Introdução à Microbiologia Geral

MICROBIOLOGIA GERAL
2009/2010
Licenciatura em Bioqumica
3 Ano
Joana Maria Soares Pereira
FCUP/ICBAS
2009/2010
Microbiologia geral
INTRODUO MICROBIOLOGIA
HISTRIA E EXTENSO DA MICROBIOLOGIA
A Microbiologia
O microorganismos apresentam beneficios para a sociedade, entre eles: Podem ser necessrios na produo de, po, queijo, cerveja, ingurte, antibiticos, vacinas, Vitaminas, Enzimas e muitos outros produtos importantes; So uma fonte de nutrientes na bases das cadeias e redes alimentares ecolgicas; So componententes indispensveis do nosso ecossistema. Eles tornam possiveis os ciclos do carbono, oxignio, azoto e enxofre que ocorrem nos sistemas aqutico e terrestre:
No entanto, os microorganirmos tambm apresentam desvantagens para os humanos, tendo prejudicado tanto a sade humana como a sociedade: As doenas microbianas indubitavelmente tiveram um papel importante em eventos histricos, como o declinio do Imprio Romano e a conquista do Novo Mundo; Em 1347, a peste negra atingiu a Europa brutalmente e apenas em 1351 a praga j tinha matado 1/3 da populao. Durante os 80 anos seguintes, a doena surgiu de novo e de novo, eventualmente matando 75% da populao Europeia. Acredita-se que este desastre mudou a cultura Europeia, preparando o Renascimento; Em 1900, as doenas infecciosas constituiam as principais causas de morte nos paises desenvolvidos e no desenvolvidos. No entanto, nos tempos correntes as doenas infecciosas apresentam uma maior importncia neste facto, em paises mais desenvolvidos.
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Entre 1900 e 2000, trs factores mudaram para que tal disparidade nas taxas de mortalidade causadas por doenas infecciosas baixasse: 1. Por volta dos anos 30/40 chegaram os antibiticos, por descoberta da Penicilina; 2. As vacinas tiveram um impacto tremendo no tratamento de doenas infecciosas; 3. Foram tomadas mediddas higinicas. Assim, facil compreender que paises menos desenvolvidos sejam bastante fustigados pelas doenas infecciosas, sendo estas a principal causa de morte, apresentando um panorama idntico ao do observado no nicio do sculo XX. As doenas infecciosas de maior importncia nos nossos tempos so: SIDA; Malria; Tuberculose.
Literalmente, podemos definir: Microbiologia estudo dos organismos e agentes demasiado pequenos para serem claramente observados a olho n, isto , o estudo dos microorganismos.
Como os objectos com menos de um mlimetro de dimetros no podem ser observados claramente e devem ser examinados com um microcscpio, a microbiologia foca-se principalmente em estudar organismos e agentes to ou mais pequenos: Bactrias (a); Virus (b); Alguns fungos (c); Algumas algas; Protozorios (d).
No entanto, alguns membros destes grupos podem ser visiveis a nivel n, particularmente algumas algas e fungos. Exemplos so fungos do po e as algas filamentosas.
A Descoberta dos Microorganismos

Mesmos antes dos microorganismos serem observados, alguns investigadores suspeitaram da sua existncia e sua responsabilidade em doenas: O filsofo romano Lucretius (98-55 a.c.) e o mdico Girolamo Fracastoro (1478-1553) sugeriram que as doenas eram causadas por criaturas vivas invisiveis.
No entanto, a primeira pessoa a observar e descrever microorganismos com preciso foi o microscopista amador holands Antony van Leeuwenhoek (1632-1723):
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Leeuwenhoek trabalhava como alfaiate, mas passava a amaior parte do seu tempo livre a construir pequenos microscpios compostos por duas lentes de vidro convexas encaixadas entre duas placas de prata; Os seus microscpios conseguiam ampliar entre 50 a 300 vezes, e ele conseguia iluminar os seus espcimes liquidos colocando-os entre duas peas de vidro e lanando luz num angulo de 45; Isto proporcionou que Leeuwenhoek observasse bactrias e protozorios, que ento desenhava.
O Conflito da Gerao Espontnea

Nos primeiros tempos, as pessoas acreditavam na gerao espontnea, ou seja, que os organismos se podiam desenvolver espontanemaente de matria no viva. Esta imagem foi desafiada pelo mdico italiano Francesco Redi (1626-1697), que efectuou uma srie de experincias com carne em decomposio estudando a habilidade de produzir larvas:
Experincia a b c
Descrio Pedao de carne descoberta Pedao de carne coberta com papel Pedao de carne coberta com uma gaze fina
Resultados Moscas depositaram ovos na carne e larvas desenvolveram-se No houve produo espontnea de larvas No houve produo espontnea de larvas mas as moscas foram atraidas pelo conteudo e depositaram os seus ovos e as larvas produziram-se
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Assim, a gerao de larvas por carne em decomposio resultou da presena de ovos de mosca, e a carne no gera larvas espontneamente, como antes se previa. A descoberta dos microorganismos por Leeuwenhoek renovou a controvrsia: Alguns propuseram que os microorganismos surgiam pos gerao espontnea enquanto os organismos maiores no.
Em 1748, o padre ingls John Needham (1713-1781) reportou os resultados das suas experincias quanto gerao espontnea: Needham levou ebolio caldo de carne de carneiro e, depois, fechou os frascos hermeticamente; Eventualmente, muitos dos frascos tornaram-se turvos e continham microorganismos; Ele pensou que a matria orgnica continha uma fora vital que deveria conferir propriedades vitais matria no viva.
Alguns anos mais tarde, o padre e naturalista italiano Lazzaro Spallanzani (1729-1799) melhorou o design experimental de Needham: Selou primeiro os frascos de vidro, que continham gua e sementes; Se os frascos selados fossem colocados em gua em ebolio durante de uma hora, no havia crescimento enquanto os frascos se mantinham selados; Ele props que o ar carregava germes para o meio de cultura, mas tambm comentou que o ar externo deveria ser necessrio para o crescimento de animais existentes j no meio.
Aqueles que suportavam a hiptese da gerao espontnea mantinham que o aquecimento do ar em frascos selados destruia a sua habilidade de suportar vida. Vrios investigadores centraram-se em estudar tais argumentos: Thodore Schwann (1810-1882) permitiu que ar entrasse em frascos contendo uma soluo de nutrientes estreis depois do ar ter passado atravs de um tubo vermelho quente, e os frascos continuaram estreis; Subsequentemente, Friedrich Schroder e Theodor von Dusch permitiram a entrada de ar em frascos com meio esterilizado pelo calor depois deste passar atravs de l de algodo estril e nenhum crescimento ocorreu, apesar do algodo no ter sido aquecidos; Apesar destas experincias, o naturalista francs Felix Pouchet aclamava em 1859 ter realizado experincias que provavam que o crescimento microbiano podia ocorrer mesmo sem contaminao do ar.
Estas constataes provocaram Louis Pasteur (1822-1895) que se centrou e acabou com a discusso de uma vez por todas: Pasteur primeiro filtrou ar atravs de algodo e descobriu que objectos que continham esporos de plantas ficaram presos. Se o pedao de algodo fosse colocado em meio estril depois de ar ter sido filtrado atravs dele, havia crescimento de microorganismos; Depois, ele colocou solues nutritivas dentro de frascos, aqueceu os seus pescoos numa chama, e dobrou-os numa variedade de curvas, enquanto os mantinha abertos para a superficie. Pasteur levou as solues ebolio durante alguns minutos e permitiu que amornassem. Nenhum crescimento ocorreu apesar do conteudo dos frascos estar exposto ao ar;
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Pasteur concluiu que no ocorreu nenhum crescimento porque o p e os germes teriam sido retidos nas paredes dos pescoos curvados. Se estes fossem quebrados, o crescimento comeava imediatamente.
Assim, Pasteur no apenas resolveu a controvrsia por volta de 1861 mas tambm mostrou como manter as solues estreis. O mdico ingls John Tyndall (1820-1893) ps mais um ponto final na hiptese da gerao espontnea em 1877 demonstrando que o p de facto carregava hermes e que, se o p estivesse ausente, o caldo manteria-se estril mesmo quando exposto ao ar.
O Papel dos Microorganismos no Desenvolvimento de Doenas

A importncia dos microorganismos no desenvolvimento de doenas no foi imediatamente bvio para as pessoas, e demorou alguns anos para que os cientistas estabelecessem a ligao entre microorganismos e patologias: O reconhecimento do papel dos microorganismos dependeu fortemente do desenvolvimento de novas tcnicas para o seu estudo; Assim que se tornou claro que as doenas podiam ser causadas por infeces microbianas, os microbiologistas comearam a examinar a forma pela qual os hospedeiros se defendiam contra os microorganismos e a estudar como a doena podia ser prevenida Cresceu a Imunologia.
Reconhecimento da Relao entre Microorganismo e o Desenvolvimento de Doenas Apesar de Fracastoro e outros terem sugerido que microorganismos invisiveis produziam doenas, a maior parte acreditava que as doenas eram devidas a causas como foras supernaturais, vapores txicos designados miasmas, e a desiquilibrios entre os quatro humores que se pensavam estar presentes no corpo: A ideia de que um desiquilibrio entre os quatro humores (sangue, fleuma, bilis amarela e bilis negra) levava a doena foi durante muito tempo aceite desde os tempos do mdico grego Galen (129-199).
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O suporte da teoria de que os germes estavam envolvidos no desenvolvimento de doenas, comeou a surgir no nicio do sculo XIX: Agostino Bassi (1773-1856) mostrou que um microorganismo pode causar uma doena quando demonstrou, em 1835, que a doena-da-seda era devida a uma infeco fungica; Em 1845, M. J. Berkeley provou que a grande praga da batata na Irlanad foi causada por fungos.
Seguindo o seu sucesso no estudo da fermentao, Louis Pasteur foi convidado pelo governo francs para investigar a doena-da-seda que estava a perturbar a industria da seda. Depois de alguns anos de trabalho, ele mostrou que a doena era devida a um parasita protozorio. A doena foi controlada pelo aumento de lagartas a partir de ovos produzidos por traas saudveis. Evidncias indirectas que os microorganismos constituiam agentes para a doena humana surgiram a partir do trabalho do cirurgio ingls Joseph Lister (1827-1912) sobre a preveno da infeco de feridas: Lister ficou impressionado com os estudos de Pasteur sobre o envolvimento dos microorganismos na fermentao e putrefaco e desenvolveu um sistema de cirurgia antisptica designada para prevenir a entrada de microorganismos nas feridas; Os instrumentos eram esterilizados, e era usado fenol nas vestimentas cirurgicas e, por vezes, pulverizado sobre a rea cirurgica; Como o fenol mata bactrias e preveniu as infecoes, provou-se indirectamente que os microorganismos estavam envolvidos nas infeces.
Evidncias directas do papel das bactrias em doenas surgiram do estudo do antraz pelo mdico alemo Robert Koch (1843-1910). Koch usou o citrio proposto pelo seu professor, Jacob Henle (18091885), para estabelecer a relao entre o Bacillus anthracis e o antraz:
Koch injectou ratos saudveis com material de animais doentes, e os ratos ficaram doentes; Depois de transferir antraz por inoculao atravs uma srie de 20 ratos, incubou uma pea de bao contendo o bacilo de antraz em soro bovino; Os bacilos cresceram, reproduziram-se e produziram esporos; Quando os bacilos ou esporos foram injectados em ratos, estes desenvolevram antraz.
O seu critrio para prvar a relao causal entre microorganismos e uma doena especifica so conhecidos como os Postulados de Koch, e podem ser resumidos a: 1. O microorganismo tem de ser encontrado em todos os individuos doentes e em nenhum saudvel; 2. O microorganismo suspeito deve ser isolado e cultivado em cultura pura; 3. Quando inoculado num animal saudvel, o microorganismo deve causar nele a mesma doena; 4. O mesmo microorganismo deve ser isolado do hospedeiro doente.
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O Desenvolvimento de Tcnicas para o Estudo de Patognios Microbianos Durante os estudos de Koch sobre as doenas bacterianas, tornou-se necessrio isolar patognios microbianos suspeitos: 1. Primeiro, Koch cultivava bactrias nas superficies estreis de batatas levadas ebolio cortadas. Isto era insatisfatrio porque as bactrias nem sempre cresciam bem em batatas; 2. Ele tentou ento solidificar meio liquido com gelatina, e colnias de bactrias separadas desenvolviam-se depois da superficie ser listrada com uma amostra bacteriana. No entanto, a gelatina no foi um bom agente solidificante porque esta era digerida por muitas bactrias e derretia quando a temperarura ia acima dos 28 C; 3. Uma melhor alternativa foi sugerida pela esposa de Walther Hesse, um assistente de Koch. Esta sugeriu o uso de agar como agente solidificante, j que ela o usava com sucesso na produo de compostas. O agar no foi atacado pela maior parte das bactrias e no derretia at atingir uma temperatura de 100 C; 4. Um dos assistente de Koch, Richard Petri, desenvolveu a placa de petri, um recipiente para o meio de cultura slido.
Estes desenvolvimentos tornaram possivel o isolamento de culturas puras que continham apenas um tipo de bactrias e estimulou directamente o progresso em todas as reas da bacteriologia. Koch tambm desenvolveu meio adequado para o crecimento de bactrias isoladas do corpo humano: Devido sua semelhana com os fluidos corporais, extractos de carne e produtos da digesto proteica eram usados como fontes de nutrientes; O resultado era o desenvolvimento de meios de agar nutritivos, que ainda so usados hoje em dia.
O ESTUDO DA ESTRUTURA MICROBIANA
Pesquisa Bacteriolgica
Os estudo dos microorganismos, mais comummente de bactrias, segue uma srie de passos at se poder estudar a espcie em questo: 1. Crescimento do microorganismo a paritr de uma amostra, em meios de cultura apropriados; 2. Isolamento em cultura pura, em meios selectivos e slidos; 3. Expanso em meio liquido, visto que a cultura pura apenas fornece uma pequena quantidade de microorganismos. A expanso premite a obteno de uma grande quantidade de espcie pura; 4. Caracterizao, via colorao, estudos bioquimicos, estudos genticos, etc
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Meios de Cultura
A maior parte do estudo da microbiologia depende da habilidade de crescer e manter microorganismos no laboratrio e isto possivel apenas se estiverem disponiveis meios de cultura adequados. Meio de cultura preparao liquida ou slida usada para o crescimento, transporte e armazenamento de microorganismos.
Para ser eficiente, o meio deve conter todos os nutrientes que os microorganismos requerem para crescer: Meios especializados so essenciais no isolamento e identificao de microorganismos, no teste de sensibilidade a antibiticos, anlise de gua e alimentos, na microbiologia industrial e noutras actividades; Apesar de todos os microorganismos necessitarem de fontes de energia, carbono, azoto, fosforo, enxofre e vrios minerais, a composio precisa de um meio satisfatrio depender da espcie que se quer cultivar pois os requerimentos nutricionais variam altamente.
Frequentemente, um meio usado para seleccionar e crescer microorganismos especificos ou para permitir a identificao de uma espcie em particular. Segundo a dificuldade de produo de um meio nutritivo adequado e, consequentemente, o isolamento de uma espcie, podemos encontrar diferentes tipos de microorganismos face s necessidades de nutrientes: Prototrficos microorganismos que so nutricionalmente auto-suficientes e que podem existir num substrato de sais inorgnicos simples e com uma fonte de energia. Ou seja, conseguem sobreviver num meio minimo; Auxotrficos microorganismos que no se desenvolvem em meio minimo, requerendo para o seu crescimento a adio de um composto especifico, como um aminocido ou uma vitamina; Fastidiosos microorganismos que necessitam de meios de cultura e condies atmosfricas especificas para o seu isolamento. So exigentes nutricionalmente necessitam de um meio muito rico, sendo normalmente fornecidos esse nutriente por adio de sangue ao meio de cultura; Parasitas intracelulares obrigatrios microorganismos que apenas sobrevivem no interior de clulas hospedeiras. Um exemplo so os virus, que no apresentam maquinaria para replicao, necessitando de infectar uma clula para que sobreviva; No cultivveis - parasitas que necessitam de condies dificilmente alcanveis no laboratrio.
Conforme descemos na lista, a dificuldade de isolamento do tipo em questo vai aumentando, pois vaise tornando mais dificil atingir condies especificas no laboratrio, como temperatura, presso, nutrientes, etc O conhecimento do habitat normal de um microorganismo normalmnete util na seleco de um meio de cultura aproriado porque os requerimentos nutricionais reflectem as vizinhanas naturais. Podemos dividir os meios em diferentes tipos de meios dependendo de vrios critrios:
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Critrio Estado fsico Composio qumica Tipo de Meio Liquido Slido Definido Complexo Simples Selectivo Diferencial Enriquecido
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Objectivo
Meio Definido Alguns organimos, particularmente autotrfes fotolitotrficos como as cianobactrias e as algas eucaritas, conseguem crescer num meio relativamente simples contendo CO2 como fonte de carbono (normalmente adicionado como carbonato de sdio ou bicarbonato), nitrato ou amnia como fontes de azoto, sulfato, fosfato e uma variedade de minerais, especificos para cada espcie.
