muchos eptopos repetitivos estrechamente espaciados, como los que se encuentran en la superficie de bacterias y otros patgenos, una IgM con sitios de unin de menor afinidad puede unirse ms firmemente que una IgM con sitios de mayor afinidad.

Reactividad cruzada
Aunque las reacciones Ag-Ab son muy especficas, en algunos casos el anticuerpo estimulado por un antgeno puede reaccionar en forma cruzada con un antgeno no relacionado. Esta reactividad cruzada ocurre si dos antgenos diferentes comparten un eptopo idntico o muy similar. En el ltimo caso la afinidad del anticuerpo por el eptopo de reaccin cruzada suele ser menor que para el eptopo original. Con frecuencia se observa reactividad cruzada entre antgenos polisacridos que contienen residuos oligosacridos similares. Por ejemplo, los antgenos del grupo sanguneo ABO son glucolpidos que se expresan en los glbulos rojos. Diferencias sutiles en los residuos terminales de los azcares unidos a estos glucolpidos de superficie distinguen los antgenos de los grupos sanguneos A y B. Aunque los mecanismos de tolerancia impiden la formacin de anticuerpos contra los antgenos del propio grupo sanguneo, una persona que carece de uno o ambos de estos antgenos tendr anticuerpos sricos contra el o los antgenos faltantes, inducidos no por la exposicin a antgenos de los glbulos rojos sino por la exposicin a antgenos microbianos de reaccin cruzada presentes en las bacterias intestinales comunes. Estos antgenos microbianos inducen la formacin de anticuerpos en personas que carecen de los antgenos de grupos sanguneos similares en sus glbulos rojos. (En quienes poseen estos antgenos, los anticuerpos complementarios se eliminaran durante la etapa de desarrollo, en la que se desechan las clulas productoras de anticuerpos que reconocen eptopos propios; vase el cap. 16.) Aunque los anticuerpos de grupo sanguneo son inducidos por agentes microbianos, reaccionan en forma cruzada con oligosacridos similares en glbulos rojos extraos, lo que constituye la base para las pruebas de tipificacin sangunea y explica la necesidad de grupos de sangre compatibles para las transfusiones sanguneas. Un individuo del grupo A tiene anticuerpos anti-B, una persona del grupo B tiene anti-A y un individuo grupo O tiene anti-A y anti-B (cuadro 6-2).

Varios virus y bacterias poseen determinantes antignicos idnticos o similares a componentes normales de la clula hospedadora. Est demostrado que en algunos casos estos antgenos microbianos estimulan anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con los componentes de la clula hospedadora y dan por resultado una reaccin autoinmunitaria que daa tejido. Por ejemplo, la bacteria Streptococcus pyogenes expresa protenas de pared celular llamadas antgenos M. Se sabe que los anticuerpos producidos contra antgenos M estreptoccicos reaccionan en forma cruzada con varias protenas miocrdicas y del msculo esqueltico, y participan en el dao cardaco y renal consecutivo a infecciones estreptoccicas. La funcin de otros antgenos de reaccin cruzada en el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias se estudia en el captulo 16. Ciertas vacunas tambin muestran reactividad cruzada. Por ejemplo, el virus de la viruela bovina, que causa la pstula vacuna, expresa eptopos que reaccionan en forma cruzada con el virus variola, el agente causal de la viruela. Como se menciona en el captulo 1, esta reactividad cruzada fue la base del mtodo de Jenner en el que se utiliza virus de la viruela bovina a fin de inducir inmunidad a la viruela.

Resonancia de plasmones superciales

Los mtodos de dilisis de equilibrio para medir la afinidad de anticuerpo han sido superados desde mediados del decenio de 1990 por la resonancia de plasmones superficiales (SPR, del ingls surface plasmon resonance), que es mucho ms sensible, prctica y rpida (fig. 6-4a). Adems de permitir la medicin de constantes de afinidad, la SPR puede usarse para determinar la rapidez de reacciones antgeno-anticuerpo e incluso puede adaptarse para medir concentraciones de anticuerpo. La SPR funciona detectando cambios en las propiedades de reflectancia de la superficie de un detector recubierto de antgeno cuando se une a anticuerpo. Aunque la fsica subyacente a la SPR es bastante compleja [y lo mejor para estudiarla es consultar las referencias adecuadas (Rich y Myszka, 2003) y los sitios Web que se enumeran al final del captulo], el mtodo es directo e ingenioso. Un haz de luz polarizada se hace pasar por un prisma hacia una delgada pelcula de oro (cubierta con antgeno del lado opuesto) y se refleja en la pelcula hacia un detector colector de luz. Sin embargo, a un ngulo nico, parte de la luz incidente es absorbida por la capa de oro, y su energa se transforma en ondas de carga llamadas plasmones superficiales. A ese ngulo, llamado ngulo de resonancia, es posible medir una cada abrupta en la intensidad de la luz reflejada. El ngulo depende del color de la luz, el espesor y la conductancia de la pelcula metlica, y las propiedades pticas del material cerca de las superficies de las capas de oro. El mtodo de SPR aprovecha el ltimo de estos factores: la unin de anticuerpos al antgeno adherido a la pastilla tiene un efecto lo suficientemente intenso para producir un cambio detectable en el ngulo de resonancia. Se ha descubierto que el ngulo es proporcional al nmero de anticuerpos unidos. Midiendo la rapidez con que el ngulo de resonancia cambia durante una reaccin antgeno-anticuerpo, es posible determinar la rapidez de esta reaccin (fig. 6-4b). En la prctica, esto se

CUADRO 6-2
Grupo sanguneo A B AB O

Grupos sanguneos ABO

Antgenos en eritrocitos A B AyB Ninguno Anticuerpos sricos Anti-B Anti-A Ninguno Anti-A y anti-B

150
a)

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

b) ngulo de resonancia, sensible a la unin de anticuerpo Prisma Detector

Etapas II I Se agrega Ab Sin Ab. al flujo. No se Se forman forman complejos complejos Ag-Ab Ag-Ab III La formacin de complejos se estabiliza IV La cmara se lava con solucin amortiguadora. Los complejos Ag-Ab se disocian

Fuente de luz polarizada

Unidades de resonancia

Capa de oro

Asociacin Ag Ab Ag-Ab

Disociacin Ag-Ab Ag Ab

Cmara de flujo

Antgeno inmovilizado

Tiempo

FIGURA 6-4 Resonancia de plasmones superciales (SPR). a) Una solucin amortiguadora que contiene anticuerpo se hace pasar por una cmara de ujo, una de cuyas paredes contiene una capa de antgeno inmovilizado. Como se explica en el texto, la formacin de complejos antgeno-anticuerpo en esta capa causa un cambio en el ngulo de resonancia de un haz de luz polarizada contra la cara posterior de la capa. Un detector sensible registra los cambios en el ngulo de resonancia a medida que se forman complejos antgeno-anticuerpo. b) Interpretacin de un sensograma. Existen cuatro etapas en la grca de la respuesta del detector (expresada en unidades de resonancia, que representan un cambio de 0.0001 grado en el ngulo de resonancia) contra tiempo. Etapa I: se hace pasar el
realiza haciendo pasar una solucin con una concentracin conocida de anticuerpo sobre la pastilla cubierta de antgeno. La grfica de los cambios medidos durante el experimento de SPR contra el tiempo se denomina sensograma. En el curso de una reaccin antgeno-anticuerpo, el sensograma asciende hasta que todos los sitios capaces de unirse a antgeno (a una concentracin dada) lo han hecho. Ms all de ese punto el sensograma describe una meseta. Los datos de estas mediciones pueden usarse para calcular k1, la constante de velocidad de asociacin para la reaccin Ab Ag Ab-Ag k1

amortiguador a travs de la cmara de ujo. No hay presentes complejos Ag-Ab, lo cual permite establecer un nivel de referencia. Etapa II: se introduce anticuerpo en el ujo y se forman complejos Ag-Ab. La pendiente positiva de esta curva es proporcional a la rapidez de reaccin hacia la derecha. Etapa III: la curva forma una meseta cuando todos los sitios capaces de unirse a la concentracin prevaleciente de anticuerpo estn ocupados. La altura de la meseta es directamente proporcional a la concentracin de anticuerpo. Etapa IV: la celda de ujo se lava con amortiguador que no contiene anticuerpo, y los complejos Ag-Ab se disocian. La rapidez de disociacin es proporcional a la pendiente de la curva de disociacin. El cociente de las pendientes (ascendente sobre descendente) es igual a k1/k2 = ka.

La SPR puede usarse para caracterizar las especicidades de eptopo de grupos de anticuerpos
La SPR tiene otros usos adems de medir la afinidad o concentracin de anticuerpos. Supngase que se tienen dos anticuerpos monoclonales distintos contra un antgeno como gp120, la protena de cubierta del VIH. Se unen estos anticuerpos al mismo eptopo o a eptopos diferentes de esta protena clave? La resonancia de plasmones superficiales constituye un poderoso mtodo para responder dicha pregunta. Los anticuerpos que se unen a diferentes eptopos sobre un antgeno producen un sensograma caracterstico cuando se colocan de manera seriada en la cmara (fig. 6-5a). Los anticuerpos que se unen al mismo eptopo compiten entre s por los sitios de unin, y cada uno bloquea la unin del otro, como lo demuestran las grficas de la figura 6-5b. En una variacin de este procedimiento, es posible usar sntesis qumica o hidrlisis enzimtica juiciosa para generar un conjunto de fragmentos de un antgeno y luego inmovilizar cada uno de estos fragmentos en una pastilla. Suponiendo que los fragmentos de antgeno tienen la misma conformacin tridimensional que el antgeno nativo, pueden determinarse las reactividades (o la falta de ellas) de anticuerpos y aislar los sitios de los eptopos en la molcula de antgeno original, un procedimiento llamado mapeo de eptopos.

Una vez que se ha alcanzado la meseta, puede hacerse pasar por la cmara solucin sin anticuerpo. En estas condiciones los complejos antgeno-anticuerpo se disocian, lo que permite el clculo de la constante de velocidad de disociacin, k2. La medicin de k1 y k2 hace posible determinar la constante de afinidad Ka, ya que Ka k1/k2. La resonancia de plasmones superficiales tambin puede usarse para medir la concentracin de anticuerpo en una muestra. La cantidad de complejo antgeno-anticuerpo que se forma sobre la pastilla es representada por la altura del sensograma, y esta medida es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo en la solucin que fluye por la cmara. Comparando con datos de referencia es posible determinar las concentraciones de anticuerpo.

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

151

a) Ab1 y Ab2 se unen a diferentes eptopos del mismo antgeno Unidades de resonancia Se agrega Ab1 Se agrega Ab2

Ab1 Ab2

Eptopos

Tiempo b) Ab1 y Ab2 se unen al mismo eptopo Unidades de resonancia Se agrega Ab1 Se agrega Ab2 Se agrega Ab2 Se agrega Ab1

Ab1

Ab2

Eptopos

Tiempo

Tiempo

FIGURA 6-5 La SPR puede usarse para determinar si diferentes anticuerpos se unen al mismo eptopo o a eptopos diferentes. a) Ab1 y Ab2 reconocen diferentes eptopos del antgeno. La inyeccin inicial de Ab1 causa un aumento desde el nivel basal hasta una meseta; la adicin ulterior de Ab2 causa un aumento hasta una segunda meseta ms alta. Esto indica que Ab1 y Ab2 reaccionan con diferentes eptopos en el antgeno, por ejemplo dos regiones espacialmente distintas de una protena. b) Ab1 y Ab2

reconocen el mismo eptopo del antgeno. En el primer sensograma, la adicin de Ab1 revela una respuesta, y la inyeccin ulterior de Ab2 no genera respuesta ulterior. En el segundo sensograma, la adicin de Ab2 revela primero una respuesta, pero la adicin ulterior de Ab1 no induce una respuesta ulterior. Este patrn indica que Ab1 y Ab2 se unen de manera competitiva, ya que ambos reconocen el mismo eptopo en el antgeno; la unin de uno bloquea la unin subsecuente del otro.

Reacciones de precipitacin
El anticuerpo y el antgeno soluble que interactan en una solucin acuosa forman un retculo que por ltimo se convierte en un precipitado visible. Los anticuerpos que aglomeran antgenos solubles se denominan precipitinas. Aunque la formacin del complejo soluble Ag-Ab ocurre en el transcurso de minutos, la del precipitado visible se lleva a cabo con mayor lentitud y a menudo requiere uno o dos das para completarse. La formacin de un retculo de Ag-Ab depende de la valencia tanto del anticuerpo como del antgeno:

las reacciones antgeno-anticuerpo que producen un precipitado. En el cuadro 6-3 se compara la sensibilidad o cantidad mnima de anticuerpo detectable por varios inmunoensayos.

Las reacciones de precipitacin en gel producen lneas de precipitina visibles

Los precipitados inmunitarios no slo pueden formarse en solucin sino tambin en una matriz de agar. Cuando el antgeno y el anticuerpo se difunden uno hacia el otro en agar, o cuando el anticuerpo se incorpora dentro del agar y el antgeno se difunde hacia la matriz que contiene anticuerpo, se forma una lnea visible de precipitacin. Como en la reaccin de precipitacin en lquido, ocurre una precipitacin visible en la regin de equivalencia, en tanto que no se observa precipitado visible en las regiones de exceso de anticuerpo o antgeno. Es posible utilizar dos tipos de reacciones de inmunodifusin para determinar las concentraciones relativas de anticuerpos o antgenos, comparar antgenos o determinar la pureza relativa de una preparacin de antgeno. stos son la inmunodifusin radial (mtodo de Mancini) y la inmunodifusin doble (mtodo de Ouchterlony); ambos se efectan en un medio semislido como el agar. En la inmunodifusin radial se coloca una muestra de antgeno en un foso y se deja difundir en agar que contiene una dilucin conveniente de un antisuero. Conforme el antgeno se difunde dentro

El anticuerpo debe ser bivalente; no se forma un precipitado con fragmentos Fab monovalentes. El antgeno debe ser bivalente o polivalente; es decir, debe tener cuando menos dos copias del mismo eptopo o presentar diferentes eptopos que reaccionan con distintos anticuerpos presentes en antisuero policlonal.

Aunque en alguna poca los principales tipos de valoracin empleados en inmunologa fueron diversas modificaciones de la reaccin de precipitacin, se sustituyeron en gran parte por mtodos ms rpidos y que slo requieren cantidades muy pequeas de antgeno o anticuerpo porque son mucho ms sensibles. Adems, estos mtodos modernos de valoracin no se limitan a

152

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

INMUNODIFUSIN RADIAL Difusin de antgeno

CUADRO 6-3

Sensibilidad de diversos inmunoensayos

Sensibilidad (g de anticuerpo/ml) 20200 1050 20200 2 0.3 0.0060.06 0.0060.06 0.00060.006 ~0.00010.01 ~0.000010.01 1.0 0.0060.06
*

Prueba Reaccin de precipitacin en lquidos Reacciones de precipitacin en gel Inmunodifusin radial de Mancini Inmunoelectroforesis Electroforesis en cohete Reacciones de aglutinacin Directa Aglutinacin pasiva Inhibicin de la aglutinacin Radioinmunoensayo Ensayo de inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) ELISA con quimioluminiscencia Inmunouorescencia Citometra de ujo

Anticuerpo incorporado en agar

Antgeno

Doble inmunodifusin de Ouchterlony 20200

El precipitado forma un anillo

INMUNODIFUSIN DOBLE Anticuerpo Antgeno

* La sensibilidad depende tanto de la anidad del anticuerpo usado para el ensayo como de la densidad de eptopos y la distribucin del antgeno.

