Anda di halaman 1dari 33

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

All images in this document is removed due to copyright restriction

HISTOTEKNIK DASAR
Ahmad Aulia Jusuf Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia 2009

PENDAHULUAN
Histoteknik adalah metoda atau cara/proses untuk membuat sajian histologi dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk diamati atau dianalisa. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk

1. Bahan pengajaran dan praktikum mahasiswa, guna mempelajari bentuk dan struktur
jaringan tubuh tertentu yang normal.

2. Riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan percobaan yang
mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari pertumbuhan dan perkembangan jaringan atau organ tubuh tertentu.

3. Membantu menegakkan diagnosa penyakit yang diderita oleh seorang pasien


Untuk mencapai ketiga tujuan tersebut sajian histologi yang dibuat harus dapat memberikan gambaran tentang bentuk dan besar serta susunan sel; inti sel dan sitoplasma; badan inklusi (glikogen, tetesan lemak, pigmen dsbnya); susunan serat jaringan ikat; otot dan lain sebagainya sesuai dengan gambaran jaringan tubuh tersebut dalam kondisi hidup. Sajian yang baik dapat membantu mahasiswa memahami struktur histologi jaringan tubuh sesuai dengan kondisi yang sebenarnya pada waktu hidup. Sajian yang baik juga akan memberikan hasil yang benar-benar shahih (valid/akurat) yang sangat dibutuhkan oleh para peneliti untuk menjawab permasalahan yang timbul. Di samping itu sajian yang baik juga diperlukan oleh klinikus untuk menunjang diagnosa penyakit yang diderita oleh pasien. SUMBER JARINGAN ATAU ORGAN 1. Manusia Jaringan yang berasal dari manusia tentulah yang paling ideal karena struktur histologi yang harus dipelajari oleh mahasiswa adalah struktur histologi manusia. Jaringan tubuh ini dapat di ambil dari cadaver (jenazah) dengan syarat jaringan atau organ tersebut di

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

ambil kurang dari 3 jam setelah kematian, sebab bila lebih lama sudah terjadi pembusukan atau autolisis. Sayangnya syarat tersebut pada masa kini hampir mustahil dapat dipenuhi. Cara lain adalah mengambil jaringan atau organ tersebut dari kamar operasi. 2. Hewan Jaringan atau organ yang diambil dari hewan merupakan alternatif. Beberapa hewan yang sering dipakai adalah

a. Kera, paling menyerupai jaringan tubuh manusia karena sama-sama tergolong


mahluk primata b. Kambing, terutama untuk melihat serat Purkinje di jantung c. Babi untuk melihat lobulus klasik hepar dan arteri Hulsen pada limpa. d. Kucing dan anjing e. Tikus putih (mice) dan rat f. Kelinci Jaringan dapat diambil dari hewan yang difiksasi dalam keadaan hidup (fiksasi supra/ intravital) atau hewan yang telah mati (fiksasi emersi/rendam). Histoteknik ini dapat dilakukan oleh staf pengajar, peneliti atau teknisi laboratorium. Setiap staf pengajar bagian biomedik harus menguasai teknik pembuatan sajian histologi dengan baik, karena setiap staf pengajar bagian biomedik dituntut untuk dapat melakukan riset yang sering kali melibatkan teknik pembuatan sediaan histologi. Setiap peneliti sebaiknya membuat sajian histologi sendiri, karena dengan melakukannya sendiri setiap peneliti dapat mengetahui kesulitan-kesulitan yang terjadi sekaligus cara untuk mengatasinya. Disamping peneliti juga dapat mengamati hal-hal yang terjadi pada jaringan selama proses pembuatan sajian. Pembuatan sajian histologi yang bersifat massal dan banyak biasanya dilakukan oleh teknisi laboratorium tetapi harus dikontrol oleh staf pengajar sehingga kualitas sajian histologi yang dihasilkan akan dapat senantiasa dikontrol. Setelah jaringan atau organ tubuh yang akan dibuat sajian histologi diisolasi dari sumbernya, jaringan tubuh tersebut kemudian diproses hingga menjadi sajian histologi. Rangkaian proses pembuatan sajian histologi (Gb-1) terdiri atas 1. Fiksasi (Fixation) 2. Dehidrasi (Dehydration) 3. Pembeningan (Clearing) 4. Pembenaman (Impregnasi/Embedding) 5. Pengecoran (Blocking)

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

6. Pemotongan jaringan (Sectioning) 7. Pewarnaan (Staining) 8. Perekatan (Mounting) 9. Pelabelan (Labelling) Uraian selanjutnya akan membahas tahapan pembuatan sajian histologi ini secara lebih rinci.

Gambar-1 Rangkaian Proses dalam Histoteknik

ISOLASI (PENGAMBILAN ) JARINGAN TUBUH A. Persiapan


Sebelum jaringan tubuh diambil beberapa pesiapan perlu dilakukan yang terdiri atas 1. Persiapan alat dan bahan/cairan Perangkat peralatan yang harus dipersiapkan untuk melakukan isolasi atau pengambilan jaringan tubuh terdiri atas peralatan bedah minor (gunting, pinset, scalpel, klem, pemegang jaringan, kassa, dll), meja operasi, lampu, peralatan anestesi (disposible syringe, sungkup/masker anestesi) dan obat anestesi (eter, ketalar, phenobarbital dll) serta perangkat pengawetan jaringan (fiksasi jaringan) seperti wadah untuk fiksasi emersi, cairan fiksasi (Formol salin, Muller, Bouin, Zenker dll), peristaltik pump/syringe pump untuk fiksasi supravital dan lain-lain 2. Persiapan sampel Untuk jaringan yang diambil dari kadaver atau manusia, jaringan segera diambil dan dimasukkan kedalam caian fiksasi. Untuk sampel yang diambil dari hewan, maka hewan perlu dipersiapkan terlebih dahulu. Hewan yang dipilih haruslah sehat, galurnya harus baik dan jelas, mempunyai status gizi yang baik dan dipelihara sesuai dengan syarat-syarat pemeliharaan hewan coba. Hewan yang digunakan dipilih sesuai dengan tujuan penelitian dan pengajaran. Kera merupakan hewan yang mempunyai struktur tubuh yang mirip dengan manusia. Untuk mempelajari serat purkinje pada jantung dengan lebih jelas dapat digunakan jantung kambing, untuk mempelajari lobulus hati klasik degan lebih