Meio Meio para Cianobactrias NaNO3 K2HPO43H2O MgSO47H2O CaCl22H2O cido citrico Citrato de amnia frrico EDTA Na2CO3 Soluo com traos de metais pH 7,4 Meio para E. coli Glucose Na2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO47H2O CaCl2 FeSO47H2O pH 6,8-7,0 Quantidade (g/L) 1,5 0,04 0,075 0,036 0,006 0,006 0,001 0,02 1,0 ml/L
Tais meios nos quais todos os componentes so conhecidos so designados meios defenidos. Estes meios so usados amplamente em investigao, visto serem uteis para identificar o que os microorganismos a estudar metabolizam. No entanto, nem todos os meios definidos so to simples como os apresentados na tabela.
1,0 16,4 1,5 2,0 200,0 mg 10,0 mg 0,5 mg
Meio Complexo Meios que contm alguns ingredientes de composio qumica desconhecida so meios complexos: Bastante uteis, visto que um nico meio complexo pode ser suficientemente rico e complexo para igualar as necessidades nutricionais de diferentes organismos; Em adio, podem ser algumas vezes necessrios porque os requerimentos nutricionais de um microorganismo podem ser desconhecidos, e portanto um meio definido no pode ser conhecido. Esta situao ocorre com muitas bactrias fastidiosas, algumas das quais por vezes requerem um meio contendo soro ou sangue.
Os meios complexos contm componentes indefenidos como peptonas, extracto de carne e extracto de levedura:
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Peptonas so hidrolizados proteicos preparados por digesto proteolitica parcial de carne, caseina, soja, gelatina e outras fontes proteicas. Servem como fontes de carbono, energia e azoto; Extractos de carne so extractos aquosos de carne magra e contm aminocidos, pptidos, nucletidos, cidos orgnicos, vitaminas e minerais; Extractos de leveduras so extractos aquosos de leveduras da cerveja e so uma excelente fonte de vitaminas B e de compostos carbonados e azotados.
Existem trs meios complexos usados normalmente: 1. Caldos de nutrientes; 2. Caldos de soja; 3. Agar MacConkey.
Meio Caldo de Nutrientes Peptona (hidrolisado de gelatina) Extracto de carne Caldo de soja Triptona (digesto pancretica de caseina) Peptona (digerido de soja) Glucose Cloreto de sdio Fosfato de dipotssio Agar de MacConkey Digerido pancretico de gelatina Digerido pancretico de caseina Digerido petidico de tecido animal Lactose Sais biliares Cloreto de sdio Vermelho neutro Violeta cristal Agar Quantidade (g/L) 5 3 17 3 2,5 5 2,5 17, 1,5 1,5 10 1,5 5 0,03 0,001 13,5
Se um meio slido necessrio para cultivo de microorganismos, um meio liquido pode ser solidificado com a adio de 1,0 a 2,0% de agar: Agar um polimero sulfatado composto principalmente por D-galactose, 3,6-anidro-L-galactose e cido D-glucornico e normalmente extraido de algas vermelhas; O agar est bem adaptado como agente solidificante pois depois de ser derretido em gua em ebulio pode ser arrefecido at cerca de 40 a 42 C antes de solidificar e no derreter de novo at que a temperatura atinja cerca de 80 a 90 C; tambm um agente solidificante excelente pois os microorganismos no o conseguem degradar.
Outros agente solidificantes podem ser usados: Geis de silica so usados no crescimento de bactrias autotrficas em meio slido na ausncia de substncias orgnicas e para determinar fontes de carbono para bactrias heterotrficas por suplementao do meio com vrios compostos orgnicos.
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Tipos de meios Meios como caldos de soja e agar de soja so designados meios simples pois suportam o crescimento de vrios microorganismos, sangue e outros nutrientes especiais devem ser adicionados a meios gerais para encorajara o crescimento de microorganismos fastidiosos, sendo esses meios especialmente fortificados designados meios enriquecidos (e.g. agar com sangue). Meios selectivos favorecem o crescimento de microorganismos particulares: Sais biliares ou corantes como fucsina bsica e violeta de crital favorecem o crescimento de bactrias gram-negativo pela inibio do crescimento de bactrias gram-positivo sem afectar os microorganismos gram-negativo; Agar Endo, agar eosina azul de metileno (EMB) e agar MacConkey, trs meios amplamente usados na deteco de E. coli e bactrias relacionadas em fornecimentos de gua, contm corantes que suprimem o crescimento bacteriano gram-positivo. O agar MacConley tambm contm sais biliares; As bactrias tambm podem ser seleccionadas por incubao com nutrientes que especialmente usam. Um meio contendo apenas celulose como fonte de carbono e fonte de energia bastante efecciente no isolamento de bactrias que digerem celulose; As possibilidades de seleco so infidveis e existem dezenas de meios selectivos especiais em uso.
Meios diferenciais so meios que distinguem entre diferentes grupos de bactrias e ainda permitem uma tentativa de identificao de microorganismos baseado nas suas caracteristicas biolgicas: Agar com sangue (Blood agar) tanto um meio diferencial e um meio enriquecido. Distingue entre bactrias hemoliticas e no-hemoliticas. Bactrias hemoliticas (e. g., vrios streptococcus e staphylococcus isolados das gargantes) produzem zonas limpas volta das colnias devido destruio dos eritrcitos. Permite a identificao de microorganismos patognicos; Agar MacConkey tanto um meio selectivo como diferencial. Como contem lactose e corante vermelho neutro, as colnias que fermentam lactose aparecem vermelhas e so facilmente distiguidas das colnias no fermentativas; Manitol-sal-agar tanto um meio selectivo como diferencial. constituido por manitol, extracto de carne, peptona, NaCl (7,5%), vermelho de fenol e agar. Como contem uma percentagem muito elevada de sal (normal 0,5%), selecciona bactrias capazes de sobreviver nestas condies, o que caracteristico do gnero Staphylococcus. Para alm disso, a presena de manitol, um polilcool que serve de fonte de carbono para algumas espcies de bactrias, permite o isolamento de espcies de Staphylococcus que fermentam este composto por mudana de cor do meio (vermelho amarelo) devida alterao de pH causada pelo fermentao. Esta alterao de cor caracteristica da espcie aureus deste gnero.
Escherichia coli EMB Meio Selectivo e diferencial
Blood agar Meio Enriquecido e Diferencial
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Gnero Staphylococcus
Staphylococcus aureus
Manitol-sal-agar Meio Selectivo e Diferencial
Isolamento de Culturas Puras

Em habitats naturais, os microorganismos normalmente crescem em populaes complexas e misturadas contendo vrias espcies. Isto apresenta um problema porque um nico tipo de microorganismo no pode ser estudado adequeadamente numa cultura misturada. Assim necessria uma cultura pura: Uma populao de clulas com origem numa nica clula que permite a caracterizao de uma espcie individual; Tem uma importncia to elevada que permitiu o isolamento de vrios agentes patognios responsveis por variadas patologias bacterianas humanas.
Existem vrios modos de preparar culturas puras: Spread plate e streak plate; Pour plate; Crescimento e morfologia da colnia.
Spread Plate e Streak Plate Se uma mistura de clulas espalhada numa superficie de agar de modo a que todas as clulas possam crescer em colnias completamente separadas, um crescimento macroscopicamente visivel ou o agrupamento de microorganismos num meio slido, cada colnia representa uma cultura pura. Podemos chegar a este produto de dois modos diferentes: 1. Spread plate (espalhamento) um mtodo rpido e directo de atingir o resultado. Um pequeno volume de mistura microbiana diluida contend cerca de 30 a 300 clulas transferido para o centro da placa de agar e espelhado por todas a superficie com uma vareta de vidro dobrada esterilizada pelo calor e com lcool. As clulas dispersas desenvolvem-se em colnias isoladas. Como o nmero de colnios dever igualar o nmero de organismos viveis na amostra, as spread plates podem ser podem ser usadas para quantificar a populao microbiana;
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2. Streak plates (estriamento) a mistura microbiana transferida para a extremidade de uma placa de agar com um zaragatoa, ou ansa estriada, e depois estriada pela superficie em quatro zonas, de modo a criar uma concentrao decrescente de colnias. No mesmo ponto, clulas nicas so deixadas na superficie do agar e desnvolvem-se em colnias separadas. No permite a quantificao devido ao gradiente, a sua vantagem ser rpido.
Em ambas as tcnicas, o isolamento com sucesso de colnias depende da separao espacial das clulas nicas. Assim, se quisermos fazer quantificao fazemos spread plate, mas se quisermos apenas separar fazemos streak plate porque mais rpido. Pour Plate Extensivelmente usada com fungos e bactrias, a pour plate tambm fornece colnias isoladas: A amostra original diluida vrias vezes para reduzir a populao microbiana suficientemente para obter colnias separadas na placa; Depois pequenos volumens de vrias amostras diluidas so misturados com agar liquido, que foi arrefecido at cerca de 45 C, e as misturas so derramadas em placas de petri estreis; A maior parte das bactrias e fungos no so mortos pelo exposio breve ao agar quente. Depois do agar solidificar, cada clula est fixa num local e forma uma colnia individual; Placas contendo entre 30 a 300 colnias so quantificadas. O numeor total de colnias iguala o numero de microorganismos viveis na amostra diluida; As clnias que crescem na superficie podem ser usadas para inocular meio fresco e preparar culturas puras.
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Este mtodo usado em alguns casos porque alguns microorganismos cerescem melhor nestas condies. Crescimento e Morfologia das Colnias O desenvolvimento das colnias na superficie do agar ajuda na identificao de bactrias pois espcies individuais normalmente formam colnias com tamanho e aparncia caracteristicas:
Quando uma populao misturada foi plaqueada apropriadamente, por vezes possivel identificar a colnia desejada baseado na sua aparncia geral e isso permite o seu uso na obteno de colnias puras.
A estrutura microscpica das colnias normalmente to varivel como a sua aparncia visual. Na natureza, as bactrias e muitos outros microorganismos normalmente crescem na superficie de biofilmes, contudo, por vezes no formam colnias discretas. Assim, a compreenso do crescimento das colnias importante, e o crescimento das colnias em agar tem sido frequentemente estudado: Geralmente o crescimento mais rpido ocorre na extremidade da colnia; O crescimento mais lento no centro; A autolise celular ocorre nas pores centrais mais velhas da mesma colnia.
Estas diferenas no crescimento parecem dever-se a gradientes de oxignio, nutrientes e produtos txicos na colnia: Na extremidade da colnia, oxignio e nutrientes esto presentes; No centro da colnia mais espesso que a extremidade. Conquequentemente, oxignio e nutrientes no se difundem rapidamente para o centro, produtos txicos metablicos no consgeuem ser rapidamente eliminados e o crescimento do centro da colnia abrabdado ou parado; Devido a estas alteraes ambientais na colnia, as clulas no cnetro vo morrendo enquanto as clulas perifricas podem crescer a taxas mximas.
As bactrias que crescem em superficies slidas como o agar podem formar colnias complexas e com formas complicadas: Esses padres variam com a disponibilidade de nutrientes e com a dureza da superficie de agar; A difuso e disponibilidade de nutrientes, a quimiotaxia bacteriana e a presena de liquido na superficie parecem ter papel importane na formao de um padro.
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Preparao e Colorao de Especimens

Apesar dos microorganismos poderem ser directamente examinados com o microcpio ptico, normalmente devem ser fixados e coloridos de modo a aumentar a sua visibilidade, acentuar caracteristicas morfolgicas especificas e preseva-los para estudo futuro. Fixao As clulas coloridas vistas ao microcpio devem manter-se vivas o maior tempo possivel para que seja possivel observar a sua estrutura interna, assim, a fixao o processo pelo qual as estruturas internas e externas das clulas e microorganismos so preservadas e fixadas nas suas posies originais: Inactiva enzimas que podem romper a morfologia da clula e endurece as estruturas celulares para que estas no se alterem durante a colorao e a observao; Durante o processo, um microorganismo normalmente morto e ligado firmemente lmina de vidro.
Existem fundamentalmente dois tipos de fixao: 1. Fixao pelo calor preserva a morfologia geral, mas no as estruturas internas; 2. Fixao quimica deve ser usada para proteger subestruturas celulares e a morfologia de microrganismos maiores e mais delicados. Os fixadores qumicos penetram as clulas e reagem com componetes celulares, normalmente proteinas e lipidos, para os tornar inactivos, insoluveis e no mveis. Misturas fixadoras comuns contm componetes como o etanol, cido actico, cloreto de mercurio, formaldeido e glutaraldeido. Corantes e colorao simples Os principais tipos de corantes usados na colorao de microorganismos apresentam duas caracteristicas comuns: 1. Apresentam grupos cromforos, grupos com ligaes duplas conjugadas que atribuem a cor ao corante; 2. Podem ligar-se s clulas por ligaes inicas, covalentes ou hidrofbicas. Por exemplo, um corante carregado positivamente liga-se a estruturas celulares carregadas negativamente. Os corantes ionizveis podem ser dividido em duas classes gerais baseado na natureza do seu grupo carregado: 1. Corantes bsicos azul de metileno, fucsina bsica, violeta de cristal, safranina, verde malaquito apresentam grupos carregados positivamente e so geralmente liagdos a sais de cloro. Ligam-se a molculas carregadas negativamente como cidos nucleicos e vrias proteinas. Como as superficies das clulas bacterianas so tambm carregadas negativamente, os corantes bscios so normalmente usados em bacteriologia; 2. Corantes acidicos eosina, rosa de bengal e fucsina cida possuem grupos carregados negativamente como carboxilos (-COOH) e hidroxilos fenlicos (-OH). Os corantes acidicos, devido ao seu grupo carregado negativamente, liga-se a estruturas celulares carregados positivamente. O pH pode alterar a eficincia da colorao visto que a natureza e o grau da carga dos componetes celulares altera-se com o pH. Assim:
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Os corantes aninicos coloram melhor sob condies acidicas, quando as proteinas e outras molculas carregam uma carga positiva; Os corantes bscios so mais eficientes a pHs mais altos.
Apesar das interaces inicas serem provavelmente o meio mais comum de ligao, os corantes tambm se ligam atravs de ligaes covalentes ou devido s suas caracterisitcas soluveis: O DNA pode ser colorido pelo procedimento de Feulgen, no qual o reagente de Schiff covalentemente ligado aos acares deosoxirribose depois de tratamento com cido hidroclrico; O preto do Sudo colora selectivamente lipidos pois lipossoluvel, no se dissolvendo em pores aquosas da clulas.
Frequentemente, os microorganismos podem ser coloridos muito satisfactoriamente por colorao simples, na qual um nico agente de colorao usado: O valor da colorao simples reside na sua simplicidade e facilidade de uso; Baseia-se na cobertura da amostra fixada com o corante por um periodo de tempo especifico, lavagem de excesso de corante com gua e secagem; Corantes bsicos como violeta de cristal, azul de metileno e carbolfucsina so frequentemente usado para determinar o tamanho, forma e arranjos das bactrias.
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Colorao diferencial Procedimentos de colorao diferencial dividem as bactrias em grupos separados baseado nas suas propriedades de colorao. Existem dois mtodos diferentes: 1. Colorao de Gram desenvolvida em 1884 pelo mdico dinamarqus Christian Gram, o mtodo de colorao mais usado em bacteriologia. um procedimento de colorao diferencial porque divide as bactrias em duas classes gram negativo e gram positivo baseado nas propriedades da parede celular; 2. Colorao lcool-cido permite a identificao de bacilos lcool-cido resistentes, como os agentes da tuberculose e da lepra. O procedimento da colorao de Gram o seguinte:
1. O esfregao corado com o corante bsico violetas de cristal, o corante primrio; 2. De seguida, tratado com uma soluo de iodo funcionando como um mordente, isto , o iodo aumenta a interaco entre a clula e o corante de modo a que a clula seja colorida mais eficientemente; 3. O esfregao depois descolorido por lavagem com etanol ou acetona. Este passo gera o aspecto diferencial da colorao de Gram: Bactrias Gram-positivo retm o violeta de cristal; Bactrias Gram-negativo perdem o violeta de cristal e ficam incolores. 4. Finalmente, o esfregao de novo colorido com outro corante simples bsico diferente do violeta de cristal. O mais comum o uso de safranina, que cora as bactrias gram-negativo de rosa a vermelho e deixa as gram-positivo com uma cor violeta escuro.
Clostridium perfringens Gram-positivo
Escherichia coli Gram-negativo
A colorao lcool-cido outro procedimento de colorao diferencial importante. Algumas espcies, particularmente as do gnero Micobactrium, no se ligam a corantes simples rapidamente e devem ser coradas por um mtodo mais severo, o mtodo de Ziehl-Neelsen: 1. O passo inicial o aquecimento do esfregao com uma mistura de fucsina bsica e fenol;
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2. Assim que a fucsina bsica penetra na clula com a ajuda do calor e do fenol, as clulas lcoolcido resistentes retm o corante e no perdem a cor rapidamente com uma lavagem com lcool-cido e mantm-se vermelhas. Isto deve-se ao grande conteudo lipidico da parede celular das bactrias lcool-cido resistentes, em particular o cido miclico um grupo de lipido ramificados que responsvel pela resistncia ao lcool-cido; 3. As bactrias lcool-cido no resistentes so descoloradas pelo lcool-acido e assim, coradas de azul pelo corante secundrio azul de metileno. Este ultimo mtodo usado para identificar Mycobacterium tuberculosis e M. leprae, os patognio responsveis pela tuberculose e pela lepra, respectivamente.
