BAB V ALUR PENELITIAN SELANJUTNYA

Tahap awal telah diperoleh ekstrak kasar enzim L-asparaginase dari bawang putih (Allium sativum). Enzim kasar merupakan campuran protein enzim dan protein non enzim, sehingga perlu dilakukan pemurnian. Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan enzim menggunakan garam amonium sulfat. Hal ini bertujuan untuk memisahkan protein enzim asparaginase dengan protein lainnya. Proses pemurnian berikutnya adalah dialisis. Dialisis bertujuan untuk memisahkan partikel-partikel kecil dari pertikel-partikel besar dengan

menggunakan membran berdasarkan pada prinsip difusi, yaitu adanya perbedaan konsentrasi larutan bufer Tris-hidroksimetil-aminometan di dalam dan di luar membran. Membran yang digunakan adalah selofan. Protein enzim yang dihasilkan dari proses dialisis merupakan protein enzim yang terbebas dari amonium sulfat. Untuk mengetahui kandungan amonium sulfat pada fraksi tersebut, dilakukan uji dengan larutan BaCl2. Jika dengan penambahan BaCl2 pada larutan bufer di luar membran tidak menimbulkan endapan putih berarti enzim telah terbebas dari amonium sulfat dan diperoleh enzim L-asparaginase yang murni. Sebab jika masih mengandung amonium sulfat maka Ba2+ akan bereaksi dengan SO42- membentuk BaSO4 yang merupakan endapan putih. Langkah selanjutnya adalah penentuan unit aktivitas enzim L-

asparaginase. Enzim L-asparaginase hasil isolasi ditentukan aktivitasnya dengan

18

19

mereaksikan enzim tersebut menggunakan substrat yang sesuai yaitu L-asparagin. Pada reaksi enzimatis, L-asparagin akan terurai menjadi asam aspartat dan amonia. Amonia yang terbentuk dari proses penguraian tersebut dapat dianalisa dengan pereaksi Nessler karena membentuk kompleks dengan reagen Nessler yang berwarna kuning kecoklatan. Kadar amonia diketahui berdasarkan pengukuran absorbansi kompleks amonia dengan reagen Nessler pada panjang gelombang optimum (410 nm). Aktivitas spesifik adalah unit enzim per miligram protein (Lehninger, 1995). Kadar protein dapat ditentukan dengan metode Lowry yaitu analisa kuantitatif berdasarkan pembentukan kompleks warna biru. Warna biru yang dihasilkan kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang optimum BSA. Absorbansi yang diperoleh kemudian diolah dengan bantuan kurva standar BSA, sehingga didapatkan kadar protein. Setelah diketahui bahwa aktivitas spesifik enzim L-asparaginase terbesar pada fraksi tertentu, maka proses selanjutnya adalah karakterisasi enzim yang meliputi, penentuan suhu, pH,dan waktu inkubasi optimum. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan pengujian aktivitas enzim pada variasi suhu 35 0C, 36 0C, 37 0C , 38 0C, dan 39 0C. Penentuan pH optimum dilakukan dengan pengujian aktivitas enzim pada variasi pH 8,2; 8,4; 8,6; 8,8 dan 9,0. Penentuan waktu inkubasi optimum dilakukan dengan pengujian aktivitas enzim pada variasi waktu inkubasi yaitu 28, 29,30, 31dan 32 menit.

20

Secara umum, alur penelitian selanjutnya adalah : 5. 1. Fraksinasi 5. 2. Dialisis 5. 3. Penentuan unit aktivitas enzim 5. 4. Penentuan aktivitas spesifik enzim 5. 5. Karakterisasi enzim yang meliputi suhu, pH, dan waktu inkubasi optimum