Matriz de agar

Precipitado

Obsrvese que la sensibilidad de las pruebas ELISA basadas en quimioluminiscencia puede equipararse a la de RIA. FUENTE: Adaptado de N. R. Rose et al., eds., 1997, Manual of Clinical Laboratory Immunology; 5th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

FIGURA 6-6 Diagramas de la inmunodifusin radial (mtodo de Mancini) y la inmunodifusin doble (mtodo de Ouchterlony) en un gel. En ambos casos se forman complejos insolubles grandes en el agar en la zona de equivalencia, visibles como lneas de precipitacin (regiones prpura). En la inmunodifusin radial slo el antgeno (rojo) se difunde, en tanto que en la inmunodifusin doble se difunden tanto el anticuerpo (azul) como el antgeno (rojo).
en laboratorios clnicos para detectar la presencia o ausencia de protenas en el suero. Una muestra de suero se somete a electroforesis y los componentes sricos individuales se identifican con antisueros especficos para una protena o una clase de inmunoglobulina determinada. Esta tcnica es til para determinar si un paciente produce cantidades anormalmente bajas de uno o ms isotipos, caractersticas de ciertas enfermedades de inmunodeficiencia. Asimismo puede mostrarse si un paciente produce en exceso cierta protena srica, como albmina, inmunoglobulina o transferrina. El patrn inmunoelectrofortico del suero de individuos con mieloma mltiple muestra una gran cantidad de protena de mieloma. Como la inmunoelectroforesis es una tcnica estrictamente cualitativa que slo detecta concentraciones de anticuerpo hasta cierto punto altas (mayores de varios cientos de microgramos por mililitro), su utilidad se limita a la deteccin de anormalidades cuantitativas slo cuando la desviacin respecto de lo normal es notable, como en los estados de inmunodeficiencia o los trastornos inmunoproliferativos. Una tcnica cuantitativa relacionada, la electroforesis en cohete, permite medir las concentraciones de antgeno. En este mtodo se somete a electroforesis un antgeno con carga negativa en un gel que contiene anticuerpo. El precipitado que se forma entre el antgeno y el anticuerpo tiene el aspecto de un

del agar, la regin de equivalencia se establece y alrededor del foso se forma un anillo de precipitacin, un anillo de precipitina (fig. 6-6, parte superior). El rea del anillo de precipitina es proporcional a la concentracin de antgeno. La comparacin del rea del anillo de precipitina con una curva estndar (que se obtiene al medir las reas de precipitina de concentraciones conocidas del antgeno) permite determinar la concentracin en la muestra de antgeno. En el mtodo de Ouchterlony tanto el antgeno como el anticuerpo se difunden radialmente desde los fosos uno hacia el otro y por tanto se establece un gradiente de concentracin. Conforme la equivalencia se alcanza, se produce una lnea visible de precipitacin, una lnea de precipitina (fig. 6-6, parte inferior).

La inmunoelectroforesis combina electroforesis e inmunodifusin doble

En la inmunoelectroforesis, la mezcla de antgeno se somete primero a electroforesis a fin de separar sus componentes por carga. A continuacin se cortan cuencos en el gel de agar paralelos a la direccin del campo elctrico y se les aade antisuero. Luego el anticuerpo y el antgeno se difunden uno hacia el otro y producen lneas de precipitacin donde se encuentran en proporciones apropiadas (fig. 6-7). La inmunoelectroforesis se usa

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

153

Antgenos

Anticuerpo

FIGURA 6-7 Inmunoelectroforesis de una mezcla de antgeno. Un preparado de antgeno (anaranjado) se somete primero a electroforesis, que separa los antgenos componentes con base en la carga. Luego se aade antisuero (azul) a cuencos en uno o ambos lados de los antgenos separados y se permite que se difundan; con el tiempo se forman lneas de precipitacin (arcos de color) en los que interactan anticuerpo y antgeno especcos.

de anticuerpo inhibe las reacciones de precipitacin, este exceso tambin puede inhibir las reacciones de aglutinacin; tal inhibicin se denomina efecto prozona. Ya que los efectos prozona pueden encontrarse en muchos tipos de inmunoensayos, comprender la base de este fenmeno tiene importancia general. Diversos mecanismos pueden causar el efecto prozona. Primero, a concentraciones altas de anticuerpo, el nmero de sitios de unin de anticuerpo puede exceder en grado considerable el de eptopos. Como resultado, casi todos los anticuerpos se unen a antgeno slo de manera univalente en lugar de multivalente. Los anticuerpos que se unen de manera univalente no pueden enlazar en forma cruzada un antgeno con otro. Los efectos prozona se diagnostican con facilidad al valorar una diversidad de concentraciones de anticuerpo (o antgeno). Conforme se diluye a una concentracin ptima de anticuerpo, se observan valores ms altos de aglutinacin o cualquier parmetro que se mida en la valoracin que se utilice. El efecto prozona tambin puede ocurrir por otra razn cuando se emplean anticuerpos policlonales. Es posible que el antisuero contenga concentraciones altas de anticuerpo que se unen a antgeno pero no inducen aglutinacin; estos anticuerpos, llamados anticuerpos incompletos, a menudo son de la clase IgG. A concentraciones altas de IgG, las anticuerpos incompletos pueden ocupar la mayor parte de los sitios antignicos y bloquear as el acceso de la IgM, que es una buena aglutinina. Este efecto no se presenta con anticuerpos monoclonales aglutinantes. La falta de actividad aglutinante de un anticuerpo incompleto puede deberse a flexibilidad restringida en la regin en bisagra, que dificulta que el anticuerpo asuma el ngulo necesario para el enlace cruzado ptimo de eptopos y dos o ms antgenos particulados. De otra manera la densidad de la distribucin del eptopo o la localizacin de algunos eptopos en bolsas profundas de un antgeno particular pueden dificultar que los anticuerpos especficos para estos eptopos aglutinen ciertos antgenos particulados. Cuando es factible, la solucin a ambos problemas consiste en probar anticuerpos diferentes que pueden reaccionar con otros eptopos del antgeno que no presentan estas limitaciones.

La hemaglutinacin se utiliza en la tipicacin sangunea

Para tipificar los glbulos rojos (GR) o eritrocitos suelen llevarse a cabo reacciones de aglutinacin (fig. 6-8). Dado que cada ao se realizan decenas de millones de determinaciones de grupo

cohete, cuya altura es proporcional a la concentracin de antgeno en el foso. Una limitacin de la electroforesis en cohete es la necesidad de que el antgeno tenga carga negativa para el movimiento electrofortico dentro de la matriz de agar. Algunas protenas, por ejemplo las inmunoglobulinas, no poseen la suficiente carga para analizarse de manera cuantitativa por electroforesis en cohete; tampoco es posible medir las cantidades de varios antgenos en una mezcla al mismo tiempo.

Reacciones de aglutinacin
La interaccin entre el anticuerpo y un antgeno particulado resulta en un agrupamiento visible llamado aglutinacin. Los anticuerpos que producen estas reacciones se denominan aglutininas. Las reacciones de aglutinacin son similares en principio a las reacciones de precipitacin; dependen del enlace cruzado de antgenos polivalentes. Del mismo modo en que un exceso

FIGURA 6-8 Demostracin de hemaglutinacin utilizando anticuerpos contra glbulos rojos de oveja (SRBC). El tubo testigo (10) slo contiene SRBC, que se asientan en un botn slido. Los tubos experimentales 1 a 9 contienen un nmero constante de SRBC ms diluciones seriadas al doble de suero anti-SRBC. El patrn de diseminacin en la serie experimental indica hemaglutinacin positiva en el tubo 3. [Lousiana State University Medical Center/MIP. Cortesa de Harriet C. W. Thompson.]

154

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

sanguneo, ste es uno de los inmunoensayos ms usados en el mundo. En la tipificacin de antgenos ABO, en un portaobjetos se mezclan glbulos rojos con antisuero contra los antgenos de grupo sanguneo A o B. Si el antgeno se encuentra en las clulas, stas se aglutinan y forman un grumo visible en el portaobjetos. Como verificacin adicional, la sangre del donante se examina en busca de anticuerpos contra antgenos ABO. Si el sujeto no presenta anticuerpo contra sus propios antgenos ABO, las determinaciones de clulas y anticuerpo concuerdan, y se confirma que la tipificacin celular es correcta. Si los resultados son discordantes y los ensayos de aglutinacin indican que el donante tiene anticuerpos que reaccionan contra sus propios antgenos ABO, entonces hubo un error (es incorrecto el ensayo para clulas o anticuerpo) o el donante est produciendo anticuerpos contra s mismo, una manifestacin de autoinmunidad (vase el cap. 16). Las muestras que producen resultados discordantes en la verificacin no se usan para transfusiones.

del patrn de diseminacin caracterstico de los glbulos rojos aglutinados en el fondo del foso, igual que el patrn que se observa en las reacciones de aglutinacin (fig. 6-8). En aos recientes ha habido un cambio de glbulos rojos a partculas sintticas, como cuentas de ltex, como matrices para reacciones de aglutinacin. Una vez que el antgeno se acopla a las cuentas de ltex, el preparado puede utilizarse de inmediato o guardarse para uso posterior. El empleo de cuentas sintticas ofrece las ventajas de consistencia, uniformidad y estabilidad. Ms an, las reacciones de aglutinacin en que se usan cuentas sintticas pueden leerse con rapidez, a menudo en el transcurso de los 3 a 5 min que siguen al mezclado de las cuentas con la muestra en estudio. Ya sea que se basen en glbulos rojos o en las cuentas sintticas, ms convenientes y verstiles, las reacciones de aglutinacin son sencillas de realizar, no requieren equipo costoso y detectan cantidades pequeas de anticuerpo (concentraciones tan bajas como nanogramos por mililitro).

La aglutinacin bacteriana se emplea para diagnosticar infecciones

Una infeccin bacteriana suele estimular la produccin de anticuerpos sricos especficos para antgenos de superficie en las clulas bacterianas. La presencia de dichos anticuerpos puede detectarse mediante reacciones de aglutinacin bacteriana. El suero de un paciente que se piensa que est infectado con una bacteria determinada se diluye en forma seriada en un conjunto de tubos a los que se aade la bacteria. El ltimo tubo que muestra aglutinacin visible refleja el ttulo de anticuerpo srico del paciente. El ttulo de aglutinina se define como el recproco de la dilucin srica mayor que causa una reaccin de aglutinacin positiva. Por ejemplo, si se realizan diluciones seriadas dobles de suero y la dilucin 1/640 muestra aglutinacin pero la 1/1 280 no, entonces el ttulo de aglutinacin del suero del paciente es 640. En algunos casos el suero puede diluirse hasta 1/50 000 y an mostrar aglutinacin de bacterias. El ttulo de aglutinina de un antisuero puede usarse para diagnosticar una infeccin bacteriana. Por ejemplo, los pacientes con fiebre tifoidea muestran un aumento significativo en el ttulo de aglutinacin para Salmonella typhi. Las reacciones de aglutinacin tambin constituyen un medio para tipificar bacterias. Por ejemplo, es posible distinguir diferentes especies de la bacteria Salmonella mediante reacciones de aglutinacin con un grupo de antisueros de tipificacin.

En la inhibicin de la aglutinacin, la ausencia de aglutinacin es diagnstica de antgeno

Una variante de la reaccin de aglutinacin, llamada inhibicin de la aglutinacin, constituye un ensayo muy sensible para cantidades pequeas de antgeno. Las pruebas de inhibicin de la aglutinacin tambin permiten determinar si una persona utiliza ciertos tipos de drogas ilegales, como cocana y herona. Primero se incuba una muestra de orina o de sangre con anticuerpo especfico para la droga que se sospecha. A continuacin se aaden partculas recubiertas con la droga. Si el anticuerpo no aglutina las partculas ello indica que la muestra contiene un antgeno que reconoci el anticuerpo y sugiere que el individuo utiliza la droga ilcita. Un problema con estas pruebas es que algunas drogas legales tienen estructuras qumicas similares a las de las ilcitas, pueden reaccionar de forma cruzada con el anticuerpo y producir una reaccin positiva falsa. Por este motivo es necesario confirmar una reaccin positiva con un mtodo no inmunitario. Las pruebas de inhibicin de la aglutinacin se usan con amplitud en los laboratorios clnicos para determinar si una persona se expuso a ciertos tipos de virus que causan aglutinacin de glbulos rojos. Si el suero de una persona contiene anticuerpos antivricos especficos, entonces los anticuerpos se unen al virus e interfieren con la hemaglutinacin por el virus. Esta tcnica suele emplearse en pruebas premaritales para determinar el estado inmunitario de las mujeres con respecto al virus de la rubola. El recproco de la ltima dilucin srica que muestra inhibicin de hemaglutinacin de rubola es el ttulo del suero. Un ttulo mayor de 10 (dilucin 1:10) indica que una mujer es inmune a la rubola, en tanto que un ttulo menor de 10 refleja falta de inmunidad y la necesidad de inmunizacin con vacuna de rubola.

La aglutinacin pasiva es til con antgenos solubles

La sensibilidad y la sencillez de las reacciones de aglutinacin pueden extenderse a antgenos solubles con la tcnica de hemaglutinacin pasiva. En este mtodo se preparan glbulos rojos cubiertos con antgeno mediante la mezcla de un antgeno soluble con los eritrocitos que se trataron con cido tnico o cloruro de cromo, porque ambas sustancias promueven la adsorcin del antgeno a la superficie de las clulas. El suero que contiene anticuerpo se diluye de manera seriada en fosos de una placa de microttulos y luego se aaden glbulos rojos recubiertos con antgeno a cada foso; la aglutinacin se valora por el tamao

Radioinmunoensayo
Una de las tcnicas ms sensibles para detectar antgeno o anticuerpo es el radioinmunoensayo (RIA). Fue desarrollada

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

155

originalmente en 1960 por dos endocrinlogos, S. A. Berson y Rosalyn Yalow, para determinar las concentraciones de complejos de insulina y antiinsulina en diabticos. Aunque su tcnica fue recibida con algn escepticismo, pronto demostr su valor para medir hormonas, protenas sricas, frmacos y vitaminas a concentraciones de 0.001 microgramos por mililitro o menos. La importancia de la tcnica se reconoci en 1977, unos aos despus de morir Berson, por la adjudicacin de un premio Nobel a Yalow. El principio del RIA implica la unin competitiva de antgeno radiomarcado y antgeno no marcado a un anticuerpo de alta afinidad. El antgeno marcado se mezcla con anticuerpo a una concentracin que satura los sitios de unin a antgeno del anticuerpo. En seguida se aaden en cantidades crecientes las muestras de antgeno no marcado de concentracin desconocida. El anticuerpo no distingue el antgeno marcado del no marcado, por lo que los dos tipos de antgeno compiten por los sitios de unin disponibles en el anticuerpo. Conforme la concentracin de antgeno no marcado aumenta, ms antgeno con la marca radiactiva es desplazado de los sitios de unin. El decremento de la cantidad de antgeno radiomarcado que se une al anticuerpo especfico en presencia de la muestra en estudio se mide para determinar la cantidad de antgeno que esta ltima contiene. Por lo general el antgeno se marca con un istopo emisor de partculas como 125I, pero tambin suelen emplearse como marcas istopos de emisin como el tritio (3H). El antgeno radiomarcado es parte de la mezcla de valoracin; la muestra de estudio puede ser alguna compleja, como suero u otros lquidos corporales, que contiene el antgeno no marcado. La primera etapa para llevar a cabo un RIA es determinar la cantidad de anticuerpo necesario para unir 50 a 70% de la cantidad fija de antgeno radiactivo (Ag*) en la mezcla por valorar. Esta relacin de anticuerpo con Ag* se eligi para asegurar que la cantidad de eptopos que el antgeno marcado presenta siempre exceda el nmero total de sitios de unin de anticuerpo. En consecuencia, el antgeno no marcado que se agrega a la mezcla de estudio compite con el antgeno radiomarcado por el suministro limitado de anticuerpo. Incluso una cantidad pequea de antgeno sin marca aadido a la mezcla de antgeno marcado y anticuerpo en estudio origina un descenso en la cantidad de antgeno radiactivo unido, y esta disminucin es proporcional a la cuanta del antgeno no marcado aadido. Con objeto de determinar la cantidad de antgeno marcado unida, el complejo Ag-Ab se precipita para separarlo del antgeno libre (antgeno no unido a anticuerpo) y se mide la radiactividad en el precipitado. Puede generarse una curva estndar utilizando muestras de antgeno no marcado de concentracin conocida (en lugar de la muestra de estudio), y a partir de esta grfica es posible determinar con precisin la cantidad de antgeno en la mezcla de estudio. Se han desarrollado varios mtodos para separar antgeno unido de antgeno libre en RIA. Uno de ellos incluye la precipitacin del complejo Ag-Ab con un antisuero antiisotipo secundario. Por ejemplo, si el complejo Ag-Ab contiene anticuerpo IgG de conejo, entonces la IgG anticonejo de cabra se une a la IgG de conejo y precipita el complejo. En otro mtodo se utiliza el hecho de que la protena A de Staphylococcus aureus tiene

alta afinidad por la inmunoglobulina G (IgG). Si el complejo Ag-Ab contiene un anticuerpo IgG, el complejo puede precipitarse mezclndolo con S. aureus muerto con formalina. Tras eliminar el complejo por cualesquiera de estos mtodos es posible medir la cantidad de antgeno marcado libre que queda en el sobrenadante con un contador de radiacin; la sustraccin de este valor de la cantidad total de antgeno marcado aadido proporciona la cantidad de antgeno marcado unido. Se han creado diversos RIA de fase slida que hacen ms fcil separar el complejo Ag-Ab del antgeno no unido. En algunos casos el anticuerpo se une por enlaces cruzados covalentes a cuentas de Sepharose. La cantidad de antgeno radiomarcado unido a las cuentas puede medirse despus de centrifugar y lavar estas ltimas. De modo alternativo el anticuerpo se inmoviliza en fosos de poliestireno o policloruro de vinilo y la cantidad de antgeno marcado libre en el sobrenadante se determina en un contador de radiacin. En otro mtodo se inmoviliza el anticuerpo en las paredes de los fosos de microttulo y se determina la cantidad de antgeno unido. Ya que el procedimiento slo requiere cantidades pequeas de la muestra y puede realizarse en placas de microttulo pequeas de 96 fosos (un poco ms grandes que una tarjeta de 3 5), este procedimiento resulta muy adecuado para determinar la concentracin de un antgeno particular en un gran nmero de muestras. Por ejemplo, el RIA de microttulo se utiliza con amplitud para detectar la presencia de virus de hepatitis B (fig. 6-9). El RIA de la sangre del donante reduce mucho la incidencia de infecciones por hepatitis B en receptores de transfusiones sanguneas.