Mycobacterium leprae lcool-cido resistente
Colorao de Estruturas Especificas Vrios procedimentos de colorao especiais foram desenvolvidos ao longo dos anos para estudar esttruturas bacterianas especificas com o microscpio ptico. Uma das mais simples a colorao negativa: Uma tcnica que revela a presena de cpsula difusas volta da bactrias; As bactrias so misturadas com Indian ink ou corante de Nigrosina e espalhadas como uma camada fina numa lmina. Depois da colorao, as bactrias aparecem como corpos claros no meio do fundo azul escuro j que as particulas de tinta e corante no conseguem penetrar tanto na clula bacteriana nem na parede; A extenso da regio clara determinada pelo tamanho da cpsula e da clula; Existe uma pequena distoro da forma bacteriana mas a clula pode ser contrastada para melhor visibilidade.
Bactrias do gnero Bacillus e Clostridium formam uma estrutura excepcionalmente resitente capaz de sobreviver por longos periodo num ambiente no favorvel. Esta estrutura dormente designada endosporo visto que se densenvolve dentro da clula. A morfologia e localizao do endosporo varia entre espcie e normalmente a sua identificao tem certo valor. Os endosporos podem ser esfricos a elipticos e menores ou maiores em dimetro que a bactria parente. Os endosporos no so corados eficientemente pela maior parte dos corantes, mas quando corados so fortemente resistentes descolorao. Esta propriedade a base da maior parte dos mtodos de colorao de esporos: No mtodo de Schaeffer-Fulton, os endosporos so inicialmente coloridos pelo aquecimento das bactrias com verde malaquito, que um corante muito forte que penetra os endosporos; Depois do tratamento com verde malaquito, o resto da clula lavada do corante e colorida com safranina; Esta tcnica fornece um endosporo verde no interior de uma clula rosada.
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O flagelo bacteriano um organelo fino (10-30 nm de dimetro) semelhante com um fio que permite a locomoo e que s pode ser observado directamente usando o microscpio electrnico. Para observar-lo com o microscpio ptico, o flagelo espessado por mtodos de colorao do flagelo: No mtodo de Leifson este revestido com mordentes como tannis acid e potassium alum, e corado com pararosanilina; No mtodo de Grey este revestido com mordentes como tannis acid e potassium alum, e corado com fucsina bsica.
Os procedimentos de colorao do flegelo fornece informao taxonomica sobre a presena e padro distribuio do flagelo.
Klebsiella pneumoniae Colorao negativa
Bacillus cereus Colorao de esporos
Spirillum volutans Colorao do flagelo
TAXONOMIA MICROBIANA
Clulas Procariticas
As clulas procariticas apresentam uma morfologia simples e no apresentam um ncelo delimitado por uma membrana. Neste grupo esto imcluidas todas as bactrias. Mesmo uma examinao superficial do mundo microbiano mostra que as bactrias so um dos mais importantes grupos por qualquer critrio: Nmero de organismos; Ecologia geral; Importncia, ou importncia prtica, para os humanos.
Existem dois diferentes grupos de procariotas: Bacteria e Archaea. Ambas pertencentes s bactrias. Tamanho, forma e arranjo Ser de esperar que pequenos organismos, relativamente simples, como os procariotas, sero uniformes em forma e tamanho. Apesar de ser verdade que a maior parte dos procariotas so semelhantes em morfologia, existe uma grande variao devido a diferenas genticas e ecolgicas. Quanto s bactrias: Coccus clulas aproximadamente esfricas. Podem existir como clulas individuais, mas tambm associadas em arranjos caracteristicos que so frequentemente uteis na identificao bacteriana. Diplococcus surgem quando coccus se dividem e se mantm juntos formando pares.
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Longas cadeias de coccus resultam quando as clulas se aderem depois de divises repetidas num plano. Divises em dois ou trs planos podem produzir aglomerados simtricos de coccus; Bacillus clulas com forma de bastonete. Diferem consideravelmente em tamanho. A forma da terminao do basto varia entre espcies e pode ser achatado, arredondado, bifurcado ou cilindrico. Apesar da maior parte dos bacillus ocorrerem sozinhos, eles podem manter-se unidos depois da diviso para formar pares ou cadeias; Vibries algumas bactrias com forma de bastonete podem ser curvadas para formar virgulas distintas; Espirilos tal como nos vibries, algumas bactrias podem ser curvadas para formar espirais rigidos; Espiroquetas tal como os vibries e os espirilos, algumas bactrias podem ser curvadas para formar espirais flexiveis; Pleomrficas algumas bactrias podem apresentar vrias formas.
Em todos os casos, a forma da clula bacteriana determinada pela parede celular.
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As bactrias variam em tamanho tanto como em forma: As mais pequenas tm cerca de 0,3 m de dimetro, aproximadamente o tamanho dos maiores virus (os poxvirus); Recentemente, foram reportadas clulas ainda mais pequenas. Nanobactrias ou ultramicrobactrias tm entre 0,2 m e 0,05 m de dimetro. Pensava-se que a clula possivelmente mais pequena podia ter entre 0,14 m e 0,2 m, mas algumas nanobactrias so menores; A Escherichia coli, um bacilo com um tamanho normal, tem cerca de 1,1 a 1,5 m de largura e 2,0 a 6,0 m de comprimento; Algumas bactrias tornam-se muito grandes. Algumas espiroquetas ocasionalmente atingem 500 m em comprimento, e algumas cianobatrias tm cerca de 7 m de dimetro, o mesmo dimetro dos eritrcitos; Uma grande bactria vive no intestino do peixe-cirurgio. A Epulopiscium fishelsoni pode alcanar uma dimenso de 600 por 80 m, um pouco menor que um hifen escrito; Mais recentemente, foi descoberta uma bactria ainda maior nos sedimentos do ocenao, a Thiomargarita namibiensis; Assim, algumas bactrias podem ser ainda maiores que a clula eucaritica comum, visto que uma clula animal ou vegetal tipica tem cerca de 10-50 m de dimetro.
Organizao Celular Procariota Uma variedade de estruturas encontrada nas clulas procariotas: Membrana plasmtica barreira selectivamente permevel, fronteira mecnica da clula, transportador de nutrientes e de resduos, localizao de vrios processos metablicos (respirao, fotossintese), deteco de sugestes ambientais para quimiotaxia; Vacolo gasoso permite a flutuao em ambientes aquticos;
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Ribossomas 70s sintese proteica. Diferentes dos eucariotas; Corpos de incluso armazenamento de carbono, fosfato e outras substncias; Nucleoide localizao do material gentico (DNA); Espao periplasmico contem enzimas hidroliticas e proteinas de ligao para uptake e processamento de nutrientes; Parede celular fornece forma bactria e proteco contra a lise em solues diluidas; Cpsula resistncia fagocitose, aderncia a superficies; Fimbrias e pilosidades ligao a superficies e a outras bactrias; Flagelo movimento; Endosporo sobrevivncia em condies ambientais extremas; Plasmideo anel de DNA simples que pode conter genes importantes. DNA perifrico.
Nem todas as estruturas so encontradas em todos os gneros. Em adio, as clulas gram-positivo e as gram-negativo diferem, particularmente no que diz respeito s suas paredes celulares. Apesar destas variaes, as clulas procarioticas so consistentes na sua estrutura fundamental e componentes mais importantes: As clulas procarioticas so quase sempre revestidas por uma parde celular quimicamente complexa; Dentro desta parede, e separada desta pelo espao periplasmico, encontra-se a membrana plasmtica. Esta membrana pode ser invaginada para formar algumas estruturas membranares internas simples; Como a clula procaritica no apresenta organelos internos ligados membrana, o seu interior morfologicamente simples; O material gentico est localizado numa regio especifica, o nucleoide, e no est separado do citoplasma vizinho por membranas; Os ribossomas e corpos de incluso esto espalhados pela matriz citoplasmtica; Tanto as clulas gram-positivo e as gram-negativo podem usar flagelos para locomoo; Algumas clulas so revestidas por uma cpsula externa parede celular.
Estas clulas so morfologicamente mais simples que as clulas eucariotas.
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Clulas Eucariticas
As algas, fungos e protozorios eucariotas so tambm microorganismos e so extensivamente estudados. Estes organismos normalmente so extraordinariamente complexos: Bastante interessantes e membros proeminentes dos ecossistemas; Fungos e, em alguma extenso, algas so excepcionalmente uteis em microbiologia industrial; Vrios fungos e protozorios so patognios humanos importantes.
A diferena mais bvia entre clulas eucariotas e procariotas est no seu uso de membranas: As clulas eucariotas apresentam um ncleo delimitado por membranas; As membranas tm um papel proeminente na estrutura de muitos organelos.
Organelos so estruturas intracelulares que desempenham funes especificas nas clulas, de modo anlogo s funes dos orgos no corpo. No satisfatrio definir organelos como estruturas revestidas por membranas pois isso iria excluir componentes como ribossomas e flagelos. Comparando clulas procarioticas com eucarioticas, estas ultimas so muito mais complexas: Esta complexidade deve-se ao uso de membranas internas para vrios propsitos; A diviso do interior da clula eucariotica por membranas torna possivel a distribuio de diferentes funes bioquimicas e fisiolgicas em compartiemntos separados de modo a que ocorram mais facilmente de modo simultneo e coordenado; Maiores superficies membranare tornam possivel uma maior actividade respiratria e fotossinttica porque estes processos localizam-se exclusivamente em membranas; O complexo membranar intracitoplasmtico funciona como um sistema de transporte para mover materiais entre diferentes localizaes celulares; Sistemas membranares abundantes so provavelmente necessrios nas clulas eucariotas devido ao seu maior volume e necessidade de regulao adequada, actividade metabolica e transporte.
Os principais organelos eucarioticos so:

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Membrana plasmtica revestimento mecnico da clula, barreira selectivamente permevel com sistemas de transporte, medeia interaces clula-clula e a adeso a superficies, secreo; Matriz citoplasmtica ambiente para outros organelos, localizao de vrios processos metablicos; Microfilamentos, filamentos intermdios e microtubulos estrutura e movimentos da clula, formam o citoesqueleto; Reticulo endoplasmtico transporte de materiais, sintese de lipidos e proteinas; Aparelho de Golgi empacotamento e secreo de materiais para vrios propsitos, formao de lisossomas; Lisossomas digesto intracelular; Mitocndria produo de energia atravs do uso do Ciclo de Krebs, transporte de electres, fosofrilao oxidativa, e outras vias; Cloroplastos fotossintese; Ncleo armazenamento de informao gentica, centro de controlo da clula; Nuclolo sintese de RNA ribossomal, construo de ribossomas; Parede celular e pelicula d forma clula e protege-a; Cilios e flagelo moimento celular; Vacuolo armazenamento temporrio e transporte, digesto (vacuolos de nutrientes), balano osmtico (vacuolo contractil).
Evoluo Microbiana e Diversidade

A vida procaritica surgiu muito pouco depois da Terra arrefecer e muito provavelmente os primeiros procariotas era anaerobicos. As cianobactrias e a fotossintese, produtora de oxignio, desenvolveu-se provavelmente h cerca de 2,5 a 3,0 bilies de anoc e a diversidade microbiana aumentou bastante a partir do momento em que o oxignio se tornou disponivel.
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Os estudos de Carl Woese e dos seu colaboradores na sequenciao de rRNA de clulas procarioticas sugeriram que os procariotas se dividiram em dois grupos distintos bastante cedo:
BACTERIA
ACHAEA
EUCARYA
A rvore est dividida em trs ramos principais representando os trs grupos primrios: Bacteria, Archaea e Eucarya; Os grupos archaea e bactria divergiram primeiro, s depois os eucariotas se desenvolveram.
Estes trs grupos primrios so designados dominios e encontram-se abaixo dos neveis phylum e reino, sendo que os reinos tradicionais esto distribuidos entre estes trs dominios. Os dominios diferem bastante entre eles: Eucarya engloba os organismos eucarioticos com membrana lipidica costituida por diesteres de glicerol e com rRNA eucarioticos; Bacteria contem clulas procariotas com rRNA bacteriano e lipidos membranares que so glicerol diacil dieteres; Archaea composto por procariotas que contm isoprenoide glicerol diter ou diglicerol tetraeter nas sua membranas e rRNA archaea.
Parece provavel que as clulas eucarioticas modernas surgiram dos eucariotas h cerca de 1,4 bilies de anos.
Categorias Taxonmicas
Na preparao de um esquema de classeificao, coloca-se o microorganismo dentro de um grupo pequeno e homogeneo que ele proprio um membro de grupos maiores que no se sobrepoem num arranjo hierarquico. A categoria une os grupos ao nivel a baixo, com base em propriedades compartilhadas: Na taxonomia procariota, os niveis mais usados, em ordem ascendente, so espcie, gnero, familia, ordem, classe e filo; Grupos microbianos em cada nivel apresentam nomes com terminaes ou sufixos caracteristicos de cada nivel.
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O grupos taxonmico bsico na taxonomia microbiana a espcie. No entanto, a definio de espcie para organismos superiores difere da usada pelos microbiologitas: Espcies de organismos superiores grupos de populaes que se podem cruzar reprodutivelmente isoladas de outros grupos. Esta definio satisfatria para organismos capazes de se reproduzir sexualmente mas no para a maior partes dos microorganismos porque estes no se reproduzem deste modo; Espcies de procariotas coleco de estirpes que partilham vrias propriedades estveis e diferem significativamente de outros grupos de estirpes.
No entanto, esta definio de espcies procariotas muito subjectiva e pode ser interpretada de vrias formas. Assim, foram propostas definies mais precisas: Uma espcie (genomospcies) uma coleco de estirpes que apresentam G+C semelhante e 70% ou mais de semelhana, o que julgado por experincia de hibridao de DNA; Idealmente, uma espcie tambm deveria ser fenotipicamente distinguida de outras espcies semelhantes.
Uma estirpe uma populao de organismos que distinguida pelo menos de uma outra populao numa categoria taxonmica especifica. Considera-se que ter descendido de um nico organismos ou de uma cultura pura isolada. As estripes dentro de uma espcie podem diferir ligeiramente de vrios modos: Biovars so estirpes procariotas variantes caracterizadas por diferenas fisiolgicas e bioquimicas; Morfovars so estirpes procariotas que diferem morfologicamente; Serovars so estirpes que apresentam propriedades antignicas distintivas.
Uma etsirpes de uma espcie designada de estirpe tipo e normalmente uma das primeiras estirpes a ser estudada e mais caracterizada que outras estirpes. No entanto, no tem de ser o membro mais representativo. Nomenclatura Cada espcie associada a um gnero, a categoria taxonmica acima da espcia. Um gnero um grupo bem definido de uma ou mais espcies que claramente separada de outro gnero.
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Os microbiologistas designam os microorganismos usando o sistema binomial. O nome latinizado, em itlico, consiste em duas partes: Escherichia coli 1 parte 2 parte
1. A primeira parte, que escrita com letra grande, o nome genrico. Pode alterar se o microorganismo for atribuido a outro gnero devido a nova informao. Pode ser abreviado usando apenas a primeira letra (Escherichia E.); 2. A segunda parte, que no escrita com letra grande, o cognome especifico. Este cognome estvel. Classificao Fentica Vrios taxonomistas mantm que a classificao mais natural aquela com maior contedo informativo: Uma boa classificao deve remeter para a diversidade biolgica e ainda clarificar a funo de uma estrutura morfolgica.
Por exemplo, se a mobilidade e flagelos esto sempre associados em microorganismos particulares, sensato supor que os flagelos esto envolvidos em pelo menos alguns tipos de mobilidade. Quando visto desta forma, o melhor sistema de classificao ser o sistema fentico, que agrupa os organismos baseado em semelhanas mutuas das suas caracteristicas fenotipicas: Apesar de estudos fenticos poderem revelar possiveis relaes evolucionrias, no dependem de anlises filogenticas; Comparam vrios traos se assumirem que algumas caracteristicas so mais importantes filogeneticamente que outras, isto , traos no ponderados so empregues para estimar a semelhana geral; Deste modo, a melhor classificao fentica aquela construida comparando o maior numero de atributos possivel. Organismos que partilham vrias caracteristicas formam um grupo ou taxa comum.
Taxonomia Numrica O desenvolvimento de computadores tornou possivel a aproximao numrica conhecida como taxonomia numrica: Agrupamento por mtodos numerico de unidade taxonmicas em taxa com base nos seus estados caracteristicos; Informao acerca da propriedade do organismo convertida numa forma adequada para anlise numrica e depois comparada por computador; A classificao resultante baseada na semelhana geral, depois da comparao de vrias caracteristicas, sendo que todas tm o mesmo peso; Esta aproximao no podia ser efectuada antes do aparecimento de computadores devido ao grande numero de clculos envolvidos.
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Os resultados da anlise taxonomica numrica so normalmente sumariados num diagrama semelhante a uma rvore filogentica designado dendrograma: O diagrama normalmente colocado com um eixo graduado em unidades de similaridade; Cada ponto de ramificao corresponde ao valor de similaridade que relaciona os dois ramos.
Classificao Filogentica Sistemas filogenticos ou de classificao filtica so sistemas baseados nas relaes evolucionrias em vez de semelhanas gerais: O termo filogenia refere-se ao desenvolvimento evolucionrio das espcies; Este mtodo complicado para procariotas e outros microorganismos, principalmente devido falta de bons registos fsseis; A comparao directa de material gentico e de produtos de genes, como RNA e proteinas, supera vrios desses problemas.