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

baik digunakan hati babi, untuk mempelajari arteri Hulsen pada limpa lebih baik digunakan limpa yang berasal dari babi dan sebagainya. B. Pelaksanaan Untuk jaringan yang berasal dari kadaver dan dari jaringan operasi, jaringan yang telah diambil langsung dimasukkan kedalam wadah yang berisi cairan fiksasi. Sedangkan untuk jaringan yang berasal dari hewan tahapan pengambilan jaringan adalah sebagai berikut 1. Pembiusan Untuk membius hewan yang akan diambil jaringan tubuhnya dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu a. Pembiusan inhalasi dengan menggunakan eter dan sungkup muka b. Pembiusan dengan menyuntikkan zat anestesi seperti chloralhydrate, ketalar, phenobarbital, dan sebagainya. c. Campuran yaitu pembiusan inhalasi yang diikuti dengan pembiusan lewat suntikan 2. Pembedahan dan isolasi jaringan tubuh Setelah hewan terbius sempurna, proses selanjutnya adalah melakukan operasi dan pengambilan jaringan tubuh yang diinginkan. Jaringan tubuh lalu dipotongpotong didalam cairan fisiologis (NaCl 0.9%) untuk mendapatkan ukuran yang lebih kecil. Hal ini perlu dilakukan agar cairan fiksasi dapat masuk kedalam jaringan dengan mudah dan baik. Potongan jaringan kemudian dimasukkan kedalam wadah-wadah kecil yang telah diberikan label/keterangan. Wadah berisi cairan fiksasi dan jaringan kemudian disimpan ditempat yang sesuai hingga saat pemerosesan jaringan selanjutnya. 3. Fiksasi supravital/intra vital Khusus untuk jaringan tubuh yang difiksasi secara supravital atau intravital, segera setelah hewan terbius sempurna, hewan dibaringkan di atas meja operasi dan diikat agar posisinya stabil. Setelah itu dinding perut dibuka dengan sayatan pada garis tengah dilanjutkan ke samping kiri dan kanan pada sisi atas dan bawah. Diafragma lalu dibuka. Tulang iga dipotong pada costosterno junction. Tulang

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

sternum lalu ditarik ke atas dan difiksasi. Setelah tulang sternum diangkat ke atas akan terlihat jantung. Aurikula atrium kanan dan ventrikel kiri lalu diidentifikasi. Perikardium lalu dibuka. Dinding aurikula atrium kanan digunting dan darah dibiarkan mengalir. Setelah darah mengalir keluar, jarum yang disambung ke slang infus ditusukkan kedalam ventrikel kiri. Peristaltik pump lalu dinyalakan dan cairan infus akan mengalir masuk kedalam ventrikel kiri menggantikan darah yang hilang lewat atrium kanan. Cairan infus yang pertama mengalir adalah cairan NaCl 0.9% untuk membilas darah dari jaringan tubuh sehingga jaringan tubuh yang akan diambil bebas dari kontaminasi darah. Selanjutnya akan mengalir cairan fiksasi yang akan memfiksasi seluruh jaringan tubuh. Cairan fiksasi dibiarkan mengalir hingga seluruh jaringan terfiksasi sempurna yang ditandai oleh adanya leher dan ekor yang kaku. Selama cairan fiksasi mengalir akan terlihat kedutan pada seluruh otot. Setelah seluruh jaringan terfiksasi sempurna, sisa bekuan darah dibersihkan dari tubuh hewan dengan mencuci dengan air kran. Jaringan tubuh yang diinginkan kemudian diisolasi, dipotongpotong dan dimasukkan kedalam wadah yang berisi cairan fiksasi yang sama dengan cairan fiksasi yang diinfuskan. Wadah yang berisi cairan fiksasi dan jaringan kemudian dilabel dan disimpan hingga saat proses pengolahan jaringan selanjutnya.

FIKSASI (FIXATION)
Dasar dari pembuatan sajian histologi yang baik adalah melakukan fiksasi yang benar. Kesalahan yang dilakukan pada tahap fiksasi tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada tahapan selanjutnya. Jadi hasil akhir sajian histologi yang baik sangat tergantung pada cara melakukan fiksasi dengan baik. Tujuan dari fiksasi adalah untuk

1. Mengawetkan jaringan.
Fiksasi bertujuan untuk mempertahankan susunan jaringan agar mendekati kondisi seperti sewaktu hidup. 2. Mengeraskan jaringan

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

Fiksasi bertujuan untuk mengeraskan jaringan terutama jaringan lunak agar memudahkan pembuatan irisan tipis. Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah 1. Menghambat proses pembusukan dan autolisis Fiksasi akan menghambat terjadinya pembusukan yang disebabkan oleh kuman-kuman pembusuk yang berasal dari luar tubuh. Waktu pembusukan untuk setiap jaringan atau organ berbeda-beda tergantung kepada konsistensi dan kandungan unsur-unsur penyusun jaringan tersebut. Jaringan usus dan otak sangat rentan terhadap proses pembusukan dibandingkan jaringan tubuh lainnya. Pembusukan seringkali disertai oleh pembentukan gas yang berbau. Autolisis adalah proses perusakan jaringan tubuh yang disebabkan oleh ensim-ensim proteolitik yang terdapat pada jaringan tersebut. Proses proteolitik ini akan lebih cepat terjadi pada suhu tropik (24-36C). Proses proteolitik lebih mudah terjadi di Jakarta dibandingkan dengan negeri-negeri dingin. Untuk menghindari proses pembusukan dan autolisis, jaringan harus segera dimasukkan kedalam cairan fiksasi segera setelah kematian atau segera setelah diambil dari tubuh. Bila keadaan ini tidak memungkinkan jaringan dapat disimpan sementara di dalam ruangan dengan temperatur yang sangat dingin (Freezer). 2. Pengawetan Sel-sel dan jaringan diawetkan mendekati kondisinya seperti sewaktu hidup. 3. Pengerasan Efek pengerasan akan mempermudah penangan jaringan lunak, misalnya otak 4. Pemadatan koloid Fiksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair (Sol) menjadi lebih padat (Gel) 5. Differensiasi optik Fiksasi akan mengubah indeks refraksi berbagai unsur sel dan jaringan sehingga unsurunsur yang belum diwarnai dapat dilihat dengan lebih mudah dibandingkan dengan jaringan yang belum difiksasi. 6. Pengaruh terhadap pewarnaan Sebagian besar cairan fiksasi yang ada mempengaruhi reaksi histokimia karena mengikat bagian reaktif jaringan. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan jaringan histologis adalah:

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

1. Tebal irisan jaringan 3-5mm sehingga cairan fiksasi dapat dengan cepat medmfiksasi
seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu tebal maka permukaan luarnya saja yang difiksasi dengan cukup baik, sedangkan bagian tengah jaringan sudah keburu membusuk sebelum cairan fiksasi sempat merembes ke sana.

2. Volume cairan fiksasi sekurang-kurangnya harus 15-20x volume jaringan yang akan
difiksasi. Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi yang diperlukan sedangkan tebal jaringan menentukan kecepatan fiksasi. Panjang dan lebar jaringan umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang akan digunakan.

3.

Jenis cairan fiksasi yang akan digunakan bergantung kepada unsur jaringan yang akan didemonstrasikan dan kepada jenis pewarnaan yang akan digunakan. Untuk keperluan praktis cairan fiksasi dapat dibedakan menjadi 3 kelompok yaitu A. Micro-anatomical fixation Fiksasi ini digunakan apabila struktur histologis jaringan hendak dipertahankan dengan hubungan yang benar antara lapisan jaringan dan kelompok sel. Cairan fiksasi yang tergolong kelompok ini adalah cairan formalin atau modifikasinya, cairan acetic alkohol formalin, cairan Heidenhain Susa, cairan Zenker, cairan Bouin B. Cytological fixatives Fiksasi ini digunakan apabila struktur intraselular atau badan inklusi hendak dipertahankan dan di ekspresikan. Untuk mencapai tujuan ini sering di capai dengan mengurbankan penetrasi cairan yang merata, kemudahan pemotongan dengan mikrotom dan hilangnya struktur sel lainnya. Fiksasi ini dapat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu fiksasi inti (nuklear) dan fiksasi sitoplasma. Cairan fiksasi yang tergolong dalam kelompok ini adalah fiksasi inti (larutan Carnov) dan fiksasi sitoplasma (larutan Muller, formol saline, formol calcium, Zenker formol). C. Histochemical fixatives Fiksasi ini digunakan apabila jaringan hendak diwarnai dengan pewarnaan histokimia sedapatnya Cairan fiksasi yang digunakan tidak boleh mengubah atau mengubah seminim mungkin unsur-unsur yang akan

didemonstrasikan. Fiksasi histokimia yang baik harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut: 1. Mengawetkan unsur yang akan didemonstrasikan

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

8
atau mengawetkan unsur jaringan khusus, tanpa

2. Mengikat

mempengaruhi gugus reaktif yang digunakan pada visualisasi.