Ensayo de inmunosorbente ligado a enzima

El ensayo de inmunosorbente ligado a enzima, que suele conocerse como ELISA (o EIA), es similar en principio al RIA pero depende de una enzima en lugar de un marcador radiactivo. Una enzima conjugada con un anticuerpo reacciona con un sustrato incoloro para generar un producto con reaccin de color. Ese sustrato se denomina sustrato cromgeno. Para ELISA se utilizan varias enzimas, como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rbano picante y -galactosidasa. Estas pruebas tienen sensibilidad comparable a los RIA y la ventaja de ser ms seguras y menos costosas.

Existen mltiples variantes de ELISA

Se cuenta con algunas variaciones de ELISA que permiten la deteccin cualitativa o la medicin cuantitativa de antgeno o anticuerpo. Cada tipo de ELISA puede usarse de manera cualitativa para detectar la presencia de anticuerpo o antgeno. De manera alternativa, se realiza una curva estndar con base en concentraciones conocidas de anticuerpo o antgeno, a partir de la cual es posible determinar la concentracin desconocida de una muestra.

156
a)

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

b) Suero infectado [125I]HBsAg [125I]HBsAg Suero no infectado 70

HBsAg no marcado Anti-HBsAg

125I

60 [125I]HBsAg unido a anti-HbsAg, %

50 Parte aproximadamente lineal de la curva

unido

125I

unido

FIGURA 6-9 Radioinmunoensayo (RIA) de fase slida para

detectar virus de hepatitis B en muestras de sangre. a) Fosos de microttulo se cubren con una cantidad constante de anticuerpo especco para HbsAg, el antgeno de supercie en viriones de hepatitis B. A continuacin se aaden una muestra de suero y [125I]HBsAg. Tras la incubacin, el sobrenadante se extrae y la radiactividad de los complejos antgeno-anticuerpo se mide. Si la muestra est infectada, la cantidad del marcador unido es menor que en los testigos con suero no infectado. b) Se obtiene una curva estndar aadiendo concentraciones crecientes de HbsAg no marcado a una cantidad ja de [125I]HBsAg y anticuerpo especco. La grca de porcentaje de antgeno marcado unido contra concentracin de antgeno no marcado permite determinar la concentracin de HBsAg en muestras de suero desconocidas mediante el uso de la parte lineal de la curva.

40

30

20

10

1 2 3 4 5 Concentracin de HBsAg no marcado, ng/ml

ELISA indirecto
Por medio de ELISA indirecto puede detectarse anticuerpo o determinarse de modo cuantitativo (fig. 6-10a). Suero o alguna otra muestra que contenga el anticuerpo primario (Ab1) se aade a un foso de microttulo recubierto con antgeno y se permite que reaccione con el antgeno unido al foso. Despus de eliminar por lavado cualquier Ab1 libre, la presencia de anticuerpo unido a antgeno se detecta mediante la adicin de un anticuerpo secundario (Ab2) conjugado con enzima, que se une al anticuerpo primario. A continuacin se elimina por lavado cualquier Ab2 libre y se aade un sustrato para la enzima. La cantidad de producto de la reaccin de color que se forma se mide con lectores espectrofotomtricos de placa especializados, que pueden medir la absorbancia de la totalidad de los fosos de una placa de 96 fosos en segundos. El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causal del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). En esta prueba, protenas recombinantes de la envoltura y del ncleo del VIH se adsorben como antgenos en fase slida a fosos de microttulo. Las personas infectadas con VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas vricas. Por lo general, el ELISA indirecto permite detectar anticuerpos sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin.

ticuerpo inmovilizado. Despus de lavar el foso, se agrega un segundo anticuerpo ligado a enzima especfico para un eptopo distinto del antgeno y se permite que reaccione con el antgeno unido. Tras eliminar cualquier segundo anticuerpo libre mediante lavado, se aade sustrato y se mide el producto de la reaccin de color.

ELISA competitivo
El mtodo de ELISA competitivo es otra variante para medir cantidades de antgeno (fig. 6-10c). En esta tcnica se incuba primero anticuerpo en solucin con una muestra que contiene antgeno. Despus la mezcla de antgeno y anticuerpo se aade a un foso de microttulo recubierto con antgeno. Cuanto ms antgeno se encuentra en la muestra, tanto menos anticuerpo libre est disponible para unirse al foso recubierto con antgeno. La adicin de un anticuerpo secundario (Ab2) conjugado con la enzima especfico para el isotipo de un anticuerpo primario puede utilizarse para determinar la cantidad de anticuerpo primario unido al foso como en un ELISA indirecto. Sin embargo, en la prueba competitiva cuanto ms alta es la concentracin de antgeno en la muestra original tanto ms baja es la absorcin.

Quimioluminiscencia
La luz que se produce por quimioluminiscencia durante determinadas reacciones qumicas constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en ELISA. Las versiones de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia usan un sustrato luxgeno (que genera luz) en lugar del sustrato cromgeno de las reacciones ELISA ordinarias. Por ejemplo, la oxidacin del compuesto luminol por H2O2 y la enzima peroxidasa de rbano picante (HRP) produce luz:

ELISA en sndwich
Es posible detectar o medir antgeno mediante ELISA en sndwich (fig. 6-10b). En esta tcnica, el anticuerpo (en lugar del antgeno) se inmoviliza en un foso de microttulo. Se aade una muestra que contiene antgeno y se deja reaccionar con el an-

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

157

a) ELISA indirecto

lavado

lavado

lavado

Foso recubierto con antgeno

Aadir anticuerpo especfico por medir

Aadir anticuerpo secundario conjugado a enzima

Aadir sustrato (S) y medir el color

b) ELISA en sndwich

E lavado lavado

E lavado

E S

Foso recubierto con antgeno

Aadir antgeno por medir

Aadir anticuerpo secundario conjugado a enzima

Aadir sustrato y medir el color

c) ELISA competitiva

S S

lavado Incubar anticuerpo con antgeno por medir

lavado

Aadir mezcla de Ag-Ab al foso cubierto con antgeno

Aadir anticuerpo secundario conjugado a enzima

Aadir sustrato y medir el color

FIGURA 6-10 Las variaciones en la tcnica del ensayo de inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) permiten determinar anticuerpo o antgeno. Cada prueba puede utilizarse de manera cualitativa o cuantitativa mediante la comparacin con curvas estndar elaboradas con concentraciones conocidas de anticuerpo o

antgeno. El anticuerpo puede determinarse con ELISA indirecto (a), en tanto que el antgeno puede determinarse por ELISA en sndwich (b) o ELISA competitivo (c). En este ltimo, que es un ensayo tipo inhibicin, la concentracin de antgeno es inversamente proporcional al color que se produce.

Ab-HRP

2 2 Ag Ab-HRP-Ag luz

luminol

HO

La luz que se genera durante las reacciones luxgenas puede detectarse en virtud de su capacidad de exponer pelcula fotogrfica. La medicin cuantitativa de la emisin de luz puede hacerse por medio de un luminmetro. La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las cromgenas es la mejora de la sensibilidad. En general el lmite de deteccin puede incrementarse cuando menos 10 veces si se cambia de un sustrato cromgeno a uno luxgeno, y ms de 200 veces cuando se adicionan agentes de realce. De hecho, en condiciones ideales se detectan apenas 5 10 18 moles (5 attomoles) de antgeno blanco.

Prueba ELISPOT
Una modificacin de la prueba ELISA llamada ELISPOT permite la deteccin cuantitativa del nmero de clulas en una poblacin que produce anticuerpos especficos contra un antgeno

determinado o un antgeno contra el que se dispone de un anticuerpo especfico (fig. 6-11). En este mtodo las placas se recubren con el antgeno (antgeno de captura) reconocido por el anticuerpo de inters o con el anticuerpo (anticuerpo de captura) especfico para el antgeno cuya produccin se valora. Luego se aade a las placas recubiertas una suspensin de la poblacin celular que se investiga y se incuba. Las clulas se asientan en la superficie de la placa, y las molculas secretadas reactivas a las molculas de captura son unidas en la cercana de las clulas secretorias, lo que produce un anillo de complejos antgeno-anticuerpo alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters. A continuacin la placa se lava y un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno secretado o para la especie (p. ej., anticonejo de cabra) del anticuerpo secretado se aade y deja unir. El revelado ulterior del ensayo por la adicin de un sustrato cromgeno o luxgeno adecuado indica la posicin de cada clula productora de anticuerpo o de antgeno como un punto de color o luz.

158

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

Foso recubierto con anticuerpos anticitocina

Western blotting
Es posible la identificacin de una protena especfica en una mezcla compleja de protenas mediante una tcnica conocida como Western blotting, as denominada por su similitud con Southern blotting, que detecta fragmentos de DNA, y con Northern blotting, que detecta mRNA. En la Western blotting, una mezcla de protenas se separa por medios electroforticos en un gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), un gel en placa con infusin de dodecilsulfato sdico (SDS), un agente de disociacin (fig. 6-12). Las bandas de protenas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis, y las bandas individuales de protena se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o monoclonal radiomarcado o unido a enzimas especfico para la protena de inters. Los complejos Ag-Ab que se forman en la banda que contiene la protena reconocida por el anticuerpo pueden visualizarse de diversos modos. Si un anticuerpo radiactivo se uni a la protena de inters, es posible determinar su posicin en la mancha (blot) exponiendo una placa de rayos X a la membrana, un procedimiento que se conoce como autorradiografa. Sin embargo, en los procedimientos de deteccin que ms se usan suelen emplearse anticuerpos unidos a enzima contra la protena. Tras la unin del conjugado de enzima y anticuerpo, la adicin de un sustrato cromgeno que produce un producto de color intenso e insoluble origina la aparicin de una banda de color en el sitio del antgeno blanco. Puede lograrse una sensibilidad mucho ms alta si se usa un compuesto quimioluminiscente aunado a agentes de realce adecuados para producir luz en el sitio del antgeno. La tcnica de Western blotting tambin puede identificar un anticuerpo especfico en una mezcla. En este caso los antgenos conocidos de peso molecular bien definido se separan mediante SDS-PAGE y transfieren a nitrocelulosa. Las bandas separadas de antgenos conocidos se prueban luego con la muestra que se sospecha contiene anticuerpo especfico para uno o ms de estos antgenos. La reaccin de un anticuerpo con una banda se detecta mediante el empleo de anticuerpo secundario radiomarcado o ligado a enzima especfico para la especie de los anticuerpos en la muestra en estudio. La aplicacin ms amplia de este procedimiento es como prueba de confirmacin de VIH, donde la Western blotting se utiliza para determinar si el paciente tiene anticuerpos que reaccionan con una o ms protenas vricas.

S Secretor NS No secretor Aadir poblacin de clulas de prueba

NS

Incubar a 37C

Descartar clulas Lavar la placa

Aadir anticuerpo anticitocina ligado a enzima CS E CS Vista lateral E enzima CS sustrato cromgeno CP producto coloreado

CP

CP

Sitio de clulas secretoras Vista superior

FIGURA 6-11 En la prueba ELISPOT, un foso se recubre con anticuerpo contra el antgeno de inters, en este ejemplo una citocina; luego una capa de una suspensin de la poblacin celular que se piensa que contiene algunos miembros que sintetizan y secretan la citocina se coloca en el fondo del foso y se incuba. La mayora de las molculas de citocina secretadas por una clula particular reacciona con los anticuerpos cercanos unidos al foso. Despus del perodo de incubacin, se lava el foso y se aade un anticuerpo anticitocina marcado con enzimas. Tras eliminar por lavado el anticuerpo no unido, se aade un sustrato cromgeno que forma un producto insoluble de color. Este ltimo (prpura) se precipita y forma una mancha slo en las reas del foso en que se depositaron clulas que secretan citocina. El recuento de las manchas de colores permite determinar cuntas clulas que secretaban citocina estaban presentes en la suspensin celular adicionada.

Inmunoprecipitacin
La tcnica de inmunoprecipitacin tiene la ventaja de permitir el aislamiento del antgeno de inters para un anlisis ms amplio. Asimismo constituye una prueba sensible para la presencia de un antgeno particular en un tipo de clula o tejido determinado. Un extracto obtenido por rotura de clulas o tejidos se mezcla con un anticuerpo contra el antgeno de inters a fin de formar un complejo antgeno-anticuerpo que se precipitar. Sin embargo, si la concentracin de antgeno es baja (lo que a menudo es el caso en extractos de clulas y tejidos), el ensamblaje de los complejos antgeno-anticuerpo en precipitados puede requerir horas e incluso das, y es difcil aislar la pequea cantidad de inmunoprecipitado que se forma.

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

159

a) Aadir la mezcla de protena tratada con SDS al recipiente de gel

b) Electroforesis en gel de poliacrilamida

Direccin de la migracin Antgenos protenicos desnaturalizados en SDS

c) Remover el gel y efectuar electrotransferencia

Corriente elctrica

Hoja de membrana porosa d) Unir el antgeno de inters con anticuerpos ligados a enzima

Se cuenta con varias maneras de evitar estas limitaciones. Una consiste en unir el anticuerpo a un apoyo slido, como una cuenta sinttica, que permite reunir el complejo antgeno-anticuerpo mediante centrifugacin. Otra es agregar un anticuerpo secundario especfico para el anticuerpo primario con objeto de unir los complejos antgeno-anticuerpo. Si el anticuerpo secundario se une a una cuenta, los inmunocomplejos pueden colectarse mediante centrifugacin. Una versin particularmente ingeniosa de este procedimiento incluye el acoplamiento del anticuerpo secundario a cuentas magnticas. Despus de que los anticuerpos secundario y primario se unen, los inmunoprecipitados se colectan colocando un imn contra un lado del tubo (fig. 6-13). Cuando se utiliza en conjunto con el marcado biosinttico con radioistopo, la inmunoprecipitacin tambin permite determinar si en realidad una clula o tejido sintetiza un antgeno particular. El radiomarcado de las protenas que las clulas de inters producen puede efectuarse cultivando las clulas en un medio que contiene uno o ms aminocidos radiomarcados. Por lo general los aminocidos que se usan para esta aplicacin son los ms resistentes a modificaciones metablicas, como leucina, cistena o metionina. Despus de que las clulas proliferan en el medio radiactivo, se lisan y someten a un anticuerpo primario especfico para el antgeno de inters. El complejo Ag-Ab se colecta mediante inmunoprecipitacin, se limpia de aminocido radiomarcado no incorporado y otras impurezas por lavado, y a continuacin se analiza. El complejo puede cuantificarse en un contador de centelleo para obtener una determinacin cuantitativa de la cantidad de protena sintetizada. A menudo el anlisis adicional incluye la alteracin del complejo, casi siempre con SDS y calor, de manera que sea posible confirmar la identidad del antgeno inmunoprecipitado controlando que su peso molecular sea el esperado para el antgeno de inters. Esto se realiza por separacin del complejo alterado mediante SDS-PAGE y autorradiografa subsecuente para identificar la posicin del antgeno radiomarcado en el gel.