Principais Caracteristicas usadas em Taxonomia

Vrias caracteristicas so usadas na classificao e identificao de microorganismos. Por razes de clareza, as caracteristicas foram divididas em dois grupos:
Clssicas Morfologia Fisiologia e Metabolismo Ecologia Gentica Moleculares Proteinas Conteudo do material gentico (G+C) Hibridao de cidos nucleicos Sequenciao de cidos nucleicos
Caracteristicas Clssicas A abordagem clssica da taxonomia faz uso de caracteristicas morfolgicas, fisiolgicas, bioquimicas, ecolgicas e genticas. Estas caracteristicas foram empregues em taxonomia microbiana durante vrios anos. As caracteristica morfolgicas so importantes na taxonomia microbiana por vrias razes:
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A morfologia fcil de estudar e analisar, particularmente em microorganismos eucariotas e em procariotas mais complexos; Comparaes morfolgicas so valiosas porque caracteristicas estruturais dependem da expresso de vrios genes, so geneticamente estveis, e, pelo menos em eucariotas, normalmente no variam consideravelmente com alteraes ambientais.
Assim, semelhanas morfolgicas so um bom indicativo de relao filogenetica, e vrias caracteristicas morfolgicas diferentes so empregues na classificao e identificao de microorganismos:
Caracteristica Forma celular Tamanho celular Morfologia da colnia Caracteristicas ultraestruturais Comportamento da estripe Cilios e flagelos Mecanismos de mobilidade Forma e localizao dos endosporos Morfologia e localizao dos esporos Incluses celulares Cor Grupos microbianos Todos os grupos principais Todos os grupos principais Todos os grupos principais Todos os grupos principais Bactrias, alguns fungos Todos os grupos principais Bactrias, espiroquetas Bactrias que formam endosporos Bactrias, algas, fungos Todos os grupos principais Todos os grupos principais
Apesar do microscpio optico ter vindo a ser uma ferramenta bastante importante, o seu limite de resoluo de cerca de 0,2 m, o que reduz a sua utilidade na observao de microorganismos e estruturas mais pequenas. Este problema foi ultrapassado com o uso de microscpios electrnicos de transmisso e corrimento, que apresentam maior resoluo. Caracteristicas fisiolgicas e metablicas so bastante teis porque esto directamente relacionadas com a natureza e actividade das enzimas e proteinas transportadoras microbianas. Como as proteinas so produtos de genes, a anlise destas caracteristicas fornece uma comparao indirecta do genoma microbiano. As principai caracteristicas fisiolgicas e metablicas usadas na identificao e classificao so: Fontes de carbono e de azoto; Constituintes da parede celular; Fontes de energia; Tipo nutricional geral; Temperatura ptima de crescimento; Luminescncia; Mecanismos de converso de energia; Mobilidade; Tolerncia osmtica; Relaes de oxignio; pH ptimo de crescimento; pigmentos fotossintticos; Requerimento e tolerncia salina; Metabolitos secundrios formados; Sensibilidade a inibidores metablicos e a antibiticos; Incluses de armazenamento.
Vrias propriedades so ecolgicas na natureza visto que afectam a relao dos microorganismos com o seu ambiente. Por vezes, so taxonomicamente valiosas porque mesmo microorganismos bastante relacionados podem diferir consideravelmente no que diz respeito a caracteristicas ecolgicas. Alguns exemplos de de propriedades ecolgicas taxonomicamente importantes so: Padres de ciclo de vida; Natureza de relao simbitica;
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Habilidade de causar doena num hospedeiro particular; Preferncias de habitat, como requerimentos de temperatura, pH, oxignio e concentrao osmtica.
Anlise Gentica Como a maior parte dos eucariotas so capazes de se reproduzir sexualmente, a anlise gentica tem sido consideravelmente util na classificao destes organismos. Como j mencionado, as espcies so definidas em termos de possibilidade de reproduo sexuada. Apesar dos procariotas no se reproduzirem sexuadamente, o estudo da troca de genes cromossmicos atravs de transformao e conjugao por vezes util na sua classificao: A transformao pode ocorrer entre diferentes espcies procarioticas mas raramente entre gneros. A demonstrao da tranformao entre duas estirpes fornece evidncia de uma relao proxima visto que esta no pode ocorrer a no ser que os genomas seja minimamente semelhantes. Apesar da transformao ser util, os seus resultados por vezes so dificeis de interpretar porque uma ausncia de transformao pode resultar de outros factores. Estudos de conjugao tambm fornecem dados taxonomicamente uteis, particularmente com as bactrias entricas. Por exemplo, Escherichia pode sofrer conjugao com o gnero Salmonella e Shigella mas no com Proteus e Enterobacter. Estas observaes encaixam com outros dados mostrando queos primeiros trs detes gnero esto mais relacionados entre eles do que com Proteus e Enterobacter.
Os plasmideos so sem duvida importantes em taxonomia porque esto presentes na maior parte dos generos bacterianos, e podem conter genes que codificam trao fenotipicos: Como os plasmideos podem ter efeitos significantes na classificao se carregarem o gene para um trao de grande importncia no esquema de classificao, melhor basear a classificao em vrias caracteristicas; Quando a identificao de um grupo baseada em poucas caracteristicas e algumas so codificadas por genes dos plasmideos, podem resultar erros; Por exemplo, a produo de sulfeto de hidrognio e a fermentao da lactose so bastante importantes na taxonomia de bactrias entricas, no entanto, genes para as duas caracteristicas podem advir de plasmideos ou do cromossoma bacteriano.
Caracteristicas Moleculares Algumas das abordagens mais poderosas na taxonomia so feitas atravs do estudo de proteinas e cidos nucleicos. Comos estes so tanto produtos directos de genes ou mesmo os genes em si, a comparao de proteinas e cidos nucleicos fornece informao consideravel acerca da relao verdadeira. Comparao de Proteinas As sequncias de aminocidos das proteinas reflectem directamente as sequncias de mRNA e, assim, relacionadas com as estruturas dos genes que as codificam. Assim, a comparao de proteinas de diferentes microorganismos bastante util taxonomicamente. Existem vrios modos de comparar proteinas:
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1. A abordagem mais directa determinar a sequncia de aminocidos de proteinas com a mesma funo. As sequncias de proteinas com funes dissimilares normalmente alteram a velocidade diferentes, algumas seuncias alteram muito rapidamente enquanto outras so mais estveis. Todavia, se as sequncias de proteinas com a mesma funo forem semelhantes, os organismos que as possuem so provavelmente relacionados: As sequncias de citocromos e outras proteinas tranportadoras de electres, histonas, heat-shock proteins, proteinas de transcrio e traduo e uma variedade de enzimas metabolicas so usadas em estudos taxonomicos; 2. Como a sequenciao de proteinas lenta e dispendiosa, outros mtodos indirectos de comparao de proteinas so frequentemente empregues: A mobilidade electrofortica de proteinas util no estudo de relaes ao nivel das espcies e subespcies; Anticorpos so capazes de discriminar entre proteinas muito semelhantes; Tcnicas imunolgicas so usadas para comparar proteinas de diferentes microorganismos. 3. As propriedades fisicas, cinticas e regulatrias das enzimas tm sido empregues em estudos taxonmicos. como o comportamento enzimtico reflecte a sequncia de aminocidos, esta abordagem util no estudo de alguns grupos microbianos, e padres de regulao especificos de grupos foram j encontrados. Composio Bsica de cidos Nucleicos Os genomas microbianos podem ser directamente comparados e semelhanas taxonomicas podem ser estimadas de vrias formas. A tcnica mais simples a determinao da composio bsica do DNA: O DNA contem quatro bases purinas e pirimidinas: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T); No DNA em cadeia dupla, A emparelha com T e G emparelha com C; Assim, a razo (G+C)/(A+T) ou conteudo G+C, a percentagem de G+C no DNA reflecte a sequncia base e varia com alteraes na sequncia.
A composio base do DNA pode ser determinada de vrios modos. Apesar do conteudo G+C poder ser alcanado depois de hidrlise do DNA e anlise das suas bases com HPLC, mtodos fisicos so mais fceis e mais usados. O conteudo G+C normalmente determinado apartir da melting temperature (Tm) do DNA: No DNA de cadeia dupla, trs pontes de hidrognio juntam pares de bases GC, e duas ligaes ligam AT; Como resultado, DNA com maior conteudo de G+C ter maior numero de pontes de hidrognio e as suas cadeias sero separadas a temperaturas mais altas, isto , ter maior Tm; Este processo pode ser seguido espectrofotometricamente porque a absrovncia de luz UV a 260 nm pelo DNA aumenta durante a separao;
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Quando uma amostra de DNA lentamente aqucida, a abosrvncia aumenta enquanto as ligaes de hidrognio so quebradas e atinge um plateau quando todo o DNA se torna numa nica cadeia; O ponto central da curva crescente fornece a Tm, uma medida directa do conteudo G+C.
Por outro lado, dado que a densidade do DNA tambm aumenta linearmente com o conteudo G+C, a percentagem de G+C pode ser obtida por centrifugao do DNA num gradiente de densidade de CsCL. O conteudo G+C de vrios microorganismos foi j determinado. O conteudo em G+C do DNA dos animais e das plantas superiores est entre 30 e 50%, enquanto o DNA dos microorganismos procarioticos e eucarioticos varia bastante no que diz respeito ao conteudo de G+C: O conteudo em G+C procariotico o mais varivel, variando entre 25 e 80%; Apesar desta variao, o conteudo em G+C das estirpes numa espcie particular constante; Se dois organismos diferirem no conteudo em G+C em mais de cerca de 10%, os seus genomas apresentam sequncias consideravelmente diferentes; Por outro lado, no seguro assumir que organismos com conteudo G+C bastante semelhantes tambm apresentam sequencias de bases de DNA semelhantes pois duas sequncias de bases bastante diferentes podem ser construidas a partir das mesmas propores de AT e GC; Apenas se dois microorganismos forem semelhantes filogeneticamente que o seu conteudo G+C sugere uma relao.
Os dados do conteudo de G+C so taxonomicamente valiosos pelo menos de dois modos: 1. Podem confirmar o esquema taxonomico desenvolvido usando outros dados. Se organismos no mesmo txon so demasiado diferentes em conteudo G+C, provavelmente esse txon deve ser dividido; 2. O conteudo G+C parece ser util na caracterizao de gneros procarioticos visto que a variao dentro de um gnero normalmente inferior a 10% enquanto a diferena entre gneros bastante superior. Hibridao de cidos Nucleicos A semelhana entre genomas pode ser comparada mais directamente pelo o uso dos estudos de hibridizao de cidos nucleicos: Se uma mistura de DNA de cadeia simples formada pelo aqucimento de DNA de cadeia dupla arrefecida e mantida a temperaturas inferiores a Tm em cerca de 25 C, sequncias com sequncias de bases complementares reassociam-se para formar molculas de DNA de cadeia dupla estveis, enquanto cadeias no complementares mantm simples; Como cadeias com sequncias semelhantes, mas no idnticas, se associam para formar hibridos de DNA de cadeia duplas menos estveis, a incubao da mistura a cerca de 30 a 50 C inferior a Tm permitir a formao de hibridos mais diversos;
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A incubao a cerca de 10 a 15 C abaixo da Tm permite a formao de hibridos apenas com cadeias quase idnticas.
Numa das tcnicas de hibridizao mais usadas, filtros de nitrocelulose com cadeias de DNA no radioactivas ligadas so incubadas a temperatura adequada com fragmentos de DNA marcados radioactivamente. Depois dos fragmentos radioactivos hibridizarem com o DNA de cadeia simples ligado membrana, esta lavada para remover DNA no hibridizado e a radioactividade medida: A quantidade de radioactividade ligada ao filtro reflecte a quantidade de hibridao e, assim, a semelhana entre sequncias de DNA.
O grau de homolgia expresso em percentagem de radioactividade experimenatl retida no filtro comparada com a percentagem da reactividade do DNA homologo sobre condies semelhantes: Duas estirpes cujos DNA mostram pelo menos 10% de relao em condies optimas de hibridao e menos de 5% de diferena na Tm so consideradas membros da mesma espcie.
Se molculas de DNA so muito diferentes em sequncia, no formaro um hibrido estvel e detectvel. Assim, a hibridizao de DNA-DNA usada apenas para o estudo de microorganismos relacionados. Microorganismos relacionados mais distantemente so comparados por hibridizao DNA-RNA, usando RNA ribossomal ou de transferncia radioactivo: Relaes distantes podem ser detectadas porque genes de rRNA e tRNA representam apenas uma pequena proporo do DNA total do genoma e no evoluiram to rapidamente como outros genes microbianos; A tcnica semelhante empregue para a hibridizao DNA-DNA; DNA ligado a uma membrana incubado com rRNA radioactivo, incubado e contado.
Sequenciao de cidos Nucleicos Apesar da utilidade da determinao do conteudo G+C e dos estudos de hibridizao de cidos nucleicos, estruturas genomicas podem ser directamente comparadas apenas por sequenciao de DNA e RNA: dada maior ateno s sequncias de rRNAs de 5S e 16S isolados de subunidades 50S e 30S, respectivamente, de ribossomas procariotas;
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Os rRNAs so quase ideias para estudos da evoluo microbiana e de relao visto serem essenciais para organelos criticos encontrados em todos os microorganismos. O seu papel funcional o mesmo em todos os ribossomas; As suas estruturas alteram muito lentamente ao longo do tempo, presumivelmente devido ao seu papel constante e critico; Como rRNA contem sequencias variveis e estveis, tanto microorganismos relacionados distantemente ou proximamente podem ser comparados; Isto constitui uma vantagem importante pois organismos distantemente relacionados podem ser estudados usando apenas sequncias que alteram ligeiramente ao longo do tempo.
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ESTRUTURA, CRESCIMENTO E NUTRIO MICROBIANA

ESTRUTURA DAS BACTRIAS
Membrana Celular Procaritica

As membranas so um requerimento absoluto para todos os organismos vivos. As clulas devem interagir de um modo selectivo com o seu ambiente, independentemente deste ser um ambiente interno de um organismo multicelular ou um ambiente externo menos protegido e mais varivel. As clulas no devem apenas ser capaz de adquirir nutrientes e eliminar desperdicios, mas tambm tm de manter o seu interior num estado constante, altamente organizado, quando existem alteraes externas. Assim: Membrana plasmtica engloba o citoplasma das clulas eucariticas e procariticas. Esta membrana o principal ponto de contacto com o ambiente da clula e, assim, responsvel pelas relaes com o exterior.
As membranas contm tanto lipidos com proteinas, apesar das propores exactas variarem amplamente. A membrana plasmtica bacteriana normalmente apresenta uma maior proporo de proteinas que as membranas eucariticas, possivelmente porque apresentam tantas e variadas funes, que nos eucariotas esto localizadas nas membranas dos organelos. A maior parte dos lipidos associados a membranas so estruturalmente assimtricos com terminaes polares e apolares (anfipticos): As terminaes polares interagem com gua e so hidrofilicas; As terminaes apolares hidrofbicas so insoluveis em gua e tendem a se associar entre si.
Esta propriedade dos lipidos permite que estes formem bicamadas nas membranas, sendo que as superficies externas so hidrofilicas enquanto as terminaes hidrofbicas so ocultadas no interior longe da gua vizinha. Para alm disso, a maior parte destes lipidos anfipticos so fosfolipidos, sendo os mais abudantes nas bactrias, por ordem decrescente: Fosfatidil-etanolamina; Fosfatidil-glicerol; Fosfatidil-serina; Cardiolipina.
No entanto, a membrana bacteriana no apresenta fosfatidil-colina nem esfingomielina, que so encontradas nas membrana eucariotas.
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As membranas bacterianas normalmente diferem das membranas eucarioticas por no apresentarem esterides como colesterol. Contudo, vrias membranas bacterianas contm molculas pentaciclicas semelhantes com esterides designadas hepanides e grandes quantidades destas molculas esto presentes no nosso ecossistema: Sintetizados a partir dos mesmo precursores dos esterides; Como os esterides nos eucariotas, provavelmente estabilizam a membrana bacteriana.
Quando dividimos a bicamada lipidica, observam-se espaos entre os lipidos, o que corresponde a estaos ocupados po proteinas membranares. O modelo mais aceite para a existncia desta estrutura membranar o modelo do mosaico fluido de S. Jonathan Singer e Garth Nicholson, distinguindo dois tipos de proteinas embebidas na membrana: Proteinas perifricas fracamente ligadas membrana e facilmente removiveis. So soluveis em solues aquosas e compoem cerca de 20-30% do total proteico membranar; Proteinas integrais constituem cerca de 70-80% do total proteico membranar e no so facilmente removiveis da membrana nem soluveis em solues aquosas.