3. Tidak mempengaruhi reagen yang digunakan pada proses visualisasi,


misalnya fiksatif glutaraldehida memfiksasi protein jaringan sedemikian rupa dengan suatu coating terdiri atas gugus aldehida reaktif sehingga menghasilkan reaksi PAS atau Schiff positif.

A. LARUTAN FORMALIN
Larutan formalin merupakan cairan fiksasi yang paling umum digunakan. Laurtan formalin yang digunakan adalah formalin 10%. Formula yang digunakan adalah Formalin (40% Formaldehida) ........................................................ 10 ml Air .................................................................................................. 90 ml Formaldehida 40% adalah gas yang larut dalam air dengan volume 40% dari total berat larutan. Larutan jenuh ini secara komersial diperdagangkan sebagai Formalin atau 40% Formaldehida. Telah disepakati bahwa yang dimaksud dengan formaldehida 40% = larutan jenuh gas formaldehida. Formalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari formaldehida. Bentuk ini tak dapat digunakan untuk fiksasi. Yang dapat digunakan adalah bentuk monomernya. Untuk menghasilkan formalin dalam bentuk monomer diperlukan waktu, kecuali bila pH larutan netral atau sedikit alkalis, karena kecepatan depolarisasi tergantung pada pH. Jadi jangan sekali-kali menggunakan formalin 10% yang baru dibuat karena jaringannya keburu membusuk sebelum terfiksasi dengan baik. Selain itu formalin bersifat asam karena mengandung asam formiat akibat oksidasi formaldehida. Oleh sebab itu larutan formalin 10% harus dibuat netral atau sedikit alkalis dengan menggunakan larutan buffer phosphate dengan pH 7.2 sebagai pelarut, atau dengan menambahkan kalsium asetat. Yang paling mudah dan murah adalah Formol Saline dengan formulanya Formalin (formaldehida 40%) .............................................................. 100ml Sodium klorida (NaCl) Air kran .............................................................. 9gram ............................................................ 900ml

Larutan formalin 10% dengan phosphate buffer yang sering digunakan adalah 1. Formol Calcium (Lillie 1965) Formalin (40% formaldehida) ....................................................... 10 ml Kalsium asetat ................................................................................. 2 gr Akuades ................................................................................... ad 100 ml

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

2. Formol Calcium (Baker, 1944)


Formalin ............................................................................................. 10 ml Calcium chlorida .................................................................................. 2 gr Akuades ....................................... ................................................ad 100 ml 3. Buffer formalin Formalin ............................................................................................ 10 ml Acid sodium phosphate monohydrate ............................................... 0.40 gr Anhydrous disodium phosphate ........................................................ 0.65 gr Akuades ...........................................................................................ad 100 ml

4. Buffered formalin sukrosa (Holt dan Hicks, 1961)


Formalin ............................................................................................. 10 ml Sukrosa ................................................................................................ 7.5 gr M/15 Phosphate buffer (pH 7.4) .......................................................ad 100 ml Cairan fiksatif formalin akan mengawetkan struktur halus (fine structure) dengan sangat baik, phospholipid dan beberapa ensim. Cairan ini sangat dianjurkan untuk dipakai pada penelitian gabungan secara sitokimia dan mikroskop elektron. Untuk mendapatkan hasil yang terbaik jaringan harus di dinginkan sampai 4 derajat Celsius dalam refrigerator. Kelebihan larutan fiksatif formalin adalah a. merupakan cairan fiksatif umum b. pH mendekati netral

c. Pigmen formalin (acid formaldehyde haematin) tidak terbentuk karena pembentukannya baru
terjadi bila ada interaksi antara larutan formalin pada pH asam dengan hemoglobin atau produknya (sering dijumpai pada organ yang mengandung banyak darah seperti hepar, lien, sumsum tulang dan sebagainya). Bila pigmen ini terbentuk dapat dihilangkan dengan perlakuan pikrat-alkohol atau larutan alkohol 1% dalam sodium hidroksida (NaOH)

d. Potongan jaringan dapat ditinggalkan di dalam cairan formol salin untuk jangka waktu lama
(dapat sampai 1 tahun) tanpa ada perubahan yang berarti e. Bla diperlukan jaringan yang direndam dalam cairan fiksatif dimasukkan ke dalam cairan fiksatif lainnya bila diperlukan Kekurangan larutan fiksatif formalin adalah Jaringan yang difiksasi dengan cara rendam memerlukan waktu sedikitnya 24 jam baru dapat diproses. ini dapat di ambil dan

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

10

B. LARUTAN MULLER
Cairan fiksasi ini merupakan fiksatif sitologi yang dapat digunakan untuk memfiksasi inti dan sitoplasma sel. Potassium dikromat yang terdapat di dalam larutan Muller akan memfiksasi protein tanpa mempresipitasikannya. Diduga hal ini terjadi karena ion krom membentuk kompleks-kompleks dengan air yang mengikat bagian reaktif rantai protein di dekatnya. Kalium dikromat terutama mengikat gugus karboksil dan hidroksil protein sehingga fiksatif yang mengandung ion krom tidak dapat di pakai untuk histokimia. Kalium dikromat dapat digunakan untuk reaksi kromaffin. Setelah fiksasi dengan larutan Muller jaringan harus dicuci dulu di dalam air kran mengalir selama 24 jam sebelum dilakukan proses dehidrasi, karena memindahkan jaringan secara langsung ke dalam alkohol akan menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat disingkirkan lagi dari jaringan. Kelebihan dari larutan Muller adalah 1. Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan baik. Jaringan biasanya akan terfiksasi baik dalam waktu 24 jam. 2. Memfiksasi inti dan sitoplasma sel dengan baik Kekurangan dari larutan Muller adalah

1. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Muller harus segera dilakukan proses
dehidrasi setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom secara baik. 2. Tidak dapat dipakai untuk pewarnaan dengan metoda histokimia

3. Harus dicuci dulu dengan air kran mengalir sebelum dilakukan dilakukan proses
dehidrasi, karena dehidrasi langsung dengan menggunakan alkohol dapat menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat disingkirkan dari jaringan. Formula larutan Muller adalah sebagai berikut Potassium dikromat .................................................................. 12.5 gram Sodium sulfate ............................................................................ 5 gram Akuades ..................................................................................ad 500 ml