FIGURA 6-12 En la tcnica de Western blotting, una mezcla

protenica a) se trata con SDS, un detergente desnaturalizador potente, b) luego se separa mediante electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) que discrimina los componentes segn su peso molecular; los componentes de peso molecular ms bajo migran ms rpido que los de peso molecular ms alto. c) El gel se retira del aparato y se aplica a una hoja de nitrocelulosa o nylon que une protenas, y las protenas y el gel se transeren a la hoja mediante el paso de una corriente elctrica. d) La adicin de anticuerpos unidos a enzima detecta el antgeno de inters y e) la posicin de los anticuerpos se observa mediante una reaccin ELISA que genera un producto insoluble de color intenso el cual se deposita en el sitio de la reaccin. De otra manera puede utilizarse un ELISA quimioluminiscente para generar luz que se detecta con facilidad al exponer una pieza de pelcula fotogrca a la blot (mancha).

e) Aadir sustrato para activar la reaccin de color

160
a)

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

b) Anticuerpo especfico

c)

d)

Cuenta magntica Antgeno A

Aadir anticuerpo especfico a extracto celular

Aadir anticuerpo secundario unido a cuentas magnticas

Aplicar imn y lavar para eliminar material no unido

FIGURA 6-13 Los inmunoprecipitados pueden colectarse utilizando cuentas magnticas acopladas a un anticuerpo secundario. a) El tratamiento de un extracto celular que contiene antgeno A (rojo) con un anticuerpo anti-A de ratn (azul) da por resultado la formacin de complejos antgeno-anticuerpo. b) La adicin de cuentas magnticas a las que se uni antgeno antirratn de conejo se unen a los complejos antgeno-anticuerpo (y cualquier

Ig de ratn no reactiva). c) La colocacin de un imn contra el lado del tubo permite colectar con rapidez los complejos antgeno-anticuerpo. Despus de lavar para eliminar cualquier material no unido, los complejos antgeno-anticuerpo pueden disociarse y el antgeno estudiarse. d) Micrografa electrnica que muestra una clula con cuentas magnticas unidas a su supercie mediante anticuerpos.
[Parte d, P. Groscurth, Instituto de Anatoma, Universidad de Zurich-Irchel.]

Inmunouorescencia
En 1944 Albert Coons mostr que era factible marcar los anticuerpos con molculas que tienen la propiedad de la fluorescencia. Las molculas fluorescentes absorben luz de una longitud de onda (excitacin) y emiten luz de otra longitud de onda (emisin). Si las molculas de anticuerpo se marcan con un colorante fluorescente, o fluorocromo, los complejos inmunitarios que contienen estos anticuerpos marcados con fluorescencia (FA) pueden detectarse por la emisin de luz de color cuando se excitan con una luz de longitud de onda apropiada. Es posible observar de manera similar molculas de anticuerpo unidas a antgenos en clulas o cortes de tejido. La luz emitida puede verse con un microscopio de fluorescencia, que est equipado con una fuente de luz UV. En esta tcnica, que se conoce como inmunofluorescencia, suelen emplearse compuestos fluorescentes, como fluorescena y rodamina, pero tambin otras sustancias muy fluorescentes, por ejemplo ficoeritrina, un pigmento de color muy intenso y muy fluorescente obtenido de algas. Estas molculas pueden conjugarse con la regin Fc de una molcula de anticuerpo sin afectar la especificidad de ste. Cada uno de los fluorocromos que se mencionan a continuacin absorbe luz en una longitud de onda y emite luz a una longitud de onda ms larga:

longitud de onda ms larga que la fluorescena, puede usarse en pruebas de inmunofluorescencia de dos colores. Un anticuerpo especfico para un determinante se marca con fluorescena y un anticuerpo que reconoce un antgeno distinto, con rodamina. La localizacin del anticuerpo marcado con fluorescena es visible por su color verde amarillo, fcil de distinguir del rojo que se emite donde el anticuerpo marcado con rodamina se uni. La conjugacin de fluorescena a un anticuerpo y la de rodamina a otro anticuerpo permite, por ejemplo, ver al mismo tiempo dos antgenos de membrana celular diferentes en la misma clula.

Ficoeritrina absorbe luz de manera eficiente (~30 veces ms que la fluorescena) y es un emisor brillante de fluorescencia roja, lo cual la hace de uso amplio como un marcador de inmunofluorescencia.

Fluorescena, un colorante orgnico que es el marcador ms utilizado para procedimientos de inmunofluorescencia, absorbe luz azul (490 nm) y emite una fluorescencia verde-amarillo intensa (517 nm). Rodamina, otro colorante orgnico, absorbe en el intervalo del verde y el amarillo (515 nm) y emite una fluorescencia roja intensa (546 nm). Ya que emite fluorescencia en una

La tincin con anticuerpo fluorescente de molculas de la membrana celular o de cortes de tejido puede ser directa o indirecta (fig. 6-14). En la tincin directa el anticuerpo especfico (el anticuerpo primario) se conjuga directamente con fluorescena; en la tincin indirecta el anticuerpo primario no se marca y se detecta con un reactivo adicional marcado con fluorocromo. Se han desarrollado varios reactivos para la tincin indirecta. El ms usual es un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo formado en una especie contra anticuerpos de otra especie, como la inmunoglobulina antirratn de cabra marcada con fluorescena. La tincin de inmunofluorescencia indirecta tiene dos ventajas sobre la tincin directa. Primera, no es necesario conjugar el anticuerpo primario con un fluorocromo. Puesto que la dotacin de anticuerpo primario suele ser un factor limitante, los mtodos indirectos evitan la prdida de anticuerpo que suele ocurrir

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

161

Clulas con antgenos de membrana (mAg)

Anticuerpo primario contra mAg

Fl Fl Fl Fl Anticuerpo primario Fl Fl Fl Anticuerpo antiisotipo secundario

Fl Fl Fl Fl Fl Fl Fl Fl Fl Protena A

a) Mtodo directo con anticuerpo marcado con fluorocromo contra mAg

b) Mtodo indirecto con anticuerpo antiisotipo marcado con fluorocromo

c) Mtodo indirecto con protena A marcada con fluorocromo

FIGURA 6-14 Tincin por inmunouorescencia directa e indirecta de antgeno de membrana (mAg). Las clulas se jan a un portaobjetos de microscopio. En el mtodo directo (a), las clulas se tien con anticuerpo anti-mAg marcado con un uorocromo (FI). En los mtodos indirectos (b y c), se incuban primero las clulas con anticuerpo anti-mAg no marcado y luego se tien con un reactivo secundario marcado con uorocromo que se une al anticuerpo primario. Las clulas se observan bajo un microscopio de uorescencia para ver si se tieron. d) En esta micrografa, molculas de anticuerpo que llevaban cadenas pesadas se detectaron mediante la tincin indirecta de clulas con un segundo anticuerpo conjugado con rodamina. [Parte d, H. A. Schreuder et al. 1997, Nature 386:196. Cortesa de
H. Schreuder, Hoechst Marion Roussel.]

d)

durante la reaccin de conjugacin. Segunda, los mtodos indirectos aumentan la sensibilidad de tincin porque mltiples molculas del reactivo fluorocromo se unen a cada molcula de anticuerpo primario, lo que incrementa la cantidad de luz que se emite en la localizacin de cada molcula de anticuerpo primario. La inmunofluorescencia se ha aplicado para identificar varias subpoblaciones de linfocitos, en especial las de clulas T CD4 y CD8 . La tcnica tambin es adecuada para identificar especies bacterianas, detectar complejos Ag-Ab en enfermedad autoinmunitaria, descubrir componentes del complemento en tejidos y localizar hormonas y otros productos celulares teidos in situ. De hecho, una aplicacin mayor de la tcnica de anticuerpo fluorescente es la localizacin de antgenos en cortes de tejido o en compartimientos subcelulares. Como puede utilizarse para mapear la localizacin real de antgenos blanco, la microscopia de fluorescencia es un instrumento potente para relacionar la arquitectura molecular de los tejidos y rganos con su anatoma macroscpica global.

Citometra de ujo y uorescencia

Las tcnicas de anticuerpos fluorescentes descritas son instrumentos cualitativos extremadamente valiosos, pero no proporcionan datos cuantitativos. Este inconveniente se elimin con el desarrollo del citmetro de flujo, que se dise para automatizar el anlisis y la separacin de clulas teidas con anticuerpo fluorescente. El citmetro de flujo recurre a un rayo lser y un detector de luz para contar clulas intactas aisladas en suspen-

sin (fig. 6-15). Cada vez que una clula pasa por el rayo lser, la luz del detector se desva y esta interrupcin de la seal lser se registra. El lser excita las clulas que tienen un anticuerpo marcado con fluorescencia unido a sus antgenos de superficie celular, de modo que emiten luz que un segundo sistema detector localizado en ngulo recto con el haz lser registra. La forma ms sencilla del instrumento cuenta cada clula cuando pasa por el haz lser, y registra el grado de fluorescencia que la clula emite; una computadora conectada al sistema genera grficas del nmero de clulas como coordenadas y su intensidad de fluorescencia como abscisas. Las versiones ms complicadas del instrumento son capaces de seleccionar poblaciones de clulas en diferentes contenedores segn su perfil de fluorescencia. El uso del instrumento para determinar qu poblacin celular y cuntos de sus miembros unen anticuerpos marcados con fluorescencia se denomina anlisis; el empleo del instrumento para colocar clulas que tienen diferentes patrones de reactividad en contenedores distintos se denomina clasificacin celular. El citmetro de flujo tiene mltiples aplicaciones en problemas clnicos y de investigacin. Un uso clnico frecuente consiste en determinar el grupo y el nmero de glbulos blancos en muestras de sangre. El tratamiento de muestras de sangre procesadas de manera apropiada con un anticuerpo marcado con fluorescencia y el anlisis citomtrico de flujo permiten obtener la siguiente informacin:

Cuntas clulas expresan el antgeno blanco como un nmero absoluto y tambin como porcentaje de las clulas que pasan por el haz? Por ejemplo, si se utiliza un

162

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

Clulas teidas con: Anticuerpo anti-A + anticuerpo anti-B Anticuerpo anti-A Anticuerpo anti-B Sin teir

Boquilla ultrasnica vibratoria

anticuerpo fluorescente especfico para un antgeno que se encuentra en todas las clulas T, sera posible determinar el porcentaje de clulas T en la poblacin total de glbulos blancos. A continuacin, empleando las capacidades de clasificacin celular del citmetro de flujo, podra aislarse la fraccin de clulas T de la poblacin de leucocitos. La distribucin de clulas en la poblacin de una muestra conforme a las densidades de antgeno determinadas por la intensidad de fluorescencia. Por tanto es posible obtener una medida de la distribucin de la densidad de antgeno dentro de la poblacin de clulas que poseen el antgeno. sta es una caracterstica potente del instrumento porque el mismo tipo de clulas puede expresar diferentes niveles de antgeno segn su desarrollo o estado fisiolgico. El tamao de las clulas. Esta informacin se deriva del anlisis de las propiedades de dispersin de la luz de miembros de la poblacin celular que se examina.

Lser

Fluo

e resc

ncia
Pantalla de computadora Clulas AB+ Clulas A+B+ Fluorescencia de anticuerpo anti-B

Placas de desviacin

Clulas AB Clulas A+B

Fluorescencia de anticuerpo anti-A

Clulas AB+ y A+B Clulas AB

Clulas A+B+

FIGURA 6-15 Separacin de clulas marcadas con uorocromo en el citmetro de ujo. En el ejemplo que se muestra, una poblacin mixta de clulas se ti con dos anticuerpos: uno especco para el antgeno de supercie A y el otro especco para el antgeno de supercie B. Los anticuerpos anti-A se marcaron con uorescena (verde) y los anticuerpos anti-B con rodamina (rojo). Las clulas teidas se cargan en la cmara de muestra del citmetro. Las clulas se expulsan, una a la vez, de una boquilla pequea vibratoria que genera microgotitas, cada una de las cuales contiene no ms de una clula aislada. Conforme sale de la boquilla, cada gotita recibe una carga elctrica pequea y la computadora que controla el citmetro de ujo puede detectar con exactitud cuando pasa una gotita generada por la boquilla a travs del haz de luz lser que excita el uorocromo. La intensidad de la uorescencia emitida por cada gotita que contiene una clula se vigila con un detector y se muestra en una pantalla de computadora. Como la computadora sigue la posicin de cada gotita, es posible determinar cundo una gotita particular llegar entre las placas de desviacin. La aplicacin de una carga momentnea a las placas de desviacin cuando una gotita pasa entre ellas hace posible desviar el trayecto de una gotita particular hacia uno u otro vaso de reunin. Ello permite seleccionar una poblacin de clulas en subpoblaciones que tienen diferentes perles de marcadores de supercie. Cada punto representa una clula en la pantalla de la computadora. Las clulas que caen en el panel inferior izquierdo tienen niveles de fondo de uorescencia y se juzga que no reaccionaron con anticuerpo anti-A o anti-B. Las que aparecen en el panel superior izquierdo reaccionaron con anti-B, pero no con anti-A, y las del panel inferior derecho reaccionaron con anti-A pero no con anti-B. El panel superior derecho contiene clulas que reaccionan tanto con anti-A como con anti-B. En los ejemplos que aqu se muestran, las subpoblaciones A B y A B se seleccionaron cada una hacia tubos separados. La tincin con anticuerpos uorescentes anti-A y anti-B permite distinguir cuatro subpoblaciones: A B , A B , A B y A B .

La citometra de flujo tambin permite analizar poblaciones celulares que se marcaron con dos o incluso tres diferentes anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, si una muestra de sangre reacciona con un anticuerpo especfico para clulas T marcado con fluorescena y tambin con un anticuerpo marcado con ficoeritrina especfico para clulas B, es posible determinar de manera simultnea el porcentaje de clulas B y T en un solo anlisis. Son comunes numerosas variantes de estos anlisis multicolores, incluidos experimentos en que se utilizan muchos colores a la vez. La citometra de flujo ocupa ahora una posicin fundamental en la inmunologa y la biologa celular, y tambin constituye un recurso clnico indispensable. El citmetro de flujo es uno de los instrumentos esenciales para la deteccin y clasificacin de leucemias en muchos centros mdicos (vase el enfoque clnico). La eleccin del tratamiento de la leucemia depende en mucho de los tipos de clulas afectados, lo que determina que la identificacin precisa de las clulas neoplsicas sea una parte esencial de la prctica clnica. Asimismo la medicin rpida de subpoblaciones de clulas T, un indicador pronstico importante en el SIDA, suele llevarse a cabo mediante el anlisis citomtrico de flujo. En este procedimiento se utilizan anticuerpos monoclonales marcados contra los subtipos principales de clula T que llevan los antgenos CD4 y CD8 para determinar sus proporciones en la sangre del paciente. ste tiene un riesgo alto de infecciones oportunistas cuando la cifra de clulas T CD4 disminuye por debajo de determinado nivel.

Alternativas a las reacciones antgeno-anticuerpo

Como defensa contra los anticuerpos del hospedador, algunas bacterias desarrollaron la capacidad de elaborar protenas que se unen a la regin Fc de las molculas de IgG con afinidad alta (Ka ~ 108). Una de estas molculas, que se conoce como protena A, se encuentra en las paredes celulares de algunas cepas de Staphylococcus aureus, y otra, la protena G, se presenta en las paredes de estreptococos de los grupos C y G. La clonacin de los genes para las protenas A y G, y la generacin de un hbrido

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

163

EN F OQ U E C L N I C O

Citometra de ujo y tipicacin de leucemias

La leucemia es la proliferacin incontrolable de una clona anormal de clulas hematopoyticas. De manera caracterstica, las clulas leucmicas responden mal o en forma inapropiada a seales reguladoras, muestran patrones de diferenciacin aberrantes o incluso no se diferencian. Ms an, en ocasiones suprimen el desarrollo de clulas linfoides y mieloides normales. La leucemia puede surgir en cualquier etapa de maduracin de cualesquiera de los linajes hematopoyticos. Las leucemias linfocticas muestran muchas caractersticas de clulas del linaje linfoide; otro grupo amplio, las leucemias mielgenas, tienen atributos de miembros del linaje mieloide. Aparte del linaje, muchas leucemias pueden clasicarse como agudas o crnicas. Algunos ejemplos son la leucemia linfoctica aguda (ALL), la ms frecuente de la niez; la leucemia mielgena aguda (AML), que se encuentra ms a menudo en adultos que en nios, y la leucemia linfoctica crnica (CLL), que rara vez se observa en nios pero es la forma ms comn de leucemia del adulto en el mundo occidental. Un cuarto tipo, la leucemia mielgena crnica (CML), se presenta con mucho mayor frecuencia en adultos mayores que en nios. El diagnstico de leucemia se basa en la deteccin de clulas anormales en el torrente sanguneo y la mdula sea. El diseo del tratamiento ms apropiado para el paciente demanda conocer el tipo de leucemia que padece. A este respecto, dos preguntas son importantes: 1) cul es el linaje de las clulas anormales? y 2) cul es la etapa de maduracin? Varios mtodos, inclusive el examen citolgico de la morfologa celular y las caractersticas de tincin, la inmunofenotipicacin y, en algunos casos, un anlisis de reordenamientos gnicos, son tiles para responder a estas preguntas. Uno de los ms potentes de estos mtodos es la inmunofenotipicacin, la determinacin del perl de marcadores de supercie celular seleccionados que muestra la clula leucmica. Aunque an no se encuentran antgenos especcos de leucemia, los perles de los antgenos de supercie que se expresan con frecuencia permiten establecer el linaje celular y suelen ser tiles para determinar las etapas de maduracin presentes en las poblaciones de clulas leucmicas. Por ejemplo, una clula anormal que muestra inmunoglobulina de supercie se asignara al linaje de clula B y su etapa de maduracin sera la de una clula B madura. Por otra parte, una clula que tiene cadenas pesadas citoplsmicas pero carece de inmunoglobulina de supercie sera una clula leucmica de linaje B, pero en etapa de maduracin de clula pre-B. La tecnologa ms ecien-

te y precisa para inmunofenotipicacin utiliza la citometra de ujo y anticuerpos monoclonales. La disponibilidad de anticuerpos monoclonales especcos para cada una de las calicaciones de antgenos que se encuentran en diversos tipos y subtipos de clulas hematopoyticas hizo posible identicar los patrones de expresin de antgeno que son tpicos de linajes celulares, etapas de maduracin y varios tipos distintos de leucemia. Casi todos los centros para cncer estn equipados con citmetros de ujo que son capaces de efectuar e interpretar los anlisis de mltiples parmetros necesarios para suministrar perles tiles de marcadores de supercie en poblaciones de clulas tumorales. La determinacin citomtrica de ujo de inmunofenotipos permite:

Conrmar el diagnstico Establecer el diagnstico cuando no es posible tener un juicio claro con base en la morfologa o los patrones de tincin citoqumica Identicar perles de antgeno aberrantes que pueden ayudar a detectar el retorno de la leucemia durante una remisin Mejorar la prediccin del curso de la enfermedad

Distribucin de marcadores seleccionados en algunos tipos de clulas leucmicas. Se muestran los perles de antgeno de supercie tpicos que se encuentran en muchas ALL y CLL.