As proteinas integrais, como os lipidos membranares, so anfipticas, sendo que as suas regies hidrofbicas so revistidas por lipidos enquanto as pores hidrofilicas se projectam na superficie membranar. Algumas destas proteinas ainda atravessam toda a membrana. As proteinas integrais so capazes de de difundirem lateralmente para novas localizaes, mas no fazem flip-flop nem rodam atravs da membrana. Por vezes, existem carboidratos ligados superficie externa das proteinas membranares e estes apresentam funes bastante importantes. Assim, a organizao geral da membrana bacteriana a seguinte:
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Deste modo, a membrana celular um sistema altamente organizado e assimtrico, que tambm flxivel e dinmico. Apesar das membranas aparentemente apresentarem um design bsico comum, existem vrias variaes tanto nas suas capacidade estruturais e funcionais. Estas diferenas so to grandes e caracteristicas que a quimica membranar pode ser usada na identificao bacteriana. Devido no existncia de organelos intracelulares, a membrana plasmticas das clulas procariticas tem de ser capaz de exercer variadas funes com sucesso, entre elas: Retem o citoplasma, particularmente em clulas sem parede celular, e separa-o do exterior; Serve como barreira permevel selectiva, permitindo que ies e molculas particulares passem, tanto para dentro como para fora da clula, e prevenindo o movimento de outras. Assim, previne a perda de componentes essenciais e permite o movimento de outros; Como vrias substncias no so capazes de atravessar a membrana plasmtica sem assistncia, a membrana paresenta transportadores que ajudam este movimento. Estes sistemas de transporte podem ser usados para uptake de nutrientes, excreo de desperdicios e secreo proteica; o local de vrios processos metablicos cruciais, como respirao, fotossintes, sintese de lipidos e de constituintes da parede celular, e provavelmente de segregao cromossmica, participando na diviso; Contem receptores especiais que ajudam os procariotas a detectar e responder a quimicos nas suas vizinhanas.
As principais funes da membrana bacteriana e componentes que proporcionam essas funes podem ser resumidas no seguinte quadro:
Funo Permeabilidade selectiva Respirao Transporte de nutrientes Secreo Locomoo (quimiotaxia) Diviso Sintese de parede celular Componente Barreira fisica, sistemas de tranporte Cadeia respiratria, ATPase Sistemas de simporte e antiporte Sistemas de secreo I-IV Motor do flgelo, sensores Ligao do cromossoma FBP, bactoprenol
Assim claro que a membrana plasmtica essencial para a sobrevivncia dos microorganismos. Membranas e Lipidos das Archaeabacteria Os membros das Archaeabacteria so extremfilos e, assim, as membranas das Archaebacteria so uma carateristica importante destas bactrias. A membrana plasmtica destas bactrias difere das membranas bacterianas e eucarioticas gerais por apresentarem uma monocamada com molculas lipidicas a atravessar toda a membrana e por apresentarem cadeias de hidrocarbonetos ramificadas ligadas a glicerol por ligaes ter em vez de cidos gordos ligados por ligaes steres: Por vezes, dois grupos glicerol ligam-se para formar uma molcula tetrater extremamente longa; Normalmente, as cadeias laterias diter apresentam 20 carbonos, e as cadeias tetrater apresentam 40; As clulas so capazes de ajustar o comprimento geral dos tetraters ciclizando as cadeias para formar aneis pentaciclicos, e cadeias bifitanil podem conter um a quatro aneis ciclopentilo.
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No entanto, lipidos polares esto tambm presentes nas membranas das Archaeacateria: Fosfolipidos; Sulfolipidos; Glicolipidos.
Mas cerca de 7 a 30% dos lipidos membranares so apolares, e derivam normalmente do esqualeno. Estes lipidos podem ser combinados de vrios modos para originar membranas com rigidez e espessura diferente: a) Dieteres C20 podem ser usados para formar membranas de bicamada regulares; b) Tetraeteres C40 podem ser usados para formar membranas de monocamada mais rigidas.
Como claro, as membranas das Archaeabacteria podem conter uma mistura de diteres, tetraeteres e outros lipidos. Como ser esperado da sua necessidade de estabilidade, a membrana de termfilos extremos como Thermoplasma e Sulfolobus so quase competamente compostas por monocamadas tetraeter.
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Sistemas Membranares Internos Apesar do citoplasma procaritico no conter organelos membranosos complexos como mitocndrias ou cloroplastos, estruturas membranosas de vrios tipos podem, no entanto, ser observadas. Uma estrutura geralmente observada o mesossoma. Os mesossomas so invaginaes da membrana plasmtica em forma de vesiculas, tubulos ou lamelas. So tanto observadas em bactrias grampositivas como gram-negativas, apesar de serem mais comuns nas primeiras: So normalmente encontrados perto das paredes celulares que se formam na clula em diviso e por vezes parecem ligados ao cromossoma bacteriano; Podem estar envolvidos na formao da parede celular durante a diviso ou podem ter um papel importante na replicao e distribuio do cromossoma das clulas filhas; No entanto, acredita-se agora que os mesossomas so artefactos gerados durante a fixao quimica das bactrias por microscopia electrnica. Assim, representam possivelmente partes da membrana plasmtica que so quimicamente diferentes e mais atingidas pelos fixadores.
Ainda, vrias bactrias apresentam sistemas membranres internos diferentes dos mesossomas: Invaginaes das membranas plasmticas podem tornar-se extensivas e complexas em bactrias fotossintticas como as cianobactrias e as bactrias purpura ou em bactrias com um actividade respiratria bastante elevada como as bactrias nitrificantes; Podem ser agregados de vesiculas esfricas, vesiculas espalmadas ou membranas tubulares; A principal funo destes sitemas poder ser fornecer uma superficie membranar maior para uma actividade metablica melhorada.
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Parede Celular Procaritica

A parede celular a camada, normalmente rigida, que se encontra na face externa da membrana plasmtica. uma das partes mais importantes da clula procaritica e apenas mycoplasmas e algumas Archaeabatria que no a apresentam: A maior parte das bactrias apresentam paredes fortes que lhes confere forma e as protege da lise osmtica, caracteristica devida ao peptidoglicano; A parede celular de vrios patognios apresenta componentes que contribuem para a sua patogenicidade; A parede celular capaz de proteger a clula de substncias txicas e o local de aco de vrios antibiticos.
Aps Christian Gram desenvolver a colorao de Gram em 1884, tornou-se evidente que as bactrias podiam ser divididas em dois grupos principais com base na sua resposta colorao de Gram e a verdadeira diferena estrutural entre estes dois grupos tornou-se clara com o surgimento do micrscpio electrnico: Bactrias gram-positivas coram de purpura e a sua parede celular consiste numa camada unica de 20-80 nm de espessura homogenea de peptidoglicano por fora da membrana plasmtica; Bactrias gram-negativo coram de rosa ou vermelho e a sua parede celular mais complexa apresentando uma camada de peptidoglicano de 2-7 nm revestida por uma membrana externa de 7-8 nm.
Devido camada de peptidoglicano mais espessa, as paredes das clulas gram-positivo so mais fortes que as das bactrias gram-negativo. Todas as estruturas no exterior da membrana plasmtica so designadas como invlucro celular, o que inclui a parede e estruturas como a cpsula, quando presentes. Frequentemente, observado um espao entre a membrana plasmtica e a membrana externa em micrografias electrnicas de bactrias gram-negativas e, por vezes, um espao semelhante mas mais pequeno tambm observado entre a membrana plasmtica e a parede em bactrias gram-positivo, espao este designado espao periplasmtico: Evidncias recentes indicam que o espao periplasmtico preenchido por uma rede pouco densa de peptidoglicano, sendo mais possivelmente um gel do que um espao preenchido por fluido. A substncia que ocupa o espao periplasmtico o periplasma e clulas gram-positivo apresentam periplasma, mesmo no apresentando um espao periplasmtico bvio;
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Estima-se que o tamanho do espao periplasmtico em bactrias gram-negativo varia entre 171 nm, indicando que pode constitui cerca de 20-40% no volume total da clula (cerca de 30-70 nm).
Quando as paredes celulares so destruidas cuidadosamente ou removidas sem danificar a membrana plasmtica, proteinas periplasmticas so libertadas. O espao periplasmtico de bactrias gramnegativo, contem: Vrias proteinas que participam na aquisio de nutrientes; Enzimas hidroliticas que atacam cidos nucleicos; Proteinas envolvidas no transporte de materiais para a clula; Bactrias quimolitoautotrficas e desnitrificantes normalmente apresentam proteinas transportadoras de electres; Enzimas envolvidas na sintese de peptidoglicano; Enzimas envolvidas na modificao de compostos txicos.
As bactrias gram-positivo no apresentam um espao periplasmtico visivel e na parecem apresentar tantas proteinas periplasmticas. Em vez disso, elas secretam vrias enzimas que seriam periplasmticas em bactrias gram-negativo. Tais enzimas secretadas so normalmente designadas exoenzimas. Algumas enzimas podem tambm ficar retidas no espao periplasmtico e ligadas membrana plasmtica. Assim, importante estudar a parede celular bacteriana porque: componente unico dos procariotas; alvo de mecanismos de defesa inata dos vertebrados; alvo de antibiticos; Permite distinguir gram-positivos de gram-negativos.
Paredes Celulares Gram-Positivo Normalmente, a parece celular espessa e homognea das bactrias gram-positivas principalmente composta por peptidoglicano, que normalmente contem uma ponte inter-peptidica. Contudo, as paredes celulares das clulas grampositivo tambm contm grandes quantidades de cidos teicicos, polimeros de glicerol ou ribitol ligados por grupos fosfato: Aminocidos como D-alanina ou acares como glucose esto ligados aos grupos glicerol e ribitol; Os cidos teicicos esto ligados ao peptidoglicano por uma ligao covalente com o hidroxilo 6 do cido Nacetilmurnico ou aos lipidos da membrana plasmtica. No ultimo caso designam-se cidos lipoteicicos;
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Os cidos teicicos extendem-se at superficie do peptidoglicano e, devido sua carga negativa, ajudam a fornecer parede celular gram-positiva a sua carga negativa; A funo destas molculas ainda desconhecida, mas devem ser importantes na manuteno da estrutura da parede; Os cidos teicicos no se encontram nas bactrias gram-negativo.
Paredes Celulares Gram-Negativo As paredes celulares gram-negativo so muito mais complexas que as paredes gram-positivo. A fina camada de peptidoglicano prxima da membrana plasmtica no constitui mais de 5-10% do total da parede. Por exemplo, em E. coli tem cerca de 2 nm de espessura e contem apenas uma ou duas camadas de peptidoglicano. Depois, a membrana externa encontra-se no exterior da fina camada de peptidoglicano:
A proteina membranar mais abundante a lipoproteina de Braun, uma pequena lipoproteina covalentemente ligada ao peptidoglicano que se encontra subjacente e embebida na membrana externa pela sua terminao hidrofbica, estabilizando a membrana externa. A membrana externa e o peptidoglicano esto to firmemente ligados a esta lipoproteina que podem ser isolados como uma unidade.
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Outra estrutura que fortalece a parede gram-negativa e mantem a membrana externa no seu local o sitio de adeso: A membrana externa e a membrana plasmtica parecem estar em contacto directo em vrios locais da parede gram-negativa; Os sitios de adeso podem tanto ser locais de contacto directo ou possivelmente locais de fuso de membranas; Pensa-se que algumas substncias sejam capazes de se mover para dentro da clula atravs destas locais de adeso em vez de viajarem atravs do periplasma.
Os constituentes menos usuais da membrana externa so os lipopolissacarideos (LPSs). Estas grandes e complexas molculas contm lipidos e carboidratos e consistem em trs partes cuja estrutura a seguinte, com base no que se sabe sobre Salmonella: 1. Lipido A contem dois derivados acar glucosamina, cada com trs cidos gordos e fosfatos ou pirofosfatos ligados. Est encaixado na membrana externa e a restante molcula LPS projecta-se da superficie; 2. Polissacarideo central est ligado ao lipido A. Construido por 10 acares, a maior parte deles com uma estrutura no usual; 3. Cadeia lateral O ou antignio O uma cadeia polissacaridea que se extende do polissacarideo central. Tem vrios acares peculiares e varia em composio entre estirpes bacterianas. Apesar do antignio O ser reconhecido por anticorpos do hospedeiro, as bactrias gram-negativo podem contrariar as defesas do hospedeiro por alterao rpida da natureza das suas cadeias laterais O, o que impede a deteco. A interaco de anticorpow com LPS antes da parede celular ser alcanada tambm protege a parede celular de ataque directo. A importncia do LPS deve-se a vrias razes: Permite a resistncia defesa do hospedeiro devido facil alterao do antignio O; Como o polissacarideo apresenta acares e fosfatos carregados, o LPS contirbui para a carga negativa da superficie bacteriana; O lipido A um constituinte principal da membrana externa e o LPS ajuda a estabilizar esta membrana; O lipido A muito txico, assim, o LPS capaz de actuar como endotoxina e causa alguns dos sintomas que surgem nas infeces por bactrias gram-negativas.
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A funo mais importante da membrana externa servir como uma barreira protectora. Ela previne ou atrasa a entrada de sais biliares, antibiticos e outras substncias txicas que poderiam matar ou danificar as bactrias e previne a perda de constituintes como enzimas periplasmticas. Deste modo, a membrana externa mais permevel que a membrana plasmtica mas permite a passagem de pequenas molculas como glucose e outros monossacarideos. Isto deve-se presena de porinas especiais: Trs molculas de porina agrupam-se e dividem a membrana para formar um canal estreito atravs do qual molculas menores que 600-700 daltons conseguem passar; Molculas maiores como vitamina B12 devem ser transportadas atravs da membrana externa por carregadores especificos.
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Mecanismo de Colorao de Gram Apesar de vrias explicaes serem atribuidas aos resultados das reaces de colorao de Gram, parece provvel que as diferenas entre bactrias gram-negativo e gram-positivo se devem natureza fisica das suas paredes celulares: Se a parede celular for removida a bactrias gram-positivo estas tornam-se gram-negativo; O peptidoglicano por si s no colorido, em vez disso parece actuar como uma barreira que previne a perda de violeta de cristal.
Assim, a explicao do procedimento da colorao Gram o seguinte: As bactrias so primeiro coradas com violeta de cristal e depois tratadas com iodo para promover a fixao do corante; Quando bactrias gram-positivo so descoradas com etanol, o alcool contrai os poros do espesso peptidoglicano, pelo que o complexo iodo-corante retido durante o curto passo de descolorao e as bactrias mantm-se prpura; Em contraste, o peptidoglicano gram-negativo muito fino, no tanto cross-linked e apresenta poros maiores. O tratamento com alcool tambm extrai lipidos suficientes para que a parede gram-negativa aumente a sua porosidade. Assim, o alcool leva remoo do complexo violeta de cristaliodo prpura das bactrias gram-negativo.
Assim, as bactrias gram-positivo apresentam uma cor prpura enquanto as bactrias gram-negativo tm de sofrer um segundo passo de colorao no procedimento - normalmente com safranina, que confere uma cor rosa - para poderem serem visiveis:
Clostridium perfringens Gram-positivo
Escherichia coli Gram-negativo
Parede Celular lcool-cido Resistente As Mycobacterias so classificadas como bactrias gram-positivo, mas apresentam caracteristicas de organismos gram-positivo e de gram-negativo: Mycobactrias patognias incluem os organismos que causam tuberculose e lepra e so parasitas intracelulares, replicando em fagossomas modificados dos macrfgos; Nesta localizao, estas bactrias previnem a formao de fagolisossomas e inibem as respostas dos macrfagos infeco, como apoptose e secreo de citocinas inflamatrias.
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Estas bactrias so muito resistentes e no so coloridas pelos mtodos convencionais de colorao, como a colorao de Gram, necessitando de um mtodo especial no qual o corante forado a entrar, o mtodo de colorao lcool-cido. Pelo menos algum destes sucessos esto ligadoa s propriedades fisico-quimicas no usuais da superfice mycobacteriana:
A bactria est inclusa numa membrana plasmtica tipica, que se encontra abaixo de uma camada de peptidoglicano rigida; Um numero de proteinas encontrada em associao com o peptidoglicano e entre a membrana e o peptidoglicano, sendo algumas destas imunognicas; O peptidoglicano encontra-se ligado via ligaes fosfodister a arabinogalactano, um polimero de arabinose e galactose; cidos miclicos, grande cidos gordos ramificados (C60 a C90), normalmente encontrados como misturas de homlogos, encontram-se ligados poro distal de arabinogalactano. O complexo de peptidoglicano, arabinogalactano e micolatos est tambm associado com o esqueleto da parede celular; Outro grupo de componentes importantes da parede celular so os trehalose-29-sulfatos, que so importantes para a virulncia, j que as estripes mais virulentas de M. tuberculosis formam sulfolipidos fortemente acidicos que estaro envolvidos na inactivao dos fagossomas dos macrfagos.
Os cidos miclicos so cidos gordos -hidroxi com uma longa cadeia lateral -alkyl. Existem como sries de cidos gordos homlogos diferindo em 28 unidades de massa atmicas e, em M. tuberculosis, so caracterizados como cidos gordos C54-C63 bastante hidrofbicos com cadeias laterais de C22-C24. Existem trs classes distintas de cidos miclicos em M. tuberculosis:
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cido -miclico a forma mais abundante (>70%) e um cido gordo cis, cis.diciclopropil. existem duas variaes deste cido miclico, dependendo da fonte; cido metxi-miclico; cido ceto-miclico.
A presena deste cidos miclicos permite que as mycobactrias sejam lcool-resistentes corando pelo mtodo da colorao lcool-cido.
