Preparacin, Esterilizacin y Prueba de Esterilidad para Agar Mueller Hinton Mndez, Helena Palacios, Hasleidy Universidad de Boyac Facultad

ad Ciencias de la Salud Bacteriologa y Laboratorio Clnico RESUMEN En condiciones de laboratorio se realiz la preparacin de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparacin dadas por la casa comercial. Basados en esta informacin se realizaron los clculos adecuados para la preparacin de 20ml de Agar Mueller Hinton, que serian distribuidos en dos cajas de petri pequeas. Inicialmente se pesaron 1.86 gr. del agar (en polvo) incluido el peso del papel, necesarios para la preparacin del medio de cultivo. Seguidamente se diluyo la cantidad del medio de cultivo en un vaso de precipitado que contena 20 ml de agua destilada, y se calent a 250C hasta que hirviera; una vez obtenida la preparacin, se llevo a esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C. Luego se procedi a distribuir en las dos cajas de petri el medio de cultivo (aproximadamente 10 ml en cada una) utilizando la cmara de flujo laminar, para evitar la contaminacin de este. Finalmente se realizo la prueba de esterilidad, incubando los medios de cultivos preparados durante 24 horas con una temperatura de 37C. Las observaciones posteriores al periodo de tiempo requerido para la incubacin del medio de cultivo, arrojaron resultados negativos para el crecimiento de colonias, indicando que el mtodo de esterilizacin empleado es efectivo, y que el medio de cultivo puede ser utilizado para el aislamiento de diferentes microorganismos. PALABRAS CLAVE: Agar Mueller Hinton, esterilizacin, medios de cultivo, prueba de esterilidad. INTRODUCCIN Fue en 1876 cuando Koch fue capaz de propagar una bacteria patgena (Bacillus anthracis) en cultivo puro, fuera del cuerpo que la portaba; en 1881, utilizando un medio liquido, lo solidifico con gelatina y desarrollo los mtodos de rayado y siembra en placa para aislamiento de bacterias. El siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, al utilizar como agente solidificante un producto denominado agar, extrado de las algas rojas. El agar era muy superior a la gelatina, ya que era resistente a la digestin microbiana y a la licuefaccin. Se enriqueci la composicin de los cultivos solidificados utilizando extractos de carne e infusiones, a fin de equipararlos con el tejido infectado portador (1). Para el aislamiento, estudio y clasificacin de los microorganismos, es necesario utilizar un medio de cultivo en el que se dispongan de las sustancias orgnicas e inorgnicas necesarias e indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los microorganismos adems de poder multiplicarse, pueden manifestar caractersticas de crecimiento y propiedades bioqumicas, aspectos de gran importancia para su clasificacin. (2). Estos preparado, poseen

caractersticas especificas por ejemplo: contener sustancias nutritivas como protenas, azucares, minerales y vitaminas; tener un pH adecuado; estar protegidos de posibles contaminaciones; y estar esterilizados. (2). Ventajas al Utilizar los Medios de Cultivo. permite el aislamiento de un microorganismo a partir de un sustrato natural (suelo, agua, plantas, aire, excrementos, pus, etc.). permite la identificacin del microorganismo, segn las caractersticas de crecimiento, morfologa celular, propiedades tintoriales y reacciones bioqumicas. Conservacin durante meses y aos de las cepas identificadas. Obtencin de clulas de microorganismos patgenos o de sus toxinas para la elaboracin de productos biolgicos (vacunas, antitoxinas, etc.) (2). El tipo de medio que utiliza un microbilogo depende del microorganismo que esta cultivando y el porque de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mnimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rpida (3). Clasificacin Cultivo de los Medios de

menor que en los medios de cultivo slidos. - lquidos: no contiene ningn agente solidificante Segn se Composicin: - empricos: en su composicin aparecen sustancias orgnicas. - sintticos: en su composicin aparecen sustancias qumicas definidas. - semisintticos: en su composicin aparecen molculas naturales hidrolizadas. Segn el uso a que se destinen: - medios enriquecidos: suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores, tales como la sangre de carnero. Son medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes. - Medios diferenciales: contienen colorantes, azucares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioqumica conocida, generalmente el color. - Medios selectivos: adems de contar en su composicin con los mismos productos que los medios diferenciales, presentan una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompaante de la muestra a estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismo que se busca. - Medios de uso general: son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos, sin exigencias nutritivas especiales (1). Preparacin del Agar Mueller Hinton 1. se disuelven 38g en un litro de agua destilada, calentndolo y agitndolo al mismo tiempo, hasta su completa disolucin. El matraz se cierra con doble capa de papel aluminio.

Segn se Estado Fsico: - Slidos: presentan en su composicin una agente solidificante, el agar, en una proporcin de 12 a 15 gramos por litro. - semislidos: presentan agar en su composicin pero en una proporcin

2. se esteriliza en autoclave, a 121C durante 15 minutos. 3. se dosifica en placa de petri a un volumen de 20ml (1).

RESULTADOS Clculos Necesarios para Preparar la Cantidad de Medio de Cultivo Deseado Se deben preparar dos cajas de petri pequeas con agar Mueller Hinton.

