Analisis kuantitatif sediaan obat multikomponen dengan spektrofluorometri

Preparasi untuk analisis sediaan obat

multikomponen Tahapan analisis kuantitatif obat multikomponen dalam sediaan obat padat, semi padat, cair dan steril secara spektrofluorometri M. SULAIMAN ZUBAIR (www.abuumar80.wordpress.com)

Istilah
y Analisis kuantitatif : analisis penentuan kadar suatu

senyawa didalam suatu sampel y Sediaan obat : padat (tablet, kapsul), semipadat (salep), cair (sirup, emulsi, suspensi) dan steril (injeksi) y Multikomponen : sediaan obat yang terdiri dari beberapa senyawa aktif obat, seperti kombinasi GG dan Difenhidramin dalam sirup obat batuk y Spektrofluorometri : metode analisis dengan menggunakan instrumen spektrofluorometer

Preparasi sediaan obat multikomponen untuk analisis kuantitatif dengan spektrofluorometri

- Sampel tablet yang akan dianalisis harus

representatif untuk menghindari resiko adanya hasil analisis yang keluar dari spesifikasi yang ditentukan. Contoh : Menurut Farmakope, untuk analisis tablet parasetamol dibutuhkan sampel sebanyak 20 tablet parasetamol 500 mg

Preparasi sediaan obat multikomponen untuk analisis kuantitatif dengan spektrofluorometri

y Sediaan cair : dapat dilakukan pengukuran

secara langsung, atau diencerkan atau dipekatkan terlebih dahulu dengan pelarut organik y Sediaan steril (injeksi) : dapat dilakukan pengukuran secara langsung

Preparasi sediaan obat multikomponen untuk analisis kuantitatif dengan spektrofluorometri

y Sediaan semi padat

Isolasi obat dalam salep harus ditunjukkan pada dasar salepnya : - Salep lemak bulu domba alkohol, biasanya dilarutkan dalam kloroform atau eter - Salep hidrofil, dilarutkan dalam kloroform atau eter - Salep lanolin, dilarutkan dalam kloroform atau eter - Salep Polietilen glikol, dilarutkan dalam etanol atau air

y Pada prinsipnya, semua pengukuran

dengan menggunakan instrumen spektroskopi, maka syarat pertama adalah harus larut dalam larutan pembawa yang digunakan y Meskipun sediaan itu merupakan sediaan obat multikomponen, maka dengan instrumen spektroskopi maupun kromatografi dapat membedakan masingmasing komponen tersebut, berdasarkan nilai panjang gelombang maupun nilai Rf yang berbeda-beda antar komponen

Tinjauan Umum Spektrofluorometri

y Spektrofotometri fluoresensi merupakan suatu prosedur

yang menggunakan pengukuran intensitas cahaya fluoresensi yang dipancarkan oleh zat uji dibandingkan dengan yang dipancarkan oleh suatu baku tertentu. y Pada umumnya cahaya yang diemisikan oleh larutan berfluoresensi mempunyai intensitas maksimum pada panjang gelombang yang biasanya 20 nm hingga 30 nm lebih panjang dari panjang gelombang radiasi eksitasi (gelombang pita penyerapan sinar yang membangkitkannya).

Instrumentasi
y Pengukuran intensitas fluoresensi dapat

dilakukan dengan suatu fluorometer filter sederhana. Instrument yang dipergunakan bermacam-macam mulai dari yang paling sederhana (filter fluorometer) sampai ke yang sangat kompleks yaitu spektrofotometer.

Fluoresensi dan Struktur Molekul

y Supaya terjadi fluoresensi, harus terjadi peresapan

cahaya yang kuat oleh suatu molekul. Hal ini dapat terjadi pada senyawa aromatic, senyawa heterosiklik dan molekul dengan system konjugasi. y Senyawa dengan transisi elektronik -- *, mempunyai kemungkinan yang lebih besar untuk berfluoresensi daripada transisi n -- *. Misalnya, benzen dapat berfluoresensi sedangkan piridina tidak.

Tabel dari beberapa senyawa yang dapat berfluoresensi.

Senyawa pH Panjang gelombang, nm Eksitasi
Asam p-aminosalisilat Sianokobalamin Kinina Reserpina Kloropromazina

11 7 1 1 11

300 275 250, 350 300 350

Konsentrasi minimum Fluoresensi (ppm) 405 0,004 305 450 375 480 0,003 0,002 0,008 0,1

y Dengan suatu pereaksi tertentu, senyawa yang tidak

berfluoresensi dapat diubah menjadi senyawa yang berfluoresensi. Metode ini penting baik untuk senyawa organic maupun anorganik, dan banyak senyawa anorganik membentuk kompleks yang mudah berfluoresensi dengan pereaksi organic. Misalnya : Vitamin B1 dalam sediaan Farmasi atau makanan dapat ditetapkan secara spektrofluorimetri setelah dioksidasi menjadi tiokrom yang mudah berfluoresensi.