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

11

C. LARUTAN BOUIN
Larutan fiksatif ini mengandung larutan asam pikrat jenuh. Asam pikrat merupakan zat berbentuk serbuk bewarna kuning seperti kunyit dan mudah meledak dalam keadaan kering, sehingga harus disimpan dalam keadaan lembab. Asam pikrat jenuh dibuat dengan cara melarutkan serbuk asam pikrat dalam air hingga jenuh (terdapat endapan serbuk pikrat di dasar larutan. Asam pikrat mempresipitasikan protein dengan cara membentuk ikatan pikrat-protein. Asam pikrat menyebabkan sel darah merah menjadi rusak, seringkali menghilangkan Fe+3, terutama bila berada dalam jumlah sedikit dan dapat melindungi RNA dari proses perusakan oleh ensim ribonuklease. Kelebihan dari larutan Bouin adalah

1. Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata, tetapi dapat menyebabkan
terjadinya sedikit pengerutan. Untuk mengatasi hal ini ke dalam larutan Bouin biasanya di tambahkan asam asetat glasial sesaat sebelum dipakai. Waktu fiksasi cepat yaitu 24 jam, tetapi potongan kecil dengan ketebalan kurang dari 2-3 mm dapat selesai di fiksasi dalam 2-3 jam. Asam asetat glasial sendiri mempunyai kemampuan untuk fiksasi meskipun rendah. Asam asetat glasial biasanya digunakan bersama-sama dengan larutan fiksatif lain dan berfungsi untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh larutan lainnya. Nukleoprotein dipresipitasi oleh asam asetat dan sering ditambahkan pada zat wara hematoksilin agar inti tampak jelas dan tajam. 2. Memberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan metoda trichrome. 3. Sangat baik untuk memperlihatkan inti sel seperti pada sel benih di testis dan ovum. Kekurangan dari larutan Bouin adalah 1. Jaringan yang difiksasi dengan larutan Bouin harus segera dilakukan proses dehidrasi setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom secara baik.

2. Warna kuning pada jaringan akibat kelebihan pikrat. Untuk menghilangkan warna
kuning, jaringan harus dicelup dalam alkohol atau dengan mencucinya dalam air kran semalam. Oleh karena terbentuk beberapa ikatan pikrat yang larut dalam air, jaringan harus segera dipindahkan ke dalam alkohol

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

12

Formula larutan fiksatif Bouin adalah Larutan asam pikrat jenuh ......................................................................... 12.5 gram Formalin 10% (40% formaldehida) ............................................................ 100 ml Bila akan digunakan baru tambahkan asam asetat glasial ..................... 5 ml

D. LARUTAN ZENKER FORMOL (CAIRAN HELLY)


Larutan fiksatif Zenker mengandung Merkuri klorida yang berfungsi untuk mempresipitasi protein. Merkuri klorida akan mengikat gugus asam protein dan gugus asam fosfat nukleoprotein, dan juga bereaksi secara khusus dengan gugus thiol (SH). Kelebihan dari larutan fiksatif Zenker adalah 1. Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di bagian perifer dan lunak serta undefixed di bagian tengah. Untuk mengatasi hal tersebut larutan fiksatif ini biasanya dikombinasi dengan asam asetat, formalin, potassium dikromat dan sebagainya. Waktu fiksasi umunya 6-24 jam

2. Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa serta organ lain yang
banyak mengandung darah seperti jantung dan otot 3. Warna sitoplasma jaringan yang difiksasi dengan larutan fiksatif ini akan lebih cemerlang. Kekurangan dari larutan fiksatif Zenker adalah

1. Pemaparan jaringan di dalam larutan fiksatif ini yang melebihi waktu yang
ditentukan akan mengakibatkan jaringan menjadi rapuh (keras), overfixed dibagian perifer dan underfixed ditengahnya. Jaringan seperti ini tidak dapat dipotong dengan mikrotom. Karenanya larutan ini jarang digunakan tersendiri, umumnya dikombinasikan dengan asam asetat, formalin, potassium bikromat dan sebagainya. Formula larutan Zenker sebagai berikut Merkuri klorida .......................................................................................... 5 gram Potassium dikromat .................................................................................... 2.5 gram Sodium sulfat ............................................................................................. 1 gram Akuadest .................................................................................................. ad 100 ml

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

13

Tambahkan formalin segera sebelum pemakaian ...................................... 5 ml

E. LARUTAN ETHYL ALKOHOL


Fiksasi ini biasanya digunakan untuk sajian hapus dan tidak digunakan untuk fiksasi jaringan, sebab larutan fiksatif ini mempunyai daya penetrasi yang lambat ke dalam jaringan dan cenderung untuk mengeraskan jaringan bila jaringan direndam terlalu lama di dalam larutan fiksasi ini. Larutan ini memfiksasi jaringan dengan cara mendenaturasi protein dan mempresipitasi glikogen. Apabila fiksatif ini dicampur dengan reagen lainnya seperti larutan Carnoy, fiksasi berlangsung cepat.

D. LARUTAN ASAM ASETAT-ALKOHOL-FORMALIN (TELLYESNICZKY)


Fiksasi ini digunakan untuk mendemonstrasikan glikogen. Larutan ini akan mencegah karbohidrat menjadi larut sebelum unsur protein selesai difiksasi. Karena formalin dan alkohol merupakan zat dengan penetrasi cepat, larutan ini merupakan fiksatif yang kerjanya cepat. Jaringan dengan ketebalan 5 mm selesai difiksasi dalam 4 jam. Asam asetat , umumnya disebut asam asetat glasial karena padat pada suhu di bawah 17 derajat Celsius. Asam asetat tidak pernah digunakan sendirian karena efek pembengkakan pada serat kolagen, tetapi ia digunakan untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh reagen lainnya. Nukleoprotein (dalam inti sel) dipresipitasikan oleh acetic acid dan karenanya sering ditambahkan pada zat warna hematoksilin agar inti tampak lebih jelas dan tajam, mitokondria dan aparatus Golgi dihancurkannya atau menjadi rusak Formula larutan fiksatif ini adalah Formalin .................................................................................................... 5 ml Asam asetat glasial .................................................................................... 5 ml Alkohol 70% .............................................................................................. 90 ml

E. LARUTAN HEIDENHEINS SUSA


Larutan ini merupakan larutan fiksatif karbohidrat yang sangat baik. Larutan fiksatif ini mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata serta memberikan hasil pulasan yang sangat cemerlang dengan rincian sitologi yang sangat baik. Jaringan dengan ketebalan kurang dari 8mm selesai difiksasi setelah 12-24 jam. Bila jaringan difiksasi lebih dari 24 jam, jaringan akan menjadi keras dan rapuh Formula larutan fiksatif ini adalah

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

14

Merkuri klorida ........................................................................................... 4.5 gr Sodium klorida ............................................................................................. 0.5 gr Trichloracetic acid ........................................................................................ 2 gr Acetic acid ................................................................................................... 4 ml Formalin ....................................................................................................... 20 ml Akuadest ...................................................................................................... 100 ml

F. LARUTAN CARNOY
Larutan ini merupakan larutan fiksatif inti yang mempunyai daya penetrasi yang cepat. Di samping itu larutan fiksatif ini juga akan mengawetkan substansia Nissl dan glikogen. Keuntungan dari larutan Carnoy adalah sangat cepat . Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu diagnostik perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya pada bagian bedah untuk diagnostik sel kanker. Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2jam,sedangkan potongan kecil selesai difiksasi dalam 15 menit. Kekurangan fiksasi ini adalah efek pengerutan yang kuat dan menghancurkan sebagian besar unsur sitoplasma lainnya. Efek pengerutan dapat dikurangi dengan melakukan fiksasi pada suhu nol derajat Celsius selama 18 jam Formula larutan fiksatif Carnoy adalah Alcohol absolut ......................................................................................... 60 ml Chloroform ................................................................................................ 30 ml Glacial acetic acid ..................................................................................... 10 ml TEHNIK LENDRUM Tehnik Lendrum digunakan untuk melunakkan jaringan kulit setelah difiksasi. Hal ini terjadi karena kulit merupakan jaringan yang keras. Setelah potongan kulit dikeluarkan dari larutan fiksatif, kulit dicuci sebentar dengan air kran mengalir atau dengan alkohol 90%, kemudian direndam dalam larutan phenol 4% dalam akwades selama 1-3 hari. Dengan perlakuan khusus ini diharapkan kulit menjadi mudah diiris dengan pisau mikrotom tajam tanpa merobek . Sebelum memotong pisau mikrotom sebaiknya direndam dalam es sehingga memudahkan pemotongan. Setelah dibuat blok, blok preparat sebaiknya disimpan dalam air es.