ALL del linaje pre-B (la ALL ms frecuente)

ALL de linaje T CD8 (correceptor para MHC I) CD1 (una molcula similar a MHC clase I)

CLL de linaje B

CD10 (una metaloproteinasa) MHC II

CD4 (correceptor para MHC II)

MHC II Ig CD23 (receptor de IgE de afinidad baja) CD5 CD34

CD44 (molcula de adhesin) CD19

CD19 (un correceptor de clula B)

CD2 (una molcula de adhesin) CD34 (marcador de precursores hematopoyticos)

CD7 (marcador de algunas clulas T, timocitos y clulas hematopoyticas pluripotentes)

CD5 (un marcador de clula T)

CD20 (marcador de clula B)

164

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

de ambos, permiten elaborar una protena recombinante, que se conoce como protena A/G, ya que combina caractersticas de ambas. Estas molculas son tiles porque unen IgG de muchas especies distintas. Por ello pueden marcarse con fluorocromos, radiactividad o biotina y emplearse para detectar molculas de IgG en los complejos antgeno-anticuerpo que se forman durante las pruebas ELISA, RIA o las que se basan en fluorescencia, como la citometra de flujo o la microscopia de fluorescencia. Estas protenas bacterianas que unen IgG tambin pueden utilizarse a fin de formar columnas de afinidad para el aislamiento de la inmunoglobulina G (IgG). La clara de huevo contiene una protena llamada avidina, la cual se une a la biotina, una vitamina esencial para la sntesis de grasa. Se piensa que la avidina evolucion como una defensa contra roedores merodeadores de nidos en busca de huevos. La unin entre avidina y biotina es en extremo especfica y de una afinidad mucho ms alta (Ka ~ 1015) que cualquier otra reaccin antgeno-anticuerpo conocida. Una protena bacteriana llamada estreptavidina, que Streptomyces avidinii elabora, tiene afinidad y especificidad altas similares. Muchos procedimientos inmunitarios aprovechan la extraordinaria afinidad y la minuciosa especificidad de la interaccin de estas protenas con la biotina. El anticuerpo primario o secundario se marca con biotina y se deja reaccionar con el antgeno blanco; luego el anticuerpo no unido se elimina por lavado. A continuacin la estreptavidina o la avidina conjugadas con una enzima, fluorocromo o una marca radiactiva se usan para detectar el anticuerpo unido.

utilizan varios marcadores electrodensos, entre otros ferritina y oro coloidal. El marcador electrodenso puede visualizarse al microscopio electrnico como puntos negros pequeos. En el marcado con inmunooro, diferentes anticuerpos pueden conjugarse con partculas de oro de distintos tamaos, lo que permite identificar varios antgenos dentro de una clula por los tamaos muy diferentes de las partculas de oro electrodensas fijadas a los anticuerpos (fig. 6-16).

RESUMEN

Las interacciones antgeno-anticuerpo dependen de cuatro tipos de interacciones no covalentes: enlaces hidrgeno, enlaces inicos, interacciones hidrfobas e interacciones de van der Waals. La constante de afinidad, que puede determinarse mediante el anlisis de Scatchard, proporciona una medida cuantitativa de la fuerza de interaccin entre un eptopo del antgeno y un sitio de unin individual de un anticuerpo. La avidez refleja la fuerza total de las interacciones entre una molcula de anticuerpo multivalente y una molcula de antgeno multivalente en mltiples sitios. La resonancia de plasmones superficiales (SPR) permite la caracterizacin de la afinidad y la cintica de las interacciones antgeno-anticuerpo. La interaccin de un antgeno soluble y la precipitacin de anticuerpo en un medio lquido o en gel forman un precipitado de antgeno y anticuerpo (Ag-Ab). La electroforesis puede combinarse con precipitacin en gel en una tcnica denominada inmunoelectroforesis. La interaccin entre un antgeno particulado y un anticuerpo aglutinante (aglutinina) produce agregacin visible o aglutinacin, que forma la base de una serie de inmunoensayos simples, rpidos y sensibles. El radioinmunoensayo (RIA) es un procedimiento muy sensible y cuantitativo que utiliza antgeno o anticuerpo marcado con radiactividad. El ensayo de inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) depende de una reaccin de enzima y sustrato que genera un producto de reaccin de color. Las pruebas ELISA que recurren a la quimioluminiscencia en lugar de una reaccin cromgena son los inmunoensayos ms sensibles con que se cuenta. La tcnica de Western blotting separa una mezcla de protenas mediante electroforesis; a continuacin las bandas de protena se transfieren electroforticamente a nitrocelulosa y se identifican con anticuerpo o antgeno marcado. La microscopia de fluorescencia que emplea anticuerpos marcados con molculas fluorescentes permite observar antgeno sobre las clulas o dentro de ellas. La citometra de flujo constituye una tecnologa extraordinariamente potente para el anlisis cuantitativo y la clasificacin de poblaciones celulares marcadas con uno o ms anticuerpos fluorescentes.

Microscopia inmunoelectrnica
La especificidad fina de los anticuerpos los convierte en poderosos instrumentos para observar componentes tisulares intracelulares especficos mediante microscopia inmunoelectrnica. En esta tcnica, un marcador electrodenso se conjuga con la porcin Fc de un anticuerpo especfico para tincin directa o con un reactivo antiinmunoglobulina para tincin indirecta. Se

FIGURA 6-16 Inmunoelectromicrografa de la supercie de

una clula B de linfoma que se ti con dos anticuerpos: uno contra molculas MCH clase II marcadas con partculas de oro de 30 nm y otra contra molculas MHC clase I marcadas con partculas de oro de 15 nm. La densidad de molculas clase I excede la de la clase II en esta clula. Bar = 500 nm. [De A. Jenei et al.,
1997, PNAS 94:7269-7274; cortesa de A. Jenei y S. Damjanovich, Escuela de Medicina de la Universidad de Debrecen, Hungra.]

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

165

Bibliografa
Bierer, B., et al. 2005. Current Protocols in Immunology. Wiley, New York. Harlow, E., and D. Lane. 1999. Using antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Herzenberg, L. A., ed. 1996. Weirs Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Oxford, Blackwell Scientific Publications. Malmqvist, M. 1993. Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics. Current Opinion in Immunology 5:282. Rich, R. L., and D. G. Myszka. 2003. Spying on HIV with SPR. Trends in Microbiology 11:124. Rose, N. R., et al. 1997. Manual of Clinical Laboratory Immunology. American Society of Microbiology, Washington, DC. Wild, D., ed. 2005. The Immunoassay Handbook, 3rd ed. Elsevier, Amsterdam.

f. A fin de que la precipitacin ocurra, tanto el antgeno como el anticuerpo deben ser multivalentes. g. El anlisis de una poblacin celular mediante citometra de flujo puede brindar al mismo tiempo informacin tanto de la distribucin por tamao como del perfil de antgeno de poblaciones celulares que contienen varios tipos diferentes de clulas. h. Las pruebas ELISA que recurren a la quimioluminiscencia son ms sensibles que las cromgenas y las pruebas de precipitacin lo son ms que las de aglutinacin. i. La Western blotting y las pruebas de inmunoprecipitacin son valoraciones cuantitativas tiles para medir las concentraciones de protenas en clulas o tejidos. j. Suponga que tanto el anticuerpo A como el B reaccionan con un eptopo C. Ms an, suponga que el anticuerpo A tiene una Ka cinco veces mayor que la de B. La fuerza de la reaccin monovalente del anticuerpo A con el eptopo C siempre ser mayor que la avidez del anticuerpo B por un antgeno con mltiples copias del eptopo C. 2. Usted obtiene un preparado de albmina srica de bovino (BSA) purificada de suero normal de bovino. Para determinar si en el preparado de BSA quedan algunas otras protenas sricas decide utilizar inmunoelectroforesis. a. Qu antgeno empleara a fin de obtener el antisuero necesario para detectar impurezas en la preparacin de BSA? b. Suponiendo que el preparado de BSA es puro, dibuje el patrn inmunoelectrofortico que cabra esperar si la valoracin se llevara a cabo con suero de bovino en un foso arriba de un cuenco que contiene el antisuero obtenido en a) y la muestra de BSA en un foso abajo del cuenco, como se muestra a continuacin:
Preparado de BSA Suero bovino

Sitios tiles en la red

http://pathlabsofark.com/owcyttests.html
Explore los Pathology Laboratories of Arkansas para ver qu tipos de muestras se obtienen de los pacientes y qu marcadores se utilizan para valorar poblaciones de linfocitos mediante citometra de flujo.

http://jcsmr.anu.edu.au/facslab/protocol.html
En el sitio Australian Flow Cytometry Group Web, muy informativo, puede encontrarse una gua detallada y cuidadosamente ilustrada para la interpretacin de anlisis citomtricos de flujo de muestras clnicas.

http://www.rockefeller.edu/spectroscopy/ instruments_spr.php
Excelente definicin de las unidades de la respuesta expresada en la resonancia de plasmones superficiales.

Preguntas de estudio
PREGUNTA
DE ENFOQUE CLNICO El anlisis de citometra de flujo para la deteccin y medicin de subpoblaciones de leucocitos, inclusive los de la leucemia, suele realizarse mediante el uso de anticuerpos monoclonales. Por qu es esto necesario?

1. Indique si cada una de las afirmaciones siguientes es verdadera o falsa. Si piensa que una afirmacin es falsa, explique por qu. a. La inmunofluorescencia indirecta es una tcnica ms sensible que la inmunofluorescencia directa. b. Casi todos los antgenos inducen una respuesta policlonal. c. Los anticuerpos anti-SRBC digeridos con papana pueden aglutinar glbulos rojos de oveja (SRBC, sheep red blood cells). d. Los anticuerpos anti-SRBC digeridos con pepsina pueden aglutinar SRBC. e. La inmunofluorescencia indirecta puede efectuarse usando un fragmento Fab como el anticuerpo primario no marcado.

3. Las etiquetas de cuatro frascos (A, B, C, y D) de conjugados de hapteno y portador se perdieron accidentalmente. Sin embargo, se saba que cada frasco contena 1) hapteno 1-portador 1 (H1-C1), 2) hapteno 1-portador 2 (H1-C2), 3) hapteno 2-portador 1 (H2-C1) o 4) hapteno 2-portador 2 (H2-C2). El portador 1 tiene peso molecular de 60 000 Da y el portador 2 uno mayor de 120 000 Da. Suponga que tiene un anticuerpo anti-H1 y un anticuerpo anti-H2, y un marcador con peso molecular de 100 000 Da. Utilice Western blotting para determinar el contenido de cada frasco y muestre los Western blots que cabra esperar de 1, 2, 3 y 4. Su respuesta tambin debe indicar qu anticuerpo o combinacin de anticuerpos se us para obtener cada blot (mancha). 4. Indique con cul de las pruebas siguientes es posible determinar la concentracin de una cantidad pequea (250 ng/ml) de hapteno: a) ELISA (cromgena), b) mtodo de Ouchterlony, c) RIA, d) microscopia de fluorescencia, e) citometra de flujo, f) inmunoprecipitacin, g) microscopia inmunoelectrnica, h) ELISPOT, i) ELISA quimioluminiscente. 5. El lector tiene una protena de mieloma, X, cuyo isotipo se desconoce, y varias otras protenas de mieloma de todos los isotipos conocidos (p. ej., IgG, IgM, IgA e IgE.)

166

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

a. Cmo producira anticuerpos especficos de isotipo que pudieran utilizarse para determinar el isotipo de protena de mieloma, X? b. Cmo podra emplear este anticuerpo antiisotipo para medir la concentracin de protena de mieloma X en suero normal? 6. Para cada antgeno o anticuerpo que se menciona en seguida, indique un mtodo de valoracin apropiado y los reactivos necesarios para la prueba. Tenga presente la sensibilidad de la prueba y la concentracin esperada de cada protena. a. b. c. d. IgG en suero Insulina en suero IgE en suero Componente C3 del complemento en membrana basal glomerular e. Anticuerpos anti-A contra antgeno de grupo sanguneo A en suero f. Contaminacin de una hamburguesa con carne de caballo g. Espiroqueta de sfilis en frotis de un chancro

a. Cul es el valor de K0 para cada antisuero? b. Cul es la valencia de cada anticuerpo? c. Cul de los antisueros podra ser un anticuerpo monoclonal? d. Cul de los antisueros usara para su valoracin? Por qu? 10. Al preparar una demostracin para su clase de inmunologa, una instructora purific anticuerpos de IgG contra glbulos rojos de oveja (SRBC) y llev a cabo la digestin de algunos de los anticuerpos en fragmentos Fab, Fc y F(ab)2. Coloc cada preparado en un tubo distinto, marc los tubos con un marcador hidrosoluble y los dej en una cubeta con hielo. Cuando la instructora volvi para su clase descubri que las etiquetas se haban manchado y no eran legibles. Determinada a salvar la demostracin, marc de nuevo los tubos 1, 2, 3 y 4, y prosigui. Con base en los resultados de la prueba que se describen a continuacin, indique qu preparado contena cada tubo y explique cmo se identific el contenido. a. El preparado del tubo 1 aglutin SRBC, pero no los lis en presencia de complemento. b. El preparado del tubo 2 no aglutin SRBC, ni los lis en presencia de complemento. Sin embargo, cuando este preparado se aadi a SRBC antes de la adicin de anti-SRBC completo, previno la aglutinacin de las clulas por el antisuero anti-SRBC completo. c. El preparado del tubo 3 aglutin SRBC y tambin lis las clulas en presencia de complemento. d. El preparado del tubo 4 no aglutin ni lis SRBC y no inhibi la aglutinacin de SRBC por antisuero anti-SRBC completo. 11. Considere la ecuacin 1 y deduzca la forma de la ecuacin de Scatchard que aparece en la ecuacin 2. 1. S L SL 2. B/F Ka ([S]t B)

7. Cules de los siguientes no participan en la formacin de complejos antgeno-anticuerpo? a. b. c. d. e. Enlaces hidrfobos Enlaces covalentes Interacciones electrostticas Enlaces de hidrgeno Fuerzas de van der Waals

8. Explique la diferencia entre afinidad de anticuerpo y avidez de anticuerpo. Cul de estas propiedades de un anticuerpo indica mejor su capacidad de contribuir a la inmunorreaccin humoral contra bacterias invasoras? 9. El lector desea desarrollar un inmunoensayo sensible para una hormona que se presenta en la sangre a concentraciones de casi 10 7 M. Se le ofrece una eleccin de tres antisueros diferentes cuyas afinidades por la hormona se determinaron mediante dilisis de equilibrio. Los resultados se muestran en las grficas de Scatchard.

r/c 104 ( ) r/c 105 ( ) ( )

60 40 1 20

donde S sitios de unin de anticuerpo; [S] concentracin molar de sitios de unin de anticuerpo; L ligando (antgeno monovalente); [L] concentracin molar de ligando; SL complejo de sitio y ligando; [SL] = concentracin molar del complejo de sitio y ligando; B sustituye a [SL] y F a [L]. Sugerencia: sera til comenzar escribiendo la ley de accin de masa para la reaccin que se muestra en la ecuacin 1. 12. El lector toma un trabajo de verano en un laboratorio clnico para ayudarse a pagar sus estudios. Ordena un estuche para detectar anticuerpos contra hantavirus en suero por medio de ELISA indirecto, pero cuando llega usted advierte que no tiene instrucciones, slo botellas rotuladas reactivo A, reactivo B, etc. Es posible que varios pacientes se hayan expuesto a hantavirus, y usted necesita usar el estuche para demostrarlo.