Outro componente da parede celular de M. tuberculosis o lipoarabinomanano (LAM), que, quando ancorado membrana plasmtica micobacteriana, se extende at superficie. encontrado como uma mistura de lipopolissacarideos fosforilados de alto peso molecular contendo manose e arabinose. Os cidos gordos, tipicamente palmitato e tuberculostearato, ocorrem na forma de diacilglicerol, ligados aos polissacarideos ramificados que contm arabinose e manose via fosfatidilinositol. A terminao arabinose da LAM de algumas estripes de mycobactria encapsulada por mais alguns residuos adicionais de manose, enquanto noutras pode ser por inositois fosfato adicionais. Esta diferena no encapsulamento pode levar a diferentes respostas patognias. Estas paredes apresentam tambm os componentes normais observados nas paredes celulares das bactrias, que em conjunto com estes componentes no usuais conferem um grau especial mycobactrias. Assim, as funes dos principais componentes da parede celular das Mycobactrias so: O peptidoglicano previne a lise osmtica; Os cidos miclicos e outros glicolipidos tambm impedem a entrada de quimicos fazendo com que os organismos cresam devagar e sejam mais resistentes a agentes quimicos e componentes lisossomais dos fagcitos do que as bactrias; Existem poucas porinas na comparado com a parede das clulas gram-positivas e os poros so muito mais longos. Isto contribui significativamente para a menor permeabilidade ao lcoolcido destas bactrias; A proteinas de superficie nesta parede celular, dependendo da estripe e da espcie, podem funcionar como enzimas ou como molculas de adeso; O periplasma contem enzimas para quebra de nutrientes.
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Estrutura e Sntese de Peptidoglicano O peptigoglicano um polimero ramificado enorme composto por vrias subunidades idnticas, contendo: Dois derivados de acares, N-acetilglucosamina e cido N-acetilmuranico (o ter lctico da Nacetilglucosamina); Vrios aminocidos diferentes, trs dos quais cido D-glutmico, D-alanina e cido mesodiaminopimlico no so encontrados em proteinas. A presena de D-aminocidos protege contra o ataque de vrias peptidases.
A estrutura da subunidade de peptidoglicano a seguinte: O esqueleto deste polimero composto por residuos de N-acetilglucosamina e cido Nacetilmuranico ligados alternadamente por uma ligao (14); Uma cadeia peptidica de quatro aminocidos L- e D- alternados est ligada ao grupo carboxilo do cido N-acetilmuranico; Muitas bactrias substituem outro diaminocido, normalmente L-lisina, na terceira posio por cido meso-diaminopimlico.
a) L-lisina b) cido muranico
Cadeias de subunidades de peptidoglicano ligadas so juntas por cross-links entre os pptidos. Normalmente, o grupo carboxilo da D-alanina terminal ligado directamente ao grupo amino do cido diaminopimlico, mas tambm pode ser usada uma ponte peptidica. Esta diferente ligao observada entre bactrias gram-positivas e gram-negativas: Bactrias gram-positivas os pptidos so ligados por uma ponte peptidica constituida por cinco residuos de glicina, que se liga ao residuo -amino da lisina e ao residuo carboxi D-alanina; Bactrias gram-negativo o grupo -amino da lisina do pptido est ligado ao COOH de uma D-alanina de um tetrapptido adjacente, o que forma uma ligao amida directa.
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Este cross-link resulta num enorme saculo de paptidoglicano que de facto uma rede bastante densa e interligada. Estes saculos ja foram isolados de bactrias gram-positiva e so fortes o suficiente para reter a sua forma e integridade, ainda sendo elsticos e deformveis, ao contrrio da celulose. Para alm disso, esta estrutura porosa, o que permite a penetrao de vrias molculas. Os passos de biossintese do peptidoglicano em bactrias gram-negativas so os seguintes: 1. A biossintese inicia-se com a formao de UDP-NAM pela condensao de fosfoenolpiruvato (PEP) com UDP-GlcNAc e subsequente reduo. A adio sequencial de L-alanina, D-glutamato, cido meso-diaminopimlico e D-alanina resulta na formao de UDP-NAM-pentapeptido. A adio de de cada aminocido requer uma ligase de aminocidos dependente de ATP e a adio dos dois aminocidos terminais (D-alanina-D-alanina) como uma unidade dipeptidica com origem numa D-alanina e numa L-alanina. Todas estas reaces so catalizadas por enzimas citoplasmticas;
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2. Uma translocase de membrana transfere o NAM-pentapeptido para bactoprenol fosfato na face interna da membrana interna. O produto final, designado lipido I, contem uma ligao fosfato; 3. Uma transferase na mesma face da membrana interna transfere depois N-acetilglucosamina de UDP-GlcNAc para o bactoprenol-PP-NAM-pentapptido. Este pptido dissacarideo ligado a lipidos designado muropptido ou lipido II e representa a subunidade bsica para a montagem de peptidoglicano; 4. O lipido undecaprenol actua de um modo pouco conhecido para mover subunidade muropeptido atravs da membrana interna. Alguns genes que afectam a sintese de parede celular foram identificados, possivelmente regulando esta reaco de flip; 5. Quando re-orientado na face periplasmtica da membrana plasmtica, o muripptido transferido em bloco para o peptidoglicano existente numa reaco de transglicosilao; 6. O bactoprenol-PP sofre clivagem de um grupo fosfato, que o torna disponivel para outra ronda de transferncia e volta face interna da membrana interna.
Dois mecanismos foram propostos para a introduo de subunidades no peptidoglicano existente: Crescimento apartir da terminao redutora, onde o grupo 4-OH do residuo Nacetilglucosamina no-redutora ataca a ligao P-NAM de uma cadeia de peptidoglicano nascente deslocando undecaprenil-PP; Crescimento apartir da terminao no redutora, onde a terminao na redutora Nacetilglucosamina do peptidoglicano nascente ataca a ligao P-NAM numa subunidade, de novo com libertao de undecaprenil-PP.
O mecanismo que controla o comprimento da cadeia desconhecido. A libertao final de uma nova cadeia de peptidoglicano est acoplada formao de 1,6-anidro-NAM na terminao redutora da cadeia. A libertao seguida pela formao dos cross-links, na qual a clivagem da D-alanina terminal resulta na transferncia do grupo carboxilo libertado do novo residuo D-alanina terminal para o grupo amino da cadeia vizinha. Assim, a estrutura final contem ligaes entre tetrapptidos localizados em todas as subunidades.
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Gram-negative
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Gram-positive
Assim, a sintese de peptidoglicano constituida por trs fases: 1. Montagem de percursores no citoplasma; 2. Transporte atravs da membrana interna; 3. Polimerizao. As reaces biossintticas envolvidas na sintese de peptidoglicano representam alvos atractivos e efectivos para antibiticos: Tanto bactrias gram-positivas como gram-negativas contm proteinas de ligao a penicilina que participam nas reaces de transglicosilao e transpeptidao. A penicilina e outros antibiticos -lactam ligam essas proteinas e inibem a sintese de peptidoglicano; O antibitico vancomicina inibe um passo diferene na sintese por se ligar ao dipptido Dalanina-D-alanina no muropptido bloqueando a polimerizao. Algumas bactrias resistentes contm uma ligase alterada que gera D-alanina-D-lactato em vez de D-alanina-D-alanina e, assim, resistem aco da vancomicina; A bacitracina bloqueia a desfosforilao e reciclagem do bactoprenol pirofosfato; A cicloserina inibe a alanina racemase e a D-alanil-D-alanina sintetase devido semelhana estrutural da cicloserina e da D-alanina e devido ao facto da cicloserina de ligar a estas enzimas com maior afinidade, relativamente D-alanina.
Por outro lado, existem tambm hidrolases do peptidoglicano que quebram esta rede: A lisossima cliva o peptidoglicano entre os dissacarideos NAM e NAG. No laboratrio, usada para preparar fraces subcelulares a partir de bactrias. No contexto da infeco microbiana, o complemento do hospedeiro prefura a membrana externa de proteinas gram-negativo permitindo que as lisozzimas secretadas por leuccitos penetrem e destruam a camada de peptidoglicano, ocorrendo mecanismo semelhante nas gram-positivo. Assim, a lisossima tem um papel importante na imunidade inata;
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As autolisinas, como as glicosidases, amidases, muramidases e endopeptisases, quebram as ligaes entre NAM e NAG e permitem a insero de novas subunidades de peptidoglicano; Lisinas dos bacteriofagos so lisinas que os bacteriofagos possuem e que facilitam a entrada do virus nas bactrias por degradao do peptidoglicano.
Esquematicamente, a aco de diferentes autolisinas no peptidoglicano a seguinte, usando como modelo B. subtilis.
Parede Celular e Forma Bacteriana Tendo em conta a funo bsica da parede celular manter a forma e integridade celular claro que alteraes na mesma afectaro a morfologia celular. A clula bacteriana ter, assim, de controlar a sua forma direccionando a localizao de sintese de nova parede durante o crescimento celular ou remodelando o peptidoglicano independentemente do crescimento. Por exemplo: E. Coli e B. subtilis preferencialmente sintetizam novo peptidoglicano ao longo das paredes laterais enquanto crescem para manter a forma de bastonete; A composio do peptidoglicano de Helicobacter pylori altera quando as clulas mudam de uma morfologia de bastonete curvado para uma morfologia coccoide.
Assim, pelo menos alguns determinantes morfognicos foram previstos como factores celulares que governam a sintese ou remodelao de material da parede. A importancia de proteinas de ligao a penicilina na morfologia celular consistente com esta ideia, visto que estas enzimas catalizam as reaces sintticas que so necessrias para o crescimento e remodelao do peptidoglicano. plausivel que a sintese selectiva de nova parede em localizaes particulares contribua para a morfologia celular enquanto a clula cresce e divide. Assim, o conhecimento da localizao e natureza de regies especificas de sintese importante para perceber a morfognese. Actualmente, existem trs estratgias importantes para a diferenciao entre peptidoglicano pr-existentes e novo. Contudo, dificil resolver reas de sintese novas com preciso e os processos que governam a localizao da sintese continuam desconhecidas: Em E. coli e B. subtilis, os polos das clulas so sujeitos a muita menor taxa de sintese e turnover em relao s paredes laterais e aos locais de diviso; Em S. Aureus e espcies Streptococcus esfricas, a sintese nova ocorre principalmente nos locais de diviso.
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A insero de peptidoglicano novo em E. coli e B. subtilis parece ser distribuida ao longo de trechos e bandas circunferenciais ao longo da parede celular, num padro indicativo de uma hlice. Estes parecem ser sistemas de guiai para sintese directa de peptidoglicano em localizaes particulares. A monitorizao da insero e destino do peptidoglicano enquanto as clulas crescem e dividem levou ao conceito de peptidoglicano inerte, peptidoglicano que no sofre crescimento ou turn-over, ou o faz a uma taxa altamente reduzida: Em espcies como B. subtilis e E. coli, surgiu a hiptese do peptidoglicano inerte nos polos das clulas funcionar como um suporte rigido da morfologia celular global; Nesta hiptese, um movimento errado de um trecho de peptidoglicano inerte poder funcionar como um polo ectopico, causando ramidifcao celular; Esta predio suportada pela associao de anormalidades morfologicas com a deposio de peptidoglicano inerte em locais de elongao da parede celular.
As clulas eucariotas contm trs sistemas principais de citoesqueleto, que ajudam na manuteno da forma e integridade celular, e participam tambm em vrias funes celulares, incluindo mobilidade, segregao cromossmica, transduo de sinal e citocinese. Durante vrios anos, acreditava-se que as bactrias no continham elementos de citoesqueleto e que eram moldadas por um exoesqueleto, a parede celular. Contudo, homlogos de todos os trs elementos de citoesqueleto eucariotas foram j encontrados em bactrias:
De modo a que estruturas de citoesqueleto como FtsZ, MreB, Mbl e crescentina influenciem a montagem do peptidoglicano da parede celular e, assum, a forma celular geral, uma ponte molecular deve ligar o citoesqueleto e o peptidoglicano. Tal ligao pode sre fornecida por proteinas membranares e associadas membrana que so capazes de transmitir informaes de forma atravs da membrana citoplasmtica. Este grupo de determinantes de forma podem incluir proteinas de ligao a penicilina e outras proteinas que so necessrias para a manuteno da forma. A forma da parede celular e forma de diviso influenciam o modo como as bactrias se associam, podendo haver: Diplobacilos bacilos (forma de bastonete) dividem-se em dois e ficam ligados em pares; Estreptobacilos sempre que se dividem, os bacilos ficam ligados pelos polos, formando uma espcie de corda; Palissadas sempre que se dividem, os bacilos ficam lado a lado;
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Diplococos e estreptococos coccos que apenas apresentam um plano de diviso. Os primeiros formam pares e os segundos ficam ligados em forma de corda; Ttradas coccos que apresnetam dois planos de diviso formando estruturas semelhantes a quadrados; Sarcina e estafilococos apresentam trs planos de diviso, formando estruturas semelhantes a cubos ou aglomerados, respectivamente.
Parede Celular e Proteco Osmtica A parede celular normalmente necessria para proteger a bactria contra a destruio pela presso osmtica. Durante a osmose, a gua move-se atravs de membranas selectivamente permeveis como a membrana plasmtica a partir de solues diluidas (maior concentrao de gua) para as solues mais concentradas (menor concentrao de gua). Dependendo do habitat:
Habitat hipotnico - Os solutos so muito mais concentrados no citoplasma bacteriano do que nos habitats microbianos. Assim, a gua entra nas bactrias e a presso osmtica pode alcanar 20 atm. A membrana plasmtica no capaz de suportar tais presses e a clula ir inchar e ser fisicamente rompida e destruida, um processo designado de lise. A presena de parede no permite que a clula incha e protege a clula; Habitat hipertnico - Os solutos so mais concentrados em habitats hipertnicos relativamente clula. Assim, a gua flui para o exterior, um fenmeno conhecido como plasmlise e bastante util na preservao dos alimentos porque muitos microorganismos no so capazes de sobreviver em alimentos desidratados e em geleias pois no conseguem impedi-lo.
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A importncia da parede celular na proteco da bactria contra a lise osmtica demonstrada pelo tratamento com lisossima ou penicilia: Se bactrias so incubadas com penicilina numa soluo isotnica, bactrias gram-positivas so convertidas a protoplastos que continuam a crescer normalmente quando a isotonicidade mantida, apesar de no apresentarem completamente parede celular. Clulas gram-negativas retm a sua membrana externa aps o tratamento com penicilina e so classificadas como esferoplastos porque ainda retm alguma parede celular; Os protoplastos e os esferoplastos so osmoticamente sensiveis. Se forem transferidos para uma soluo diluida, eles lisam devido ao influxo de gua descontrolado.
Assim, o mecanismo de morte bacteriana mediada por agentes que impedem a sintese de parede celular est subjacente lise celular. Apesar da maior parte das bactria necessitarem de uma parede celular intacta para sobreviverem, algumas no apresentam nenhuma. Um exemplo so os mycoplasmas: No apresentam parede celular e so osmoticamente sensiveis e resistentes penicilina mas conseguem viver em meios diluidos ou ambientes terrestres porque as suas membranas so mais fortes do que o normal; A razo precisa para este facto no conhecida apesar da presena de esterides nas membranas de vrias espcies poder fornecer uma fora adicional; Sem uma parede rigida, os micoplasmas tendem a ser pleomrficos.
Parede Celular das Archaeabactrias Apesar das Archaeabactria colorirem com gram-positivo ou gram-negativo dependendo da espessura e da massa da parede celular, a estrutura e a quimica da sua parede diferente da observada nas bactrias. Existe uma variedade considervel na estrutura da parede da Archaeabactria: a) Archaea gram-positivo a maior parte apresenta uma parede com uma unica camada homognea espessa semelhante das bactrias gram-positivo e, assim, cora gram-positivo; b) Archaea gram-negativo a maior parte no apresenta a membrana externa nem a rede de peptidoglicano das bactrias gram-negativo. Em vez disso, normalmente apresentam uma camada superficial de subunidades proteicas ou glicoproteicas;
A quimica das paredes celulares das Archaeabacteria tambm muito diferentes da das bactrias:
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1. No apresentam peptidoglicano, resistindo ao ataque de lisossima e antibiticos -lactam, como a penicilina; 2. Archaeabactria gram-positivas podem apresentar uma variedade de polimeros complexos nas suas paredes: Methanobacterium e algumas outros metanogeneos apresentam paredes que contm pseudopeptidoglicano, um polimero semelhante a peptidoglicano que apresenta L-aminocidos nas suas cross-links, cido N-acetiltalosaminurnico em vez de cido N-acetilmuranico e ligaes (13) glicosidicas em vez de ligaes (14) glicosidicas; Methanosarcina e Halococcus no apresentam pseudopeptidoglicano e contm polissacarideos complexos semelhantes a carboidratos do tecido conuntivo animal; Outros polissacarideos podem tambm ser encontrados nas paredes gram-positivas. As Archaeabactria gram-negativas apresentam uma camada de proteinas ou glicoproteinas no exterior na membrana plasmtica e esta camada pode ter uma espessura de 20-40 nm. Por vezes existem duas camadas, uma folha a rodear uma camada electronicamente densa. O conteudo quimico destas paredes varia consideravelmente: Alguns metanogneos (Methanolobus), Halobacterium e vrios termfilos extremos (Sulfolobus, Thermoproteus e Pyrodictium) apresentam glicoproteinas nas suas paredes; Outros menogneos (Methanococcus, Methanomicrobium e Methanogenium) e o termfilo extremo Desulfurococcus apresnetam paredes proteicas.