DEHIDRASI
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

15

Dehidrasi merupakan langkah ke dua dalam pemerosesan jaringan. Proses ini (Gb-2) bertujuan untuk mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan yang telah difiksasi sehingga jaringan nantinya dapat diisi dengan parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk membuat blok preparat. Hal ini perlu dilakukan karena air tidak dapat bercampur dengan cairan parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk membuat blok preparat.

Gambar-2 Proses Dehidrasi Ada beberapa macam cairan yang dapat dipakai untuk proses dehidrasi yaitu 1. Alkohol 2. sukrosa 20% 3. metil alkohol atau spiritus Setelah jaringan selesai difiksasi jaringan dipindahkan ke dalam alkohol dan diproses sebagai berikut 1. alkohol 70% ................................................................................................... 1 hari 2. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari

3. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari 4. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari 5. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari 6. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
7. alkohol 100% ................................................................................................. 1 hari 8. alkohol 100% ................................................................................................. 1 hari 9. alkohol 100% .................................................................................................. 1 hari Di samping cara di atas cara lain yang juga sering di pakai adalah dehidrasi bertahap dengan menggunakan alkohol dengan konsentrasi yang makin meningkat secara lebih perlahan yaitu 1. alkohol 70% ................................................................................................... 1 hari

2. alkohol 80% .................................................................................................... 1 hari 3. alkohol 90% ...................................................................................................... 1 hari 4. alkohol 95% ...................................................................................................... 1 hari 5. alkohol 95% ....................................................................................................... 1 hari
6. alkohol 100% ...................................................................................................... 1 hari 7. alkohol 100% ..................................................................................................... 1 hari

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

16

Alkohol yang sudah dipakai dapat dimurnikan denga cara memasukkan cuprisulfat (CuSO4) kedalamnya. Cuprisulfat yang bewarna putih (tak mengandung air) akan berubah menjadi biru (mengandung air). Ganti cuprisulfat beberapa kali hingga warnanya tetap putih walaupun telah disimpan beberapa hari. Cuprisulfat yang telah bewarna biru karena mengandung air dapat di hilangkan airnya dengan cara memanaskan. Metil alkohol dapat digunakan menggantikan alkohol absolut. Metil alkohol ini terlebih dahulu diberi cuprisulfat hingga warnanya tetap putih, setelah itu siap untuk digunakan. Bila menggunakan spiritus harus ditest dulu dengan alkohol absolut murni sebagai kontrol. Untuk jaringan yang akan dipotong menggunakan cryostat dan blok preparat dibuat menggunakan tissue tech jaringan di dehidrasi menggunakan sukrosa 20% selama 2 hari. Cairan pekat sukrosa 20% ini dibuat dengan cara sebagai beikut Sukrosa (gula pasir) ...................................................... 20 gram Air suling .....................................................................ad 100 ml

PEMBENINGAN (CLEARING)
Pembeningan adalah suatu tahap untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan dan menggantinya dengan suatu larutan yang dapat berikatan dengan parafin. Jaringan tidak dapat langsung dimasukkan ke dalam parafin karena alkohol dan parafin tidak bisa saling melarutkan. Proses mengeluarkan alkohol dari jaringan ini sangat krusial karena bila di dalam jaringan masih tertinggal sedikit alkohol maka parafin tidak bisa masuk kedalam jaringan sehingga jaringan menjadi matang diluar, mentah di dalam dan akan menyebabkan jaringan menjadi sulit untuk dipotong dengan mikrotom. Bahan atau reagen pembening yang paling sering dipakai adalah sebagai berikut 1. chloroform 2. benzene/benzol 3. xylene/xylol 4. cedar wood oil 5. benzil benzoat 6. methyl benzoat

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

17

Chloroform Chloroform merupakan clearing agent yang paling sering dipakai, karena sifatnya yang toleran artinya jaringan tidak menjadi keras dan rapuh. Sifat ini tak dipunyai oleh benzene dan xylene. Jaringan biasanya dibeningkan dalam waktu semalam Kekurangan chloroform adalah titik akhirnya yaitu saat jaringan telah menjadi bening dan transparan yang tak dapat terlihat dengan jelas oleh mata. Untuk mengatasi hal ini jaringan sebaiknya direndam dalam chloroform untuk jangka waktu yang lebih panjang dari yang sebenarnya, sehingga seluruh alkohol diyakini telah keluar dari jaringan dan jaringan telah sempurna diresapi oleh chloroform. Kekurangan lainnya adalah chloroform harganya ebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murah dari cedarwood oil Benzene/Benzol dan Xylene Benzene dan xylene merupakan clearing agent yang cukup cepat. Masa kerja benzene lebih sedikit lambat dari xylene, tetapi tidak membuat jaringan menjadi serapuh bila menggunakan xylene. Potongan kecil dapat dibuat menjadi bening dalam waktu 1 jam, sedangkan yang lebih tebal (5mm) telah menjadi bening dalam waktu 2-4 jam. Benzene saat ini sudah jarang dipakai karena sifat karsinogeniknya. Bila xylene atau xylol yang dipakai sebagai zat pembening, metodanya adalah sebagai berikut: 1. Setelah jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi (alkohol) jaringan dimasukkan kedalam xylol I selama 1 jam. 2. Perhatikan jaringan akan menjadi bening 3. untuk menyakinkan bahwa seluruih cairan alkohol telah keluar, jaringan kemudian dipindahkanke cairan xylol II. Lama inkubasi dalam xylol tergantung pada besarnya jaringan, tetapi biasanya berkisar antara - 1 jam. 4. Jaringan kemudian direndam dalam parafin cair di dalam oven selama kira-kira jam. Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok parafin. Benzyl benzoat Benzyl benzoat merupakan clearing agent yang lambat penetrasinya sehingga dibutuhkan waktu inkubasi yang lebih lama Metoda pembeningan adalah sebagai berikut