1 r

Para uso con la pregunta 12 Nulo 0.001 0.006 0.005 Testigo 0.103 0.056 0.096 + Testigo 0.857 0.952 0.903 P1 P2 P3 1:1 1.002 0.002 0.568 1:10 0.562 0.005 0.203 1:100 0.352 0.008 0.086 1:1 000 0.202 0.002 0.079 1:10 000 0.096 0.004 0.082 1:100 000 0.005 0.001 0.045

INTERACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

C A P T UL O

167

a. Cules de las siguientes sustancias quiz se incluyan en el estuche como reactivos necesarios para realizar el ensayo? 1. Antgeno soluble testigo positivo 2. Anticuerpo primario contra hantavirus 3. Sustrato 4. Anticuerpo secundario marcado por enzima contra el primario 5. Anticuerpo secundario marcado por enzima contra el virus 6. Placas recubiertas de antgeno b. Usando el estuche, usted obtiene resultados para el suero de tres pacientes (P1-P3 en el cuadro de la pgina anterior). Cules son los ttulos de los sueros de los pacientes? (D un ttulo para cada uno de los tres pacientes.) Cul o cules de estos pacientes se expusieron, en su caso? 13. El investigador para el que usted trabaja acaba de descubrir un nuevo receptor que se piensa es importante en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Otros miembros del personal del laboratorio han clonado el receptor y han transfectado el gen en una lnea celular para estudio ulterior. La tarea de usted es clasificar las clulas transfectadas para eliminar las que no expresan el gen, y seleccionar una poblacin de las que lo expresan en alto grado. Usted dispone de un anticuerpo de conejo contra el receptor, un anticuerpo murino testigo que se une a las clulas transfectadas, anticuerpos antimurinos de cabra conjugados con fluorescena, y anticuerpos anticonejo de burro conjugados con rodamina. a. Describa cmo diseara el experimento de FACS. b. Trace un histograma FACS representativo para los resultados esperados, donde el eje x muestre la concentracin de fluorescena y el eje y la concentracin de rodamina. Incluya en su histograma el sitio donde colocara las compuertas para la separacin de las clulas. 14. Cul es la ventaja de usar un ELISPOT contra un ELISA en sndwich estndar? Cules son las semejanzas y diferencias entre estos dos ensayos?

Ligando DNP O2N NIP HO I O2N NP HO O2N mNP CH2COCH2COCH2CO-

IC50 (M)

10

(15)

10

(1)

10

(1)

pNP

O2N

CH2CO-

10

(0.05)

HP

HO

CH2CO-

Sin inhibicin

b. c. d.

e.

ANALICE

1.0

Afinidad relativa (pNP4/pNP20)

Concentracin relativa de IgG (medida por ELISA)

LOS DATOS Kanayama y colaboradores (J. Immunology 169:6865, 2002) crearon un ratn transgnico (ratn QM) cuyo principal receptor de clula B (presente en 80% de todas las clulas B del ratn) estaba constituido por cadenas pesadas codificadas por VH 17.2.25 y cadenas ligeras 1 o 2. El receptor de antgeno era especfico para el hapteno 4-hidroxi-3-nitrofenilacetilo (NP). Los investigadores estimaron la afinidad relativa de esas clulas B hacia otros haptenos relacionados con NP usando los ensayos de inhibicin competitiva (IC50 = concentracin necesaria para competir por 50% de la unin a NP radiomarcado) que se indican en el cuadro adjunto. Tambin inmunizaron las almohadillas digitales de los ratones QM con pNP-CGG (globulina de pollo) y luego obtuvieron sangre de los ratones a diversos intervalos (vanse las grficas ms adelante). Conteste las siguientes preguntas basndose en la informacin presentada y en lo que ha aprendido en este libro.

siempre tendr la mxima afinidad por NP comparado con otros haptenos afines a NP. Explique. Ocurri cambio de clase en respuesta a la inmunizacin? Explique su respuesta. Cules dos procesos contribuyeron al resultado que se ilustra en la grfica b? Las clulas B de los ratones QM analizadas en este estudio expresaron cadenas ligeras . Qu puede decir acerca de los sucesos ocurridos en la etapa de clula pre-B de la diferenciacin de linfocitos B que condujeron a la produccin de anticuerpo con cadenas ligeras ? Tienen las clulas B que expresan la cadena pesada codificada por VH 17.2.25 y la cadena ligera 1 el mismo idiotipo que las clulas B que expresan IgG con cadena pesada codificada por VH 17.2.25 y la cadena ligera 2?

a) Respuesta anti-IgG contra pNP con el tiempo

b) Afinidad relativa de la respuesta de anticuerpo anti-pNP con el tiempo

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 8 16

= experimentos separados

= experimentos separados

0.1

a. Verdadero o falso: este idiotipo (receptor de antgeno) es especfico para el hapteno NP; por tanto, el receptor de Ig

0.01 0 8 16

Da

Da

captulo 7
Sistema del complemento
C1qr2s2 C1r2s2 C1Inh

l sistema del complemento es el principal efector de la rama humoral del sistema inmunitario. La investigacin del complemento se inici en la dcada de 1890, cuando Jules Bordet, del Instituto Pasteur en Pars, demostr que el antisuero de oveja contra la bacteria Vibrio cholerae lisaba la bacteria y el calentamiento del antisuero destrua su actividad bacterioltica. Como hecho sorprendente, la capacidad del suero calentado de lisar bacterias se restableci con la adicin de suero intacto que no contena anticuerpos dirigidos contra la bacteria y que era incapaz de destruir la bacteria por s mismo. Bordet razon de forma correcta que la actividad bacterioltica requiere dos sustancias diferentes: primero, anticuerpos antibacterianos especficos que sobreviven al proceso de calentamiento, y un segundo componente sensible al calor que causa la actividad ltica. Bordet dise una prueba simple para la actividad ltica: la lisis (que se detecta con facilidad) de glbulos rojos recubiertos con anticuerpo, la denominada hemlisis. Paul Ehrlich, en Berln, llev a cabo de manera independiente experimentos similares e ide el trmino complemento y lo defini como la actividad del suero sanguneo que completa la accin del anticuerpo. En los aos siguientes, los investigadores descubrieron que la accin del complemento resultaba de interacciones de un grupo grande y complejo de protenas. Se demostr adems que los resultados de la activacin del complemento van ms all de la lisis celular mediada por anticuerpo, y que el complemento tiene un papel clave tanto en la inmunidad innata como en la adaptativa. Un aspecto importante de la actividad del complemento es su posicin en el sistema inmunitario innato. Aunque el descubrimiento del complemento y la mayora de los estudios tempranos se vincularon con la actividad del complemento despus de la unin de anticuerpo, una funcin importante de este sistema es el reconocimiento y la destruccin de patgenos con base en el reconocimiento de patrones moleculares relacionados con patgeno, o PAMP, ms que en la especificidad de anticuerpo. La activacin de la cascada del complemento puede ser iniciada por varias protenas que circulan en el suero normal. Estas molculas, denominadas protenas de fase aguda, poseen capacidad de reconocimiento de patrones y experimentan cambios de concentracin durante la inflamacin. De este modo, todas las diversas acciones del sistema del complemento pueden ser desencadenadas no slo por anticuerpos, como lo demostr originalmente Bordet, sino tambin por componentes de la inmunidad innata.

Anticuerpo

Inicio de la va clsica del complemento por unin de anticuerpo a una membrana celular y su inhibicin por inhibidor C1.

Funciones del complemento Componentes del complemento Activacin del complemento Regulacin del sistema del complemento Consecuencias biolgicas de la activacin del complemento Deciencias de complemento

En este captulo se describen los componentes del sistema del complemento, su activacin por tres vas principales, la regulacin del sistema, las funciones efectoras de diversos componentes del complemento y las consecuencias clnicas de sus deficiencias. En el enfoque clnico se describen las consecuencias de un defecto de las protenas que regulan la actividad del complemento.

Funciones del complemento

La investigacin sobre el complemento incluye en la actualidad ms de 30 protenas solubles y unidas a clulas. Las actividades biolgicas de este sistema afectan las inmunidades innata y adaptativa y van mucho ms all de las observaciones originales de la lisis de bacterias y glbulos rojos mediada por anticuerpo. Las comparaciones estructurales de las protenas que participan en las vas del complemento sitan el origen de este sistema en microorganismos primitivos que poseen los

168

SISTEMA DEL COMPLEMENTO

C A P T UL O

169

LISIS

OPSONIZACIN

ACTIVACIN DE LA REACCIN INFLAMATORIA Receptor de complemento

DEPURACIN DE INMUNOCOMPLEJOS

Bacterias Complemento Desgranulacin Extravasacin Tejido Sangre Clula blanco Fagocito

Complejo Ag-Ab

Fagocito

FIGURA 7-1 Las diversas actividades del sistema del complemento. Protenas sricas y receptores de complemento unidos a membrana participan en varias actividades inmunitarias: lisis de clulas extraas por vas dependiente o independiente de anticuerpo; opsonizacin o captacin de antgenos particulados, incluidas las bacterias, por fagocitos; activacin de reacciones inamatorias y

depuracin de inmunocomplejos circulantes por clulas en hgado y bazo. Las protenas del complemento solubles estn indicadas de forma esquemtica por un tringulo y los receptores por un semicrculo; en este esquema no se intenta diferenciar entre componentes individuales del sistema del complemento.

sistemas inmunitarios innatos ms rudimentarios. Los organismos multicelulares primitivos que carecen de componentes de inmunidad adaptativa poseen protenas relacionadas con el sistema del complemento. En contraste, la interaccin de receptores celulares con protenas del complemento controla algunas actividades de las clulas B, lo cual revela que este sistema participa en el sistema inmunitario adaptativo, altamente desarrollado. As, en las especies de vertebrados, existe un sistema que abarca la inmunidad innata y la adaptativa, que contribuye a cada una de modos diversos. Despus de la activacin inicial, los diferentes componentes del complemento interactan en una cascada muy regulada para llevar a cabo varias funciones bsicas (fig. 7-1), entre ellas las siguientes:

Lisis de clulas, bacterias y virus Opsonizacin, que promueve la fagocitosis de antgenos particulados Unin a receptores de complemento especficos en clulas del sistema inmunitario, lo que desencadena funciones caractersticas de dichas clulas, inflamacin y secrecin de molculas inmunorreguladoras Depuracin inmunitaria (inmunodepuracin), que elimina complejos inmunitarios de la circulacin y los deposita en el bazo y el hgado

aparatos digestivo y genitourinario. Estos componentes constituyen 5% (en peso) de la fraccin de la globulina srica. Casi todos circulan en el suero en formas funcionales inactivas como proenzimas, o cimgenos, hasta que ocurre la escisin proteoltica que elimina un fragmento inhibidor y expone el sitio activo de la molcula. La secuencia de reaccin del complemento se inicia con una cascada enzimtica. Los componentes del complemento se designan con numerales (C1-C9), letras (p. ej., factor D) o nombres comunes (como factor de restriccin homlogo). Los fragmentos peptdicos que se forman por activacin de un componente se indican con letras pequeas. En la mayor parte de los casos, los fragmentos ms pequeos que resultan de la escisin de un componente se designan a, y el fragmento ms grande se designa b (p. ej., C3a, C3b; cabe sealar que C2 es una excepcin: C2a es el fragmento de escisin ms grande). Los fragmentos ms grandes se unen al blanco cerca del sitio de activacin, y los ms pequeos se difunden desde el sitio y pueden precipitar reacciones inflamatorias localizadas por unin a receptores especficos. Los fragmentos del complemento interactan entre s para formar complejos funcionales. Los complejos que tienen actividad enzimtica se designan con una lnea sobre el nmero o signo (p. ej., C4b2a, C3bBb).

Activacin del complemento Componentes del complemento

Las protenas y glucoprotenas solubles que componen el sistema del complemento se sintetizan sobre todo en los hepatocitos, aunque tambin producen cantidades de importancia monocitos sanguneos, macrfagos tisulares y clulas epiteliales de los En la figura 7-2 se delinean las vas de activacin del complemento. Las etapas tempranas, que culminan con la formacin de C5b, pueden ocurrir por las vas clsica (o comn), alterna o de lectina. Los pasos finales que llevan a la formacin del complejo de ataque a membrana (MAC, del ingls membrane-attack complex) son idnticos en todas las vas.

170

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

VA CLSICA Antgeno-anticuerpo C1qr2s2 (C1) C1qr2s2 activado C2 C4 VA DE LECTINA MBL MASP Pared celular microbiana C3a C3 C3b B Ba C3bBb (convertasa de C3) Factor D C3bBb3b (convertasa de C5) C3 Complejo tipo C1 activado C4a C4b C2b C4b2a (convertasa de C3) C3a C3b C3a C5 C5a C5b C6 C7 C8 C9 C5b6789 (MAC) C4b2a3b (convertasa de C5)

Superficies microbianas VA ALTERNA

FIGURA 7-2 Generalidades de las vas de activacin del complemento. La va clsica se inicia cuando se une C1 a complejos de antgeno y anticuerpo. La va alterna comienza por la unin de C3b generado de modo espontneo a supercies de activacin, como paredes de clulas microbianas. La va de lectina empieza con la unin

de la protena srica MBL a la supercie de un patgeno. Las tres vas liberan convertasas de C3 y C5 y unen C5b, que se convierte en un complejo de ataque a membrana (MAC) por una secuencia comn de reacciones terminales.

La va clsica se inicia con la unin de antgeno y anticuerpo

La activacin del complemento por la va clsica comienza casi siempre con la formacin de complejos de antgeno y anticuerpo solubles (complejos inmunitarios o inmunocomplejos) o con la unin de anticuerpo a antgeno en un blanco conveniente, por ejemplo una clula bacteriana. La IgM y ciertas subclases de IgG (IgG1, IgG2 e IgG3 humanas, pero no IgG4) pueden activar la va clsica del complemento. La etapa inicial de la activacin incluye C1, C2, C3 y C4, que se encuentran en el plasma en formas funcionales inactivas. Debido a que los componentes se nombraron en el orden de su descubrimiento y antes que se determinaran sus sitios funcionales, los nmeros en sus nombres no siempre indican el orden en que reaccionan. La formacin de un complejo de antgeno y anticuerpo induce cambios de conformacin en la porcin Fc de la molcula de IgM, los cuales exponen un sitio de unin para el componente C1 del sistema del complemento. El C1 en suero es un complejo macromolecular que consiste en C1q y dos molculas C1r y dos C1s, unidas entre s en un complejo (C1qr2s2) estabilizado por iones Ca2 . La molcula C1q se compone de 18 cadenas polipeptdicas que se unen para formar seis brazos helicoidales triples parecidos a colgena, cuyas puntas se unen a sitios de unin de C1q expuestos en el dominio CH2 de la molcula de anticuerpo (fig. 7-3). Cada monmero C1r y C1s contiene un dominio cataltico y un dominio de interaccin; el ltimo facilita la interaccin con C1q o de uno con el otro.