Hubungan Struktur Molekul dan Fluoresensi

Struktur molekul yang mempunyai ikatan rangkap mempunyai sifat fluoresensi karena strukturnya kaku dan planar EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikat pada sistem T dapatmenaikkan intensitas fluoresensi EWG (NO2, Br, I, CN, COOH) dapat menurunkan bahkan menghilangkan sifat fluoresensi Penambahan ikatan rangkap (aromatik polisiklik) dapat menaikkan fluoresensi

kelompok analisis obat secara fluoresensi (1)

Obat yang mempunyai sifat fluoresensi alamiah dalam hal ini tidak diperlukan tambahan pereaksi Contoh : Quinine Larutan obat ini mengabsorbsi sinar UV dan mengemisi sinar Vis

kelompok analisis obat secara fluoresensi (2)

Turunan obat yang dibentuk dengan pengikatan dengan senyawa berfluoresensi Contoh : Asam amino diikat oleh syclorida [ 5 (dimethylamino) naphtalene-1-sulfonylchloride] dansyl asam amino yang intensitas fluoresensinya tinggi
SO23CL SO3-NH-CHR-COOH

O R=CH-C NH2 OH N(CH3)2 N(CH3)2 + - HCL

kelompok analisis obat secara fluoresensi (3)

Membentuk molekul berfluoresensi (a. fluorophore)
H3C N + NH S
3

CH2-CH2OH.2CL CH3

Fe(CN)6 OH

N Vitamin B1 H3C N

CH2

N +

Thiochrome CH2-CH2OH CH3 Berfluorensi P eks = 365 nm P em eks = 440 nm

Beberapa obat yang bersifat fosforisensi

Senyawa Aspirin Bennocaine Cocaine Diazepam Iproniazid Papaverine Phenacetin Strychnin PO4 Thioridazine P eks 240 310 240 380 430 400 P fos Waktu 2,1 3,4 2,7 1,5 1,2 0,07 Kondisi EPA Epharm Ethanol EW EW Ethanol EPA Ethanol EW

290,325 400,470,510 0,07 300,370 440 260 410 290 335 480 499 440 500

EW : Ethanol water = 1 : 1 EPA : campuran Diethyleter-isopentane-ethanol (5:5:2)

Analisa Kuantitatif
Pada larutan dengan konsentrasi tinggi, sebagian besar cahaya diserap lapisan larutan yang paling dulu kontak dengan radiasi eksitasi, sehingga fluoresensi hanya terjadi pada bagian yang menyerap cahaya tersebut. Dengan demikian, pada analisis kuantitatif harus didunakan larutan yang encer (serapan tidak lebih dari 0,02) supaya dapat memenuhi persamaan fluoresensi

F = 2,3IoQabc atau F = kc
Keterangan: F = fluoresensi k = konstan = 2,3Ioabc Io = intensitas sumber cahaya Q = efisiensi fluoresensi a = daya serap b = tebal larutan c = konsentrasi

Tahapan analisis
 mula-mula dibuat kurva kalibrasi (grafik hubungan fluoresensi

dengan konsentrasi).  Tahap selanjutnya adalah mengukur intensitas fluoresensi dari zat yang diperiksa, lalu membaca konsentrasi dari kurva kalibrasi tersebut. Selama pengukuran, kondisi percobaan harus dijaga supaya tetap konstan. Pengotoran dapat menurunkan efisiensi dari fluoresensi sehingga mengurangi sensifitas (quenching).  Analisa campuran dilakukan dengan memilih radiasi eksitasi pada panjang gelombang yang berbeda dimana masing-masing komponen campuran tersebut. Bila tidak mungkin, pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang berbeda dimana masing-masing komponen campuran tersebut berfluoresensi.

Hal-hal yang diperhatikan dalam analisa kuantitatif:

1. Konsentrasi Perlu larutan yang 10-100 kali lebih encer daripada analisa spektrofotometri. 2. Radiasi eksitasi Memerlukan cahaya monokromatik. Untuk eksitasi cahaya monokromatik sangat esensial, karena intensitas berubah-ubah sesuai dengan panjang gelombang. 3. Metoda iluminasi a. right angle method : mengukur fluoresensi yang tegak lurus radiasi eksitasi. Cara ini lebih umum dipakai karena alat yang dibuat untuk cara ini lebih ekonomis dan memberikan nilai blangko yang lebih kecil untuk cahaya terhambur dan fluoresensi dari dinding kuvet. b. frontal-method : mengukur fluoresensi pada sudut beberapa derajat dari arah radiasi eksitasi. Cara ini dipakai untuk larutan yang kurang transparan (opaque), larutan pekat atau zat padat, kromatrografi kertas atau KLT

4. pH pH mempengaruhi keseimbangan bentuk molekul dan ionic

OH

eks = 285 em = 365 Int = 18

Phenol Phenolat

eks = 310 em = 410 Int = 10

5. Oksigen terlarut Adanya oksigen terlarut dalam larutan cuplikan menyebabkan intensitas fluoresensi berkurang sebab Oksigen terlarut oleh pengaruh cahaya dapat mengoksidasi senyawa yang diperiksa

6. Fotodekomposisi Diperlukan sumber cahaya dengan intensitas tinggi sehingga penguraian zat yang diperiksa lebih besar. 7. Suhu dan kekentalan Perubahan suhu dan kekentalan menyebabkan perubahan frekuensi banturan molekul-molekul.