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

18

1. Benzyl benzoat I Jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi dan direndam dalam benzyl benzoat selama semalam (24 jam) sampai seluruh jaringan tenggelam. Benzyl benzoat mempunyai penetrasi yang lambat sehingga tidak perlu kuatir jaringan menjadi terlalu keras dan rapuh.. Setelah inkubasi selama semalam, jaringan akan tampak menjadi bening dan transparan. 2. Benzyl benzoat II Jaringan lalu dipindahkan ke dalam benzyl benzoat II selama kira-kira 2-3 jam. 3. Benzol parafin Jaringan lalu dipindahkan ke dalam campuran benzol dan parafin cair dengan perbandingan yang sama, misalnya benzol/benzene sebanyak 25 ml di campur dengan parafin cair sebanyak 25 ml juga. Jaringan direndam dalam benzol parafin selama -1 jam. 4. Parafin cair Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam parafin cair selam kira-kira jam. Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok parafin. 5. Bisa juga setelah dari benzyl benzoat II jaringan direndam dalam xylol/xylene selama -1jam, baru kemudian dimasukkan kedalam parafin cair di oven selama jam. Cedarwood oil Cedarwood oil merupakan zat pembening termahal dari semua clearing agent tetapi merupakan clearing agent terbaik, karena sifatnya yang tidak mengeraskan jaringan, sehingga nantinya jaringan sangat mudah untuk diiris tipis dengan mikrotom. Jaringan dapat direndam dalam clearing agent ini untuk waktu yang lama bahkan hingga berbulanbulan tanpa menjadi keras dan rusak. Pembeningan oleh cedarwood oil ini sangat baik tidak hanya untuk jaringan yang halus tetapi juga untuk jaringan yang keras seperti kulit dan jaringan ikat padat. Methyl benzoate

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

19

Methyl benzoat merupakan clearing agent yang mempunyai dayapenetrasi lebih cepat dari benzyl benzoat. Kekurangan dari zat clearing ini adalah mudah menjadi rapuh/keras sehingga menyulitkan pengirisan dengan mikrotom. Prosedur pembeningannya adalah sebagai berikut 1. Methyl benzoat I Setelah dikeluarkan dari cairan dehidrasi jaringan dimasukkan kedalam larutan methylbenzoat sampai tenggelam, dengan waktu kira-kira 2-3 jam. 2. Methylbenzoat II Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam methyl benzoat II selama 1-2 jam, tergantung pada besar dan jumlah jaringan. 3. Benzol-Parafin Jaringan kemudian dipindahkan dan direndam dalam cairan benzol-parafin dan direndam selama 1/2 hingga 1 jam. Cairan benzolparafin dibuat dengan mencampurkan larutan benzol dengan parafin dengan perbandingan yang sama. 4. Jaringan kemudian dipindahkan kedalam cairan parafin selama beberapa menit

PEMBENAMAN (EMBEDDING/IMPREGNASI)
Pembenaman (impregnasi) adalah proses untuk mengeluarkan cairan pembening (clearing agent) dari jaringan dan diganti dengan parafin. Pada tahap ini jaringan harus benar-benar bebas dari cairan pembening karena sisa cairan pembening dapat mengkristal dan sewaktu dipotong dengan mikrotom akan menyebabkan jaringan menjadi mudah robek. Zat pembenam (impregnasi agent) yang dipakai adalah 1. Pafin caira panas yang mempunyai temperatur lebur (Melting temperature) kirakira 56-59 C 2. Parafin histotek khusus (Tissue mat) dengan suhu 56C 3. Paraplast yaitu campuran parafin murni dengan beberapa polimer plastik.

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

20

Gambar-3 Pembenaman (Embedding/ Impregnasi) Keuntungan memakai parafin dengan titik lebur rendah adalah jaringan tidak mudah menjadi rapuh/garing. Parafin dengan titik lebur rendah biasanya dipakai untuk jaringan embrional Keuntungan memakai paraplast adalah sifat parafinnya lebih elastis sehingga tidak mudah sobek ketika dipotong dengan mikrotom dan dapat dipotong lebih mudah. Proses pembenaman sebagai berikut 1. jaringan dbenamkan ke dalam parafin/paraplast I selama 2 jam 2. jaringan kemudian dipindahkan kedalam parafin/paraplast II selama 1 jam 3. akhirnya jaringan dimasukkan kedalam parafin/paraplast III selama 2 jam. 4. setelah pembenaman proses dapat dilanjutkan dengan pengecoran/bloking

PENGECORAN (BLOCKING)
Pengecoran (Blocking) adalah proses pembuatan blok preparat agar dapat dipotong dengan mikrotom. Untuk membuat blok preparat dapat digunakan 2 macam cara 1. Cara lama yaitu dengan menggunakan potongan besi berbentuk L (Leuckhart) 2 buah potongan besi disusun diatas lembaran logam hingga rapat dan membentuk ruang seperti kubus. Tuangkan sedikit parafin cair di bagian pinggir tempat pertemuan potongan besi agar tak bocor. Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam ruangan kubus. Selanjutnya parafin dituangkan kedalam ruangan kubus tersebut. Hal yang harus dicegah adalah jangan sampai gelembung udara mengisi kedalam blok parafin tersebut. 2. Cara baru yaitu dengan menggunakan cetakan dari plastik dan piringan logam Dengan cara ini histoplate dari plastik diletakkan di atas piringan logam (seperti cetakan membuat es batu). Tuangkan sedikit cairan parafin ke dalam cetakan tersebut. Secepatnya masukkan jaringan dengan menggunakan pinset yang telah dipanaskan (agar parafin tak beku) dan diatur posisinya di dalam cetakan. Parafin cair kemudian dituangkan kembali hingga menutupi seluruh cetakan tersebut.
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

21

Selama tindakan ini cetakan (histoplate dari plastik) dan piringan logam harus diletakkan diatas hot plate.

PEMOTONGAN (MOUNTING)
Pemotongan (mounting) adalah proses pemotongan blok preparat dengan menggunakan mikrotom. Sebelum melakukan pemotongan serangakaian persiapan yang harus dilakukan adalah 1. Persiapan pisau mikrotom Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik. Pisau mikrotom kemudian diletakan pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu. Rekatkan blok parafin pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel. Letakkan tempat duduk blok parafin beserta blok preparat pada tempatnya pada mikrotom.

2. Persiapan Kaca Objek Kaca objek yang akan direkatkan preparat harus telah dicoated (disalut) dengan zat perekat seperti albumin (putih telur), gelatin atau tespa 3. Persiapan Waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37-400C 4. Persiapan sengkelit atau kuas Tehnik pemotongan parafin yang mengandung preparat adalah sebagai berikut 1. Rekatkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat.

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

22

2. Letak pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Biasanya sudut kemiringan berkisar 20-30 derajat. 3. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya dipakai ketebalan antara 5-7 mikrometer 4. gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok preparat secara teratur dan ritmis. Buang pita-pita parafin yang awal tanpa jaringan hingga kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan 5. Pita parafin yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati menggunakan sengkelit atau kuas kedalam waterbath yang temperaturnya diatur 37-40C dan biarkan beberapa saat hingga poita parafin tersebut mengembang. 6. Setelah pita parafin terkembang dengan baik, tempelkan pita parafin tersebut pada kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Dengan menggunakan sengkelit atau kuas pita parafin ditempelkan pada kaca objek. Setelah melekat kaca objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar pita parafin tidak melipat.

7. Letakkan kaca objek yang berisi pita parafin di atas hotplate dengan temperatur 40-45C, biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan melewatkan kaca objek di atas api sehingga pita parafin melekat erat di atas kaca objek. 8. Setelah air kering dan pita parafin telah melekat dengan kuat, simpan kaca objek berisi potongan parafin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai.