Cada complejo macromolecular C1 debe unirse mediante sus cabezas globulares C1q cuando menos a dos sitios Fc para que suceda una interaccin estable C1-anticuerpo. Cuando IgM pentamrica se une a antgeno en una superficie blanco, asume la llamada configuracin en grapa, en la cual se exponen cuando menos tres sitios de unin para C1q. Sin embargo, la IgM circulante existe en una configuracin plana en la cual no estn expuestos los sitios de unin de C1q (fig. 7-4) y por consiguiente no puede activar la cascada del complemento. Por otra parte, una molcula de IgG slo contiene un sitio de unin de C1q en el dominio CH2 del Fc, de manera que la unin firme de C1q slo se logra cuando dos molculas de IgG se encuentran a 30 a 40 nm una de la otra en una superficie blanco o en un complejo, lo que proporciona dos sitios de insercin para C1q. Esta diferencia explica la observacin de que una molcula individual de IgM unida a un glbulo rojo puede activar la va del complemento clsica y lisar el eritrocito, en tanto que se requieren alrededor de 1 000 molculas de IgG para asegurar que dos de ellas se encuentren lo bastante cerca una de la otra en la superficie celular para iniciar la unin de C1q. En la figura 7-5 se muestran de modo esquemtico los intermediarios en la va de activacin clsica. La unin de C1q a sitios de unin Fc induce un cambio de conformacin en C1r que convierte sta en una enzima proteasa de serina activa, C1r, que a continuacin escinde C1s en una enzima activa similar, C1s, la cual tiene dos sustratos, C4 y C2. El componente C4 es una glucoprotena que contiene tres cadenas polipeptdicas , y . El C4 se activa cuando C1s hidroliza un fragmento

a) Se une al dominio CH2 del anticuerpo

b)

Cabezas

C1r C1s Triple hlice tipo colgena

3 Tallo C1q

Macromolcula C1

FIGURA 7-3 Estructura del complejo macromolecular C1. a) Una molcula C1q consta de 18 cadenas polipeptdicas dispuestas en seis hlices triples tipo colgena, cada una de las cuales contiene una cadena A, una B y una C, que se muestran en azul, verde y rojo, respectivamente. El grupo de la cabeza de cada triplete contiene elementos de las tres cadenas. En la macromolcula C1, C1q
a) b)

interacta con dos molculas de C1r y dos de C1s. Cada monmero C1r y C1s contiene un dominio cataltico con actividad enzimtica y un dominio de interaccin que facilita la unin con C1q o entre s. b) Micrografa electrnica de la molcula C1q que muestra el tallo y seis cabezas globulares. [Fotografa del recuadro de H. R. Knobel et al.,
1975, European Journal of Immunology 5:78.]

c)

d)

FIGURA 7-4 Modelos de IgM pentamrica en forma plana (a)

y de grapa (b). Varios sitios de unin de C1q en la regin Fc son accesibles en la forma en grapa, en tanto que en la forma plana no se expone ninguno. Micrografas electrnicas de anticuerpo antiagelo

IgM unido a agelos; se muestran las formas plana (c) y de grapa (d).
[Tomada de A. Feinstein et al., 1981, Monographs in Allergy 17:28, y 1981, Annals of the New York Academy of Sciences 190:1104.]

171

172

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

FIGURA 7-5 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

Diagrama esquemtico de los intermediarios en la va clsica de activacin del complemento

4 El componente C3b de la convertasa de C5 se une a C5 y permite que C4b2a escinda C5.

C1q se une a complejo antgeno-anticuerpo. C1r se activa de modo autocataltico y activa el segundo C1r; ambos activan C1s. C1qr2s2 C1q Anticuerpo FC C1r2s2

+ C5b C5 C5a

C1s escinde C4 y C2. La escisin de C4 expone el sitio de unin para C2. C4 se une a la superficie cerca de C1; C2 se une a C4 para formar la convertasa de C3.

Convertasa de C5 5 C5b se une a C6 e inicia la formacin del complejo de ataque a membrana.

C4 C4a

C2 C2b

C6 C4b2a Convertasa de C3 3 La convertasa de C3 hidroliza muchas molculas de C3. Algunas se combinan con la convertasa de C3 para formar la convertasa de C5.

C7

C8

C5b

C5b67

C5b678

C5b678 C9 Poli-C9 + C3 C3b C3a Complejo de ataque a membrana

C4b2a

C4b2a3b Convertasa de C5

El complejo de ataque a membrana completo (MAC, abajo a la derecha) forma un poro grande en la membrana.

SISTEMA DEL COMPLEMENTO

C A P T UL O

173

a) O C S S S S S C4b2a

b) O C3a

c) Membrana celular R C+
S

O O S S S S C SH

C3

S S

C3b activado

C3b unido

FIGURA 7-6 Hidrlisis de C3 por la convertasa de C3 C4b2a. a) C3 nativo. b) C3 activado que muestra el sitio de escisin por C4b2a; sta tiene como resultado la produccin de los fragmentos C3a y C3b. c) Se activa un enlace tioster interno lbil en C3 a medida que

se forma C3b, que permite que el fragmento C3b se una a grupos hidroxilo o amino libres (R) en una membrana celular. La C3b unida muestra diversas actividades biolgicas, que incluyen la unin de C5 y la unin a receptores C3b en clulas fagocticas.

pequeo (C4a) del extremo amino terminal de la cadena , lo que expone un sitio de unin en el fragmento ms grande (C4b). El fragmento C4b se fija a la superficie blanco en la cercana de C1 y a continuacin la proenzima C2 lo hace al sitio de unin expuesto en C4b, mientras que la C1s vecina escinde C2; el fragmento ms pequeo (C2b) se difunde. El complejo C4b2a resultante se denomina convertasa de C3, lo que hace referencia a su accin de convertir C3 en una forma activa. El fragmento ms pequeo de la escisin de C4, C4a, es una anafilatoxina, o mediador de la inflamacin, que no participa de modo directo en la funcin ltica de la cascada del complemento; ms adelante se describen las anafilatoxinas, que incluyen los fragmentos ms pequeos de C4, C3 y C5. El componente C3 nativo consta de dos cadenas polipeptdicas, y . La hidrlisis de un fragmento corto (C3a) del extremo amino terminal de la cadena por la convertasa de C3 genera C3b (fig. 7-6). Una molcula de convertasa de C3 individual puede generar ms de 200 molculas de C3b, lo cual tiene como resultado una gran amplificacin en esta etapa de la secuencia. Parte de C3b se une a C4b2a para formar un complejo trimolecular, C4b2a3b, llamado convertasa de C5. El componente C3b de este complejo se une a C5 y altera su conformacin, de tal forma que el componente C4b2a puede escindir C5 en C5a, que se difunde, y C5b, que se fija a C6 e inicia la formacin del complejo de ataque a membrana en una secuencia que se describe ms adelante. Parte de la C3b generada por la actividad de la convertasa de C3 no se une a C4b2a, sino que se difunde y a continuacin cubre inmunocomplejos y antgenos particulados, por lo que funciona como una opsonina o promotor de la fagocitosis. El C3b tambin puede unirse de modo directo a membranas celulares.

Esta va mayor de activacin del complemento incluye cuatro protenas sricas: C3, factor B, factor D y properdina. La va alterna es iniciada en la mayor parte de los casos por constituyentes de superficie celular que son extraos al hospedador (cuadro 7-1). Por ejemplo, las bacterias gramnegativas y grampositivas tienen constituyentes en la pared celular capaces de activar la va

CUADRO 7-1

Iniciadores de la va alterna de activacin del complemento

PATGENOS Y PARTCULAS DE ORIGEN MICROBIANO Muchas cepas de bacterias gramnegativas Lipopolisacridos de bacterias gramnegativas Muchas cepas de bacterias grampositivas cido teicoico de paredes de clulas grampositivas Paredes de clulas micticas y levaduras (zimosn) Algunos virus y clulas infectadas por virus Algunas clulas tumorales (Raji) Parsitos (tripanosomas) NO PATGENOS IgG, IgA e IgE humanos en complejos IgG de conejo y cobayo en complejos Factor de veneno de cobra Eritrocitos heterlogos (conejo, ratn, pollo)

La va alterna es independiente de anticuerpo

La va alterna genera productos activos similares a los de la va clsica, pero lo hace sin necesidad de complejos de antgeno y anticuerpo para iniciarse. Debido a que no se requiere anticuerpo, la va alterna es un componente del sistema inmunitario innato.

Polmeros aninicos (sulfato de dextrn) Carbohidratos puros (agarosa, inulina)

FUENTE: Adaptado de M. K. Pangburn, 1986, en Immunobiology of the Complement System, G. Ross, ed., Academic Press, Orlando.

S S

174

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

FIGURA 7-7 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

Diagrama esquemtico de los intermediarios en la formacin de C5b unida por la va alterna de activacin del complemento
1 C3 se hidroliza de modo espontneo, el fragmento C3b se fija a la superficie extraa. C3

+ C3b C3a

El factor B une C3a y expone el sitio en que acta el factor D. La escisin genera C3bBb, que tiene actividad de convertasa de C3.

Factor B

Factor D

La unin de properdina estabiliza la convertasa.

C3bBb

properdina

Convertasa de C3 C3

+ 4 La convertasa genera C3b; parte se une a la convertasa de C3 y activa la convertasa de C5'. C5b se une a la superficie antignica.

C3bBbC3b Convertasa de C5

C5

C5b + C5a

Complejo de ataque a membrana

El complejo C3bBb es estabilizado por la unin de properdina. La conversin de C5b unido a complejo de ataque a membrana

ocurre por la misma secuencia de reacciones que en la va clsica (g. 7-5).

alterna. En la figura 7-7 se muestran de manera esquemtica los intermediarios en la va alterna para generar C5b. En la va clsica, C3 se escinde con rapidez en C3a y C3b por la actividad enzimtica de la convertasa de C3. En la va alterna, el C3 srico, que contiene un enlace tioster inestable, sufre hidrlisis espontnea lenta para producir C3a y C3b. El componente C3b puede unirse a antgenos de superficie extraos (como los de las clulas bacterianas o partculas vricas) o incluso a clulas del hospedador (fig. 7-6c). Las membranas de la mayora de

las clulas de mamfero tienen concentraciones altas de cido silico, que contribuye a la desactivacin rpida de molculas C3b unidas en clulas del hospedador; en consecuencia, esta unin rara vez precipita reacciones adicionales en las membranas de la clula hospedadora. Debido a que muchas superficies antignicas extraas (p. ej., paredes celulares bacterianas y de levadura y ciertas envolturas vricas) slo tienen concentraciones bajas de cido silico, el C3b que se une a estas superficies permanece activo ms tiempo. El C3b que se encuentra en la superficie de las

SISTEMA DEL COMPLEMENTO

C A P T UL O

175

clulas extraas puede unir otra protena srica llamada factor B para formar un complejo estabilizado por Mg2 . La unin a C3b expone un sitio en el factor B que sirve como sustrato para una protena srica con actividad enzimtica llamada factor D. Este ltimo escinde el factor B unido a C3b, con lo que se libera un fragmento pequeo (Ba) que se difunde y se genera C3bBb. Este complejo C3bBb posee actividad de convertasa de C3 y, por consiguiente, es anlogo del complejo C4b2a en la va clsica. La actividad de convertasa de C3 del C3bBb tiene vida media limitada, a menos que se una a l la protena srica properdina. El C3bBb que se genera en la va alterna puede activar C3 no hidrolizado para liberar ms C3b de modo autocataltico. Como resultado, se repiten y amplifican las etapas iniciales de manera que pueden depositarse ms de 2 106 molculas de C3b en una superficie antignica en menos de cinco minutos. La actividad de convertasa de C3 del C3bBb genera el complejo C3bBb3b, que muestra actividad de convertasa de C5 y es anlogo al complejo C4b2a3b en la va clsica. El componente C3b no enzimtico se une a C5, y el componente Bb hidroliza de manera subsecuente el C5 unido para generar C5a y C5b (fig. 7-7); este ltimo se une a la superficie antignica, lo que da comienzo a la fase final del ciclo ltico.

senta un mecanismo innato de defensa importante comparable a la va alterna, pero que utiliza los elementos de la va clsica, excepto las protenas C1.

Las tres vas del complemento convergen en el complejo de ataque a membrana

La secuencia terminal de activacin del complemento incluye C5b, C6, C7, C8 y C9, que interactan de manera secuencial para formar una estructura macromolecular denominada complejo de ataque a membrana (MAC, del ingls membrane-attack complex). Este complejo forma un conducto grande a travs de la membrana de la clula blanco, que permite la libre difusin de iones y molculas pequeas a travs de la membrana. El resultado final de la activacin de las vas clsica, alterna o de lectina es la produccin de una convertasa de C5 activa. Esta enzima escinde C5, que contiene dos cadenas protenicas, y . Despus de la unin de C5 al componente C3b no enzimtico de la convertasa, el extremo amino terminal de la cadena se escinde. Esto crea el fragmento pequeo C5a, que se difunde, y el fragmento C5b grande, que se une a la superficie de la clula blanco y proporciona un sitio de unin para los componentes subsecuentes del complejo de ataque a membrana (fig. 7-5, paso 5). El componente C5b es en extremo lbil y se desactiva con rapidez a menos que se una a C6 y se estabilice su actividad. Hasta este punto, todas las reacciones del complemento se llevan a cabo en la superficie hidrfila de membranas o en inmunocomplejos en la fase lquida. A medida que se une C5b6 a C7, el complejo resultante experimenta una transicin estructural que expone regiones hidrfobas, que sirven como sitios de unin para fosfolpidos de membrana. Si la reaccin ocurre en

La va de lectina se inicia con la unin de protenas del hospedador a supercies microbianas

Las lectinas son protenas que reconocen como blancos carbohidratos especficos y se unen a ellos. Puesto que la lectina que activa el complemento se une a residuos manosa, algunos autores llaman a esta va la va de MBL o va de lectina de unin a manano. Al igual que en el caso de la va alterna, la activacin de la va de lectina no depende de anticuerpos. Sin embargo, el mecanismo es ms similar al de la va clsica que al de la va alterna, porque despus de iniciarse prosigue a travs de la accin de C4 y C2 para producir protenas activadas del sistema del complemento (fig. 7-2). La va de lectina se activa cuando la lectina de unin a manosa (MBL, del ingls mannose-binding lectin) se une a residuos manosa en glucoprotenas o carbohidratos sobre la superficie de microorganismos, incluidas ciertas cepas de Salmonella, Listeria y Neisseria, adems de los hongos Cryptococcus neoformans y Candida albicans y algunos virus, como VIH-1 y virus sincicial respiratorio. Las clulas humanas normalmente tienen residuos de cido silico que cubren los grupos azcar reconocidos por MBL, y no son blancos para la unin. La MBL, miembro de la familia de las colectinas, es una protena de fase aguda y su concentracin aumenta durante las reacciones inflamatorias. Su funcin en la va del complemento es similar a la del Clq, al que se asemeja en estructura (fig. 7-3). Despus de que la MBL se une a los residuos carbohidrato en la superficie de una clula o patgeno, a ella se fijan las proteasas de serina relacionadas con MBL, MASP-1 y MASP-2. El complejo activo formado por esta vinculacin causa escisin y activacin de C4 y C2. Las protenas MASP-1 y MASP-2 tienen similitudes estructurales con C1r y C1s e imitan sus actividades. Este modo de activar los componentes C2 a C4 para formar una convertasa de C5 sin necesidad de unin de anticuerpo especfico repre-

a)

b)

FIGURA 7-8 a) Micrografa del complejo poli-C9 formado por

la polimerizacin de C9 in vitro. b) Micrografa de lesiones inducidas por complemento en la membrana de un glbulo rojo. Estas lesiones resultan de la formacin de complejos de ataque a membrana. [Parte a de E. R. Podack, 1986, en Immunobiology of the Complement System, G. Ross, ed., Academic Press, Orlando; parte b de J. Humphrey y R. Dourmashkin, 1969, Advances in Immunology 11:75.]

176

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

la membrana de una clula blanco, los sitios de unin hidrfobos permiten que el complejo C5b67 se inserte dentro de la bicapa fosfolpida. Sin embargo, si la reaccin tiene lugar en un inmunocomplejo u otra superficie de activacin no celular, entonces los sitios de unin hidrfobos no pueden fijar (anclar) el complejo y ste se libera. Los complejos C5b67 liberados pueden insertarse en la membrana de clulas cercanas y mediar la lisis de espectadores inocentes. En condiciones normales, las protenas reguladoras impiden que esto suceda, pero en ciertas enfermedades el dao celular y tisular puede ser efecto de dicha lisis. En el enfoque clnico se explica un trastorno hemoltico que resulta de una deficiencia en una protena reguladora, y en el captulo 15 se considera un proceso autoinmunitario en el cual inmunocomplejos median el dao tisular. La unin de C8 a C5b67 unido a la membrana induce un cambio de conformacin de C8, de tal manera que sufre una transicin estructural que expone una regin hidrfoba; sta interacta

con la membrana plasmtica. El complejo C5b678 crea un poro pequeo de 10 de dimetro; la formacin de este poro puede conducir a lisis de glbulos rojos pero no de clulas nucleadas. La etapa final en la formacin del MAC es la unin y polimerizacin de C9, una molcula parecida a perforina, al complejo C5b678. Pueden unirse y polimerizarse hasta 10 a 17 molculas de C9 por accin de un solo complejo C5b678. Durante la polimerizacin, las molculas C9 experimentan una transicin, de tal forma que tambin pueden insertarse en la membrana. El MAC terminado, que tiene forma tubular y tamao de poro funcional de 70 a 100 , consiste en un complejo C5b678 rodeado por un complejo poli-C9 (fig. 7-8). Debido a que los iones y las molculas pequeas pueden difundirse con libertad a travs del conducto central del MAC, la clula no puede conservar su estabilidad osmtica y es destruida por la entrada de agua y la prdida de electrlitos. La cascada de sucesos para las tres vas de activacin del complemento se resumen en la figura 7-9.