Parede Celular das Deinococcaceae As bactrias da familia Deinococcacea so normalmente esfricos ou em forma de bastonete geralmente associados em pares ou tetrados e englobam as ordem Deinococcus e Thermus: Apesar de colorirem gram-positivo, a sua parede celular apresenta camadas e apresentam uma membrana externa como as bactrias gram-negativas; Diferem tambm dos cocci gram-positivo por apresentarem L-ornitina no seu peptidoglicano, no apresentando cido teicico, e por apresentarem uma membrana plasmtica com grandes quantidades de cido palmitoleico em vez de fosfolipidos fosfatidilglicerol.
Deinococcus radiodurans
Thermus aquaticus
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Quase todas as estirpes de Deinococcus so exraordinariamente resistentes dessecao e radiao, sendo capazes de sobreviver a 3-5 milhes unidades de radiao, uma exposio bastante superior letal para os humanos, o que os classifica como extremfilos. E quase todas as estripes de Thermus so capazes de suportar grandes temperaturas, sendo tambm extremfilos. Por exemplo, de Thermus aquaticus que se extrai a enzima Taq polimerase, to usada na tcnica de PCR em Biologia Molecular.
Componentes Externos Parede Celular

As bactrias apresentam uma variedade de estruturas no exterior da parede cellular que podem ter vrias funes: Proteco; Adeso a objectos; Movimento cellular.
Cpsula, Slime Layers e S-Layers A cpsula, as slime layers e as S-layers constituem invlucros externos parede celular encontrados em algumas bactrias e, na sua generalidade, so designados de glicoclice: Quando a camada bem organizada e dificilmente removivel designada cpsula; Quando a camada uma zona de material difuso, desorganizado e facilmente removivel designada slime layer.
O glicoclice uma rede de polissacarideos que se extende na superficie da bacteria e de outras clulas. As cpsulas e as slime layers normalmente so compostas por polissacarideos, mas podem tambm ser construidas por outros materiais, como cido poli-D-glutmico. As cpsulas so claramente visiveis ao microscpio ptico quando coloraes negativas ou coloraes especiais da cpsula so aplicadas, e podem tambm ser estudadas ao microscpio electrnico.
Klebsiella pneumoniae com cpsula colorada Microscpio ptico
Glicoclice de Bacteriides Microscpio electrnico
Apesar das cpsulas no serem necessrias para o crescimento e reproduo bacteriana em culturas laboratoriais, estas conferem vrias vantagens quando as bactrias crescem em habitats normais:
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1. Ajudam as bactrias a resistir fagocitose pelas clulas fagociticas do hospedeiro. Por exemplo: Quando Streptococcus pneumoniae no apresenta cpsula facilmente destruida e no causa doena, enquanto a variante capsulada rapidamente mata ratinhos; 2. As cpsulas contm uma grande quantidade de gua e so capazes de proteger as bactrias contra a dessecao; 3. Excluem os virus bacterianos e a maior parte dos materiais txicos, como detergentes. A composio quimica da cpsula de vrias espcies de bactrias a seguinte:
Bactria Gram-positivas Bacillus anthracis Bacillus megaterium Streptococcus mutans S. pneumoniae S. pyogenes Gram-negativas Acetobacter xylinum E. coli Pseudomonas aeruginosa Azotobacter vinelandii Agrobacterium tumefaciens Composio Polipeptidica Mista Polissacaridea Polissacaridea Polissacaridea Polissacaridea Polissacaridea Polissacaridea Polissacaridea Polissacaridea Sub-unidades estruturais cido D-glutmico cido D-glutmico, acares, acares aminados Glucose (dextrano) Acares, acares aminados, cidos urnicos N-ac-glucosamina, cido glucurnico Glucose (celulose) Glucose, galactose, fucose, cido glucornico cido manurnico cido glucurnico Glucose (glucano)
O glicoclice tambm facilita a adeso bacteriana superficie de objectos slidos em ambientes aquticos ou a superficies tecidulares em hospedeiros vegetais ou animais. Bactrias que deslizam normalmente produzem limo (slime layer), que presumivelmente facilita a sua mobilidade. Slime Layers e Biofilmes O slime uma glicoconjugado extracelular viscoso que permite que as clulas se fixem em superficies lisas com grande afinidade, e quando este produzido em grande quantidade por colnias de bactrias leva produo de biofilmes: Os microorganismos tendem a criair os seus prprios microambientes e nichos, mesmo sem terem um ambiente fisico estruturado disponivel, criando biofilmes; Estes so sistemas microbianos organizados constituidos por camadas de clulas microbianas associadas com superficies.
Podemos ter trs tipos de biofilmes: a) Biofilmes simples desenvolvem-se quando microorganismos se ligam e formam uma monocamada de clulas; b) Dependendo do ambiente de crescimento microbiano particular (luz, nutrientes presentes e taxas de difuso), estes biofilmes podem tornar-se mais complexos com camadas de organismos de diferentes tipos; c) Biofilmes mais complexos podem desenvolver-se de modo a formar uma estrutura com quatro dimenses (X, Y, Z e tempo) com clulas agregadas, poros intersticiais e canais de conduta. Este processo de desenvolvimento envolve o crescimento de microorganismos ligados, resultando na acumulao de clulas adicionais na superficie, em conjunto com o aprisionamento e imobilizao continuos de microorganismos livres que se movem para o biofilme. Esta estrutura permiet que nutrientes alcancem a biomassa e os canais so moldados por protozorios.
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A diversidade de superficies vivas e no vivas que podem ser explorados por microorganismos que formam biofilmes enorme e inclui: Rochas; Unidades de filtrao; Utensilios de cozinha sujos; Lentes de contacto; Seringas usadas; Catteres; Tracto urinrio; Dentes (trtaro); Pele; Lingua; Etc...
As superficies de catteres e unidades de dilise apresentam contacto intimo com os fluidos corporais humanos e o controlo de tais microorganismos e do seu establecimento nestes aparelhos mdicos sensiveis uma parte importante do cuidado hospitalar moderno. Microorganismos que formam biofilmes em organismos vivos como plantas ou animais apresentam desvantagens adicionais: Nestes casos, a superficies libertam nutrientes, na forma de clulas, materiais sluveis e gases; Estes biofilmes podem ter papeis principais em doenas porque so capazes de proteger os patognios dos desinfectantes, criai um foco de ocorrncia tardia da doena ou libertar
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microorganismos e produtos microbianos que podero afectar o sistema imunolgicos do hospedeiro; Os biofilmes so criticos nas doenas oculares porque Chlamydia, Staphylococcus e outros patognios sobrevivem em dispositivos oculares como lentes de contacto e em solues de limpeza.
A insero de uma prtese no corpo humano normalmente leva formao de biofilmes na superficie do dispositivo. Os microorganismos principalmente envolvidos so Staphylococcus epidermis, uma bactria gram-negativa. Estes habitantes normais da pele possuem a habilidade de tenazmente aderir superficie de prteses inertes. Nos biofilmes, estas clulas esto protegidas dos mecanismos de defesa normais do corpor e tambm dos antibiticos. Assim, os biofilmes fornecem uma fonte de infeco para outras partes do corpo pois as bactrias so capazes de se libertar quando o biofilme se desfaz. Assim, os biofilmes podem ser causa de infeco por serem fonte de microorganismos mas eles tambm podem ser uma causa directa desta: a) As bactrias podem ser eliminadas por anticorpos e fagcitos e so susceptiveis a anticorpos; b) Clulas de bactrias aderentes formam biofilmes preferencialmente em superficies inertes, e estas comunidades so resistentes a antibiticos, fagcitos e anticorpos; c) Fagcitos so atraidos para os biofilmes, mas no conseguem eliminar as bactrias, libertando enzimas fagociticas; d) As enzimas fagociticas danificam os tecidos nas vizinhanas do biofilme as as bactrias so libertadas deste. Esta libertao podem levar disseminao da infeco para outros tecidos vizinhos.
Alguns exemplos de biofilmes com importncia mdica incluem: Mortes que se seguiram a infeces massivas de pacientes que receberam coraes artificias; Pacientes de fibrose cisticas que apresentavam grandes numeros de Pseudomonas aeruginosa, que produz grandes quantidades de polimeros alginato, que inibem a difuso de antibiticos; Dentes, onde os biofilmes formam placas que danificam os dentes; Lentes de contacto, onde as bactrias podem produzir irritao ocular severa, inflamao e infeco;
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Ar condicionado e outros sistemas de reteno onde bactrias potencialmente patognicas, como espcies de Legionella, podem estar protegidas.
Os biofilmes so capazes de resistir aos agentes antimicrobianos por multiplos mecanismos, que podem ser agrupados em trs grupos: 1. Reduo da concentrao do antimicrobiano no fluido que rodeia o biofilme, sendo que o agente antimicrobiano levado a niveis no eficientes antes de alcanar o biofilme; 2. Limitao da penetrao do agente antimicrobiano no biofilme, sendo que o agente antimicrobiano deixado na superficie do biofilme mas no eficientemente transportado para o seu interior; 3. Adopo de uma estado fisiolgico resistente por pelo menos uma fraco de clulas no biofilme, sendo que o agente antimicrobiano permeia o biofilme mas incapaz de matar microorganismos porque estes se encontram num estado fenotipico que confere susceptibilidade reduzida. Existem dois modos: Uma limitao nutricional leva a regies de crescimento lento no biofilme; Um switch intrinseco de fentipo ocorre sem necessitar de limitao de nutrientes. Estes mecanismos de proteco do biofilme no so mutuamente exclusivos. De facto, parece que combinaes destes trs tipos gerais de resistncia ocorrem em conjunto. Esta resistncia no causada por mtodos normais mutao ou aquisio de elementos genticos sendo caracteristica da forma biofilme. S-Layers Vrias bactrias gram-positivas e gram-negativas apresentam uma camada regularmente estruturada desiganada S-layer na sua superficie: As S-layers so muito comuns entre Archaea, onde sero as unicas estruturas de parede fora da membrana; A S-layer apresenta uma padro semelhante a um ladrilho e composta por proteinas e glicoproteinas.
Em bactrias gram-negativo, a S-layer adere directamente membrana externa, estando associada com a superficie do peptidoglicano em bactrias gram-positivo, tendo como principais funes: Protege a clula contra flutuaes de pH e ies, stress osmtico, enzimas ou de bactrias rapinantes; Ajuda a manter a forma e a rigidez de algumas bactrias; Promove a adeso de clulas a superficies; Protege alguns patognios contra ataques do complemento e contra a fagocitose, contribuindo para a sua virulncia.
Proteina M de Streptococcus Um grupo de bactrias Streptococcus, bactrias gram-positivas, responsvel por um numero de infeces humanas, das quais faringite e impetigo so as mais comuns, com vrias sequelas por infeco persistente. A habilidade destas bactrias persistirem em tecidos intectados principalmente devida proteina M da superficie celular:
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Molcula que confere s streptococcus a habilidade de resistir fagocitose por leuccitos polimorfonucleares na ausncia de anticorpos especificos; Molcula que confere capacidade de adeso; Como existem vrios serotipos de proteina M (i.e., M5, M6, M24, etc.) confere variao antignica; Molcula que tem capacidade de incativar o complemento.
M proteins
Resistncia infeco por este grupo de streptococcus est, assim, relacionada com a presena de anticorpos especificos para a molcula M. Como existem mais de 80 serotipos diferentes de proteina M (i.e., M5, M6, M24, etc.), um individuo pode ser infectado por mais de um tipo diferente de strepcoccus durante toda a vida. A proteina M uma das molculas mais bem conhecidas como sendo um determinante de virulncia bacteriana. A sua estrutura, funo, imunoquimica e mtodo de variao antignica so unicos entre as molculas de virulncia conhecidas. A proteina M extende-se na parede celular e, de algum modo, pode ser considerada como pertencente ao glicoclice pois tm funes semelhantes a este. A estrutura da proteina M a seguinte: Constituida por dois monmeros enrolados de pepsin; A regio enrolada extende-se cerca de 50 nm a partir da parede celula com um pequeno dominio no enrolado em N-terminal; Uma regio rica em prolina-glicina est localizada no peptidoglicano, com um pequeno segmento da regio enrolada na proo rica em carboidratos da parede celular; O segmento membranar de ancoragem extende-se atravs da membrana celular, com a cauda carregada a projectar-se para o citoplasma.
Pilis e Fimbrias Vrias bactrias gram-negativo apresentam estruturas pequenas, finas, semelhantes a plos, que so mais finos que os flagelos e que no esto envolvidos na mobilidade, normalmente designadas frimbias:
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Apesar de uma clula poder ser coberta por mais de 1000 fimbrias, elas apenas so visiveis com o microcpio electrnico devido ao seu pequeno tamanho; So tubos delgados compostos por subunidades proteicas helicalmente arranjadas e com cerca de 3-10 nm de dimetro e alguns micrometros de comprimento; Alguns tipos de fimbrias fixam bactrias s superficies slidas, como rochas e tecidos hospedeiros.
Os pilis so estruturalmente semelhantes s fimbrias, mas existem cerca de 1-10 por clula e diferem de vrios modos: So maiores que as fimbrias, cerca de 9-10 nm de dimetro; Tm como funo permitir a conjugao entre bactrias e so determinados por plasmideos conjugativos.
Flagelo e Mobilidade A maior parte das bactrias movem-se pelo uso de flagelos, apndices locomotores semelhantes a um fio que se extendem para o exterior na membrana celular e da parede celular: So estruturas delgadas e rigidas com cerca de 20 nm de dimetro e 15-20 m de comprimento; So to finos que no podem ser observados directamento com um microscpio ptico, tendo de ser corados por tcnicas especiais desenhadas para aumentar a sua espessura; A estrutura detalhada de um flagelo apenas pode ser observada com o microscpio electrnico.
Spirillum volutans Colorao do flagelo Microcpio ptico
Flagelo de Proteus vulgaris Microcpio electrnico
As espcies de bactrias normalmente diferem distintivamente nos seus padres de distribuio dos flagelos:
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a) Bactrias Monotrichous apresentam apenas um flagelo, que quando se localiza numa extremidade desginado flagelo polar. Ex: Vibrio cholerae; b) Bactrias Amphitrichous apresentam um unico flagelo em cada polo. Ex: Bartonella bacilliformis; c) Bactrias Lophotricous apresentam um grupo de flagelos numa extremidade ou em ambas. Ex: Spirillum serpens; d) Bactrias Peritrichous apresentam flagelos espalhados por toda a bacteria. Ex: E. Coli. Ultraestrutura do Flagelo O flagelo bacteriano composto por trs partes: 1. A poro e mais longa e obvia o filamento, que se extende da superficie celular; 2. Um corpo basal embebido na clula; 3. Um segemnto curto e curvado, o gancho, que liga o filamento ao seu corpo basal e actua como um acoplamento flexivel.
O filamento um cilindro oco e rigido construido por uma unica proteina designada flagelina, que pode ter peso molecular de 30.000-60.000. O filamento termina com uma proteina de capping. Algumas bactrias apresentam camadas a revestir o su flagelo. Por exemplo, Bdellovibrio apresenta uma esturtura membranosa a revestir o filamento e Vibrio cholerae apresenta uma camada polissacaridea. O gancho e o corpo basal so bastante diferentes do filamento: 1. Ligeiramente mais largo que o filamento, o gancho feito de subunidades proteicas diferentes; 2. O corpo basal a parte mais complexa do flagelo: a) Em bactrias gram-negativo, o corpo basal apresenta quatro aneis ligados a uma haste central. Os aneis mais externos L e P associam-se com lipopolissacarideos e camadas de peptidoglicano, respectivamente. O anel mais interno contacta com a membrana plasmtica;
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b) As bactrias gram-positivo tm apenas dois aneis de corpo basal, um anel interno ligado membrana plasmtica e um externo provavelmente ligado ao peptidoglicano.
Sntese do Flagelo A sintese do flagelo um processo complexo que envolve pelo menos 20 a 30 genes. Para alm do gene para a flagelina, 10 ou mais genes codificam as proteinas do gancho e do corpo basal, estando ainda outros concentrados no controlo da construo ou funo flagelar mas no se sabe como que a clula regula ou determina a localizao exacta do flagelo. No entanto, acredita-se que na sintese do filamento: 1. Subunidades de flagelina so transportadas atravs do nucleo interno do filamento; 2. Quando alcanam a ponta, as subunidade agregam-se espontaneamente sob a direco de uma cap especial do filamento; 3. Isto faz com que o filamento cresa na sua ponta em vez da sua base.
A sintese do filamento um exemplo excelente de auto-montagem pois muitas estruturas formam-se espontaneamente atravs da associao das suas partes componentes sem a necessidade de enzimas especiais ou outros factores. Assim, a informao necessria para a construo do filamento est presente na estrutura da subunidade de flagelina por si s.