PEWARNAAN (STAINING)
Pewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat dikenali / diamati dengan mikroskop. Proses timbulnya warna terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul tertentu yang

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

23

terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya matahari atau lampu mikroskop yang dipaparkan pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi (diserap) atau diteruskan. Zat warna yan terikat pada jaringan akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna. Sebelum melakukan pewarnaan serangkaian persiapan yang harus dilakukan adalah sebagai berikut 1. Peralatan gelas harus dibersihkan dulu dan dibilas dengan akuades 2. Timbang zat warna dengan cermat dan tepat 3. Larutkan zat warna dalam pelarut yang benar dengan memperhatikan urutan pencampurannya, misalnya hematoksilin selalu harus dilarutkan dalam alkohol dulu sebelum ditambahkan bahan lain. 4. Aduk zat warna dengan baik agar seluruh partikel zat warna terlarut dengan baik 5. Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan dengan menyaringnya menggunakan kertas saring 6. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan tuangkan dalam wadah yang sesuai 7. Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan 8. Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol yang akan menyebabkan presipitasi (pengendapan) zat warna Pelarut yang umum dipakai dalam proses pewarnaan adalah air dengan derajat keasaman yang netral (pH 7). Disamping itu juga dapat digunakan cairan pelarut lainnya seperti etilalkohol (etanol) dengan derajat konsentrasi yang bervariasi. Bila tidak ada keterangan dalam proses pelarutan yang menggunakan alkohol berarti konsnetrasi alkohol yang digunakan adalah alkohol absolut dengan konsentrasi 99.9%. Pulasan Hematoksilin-Eosin Pulasan (pewarna) yang sering digunakan secara rutin adalah pewarnaan yang dapat digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan penyambungnya yaitu pulasan hematoksilin-eosin (HE). Pada pulasan HE digunakan 2 macam zat warna yaitu

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

24

hematoksilin yang berfungsi untuk memulas nti sel dan memberikan warna biru (basofilik) serta eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dengan nuansa yang berbeda. Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun 1863. Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawaan lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. Proses oksidasi senyawaan hematoksilin ini dikenal sebagai Ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan menambahkan senyawaan yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida, hidrogen peroksida, potassium permanganat dan sodium iodat. Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hematoksilin utuk mewarnai inti sel akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. Untuk memperpanjang proses ini larutan hematoksilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan disimpan dalam ruangan gelap. Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan diganti sekurangnya seminggu sekali. Jenis hematoksilin yangsering dipakai adalah mayer, delafied, Erlich, Bullard dan Bohmer, sedangkan counterstaining yang dipakai adalah eosin, safranin, dan phloxine. Beberapa larutan hematoksilin yang digunakan adalah 1. Hematoksilin Erlich Hematoksilin Erlich adalah hematoksilin yang paling tahan lama, mudah berdifferensiasi dan warnanya relatif tahan lama. Hematoksilin ini baru bisa digunakan setelah 1-2 bulan dibuat. Waktu inkubasinya adalah 30 menit dan counterstainingnya adalah 0.5 -1% larutan eosin dalam air. Formulanya adalah sebagai berikut o o o o o o Hematoksilin .. 6 gram Alkohol absolut . 300ml Akwades .. 300ml Glycerol . 300 ml Glacial acetic acid . 30 ml Potassium alum . berlebihan

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

25

Cara pembuatannya adalah sebagai berikut 1. Hematoksilin dilarutkan dalam alkohol 2. Sambil digerus dalam mortar secara perlahan-lahan tambahkan bahan lainnya secara berurutan sambil digerus 3. Akhirnya tambahkan kristal potassium alum (Aluminium potassium sulfate) sambil menggoyang-goyang botol hingga terdapat endapan kristal alum di dasar botol. 4. Botol berisi larutan hematoksilin Ehrlich kemudian ditutup secara longgar dengan gumpalan kapas dan disimpan ditempat terang selama 1-2 bulan sehingga hematoksilinnya teroksidasi menjadi haematin. Proses ini dikenal sebagai pematangan 2. Hematoksilin Delafield Larutan zat warna ini tahan bertahun-tahun dalam penyimpanan, bisa digunakan 3 hari setlah pembuatan, counterstaining dengan menggunakan 0.5-1% larutan eosin dalam air, waktu inkubasi 15-20 menit. Formula larutan pewarna ini adalah o o o o o Hematoksilin kristal ... 6 gr Alkohol absolut . 50 ml Ammonium alum . 55 gr Akwades .. 600ml Glycerol 150ml

Cara pembuiatan larutan hematoksilin Delafield adalah sebagai berikut 1. Larutkan kristal hematoksilin dengan alkohol absolut 2. Larutkan ammonium alum dengan akwades hingga jenuh (saturated) 3. Campurkan kedua larutan tersebut dan diamkan selama 3-5 hari 4. Saring dan tambahkan glycerol 5. Biarkan selama 3 hari dalam botol terpapar cahaya 6. Setelah 3 hari simpan dalam botol tertutup dan lindungi dari cahaya

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

26

3. Hematoksilin Mayer Larutan hematoksilin Mayer merupakan larutan yang dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-bulan), counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya 10-15 menit. Formulanya adalah o Hematoksilin kristal .. 1gr o Aquades .. 1000ml o Sodium iodate .. 0.2 gr o Ammonium/potassium alum . 50gr o Citric acid 1gr o Chloral hydrate 50gr Cara pembuatannya adalah sebagai berikut 1. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam aquades 2. Tambahkan hematoksilin dan campurkan secara baik 3. Kemudian tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate 4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik 5. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya 4. Hematoksilin Harris Larutan pewarna yang dapat dipakai segera setelah selesai dibuat, counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya adalah 15-20 menit. Formulanya adalah sebagai berikut Kristal hematoksilin 5.0 gr Alkohol 100% .. 50 ml Ammonium/potassium alum .. 100 gr Distilled water 1000 ml Merkuri oksida 2.5 gr Cara pembuatannya adalah sebagai berikut 1. Larutkan hematoksilin di dalam alkohol 2. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam distilled water dan panaskan 3. Hentikan pemanasan dan campur kedua larutan tersebut

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

27

4. Panaskan dengan cepat sambil di aduk 5. Hentikan pemanasan dan campurkan merkuri oksida kedalamnya perlahan-lahan 6. Panaskan kembali hingga larutan bewarna purple gelap 7. Hentikan pemanasan dan tempatkan wadah berisi larutan tersebut di dalam wadah berisi air dingin hingga laurtan hematoksilin menjadi dingin 8. Larutan siap untuk digunakan segera setelah dinginkan 9. Tambahkan 2-4ml asam asetat glasial per 100ml Larutan untuk meningkankan ketajaman warna inti 10. Saring sebelum digunakan Larutan Counterstaining Beberapa pulasan yang dipakai sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah eosin, safranin dan phloxine. 1. Larutan Eosin Larutan eosin yang digunakan terdiri atas larutan stok (Stock solution) dan larutan kerja (working solution). Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut 1% Stock Alkohol-Eosin Eosin Y, water soluble . 1.0 gr Distilled water .. 20 ml Larutkan dan tambahkan Alkohol 95% .. 80 ml Working Eosin Solution Eosin stock solution 1 bagian Alkohol 80% .. 3 bagian Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial 0.5ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik 2. Larutan Phloxine Laurtan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working solution dan larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut Stock Eosin Eosin Y water soluble 1 gram