8. Kekakuan struktur (structural rigidity) Struktur yang rigid (kaku) mempunyai intensitas yang tinggi

Fluoren

Bifenil EF = 0,20

Adanya -CH2- pada fluoren menyebabkan strukturnya lebih kaku

Pengaturan pH dapat merubah intensitas fluoresensi, Contoh : Phenol menjadi phenolat menaikkan fluoresensi Amina aromatik menjadi ammonium aromatik menurunkan fluoresensi Heterosiklis dengan atom N, S dan O mempunyai sifat fluoresensi Heterosiklis dengan gugus NH, jika medianya asam akan menaikkan intensitas fluoresensi

Perbedaan fluoresensi dengan spektrofotometri :

1. Kepekaan analisis pada spektrofluorimetri dapat dipertinggi dengan menaikkan intensitas sumber cahaya 2. Analisis spektrofluorimetri lebih selektif dan lebih sensitif

Keuntungan dari analisis fluoresensi

Kepekaan yang baik karena : 1. Intensitas dapat diperbesar dengan menggunakan sumber eksitasi yang tepat 2. Detektor yang digunakan seperti tabung pergandaan foto sangat peka 3. Pengukuran energi emisi lebih tepat daripada energi terabsorbsi 4. Dapat mengukur sampai kadar 10-4 10-9 M

Spektrofluorometri untuk mengukur kadar Kinin Sulfat

y Disiapkan larutan standard kinin yaitu 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3 ppm y y y y y y

dengan pengenceran dari larutan stok dengan 0,1 N H2SO4 Larutan kinin sulfat 1 g/ml dimasukkan ke dalam kuvet, kemudian ditempatkan ke dalam ruang pengukuran pada spektrofluorometer. Besar intensitas fluororesensi maksimum untuk monokromator eksitasi dari literatur dimasukkan pada alat spektrofluorometer. Besar intensitas fluororesensi maksimum monokromator emisi dari literatur dimasukkan pada alat spektrofluorometer. Dilakukan pengukuran intensitas fluororesensi (pada monokromator eksitasi) untuk blanko (asam sulfat 0,1 N). Dilakukan pengukuran intensitas fluororesensi (pada monokromator eksitasi) untuk masing-masing larutan yang diencerkan. Dilakukan pengukuran intensitas fluororesensi (pada monokromator eksitasi) untuk sampel.

a. Data Pengamatan Tabel 1. Pengamatan

Bahan Blanko Sampel 0,1 ppm 0,15 ppm 0,2 ppm 0,25 ppm 0,3 ppm Intensitas pada =450 nm 0,4 31 14 19.9 26 32 39

Panjang gelombang ( ) eksitasi : 350 nm Panjang gelombang( ) emisi : 300-400 nm Panjang Gelombang ( ) max : 450 nm Alat : Shimadzu Data Recorder DR-3

b. Pengolahan Data Pengenceran Larutan awal : 100 ppm 1. Dibuat Larutan Stok : 1 ppm Perhitungan V1.M1 = V2.M2 V1.100 ppm = 100 mL. 1ppm V1 = 1 mL 2. Larutan standar : 0,1 ppm V1.M1 = V2.M2 V1.1 ppm = 25 mL. 0,1ppm V1 = 2,5 mL 3. Larutan standar : 0,15 ppm V1.M1 = V2.M2 V1.1 ppm = 25 mL. 0,15ppm V1 = 3,75 mL

4. Larutan standar : 0,2 ppm V1.M1 = V2.M2 V1.1 ppm = 25 mL. 0,2ppm V1 = 5 mL 5. Larutan Standar : 0,25 ppm V1.M1 = V2.M2 V1.1 ppm = 25 mL. 0,25ppm V1 = 6,25 mL 6. Larutan Standar : 0,3 ppm V1.M1 = V2.M2 V1.1 ppm = 25 mL. 0,3ppm V1 = 7,5 mL

y Tabel 2. Pengolahan Data

Bahan Intensitas pada =450 nm 0,4 31 14 19.9 26 32 39 Intensitas Bahan-Blanko pada =450nm 30,6 13,6 19,5 25,6 31,6 38,6

Blanko Sampel 0,1 ppm 0,15 ppm 0,2 ppm 0,25 ppm 0,3 ppm

y Dari grafik didapatkan persamaan regresi:

y = bx + a I = m.C + Io I = 124,2 C + 0,94 Dengan perhitungan kalkulator didapat R2 = 1 Maka dapat diketahui konsentrasi sampel dengan cara substitusi nilai intensitas sampel dikurangi blanko pada panjang gelombang 450nm. I sampel = 30,6 I = 124,2 C + 0,94 I = 124,2 C + 0,94 C = 0,23 ppm Dengan faktor pengenceran : 20 kali Maka konsentrasi sebenarnya dari larutan sampel yaitu kinin sulfat adalah sebesar 0,23 x 20 = 4,6 ppm

Sekian dan Terimakasih WASSALAM