MATERIALES Y MTODOS Para la preparacin del medio de cultivo se utilizo el agar Mueller Hinton y se tomaron en cuenta las especificaciones de preparacin dadas por la casa comercial. Inicialmente se realizo el clculo de la cantidad de agar necesario para la preparacin del medio de cultivo, o sea se tomo 1.86gr de agar (incluido el peso del papel: 1.1gr), el cual se adicion en una vaso de precipitado que contena 20ml de agua destilada que se uso como diluyente del agar. Seguidamente se calent a 250C hasta que iniciara a hervir. Despus de obtenida la solucin de agar, se realizo proceso de esterilizacin con autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121C. Finalizado este proceso se procedi a dispensar el medio, realizando inicialmente limpieza con alcohol alrededor del vaso de precipitado para evitar contaminacin del medio de cultivo, luego se adiciono en dos cajas de petri pequeas aproximadamente 10ml de la preparacin, esto en condiciones estriles en cmara de flujo laminar, a la cual se le realizo limpieza previa con alcohol al 70% y se puso a funcionar el aire estril de la cmara durante 30 minutos. Una vez dispensado el medio de cultivo en las cajas de petri, estas se sellaron con cinta de enmascarar y se colocaron a incubar a 37C durante 24 horas para verificacin de prueba de esterilidad. Despus de realizado el proceso de esterilizacin en el autoclave se observo en el vaso de precipitado la formacin del agar con textura semilquida y de color amarillo muy claro, como se observa en la figura #1.

20ml para cajas grandes 15ml para cajas medianas 10ml para cajas pequeas

ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS Como se menciono anteriormente, se utilizo agar Mueller Hinton de la casa comercial OXOID, (cdigo CM 337) para la preparacin del medio de cultivo. El agar Mueller Hinton se utiliza en la comprobacin de la susceptibilidad de microorganismos a antibiticos. Es un medio simple, transparente y sin materiales termolabiles (1) como se observa en la figura #1. Dentro de su composicin en un litro encontramos: - Infusin de carne . ...2g - cidos de casamino.......17.5g - Almidn......... 1.5g - Agar ... 17g Estando con pH de 7.3 y una T entre 0.1 a 25C. El almidn contribuye al fomento en el crecimiento, as como la infusin de carne y los cidos de casamino, que sirven de nutrientes al medio (seleccionados estos para dar la mayor transparencia posible al medio). La tcnica de trabajo con este medio consiste en depositar, en la superficie, discos de papel impregnados de antibitico a probar, una vez sembrada la placa, para poder ver el halo que se forma alrededor del disco, y constatar as la inhibicin de los distintos discos en sus distintas concentraciones de antibitico (1) El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados, lo cual se observo durante la preparacin del medio de cultivo (2). La cantidad de agar encontrada en la composicin qumica (17g), indica que

Figura #1 agar Mueller Hinton despus de proceso de esterilizacin. Los resultados obtenidos en las cajas de petri luego de la prueba de esterilidad, permitieron observar que el medio de cultivo con agar Mueller Hinton continuaba de color amarillo claro, sin observarse crecimiento sobre la superficie de ninguna poblacin bacteriana, indicando ser un medio de cultivo viable para su uso. Figura #2.

Figura #2 agar Mueller Hinton despus de prueba de esterilidad.

corresponde a un medio de cultivo solid, y debido a componentes como la infusin de carne y los cidos de casamino, se observa de color amarillo claro. Figura #2. Referente a la esterilizacin del medio de cultivo, debe ponerse mucha atencin en el tiempo de esterilizacin, porque si el proceso no dura el tiempo preciso, el medio puede presentar problemas de esterilidad, y si excediera el tiempo preciso, el medio se sobrecalentara y afectara a las cualidades del medio y su pH (1). Las tcnicas de esterilizacin han de destruir todos los tipos de vida microbiana (4). El vapor a presin (autoclave) es el mtodo ms eficaz y practico para esterilizar con calor. La exposicin al vapor en un autoclave, a 15 libras de presin (121C) y durante 20 minutos, matara todas las formas de vida. El vapor a presin penetra mucho y es particularmente eficaz ya que se condensa sobre un objeto fri para liberar 596 cal por g (calor de condensacin). La condensacin permite que mas vapor entre en contacto con los objetos que se estn esterilizando (4). Antes de proceder a realizar un cultivo se microorganismos se debe considerar como evitar los contaminantes. Los microorganismos se encuentran en todas partes y, debido a su pequeo tamao, se dispersan fcilmente por el aire y las superficies. Por consiguiente se debe esterilizar el medio de cultivo inmediatamente despus de su preparacin para eliminar los microorganismos que lo contaminan, esto se hace normalmente por calor. Pero es tambin importante tomar las debidas precauciones durante el manejo posterior de un medio de

cultivo estril para lograr excluir de el todos los microorganismos (5). CONCLUSIONES Se aprendi y manejo la tcnica empleada para la preparacin de medios de cultivo. Se aplico la tcnica de esterilizacin de vapor a presin (autoclave), para medios de cultivo en agar y caldo nutritivo. Se conoci el mtodo de prueba de esterilidad para verificar viabilidad de los medios de cultivo. BIBLIOGRAFA 1. Delgado, A. Polanco, A. Amich, S. Prieto, S. Salve, M. Manual de laboratorio clnico bsico "Microbiologa". Espaa. Mc Graw Hill Interamericana. 2001. p 76, 77, 80, 91, 92. 2. Montealegre, J. Preparacin de Medios de Cultivo para Hongos y Bacterias. Laboratorio #3. [En linea]. Departamento de Sanidad Vegetal. Chile. Universidad de Chile. [citado 2002]. Disponible en INTERNET: <URL:http:agronomia.uchile.cl/web cursos/microbiologiagral/pagina% 20microbiologia1/Word/guia_lab07 _ (1).doc> 3. Ingraham, J. Ingraham, C. Prentiss, H. Introduccin a la Microbiologa. Volumen I. Espaa. Reverte SA. 1998. p 67,68. 4. Quentin, M. Russell, W. Bacteriologa y Micologa Mdicas. Segunda Edicin. Mxico. Interamericana Mc Graw Hill. 1991. p. 85, 87. 5. Madigan, M. Martinko, J. Parker, J. Brock Biologa de los Microorganismos. Octava edicin revisada. Madrid. Prentice Hall Iberia. 1999. p 15, 16.