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

28

Distilled water 100ml Stock Phloxine Phloxine B .. 1.5 gr Distilled water ... 100ml Working Solution Stock Eosin .. 100ml Stock Phloxine . 10ml Alkohol 95% . 780ml Asam asetat glasial .. 4ml 2% Alkohol Safran Safran du Gatinais . 2 gram Alkohol 100% .. 100ml Pulasan rutin yang banyak dipakai adalah I. Pulasan Mayer hematoksilin-eosin Pulasan ini banyak dipakai dengan beberapa pertimbangan 1. Differensiasi warna sangat jelas 2. Mewarnai inti sel dengan baik dan jelas dengan background yang tidak bewarna 3. Hasil konsisten 4. Prosedurnya sederhana 5. Dapat mewarnai preparat yang difiksasi dengan fiksasi apapun juga Prosedur yang dipakai adalah sebagai berikut a. Deparafinisasi dengan xylol (2x2 min) b. Hidrasi dengan serial Alkohol 100% (2x2 min) 95% (2min) 90% (2 min) 80% (2 min) - 70% (2min) Distilled water (3min) c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayers selama 15 min d. Cuci dalam air mengalir selama 15-20menit e. Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air mengalir selama beberapa menit. Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke langkah selanjutnya

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

29

f. Counterstaining dalam larutan Eosin working solution selama 15 detik hingga 2 menit tergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan g. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 70% hingga 100% masing-masing 2 menit. h. Jernihkan dan dealkoholisasi dalam xylol 2x2min i. Tutup dengan balsem kanada Hasil/ Interpretasi adalah Inti sel bewarna biru Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu II. Pewarnaan Hematoksilin Harris-Eosin Protokol pulasan hematoksilin Harris eosin adalah sebagai berikut a. Deparafinisasi dalam xylol b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%90%-80%-70% c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 15 min d. Bilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat e. Celup dalam campuran asam-alkohol secara cepat 3-10 celup cek differensiasi warna di bawah mikroskop f. Bilas dalam air mengalir secara singkat g. Celup sebanyak 3-5 kali dalam larutan ammonium atau lithium karbonat hingga potongan bewarna biru cerah h. Cuci dalam air mengalir selama 10-20 menit Bila pencucian tidak maksimal jaringan sulit terwarna oleh Eosin i. Inkubasi dalam eosin selama 15 detik hingga 2 menit j. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan, masing-masing selama 2 menit k. inkubasi dalam xylol 2x2menit l. Tutup dengan kaca penutup

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

30

Hasil/Interpretasi hasil pulasan Inti sel bewarna biru Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu III. Pewarnaan Hematoksilin Mayer-Phloxyne-Safran Prosedur pewarnaan adalah sebagai berikut a. Deparafinisasi dalam xylol b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%90%-80%-70% c. Inkubasi dalam larutan asam pikrat jenuh selama 5 menit d. Cuci dalam air mengalir hingga seluruh asam pikrat hilang e. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayer selama 15 menit f. Basuh dengan air mengalir selama 20 menit g. Warnai dalam larutan 1.5% larutan Phyloxine B selama 2 menit h. Basuh dengan air selama 5 menit i. Cuci dengan alkohol absolut 3 kali j. Warnai dalam 2% larutan alkohol Safran selama 5 menit k. Cuci dengan alkohol absolut 2 kali l. Inkubasi dalam xylol 2 kali masing-masing selama 2 menit m. Rekatkan dengan objek glass menggunakan Balsam Kanada Hasil/interpretasi Inti bewarna biru Sel darah merah bewarna vermillion pink Tulang bewarna kuning Tulang rawan bewarna hijau kekuningan Otot bewarna merah Serat kolagen bewarna kuning

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

31

IV. Pulasan Giemsa Pulasan Giemsa digunakan untuk 1. Pewarnaan darah 2. Pewarnaan sumsum tulang 3. Pewarnaan Riketsia 4. Pewarnaan bakteri Helicobacter pylori Pulasan ini menggunakan fiksasi buffer formalin, metoda blok parafin dengan ketebalan potongan 4-7 mikron. Larutan yang dipakai adalah Yenner stock solution Yenner bubuk 1 gram Methyl alkohol .. 400ml Yenner working solution Yenner stok 25ml Air suling . 25 ml Giemsa solution (Stock Solution) Giemsa bubuk . 1 gram Glyserin .. 66 ml Methyl alkohol 66 ml Campurkan glyserin dengan bubuk Giemsa, masukkan dalam oven 60 C selama 2 jam Tambahkan 66 ml methyl alkohol Giemsa working solution Campurkan Giemsa stok 50 tetes dengan air suling 50ml Setiap kali harus dengan larutan segar Larutan Asam asetat glasial 1% Asam asetat glasial (cuka) 1ml Air suling 100ml

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

32

Prosedur pulasan adalah sebagai berikut a. Deparafinisasi dengan xylol 3 kali selama 2-3 menit b. Alkoholisasi dengan larutan alkohol yang konsentrasinya menurun secara bertahap : Absolut 95% 90% .. 80% 70% c. Hidrasi dengan air suling d. Inkubasi dalam methyl alkohol 2 kali masing-masing selama 3 menit e. Inkubasi dalam Yenner working solution selama 6 menit f. Inkubasi dalam Giemsa working solution selama 45 menit g. Inkubasi dalam asetat glasial 1% sampai inti menjadi jelas h. Cuci dengan air suling i. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara bertahap 70%, 80%, 90%, 95%, absolut j. Dealkoholisasi dengan xylol 2x masing-masing selama 2-3 menit k. Tutup dengan kaca penutup yang diberi etelan Hasil/Interpretasi : Bakteri helicobacter dan Riketsia akan bewarna biru V. Pewarnaan Fite Faraco Fite Faraco adalah metoda pulasan khusus untuk mendeteksi bakteri tahan asam (BTA) seperti tuberkulosis dan lepra. Fiksasi yag digunakan adalah buffer formalin 10%, metoda blok parafin dengan ukuran 4-7 mikron. Larutan yang digunakan adalah Larutan Carbol Fuchsin Phenol .. 2.5ml Alkohol absolut 5 ml Basic Fuchsin 0.5 gram Air suling ad 50 ml Larutan Methylen Blue Methylen blue 0.5 gram Asam asetat glasial . 0.5 ml Air suling .. 100 ml Larutan alkohol asam 1% Alkohol 70% 99ml

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

33

Asam chlorida (HCl) 1 ml Prosedur pulasan adalah sebagai berikut Deparafinisasi dengan Campuran minyak kacang dan xylol (1:2) dilakukan 2 kali masing-masing selama 12 menit Alirkan dan hapus sisa minyak Basuh dibawah air mengalir selama 5 menit Warnai dengan Carbol Fuchsin 20-30 menit Cuci dengan air mengalir Cuci dengan alkohol asam 1% selama 1 menit hingga jaringan bewarna merah jambu Cuci dengan air mengalir Warnai dengan Methylen Blue hingga jaringan bewarna biru muda Bilas dengan air kran Keringkan dengan kertas penghisap dan biarkan hingga kering betul Inkubasi dalam xylol 2 kali selama 1-2 menit Tutup dengan kaca penutup yang diberi Kanada balsem/etelan Hasil/ Interpretasi hasil Bakteri tahan asam (BTA) akan memberikan warna merah

Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2009