Va clsica C4 + C2

La lectina de unin a manosa (MBL) se une a una superficie extraa

Va de lectina

Proteasas relacionadas con MBL (MASP1 + 2) se unen a MBL y generan complejo tipo C1 activado

C1 se une a complejo antgeno-anticuerpo

C1 activado Convertasa de C5 Convertasa de C3 C4b2a C4b2a3b

C3

Paso mayor de amplificacin

C3b

C5

C5b

C6 Convertasa de C3 C3bBb C3bBbC3b Convertasa de C5 Factor D Va alterna C3bB Complejo de ataque a membrana C7 C8 C9

Factor B C3b Espontnea, lenta, en pequeas cantidades C3

FIGURA 7-9 Resumen de las tres vas de activacin del complemento. Se muestra el inicio ya sea por la va clsica, a partir de la unin de C1 a un complejo antgeno-anticuerpo, o por las vas alterna o de lectina, que son independientes de

anticuerpo. Todas las vas convierten C3 en su forma activa, C3b, que participa en la formacin de una convertasa de C5. Con la formacin de C5b, las tres vas convergen para generar el complejo de ataque a membrana.

SISTEMA DEL COMPLEMENTO

C A P T UL O

177

Regulacin del sistema del complemento

Debido a que muchos elementos del sistema del complemento son capaces de atacar tanto clulas del hospedador como clulas extraas y microorganismos, varios mecanismos reguladores complejos han surgido por evolucin para restringir la actividad del complemento a los blancos designados. Un mecanismo pasivo de regulacin en todas las vas del complemento es la inclusin de componentes muy lbiles que sufren desactivacin espontnea si no son estabilizados por una reaccin con otros componentes. Por ejemplo, la actividad de convertasa de CD3 generada en la va alterna tiene vida media activa de slo 5 min a menos que dicha enzima sea estabilizada por reaccin con properdina. La regulacin activa de la actividad del complemento corre a cargo de una serie de protenas reguladoras que desactivan diversos componentes del complemento (cuadro 7-2). As, la glucoprotena denominada inhibidor de C1 (C1Inh) puede formar un complejo con C1r2s2, con lo cual determina que se disocie de C1q y previene la activacin adicional de C4 o C2 (fig. 7-10a).

La reaccin catalizada por enzimas convertasas C3 de las vas clsica, de lectina y alterna es el paso principal de amplificacin en la activacin del complemento, que genera cientos de molculas de C3b. El C3b generado por estas enzimas tiene el potencial de unirse a clulas cercanas y mediar el dao a las clulas sanas por la induccin del complejo de ataque a membrana. El dao a clulas normales del hospedador se minimiza porque C3b sufre hidrlisis espontnea para el momento en que se ha difundido a una distancia de 40 nm respecto de las enzimas convertasas C4b2a o C3bBb, de tal modo que ya no puede unirse ms a su sitio blanco. La posible destruccin de clulas sanas del hospedador por C3b es limitada adicionalmente por una familia de protenas relacionadas que regulan la actividad de convertasa de C3 en las vas clsica y alterna. Todas estas protenas reguladoras contienen secuencias (motivos) repetitivas de aminocidos de unos 60 residuos, llamadas repeticiones de consenso cortas (SCR, del ingls short consensus repeats). En el ser humano, todas estas protenas se codifican en un mismo sitio en el cromosoma 1, que se conoce como grupo gnico de reguladores de la activacin del complemento (RCA, del ingls regulators of complement activation).

CUADRO 7-2
Protena

Protenas que regulan el sistema del complemento

Tipo de protena Soluble Soluble Soluble Va afectada Clsica Clsica y de lectina Alterna Clsica, alterna y de lectina Funcin inmunitaria Inhibidor de proteasa de serina: causa la disociacin de C1r2s2 a partir de C1q Bloquea la formacin de convertasa de C3 por unin de C4b; cofactor para la escisin de C4b por factor I Bloquea la formacin de convertasa de C3 por unin de C3b; cofactor para la escisin de C3b por factor I Bloquea la formacin de convertasa de C3 por unin de C4b o C3b; cofactor para la escisin de C4b o C3b catalizada por factor I Acelera la disociacin de C4b2a y C3bBb (convertasas de C3 clsica y alterna) Proteasa de serina: escinde C4b o C3b mediante C4bBP, CR1, factor H, DAE o MCP como cofactor Se une a C5b67 soluble y evita su insercin en la membrana celular Se une a C5b678 en clulas autlogas, bloquea la unin de C9

Inhibidor de C1 (C1Inh) Protena de unin a C4b (C4bBP)* Factor H* Receptor de complemento tipo 1 (CR1 o CD35)* Protena cofactor de membrana (MCP o CD46)* Factor acelerador de la degradacin (DAF o CD55)* Factor I Protena S Factor de restriccin homlogo (HRF), tambin llamado inhibidor de membrana de lisis reactiva (MIRL o CD59)* Desactivador de analatoxina

Unida a membrana

Unida a membrana Soluble Soluble

Clsica, alterna y de lectina Clsica, alterna y de lectina Terminal Terminal

Unida a membrana

Soluble

Efectora

Inhibe la actividad de analatoxina de C3a, C4a y C5a por eliminacin de arginina de extremo C terminal catalizada por carboxipeptidasa N

*Una protena RCA (regulador de la activacin del complemento). En el ser humano, todas las protenas RCA se codican en el cromosoma 1 y contienen repeticiones de consenso cortas.

178

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

FIGURA 7-10 PARA VISUALIZACIN DE CONCEPTOS:

Regulacin del sistema del complemento por protenas reguladoras

C1r2s2

Regulacin del sistema del complemento a) Antes del ensamblaje de la actividad de convertasa 1 El inhibidor C1 (C1Inh) se une a C1r2s2 y causa la disociacin de C1q.

C1qr2s2

C1Inh

Anticuerpo C4bBP, CR1 o MCP 2 La asociacin de C4b y C2a es bloqueada por la unin de protena de unin a C4b (C4bBP), receptor de complemento tipo I o protena cofactor de membrana (MCP). C4b unida a inhibidor escindido por factor I. factor I C2a C4b + C4d C4c

Convertasa de C3 CR1, MCP, factor H

En la va alterna, CR1, MCP o factor H impiden la unin de C3b y factor B. C3b unida a inhibidor escindido por factor I.

factor I factor B C3b

C3f + iC3b factor I

Convertasa de C3

C3c

C3dg

b) Despus del ensamblaje de la convertasa Las convertasas de C3 se disocian por accin de C4bBP, CR1, factor H y factor acelerador de la degradacin (DAF).

C4bBP, CR1, factor H, DAF

Disociacin de convertasa; C4b o C3b restantes escindidas por factor I

c) Regulacin en el ensamblaje del complejo de ataque a membrana (MAC) 1 No puede atacar clulas cercanas La protena S impide la insercin del componente C5b67 del MAC en la membrana. Protena S C5b67 HRF, MIRL C9 C8 C5b67 C5b678 Poli-C9 Complejo de ataque a membrana C5b678

El factor de restriccin homlogo (HRF) y el inhibidor de membrana de lisis reactiva (MIRL o CD59) unen C5b678 y evitan el ensamblaje de poli-C9 y bloquean la formacin de MAC.

Estas protenas (en negro) actan en diversos puntos de la cascada del complemento.

SISTEMA DEL COMPLEMENTO

C A P T UL O

179

En las vas clsica y de lectina actan de manera similar tres protenas RCA, distintas desde el punto de vista estructural, para prevenir el ensamblaje de convertasa de C3 (fig. 7-10a[2]). Estas protenas reguladoras incluyen la protena de unin de C4b soluble (C4bBP) y dos protenas de unin a membrana, a saber receptor de complemento tipo 1 (CR1) y protena cofactor de membrana (MCP). Cada una de estas protenas reguladoras se une a C4b y evita su vinculacin con C2a. Una vez que C4bBP, CRI o MCP se unen a C4b, otra protena reguladora, factor I, escinde C4b en C4d unida y C4c soluble (fig. 7-10a[3]). Una secuencia reguladora similar previene el ensamblaje de C3bBb (una convertasa de C3) en la va alterna. En este caso, CR1, MCP o un componente regulador denominado factor H se unen a C3b y previenen su enlace a factor B (fig. 7-10a[4]). Una vez que CRI, MCP o factor H se unen a C3b, el factor I escinde C3b en un fragmento iC3b unido y un fragmento C3f soluble. La escisin adicional de iC3b por el factor I libera C3c y deja a C3dg unido a la membrana (fig. 7-10a[5]). En la figura 7-11 se muestran los fenmenos moleculares que participan en la regulacin de C4b y C3b unidos a la clula. Varias protenas RCA tambin actan sobre la convertasa de C3 ensamblada y dan lugar a su disociacin; incluyen C4bBP (mencionada con anterioridad), CR1 y factor H. Adems, el factor acelerador de la degradacin (DAF o CD55), que es una glucoprotena fijada de manera covalente a una protena de membrana glucofosfolipdica, tiene la capacidad de disociar la convertasa de C3. En el enfoque clnico se describen las consea) Membrana celular NH S S S S O C SH O C4bBP, CR1 o MCP Factor I

cuencias de la deficiencia de DAF. Cada una de estas protenas RCA acelera la degradacin (disociacin) de la convertasa de C3 al liberar el componente con actividad enzimtica (C2a o Bb) del componente unido a la clula (C4b o C3b). Una vez que ocurre la disociacin de la convertasa de C3, el factor I escinde el componente C4b o C3b unido a membrana restante, lo que desactiva de manera irreversible a la convertasa (fig. 7-10b). Las protenas reguladoras tambin operan a nivel del complejo de ataque a membrana. La posible liberacin del complejo C5b67 implica una amenaza de lisis de espectador inocente para clulas sanas. Varias protenas sricas contrarrestan esta amenaza al unirse al C5b67 liberado e impedir su insercin en la membrana de clulas cercanas. Una protena srica llamada protena S puede unirse a C5b67 e inducir una transicin, con lo que impide la insercin de C5b67 en la membrana de clulas cercanas (fig. 7-10c[1]). La lisis de clulas mediada por complemento es ms eficaz si el complemento proviene de una especie diferente a la de las clulas que se lisan. Este fenmeno depende de una protena de membrana que bloquea la formacin del complejo de ataque a membrana (MAC). Esta protena, que se encuentra en la membrana de muchos tipos de clulas, se denomina factor de restriccin homlogo (HRF, del ingls homologous restriction factor) o inhibidor de membrana de lisis reactiva (MIRL, del ingls membrane inhibitor of reactive lysis o CD59). Protege a las clulas de la lisis inespecfica mediada por complemento al unirse a C8, con lo que impide el ensamblaje de poli-C9 y su insercin en la membrana plasmtica (fig. 7-10c[2]). Sin embargo, esta inhibicin

NH S S S S S S S S C4c SH S S S S C3c C S S S S S S

S S

S S

S S

C4b unido b) Membrana celular R O O C SH Factor H, CR1 o MCP Factor I O R O C SH C3f

C4c

R O O C

S S

S S

S S

S S

C3b unido

iC3b?

S S

Factor I

S S C3dg C3c

C4d

FIGURA 7-11 Desactivacin de C4b y C3b (unidos) por protenas reguladoras del sistema del complemento. a) En la va clsica, C4bBP (protena de unin de C4b), CR1 (receptor de complemento tipo 1) o MCP (protena cofactor de membrana) se unen a C4b y actan como cofactores para la escisin de C4b mediada por

factor I. b) En la va alterna, factor H, CR1 o MCP se unen a C3b y actan como cofactores para la escisin de C3b mediada por factor I. Los fragmentos difusibles libres se muestran con sombreado oscuro y los componentes unidos a membrana con sombreado claro.

180

PART E I I

RESPUESTAS DE LAS CLULAS B Y T

slo ocurre si los componentes del complemento provienen de la misma especie que las clulas blanco. Por ello, se dice que CD59 exhibe restriccin homloga, de ah su nombre original.

Consecuencias biolgicas de la activacin del complemento

El complemento sirve como un mediador importante de la reaccin humoral porque amplifica la respuesta y la convierte en un mecanismo de defensa eficaz para destruir microorganismos invasores. El MAC media la lisis celular, en tanto que otros componentes del complemento o productos de escisin participan en la reaccin inflamatoria, la opsonizacin de antgeno, la neutralizacin vrica y la depuracin de inmunocomplejos (cuadro 7-3). Muchas de las actividades biolgicas del sistema del complemento dependen de la unin de fragmentos del complemento a receptores de l, que diversas clulas expresan. Adems, algunos receptores de complemento tienen una funcin importante en la regulacin de la actividad del complemento por la unin de componentes del complemento con actividad biolgica. En el cuadro 7-4 se relacionan los receptores de complemento y sus ligandos primarios, que incluyen varios componentes del complemento y sus productos de degradacin proteoltica.

El complejo de ataque a membrana puede lisar una amplia gama de clulas

El complejo de ataque a membrana formado por la activacin del complemento puede lisar bacterias gramnegativas, parsitos, virus, eritrocitos y clulas nucleadas. Puesto que las vas de acti-

vacin alterna y de lectina suelen actuar sin ninguna interaccin inicial de antgeno y anticuerpo, estas vas sirven como defensas inmunitarias innatas importantes contra microorganismos infecciosos. La necesidad de una reaccin inicial de antgeno y anticuerpo en la va clsica completa estas defensas innatas inespecficas con un mecanismo de defensa ms especfico. En algunos casos, la necesidad de anticuerpo en el fenmeno activador es satisfecha por los llamados anticuerpos naturales, que se secretan contra componentes comunes de microorganismos ampliamente difundidos. Ya se resalt en captulos anteriores la importancia de la inmunidad mediada por clulas en la defensa de hospedador contra infecciones vricas. No obstante, el anticuerpo y el complemento tienen un papel en la defensa de hospedador contra virus y, con frecuencia, son cruciales para contener la diseminacin vrica durante una infeccin aguda y para proteger contra una nueva infeccin. La mayor parte de los virus envueltos o quiz todos son susceptibles a la lisis mediada por complemento. La envoltura vrica deriva en buena proporcin de la membrana plasmtica de clulas del hospedador infectado y, por consiguiente, es susceptible a la formacin de poro por el complejo de ataque a membrana. Entre los virus patgenos susceptibles de lisis mediada por complemento se encuentran virus del herpes, ortomixovirus, como los que causan sarampin y paperas, paramixovirus como el de la gripe, y retrovirus. Por lo general, el sistema del complemento es muy eficaz para lisar bacterias gramnegativas (fig. 7-12). Sin embargo, algunas de estas ltimas y la mayor parte de las bacterias grampositivas tienen mecanismos para evitar el dao mediado por complemento (cuadro 7-5). Por ejemplo, algunas bacterias gramnegativas pueden desarrollar resistencia a lisis mediada por complemento que se correlaciona con la virulencia del microorganismo. En Escherichia coli y Salmonella, la resistencia al

CUADRO 7-3
Efecto Lisis celular

Resumen de los efectos biolgicos mediados por productos del complemento

Producto del complemento mediador* C5b-9, el complejo de ataque a membrana (MAC) C3a, C4a y C5a (analatoxinas) C3a, C5a C3a, C5a, C5b67 C3a, C5a Bb C3c C5a C5a C3b, C4b, iC3b C3b, C5b-9 (MAC) C3b

Reaccin inamatoria Desgranulacin de clulas cebadas y baslos Desgranulacin de eosinlos Extravasacin y quimiotaxis de leucocitos en el sitio inamatorio Agregacin de plaquetas Inhibicin de la migracin de monocitos/macrfagos e induccin de su diseminacin Liberacin de neutrlos de la mdula sea Liberacin de enzimas hidrolticas de neutrlos Incremento de la expresin de receptores del complemento tipos 1 y 3 (CR1 y CR3) en neutrlos Opsonizacin de antgenos particulados, lo que incrementa su fagocitosis Neutralizacin vrica Solubilizacin y depuracin de inmunocomplejos
*El componente en negritas es el ms importante en la medicin del efecto indicado.

La desgranulacin origina liberacin de histamina y otros mediadores que inducen contraccin del msculo liso e incremento de la permeabilidad vascular.

SISTEMA DEL COMPLEMENTO

C A P T UL O

181

CUADRO 7-4
Receptor CR1 (CD35)

Receptores de unin del complemento

Ligandos principales C3b, C4b Actividad Bloquea la formacin de convertasa de C3; une inmunocomplejos a clulas Parte del correceptor de clula B; une virus de Epstein-Barr Une molculas de adhesin celular en neutrlos, facilita su extravasacin; se une a inmunocomplejos e incrementa su fagocitosis Induce la desgranulacin de