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Mecanismo de Movimento do Flagelo O flagelo procariota opera de modo diferentes do eucariota, pois o filamento tem uma forma de hlice rigida e a bactria move-se quando esta hlice roda. O motor flagelar capaz de rodar muito rapidamente, sendo que em E. Coli capaz de alcanar cerca de 270 rps e em Vibrio alginolyticus cerca de 1.100 rps. A direco da rotao flagelar determina a natureza do movimento bacteriano: a) Flagelos polares, de bactrias monotrochous, rodam no sentido contrrio ao dos ponteiros do relgio (quando visto do exterior da clula) durante o movimento normal para a frente, enquanto a clula roda lentamente no sentido dos ponteiros do relgio. A rotao do flagelo impulssiona a bactria para a frente; b) As bactria monotrichous param e tm um movimento desordenado revertendo a direco do movimento do flagelo. Bactrias com flagelos espallhados por toda a clula operam de um modo semelhante: c) Para mover para a frente, os flagelos rodam no sentido contrrio ao dos ponteiros do relgio. Ao fazer isto, eles dobram-se no gancho para formar um feixe de rotao para impulsiona-las para a frente; d) Rotao no sentido contrrio ao dos ponteiros do relgio desfaz o feixe e a clula move-se desorientadamente. Como as bactrias nadam atravs da rotao dos seus flagelos rigidos, tem de haver um tipo de motor na base: Uma haste extende-se a partir do gancho e termina no anel M, que capaz de rodar livermente na membrana plasmtica; Acredita-se que o anel S se encontra anexado parede celular em clulas gram-positivo e no roda; Os aneis P e L de bactrias gram-negativas actuam como rolamentos para a rotao da haste; Existe algumas evidncias de que o corpo basal uma estrutura passiva e roda num complexo proteico embebido na membrana.
O mecanismo de rotao do corpo basal baseia-se em: A poro de rotao do motor parece ser construida principalmente por uma haste, pelos aneis M e por um anel C ligado no lado citoplasmtico do corpo basal; Estes dois aneis so feitos de vrias proteinas, sendo a proteina Fli G particularmente importante na produo do movimento flagelar; As duas proteinas mais importantes da parte esttica do motor so Mot A e Mot B. estas formam um canal de protes atravs da membrana plasmtica, sendo que Mot B tambm ancora o complexo Mot ao peptidoglicano da parede celular e Mot A e Fli G interagem directamente durante a rotao flagelar;
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A rotao dirigida por gradientes de protes ou sdio em procariotas e no directamente por ATP, como o caso dos flagelos eucariotas.
O flagelo um dispositivo de movimento natatrio bastante efectivo. Do ponto de vista da bactria, nadar uma tarefa complicada porque a gua envolvente parece to espessa e viscosa como o melaoa clula deve assim perfurar atravs da gua com o seu flagelo halical e se a sua actividade flagelar cessar ela pra quase instantaneamente. Apesar desta resistncia ambiental ao movimento, as bactrias so capazes de nadar a uma velocidade de cerca de 20 a 90 m/segundo, o que equivalente a viajar de 2 a 100 comprimentos de clula por segundo. As bactrias so capazes de se mover por outros mecanismos para alm da rotao flagelar: As espiroquetas so bactrias em forma de hlice que viajam atravs de substncias viscosas como muco ou lama por movimentos flxiveis e de giro causados por filamentos axiais compostos por flagelos periplasmticos; A mobilidade de deslizamento diferente e empregue por muitas bactrias, como cianobactrias, myxobactrias e citofagas, e alguns mycoplasmas. Apesar de no existirem estruturas externas visiveis associadas a este tipo de mobilidade, estas bactrias so capazes de viajar ao longo de superficies slidas a taxas de 3 m/segundo.
Matriz Citoplasmtica Procaritica

O citoplasma procaritico, ao contrrio do eucaritico, no apresenta organelos membranares. A matriz citoplasmtica a substncia que se encontra entre a membrana plasmtica e o nucleide e maioritariamente gua (cerca de 70% da massa bacteriana gua). inexpressivo em microscopia electronica mas normalmente empacotado com ribossomas e altamente organizado: Proteinas especificas esto posicionadas em locais particulares como o polo celular e o local onde a clula bacteriana se divide;
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Apesar da bactria poder no apresentar um citoesqueleto verdadeiro, ela apresenta um sistema de proteinas semelhantes ao citoesqueleto na sua matriz citoplasmtica.
A membrana plasmtica e tudo no seu interior designado de protoplasto, pelo que a matriz citoplasmtica a principal parte do protoplasto.
Corpos de Incluso Uma variedade de corpos de incluso, grnulos de material orgnico ou inorgnico que muitas vezes so claramente visiveis com o microscpio ptico, est presente na matriz citoplasmtica: Estes corpos so normalmente usados para armazenamento (e.g., compostos orgnicos, substncias inorgnicas e energia) e tambm reduzem a presso osmtica por prenderem molculas na forma de particulas; Alguns corpos de incluso no so revestidos por uma membrana e encontram-se livres no citoplasma (p. ex., grnulos de polifosfato, de cianoficina e alguns de glicognio); Outros corpos de incluso so revestidos por uma membrana com cerca de 2,0-4,0 nm de espessura, que uma membrana com apenas uma camasa e no uma tipica bicamada lipidica (p. ex., grnulos de poli--hidroxibutirato, alguns de glicognio e de enxofre, carboxissomas e vacuolos de gs); As membranas dos corpos de incluso variam em composio, sendo que algumas tm uma natureza proteica enquanto outras lipidica; Como os corpos de incluso so usados para armazenamento, a sua qualidade ir variar com o estado nutricional da clula.
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Os corpos de incluso orgnicos normalmente contm ou glicognio ou poli--hidroxibutirato: Glicognio um polimero de unidades de glucose composto por longas cadeias formadas por ligaes glicosidicas (14) e cadeias de ramificao ligadas s primeiras por ligaes glicosidicas (16). O glicognio est disperso uniformemente atravs da matriz na forma de pequenos grnulos (com cerca de 20-100 nm de dimetro) e podem ser muitas vezes observado apenas com o microscpio electrnico. Se as clulas conterem uma grande quantidade de glicognio, este pode ser corado com uma soluo de iodo; Poli--hidroxibutirato (PHB) contem molculas de -hidroxibutirato ligadas por ligaes ster entre os grupos carboxilo e hidroxilo de molculas adjacentes. O PHB acumula-se em corpos distintos, com cerca de 0,2-0,7 m de dimetro, que so facilmente corados com negro do Sudo para microscopia ptica, sendo claramente observveis.
Poli--hidroxibutirato
Estes corpos de incluso de glicognio e PHB so reservatrio de carbono que fornecem materiais para energia e biossintese, mas algumas bactrias tambm so capazes de aramzenar carbono na forma de gotas lipidicas. As cianobactrias apresentam dois tipos distintos de corpos de incluso orgnicos: a) Grnulos de cianoficina compostos por grandes polipeptidios que contm aproximadamente quantidades iguais de aminocidos arginina e aspartato. Os grnulos muitas vezes so grandes o suficiente para serem visiveis no microscpio ptico e armazenam azoto extra para a bactria; b) Carboxissomas presentes em muitas bactrias, bactrias nitrificantes e tiobacilos. So polidricos, com cerca de 100 nm de dimetro, e contm a enzima ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase num arranjo paracristalino. Servem como um reservatrio desta enzima e podem ser um local de fixao de CO2.
(a)
(b)
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Um corpos de incluso orgnico extraordinrio, o vacuolo de gs, est presente em muitas cianobactrias, bactrias fotossintticas prpura e verdes e em algumas formas aquticas de Halobacterium e Thiothrix. Estas bactrias flutuam na ou perto da superficie, porque os vacuolos de gs do-lhes flutuabilidade: Os vacolos de gs so agregados de numeros enormes de estruturas pequenas, ocas e cilindricas designadas vesiculas de gs; As paredes destas vesiculas no contm lipidos e so compostas inteiramente por uma pequena proteina e estas subunidades proteicas montam-se para formar um cilindro rigido que oco e impermevel gua mas livremente permevel aos gases atmosfricos;
As bactrias com vacuolos de gs so capazes de regular a sua flutuabilidade para flutuarem profundidade necessria para intensidade luminosa, concentrao de oxignio e niveis de nutrientes adequados. Elas descem simplesmente colapsando vesiculas e flutuam quando novas so construidas.
Os dois principais tipos de corpos de incluso inrognicos podem ser observados: a) Grnulos polifosfato ou grnulos volutin o polifosfato um polimero linear de ortofosfatos ligados por ligaes ster. Assim, estes grnulos funcionam como reservatrios de fosfato, um componente importante dos constituintes celulares, como os cidos nucleicos. Eem algumas clulas, actuam como reservas de energia e o polifosfato pode servir como fonte de energia em algumas reaces, sendo designados de grnulos metacrmicos porque apresentam o efeito metacrmico, ou seja, aparecem vermelhos ou com um tom de azul diferente quando so corados com azul de metileno ou azul toluidina; b) Grnulos de enxofre constituem aramazens de enxofre temporrios. Por exemplo, bactrias pprura fotossintticas so capazes de usar sulfeto de hidrognio como dador de electres na fotossintese e acumulam o enxofre resultante no espao periplasmtico ou em glbulos citoplasmticos especiais.
(a)
(b)
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Os corpos de incluso inorgnicos podem ser tambm usados para funes diferentes do aramzenamento. Um exemplo excelente o magnetossoma, que usado por algumas bactrias para se orientarem no campo magntico terrestre. Estes corpos de incluso contm ferro na forma de magnetite: Cadeias de particulas de magnetite (Fe3O4), com cerca de 40-100 nm de dimetro e rodeadas por uma membrana; Algumas espcies de habitates sulfidicos apresentam magnetossomas que contm greigite (Fe3S4) e pirite (FeS2); Visto que cada particula de ferro um pequeno iman, as bactrias do hemisfrio norte usam as suas cadeias de magnetossmas para determinar direces para norte e para baixo e nadar para locais ricos em nutrientes; As bactrias do hemisfrio sul usam para determinar direces para sul e para baixo, com o mesmo efeito;
Os magnetossomas esto tambm presentes na cabea dos pssaros, atuns, golfinhos, tartarugas e outros animais, presumivelmente para ajudar na navegao.
Nucleide
Provavelmente, a difereno mais notvel entre procariotas e eucaritas est na forma como o material gentico de ambos est empacotado: As clulas eucariticas tm dois ou mais cromossomas dentro de um organelo delimitado por uma membrana, o ncleo;
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O cromossoma das clulas procariticas est localizado numa regio de forma irregular designada nucleide.
Normalmente, os procariotas contm um nico circulo de DNA, mas alguns apresentam um cromossoma linear. Recentemente foi descoberto que algumas bactrias como Vibrio cholerae apresentam mais um cromossoma. Apesar da aparncia do nucleide variar com o mtodo de fixao e de colorao, normalmente so observadas em micrografias electrnicas e so provavelmente DNA. O nucloide tambm visivel pelo microscpio ptico aps colorao com o mtodo de Feulgen, que reage especificamente com DNA. Uma clula pode apresentar mais de um nucleide quando ocorre diviso celular aps o material gentico ser duplicado. Em bactrias que crescem activamente, o nucleide apresenta projeces que se extendem para a matriz citoplasmtica. Presumivelmente, estas projeces contm DNA que est a ser activamente transcripto para produzir mRNA. Estudos de microscopia electrnica mostram o nucleide em contacto com o mesossoma ou a membrana plasmtica e tambm foram encontradas membranas ligadas a nucleides isolados: Existe evidncia de que o DNA bacteriana est preso membrana plasmtica e as membranas podero estar envolvidas na separao do DNA para as clulas filhas durante a diviso.
Anlises qumicas a nucleides isolados sem membranas mostraram que a composio quimica destes : 60% DNA; 30% RNA; 10% proteinas.
Em E. coli, o circulo de DNA fechado mede serca de 1.400 m. Obviamente, este tem de estar muito eficientemente empacotado para caber no nucleide. O DNA extensivamente enrolado, provavelmente com a ajuda de RNA e proteinas nucelides, proteinas diferentes das histonas encontradas nos eucariotas. No entanto, existem algumas excepes, pois regies que contm DNA ligado membrana esto presentes em dois gneros de panctomycetes:
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Pirellula apresentam uma nica membrana que reveste uma regio, o pirellulossoma, que contem um nucleide fibrilar e particulas semelhantes a ribossomas; O corpo nuclear de Gemmata obscuriglobus est ligado a duas membranas.
Muitas bactrias possuem plasmideos em adio ao seu cromossoma: Molculas de DNA de cadeia dupla; Normalmente circulares; So capazes de existir e replicar independentemente do cromossoma ou podem ser integrados com este; So normalmente herdados ou passados progenia; No se encontram normalmente ligados membrana plasmtica e, por vezes, so perdidos para uma das clulas filhas durante a diviso.
Os plasmideos no so necessrios para o crescimento e reproduo do hospedeiro apesar de poderem carregar genes que conferem bactria hospedeira vantagens selectivas: Atribuir resistncia a drogas; Atribuir novas habilidades metablicas; Tornar as bactrias patogneas; Fornecer novas propriedades s bactrias.
Como os plasmdeos muitas vezes se movem entre bactrias, propriedades como resistncia a drogas podem espalhar-se atravs de uma populao.
Endosporo Bacteriano
Um numero de bactrias gram-positivas so capazes de formam uma estrutura especialmente resistente e dormente designado endosporo: Os endosporos desenvolvem-se em clulas bacterianas vegetativas de vrios gnero: Bacillus e Clostridium (bastonetes), Sporosarcina (coccos) e outras; Estas estruturas so extraordinariamente resistentes a stresses ambientais, como calor, radiao ultravioleta, radiao gamma, desinfectantes quimicos e dessecao. De facto, alguns endosporos mantiveram-se viveis por cerca de 100.000 anos; Devido sua resistncia e ao facto de vrias espcies de bactrias formadoras de endosporos serem patognios perigosos, os endosporos so de grande importncia prtica em microbiologia alimentar, industrial e mdica; No ambiente, os endosporos ajudam na sobrevivncia quando nutrientes e gua escaceiam.
Deste modo, essencial ser possivel esterilizar solues e objectos slidos. Os endosporos normalmente sobrevivem fervura por uma hora ou duas, pelo que os autoclaves devem ser usados para esterilizar muitos materiais. Os endosporos podem ter uma forma redonda ou oval e podem ser examinados tanto com o microscpio electrnico com o microscpio ptico. Como os esporos so impermeveis maior parte das coloraes, podem ser observados como reas incolores em bactrias tratadas como azul de metileno ou outras coloraes simples, ou ento corados por mtodos especiais.
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A posio do esporo na clula me ou esporngio frequentemente difere entre espcies, o que o faz ser til na identificao. Os esporos podem localizar-se em vrios locais e, por vezes, podem ser to grandes que alargam o esporngio: No centro; Perto de uma extremidade (subterminal); Definitivamente na extremidade.
A ultra-estrutura do endosporo complexa, sendo constituido por multiplas partes: Exosprio (EX) revestimento fino e delicado que envolve o endosporo; Tnicas (SC) encontram-se por baixo do exosprio e so constituidas por vrias camadas proteicas, podendo ser bastante finas. So impermeveis e responsveis pela resistncia do esporo a quimicos; Crtex (CX) pode ocupar metade do volume do esporo e encontra-se por baixo da tnica. feito de peptidoglicano que menos cross-linked do que o das clulas vegetativas; Parede celular do esporo (CW) est dentro do crtex e reveste o protoplasto, ou cerne; Cerne (CR) apresenta as estruturas celulares normais como os ribossomas e um nucleide, mas metabolicamente inactivo; Membrana celular encontra-se a baixo da parede celular do esporo.
Ainda no se sabe precisamente porque que o endosporo to resistente ao calor ou outros agentes letais, mas: Cerca de 15% do peso seco do esporo consiste em cido dipicolinico complexado com ies clcio, que se localizada no cerne. Sempre pensou que o cido dipicolinico estava directamente envolvido na resistncia ao calor pelo esporo, mas j foram isolados mutantes resistentes que no apresentam cido dipicolinico. O clcio ajuda na resistncia ao calor seco, agentes oxidantes e algum calor humido. Provavelmente o complexo cido dipicolinico que estabiliza os cidos nucleicos do esporo; Recentemente, pequenas proteinas de ligao ao DNA solveis em cido foram descobertas no endosporo. Elas saturam o DNA e protegem-no do calor, radiao, dessecao e quimicos; A desidratao do protoplasto parece ser muito importante na resistncia do calor. O crtex remove osmoticamente gua ao protoplasto, protegendo-o do calor e da radiao; As tnicas tambm parecem proteger contra enzimas e quimicos como perxido de hidrognio; Os esporos contm algumas enzimas de reparao do DNA. O DNA reparado durante a germinao e desenvolve-se depois do cerne se tornar activo mais uma vez.
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Assim, resumidamente, a resistncia ao calor pelo endosporo deve-se a vrios factores: Estabilizao do DNA por complexos clcio-dipicolinato e proteinas soluveis em cido; Desidratao do protoplasto; As tnicas; Reparao do DNA; Maior estabilidade das proteinas celulares em bactrias adaptadas ao crescimento em altas temperaturas; Outros.
A formao do esporo, esporognese ou esporulao, normalmente comea quando o crescimento cessa devido falta de nutrientes e requer cerca de 10 horas em Bacillus megaterium. um processo complexo que pode ser dividido em sete etapas: Etapa I forma-se um filamento axial de material nuclear; Etapa II forma-se uma dobra interna da membrana celular para revestir parte do DNA e produzir o septo forespore; Etapa III a membrana continua a crescer e engole o esporo imaturo numa segunda membrana; Etapa IV o crtex fica no espao entre as duas membranas e acumula-se clcio e cido dipicolinico; Etapa V formam-se as tnicas proteicas volta do crtex; Etapa VI ocorre a maturao do esporo; Etapa VII enzimas liticas destroem o esporngio libertando o esporo.
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A transformao dos esporos dormentes em clulas vegetativas activas quase to complexo como o processo de esporognese, e ocorre em trs etapas: 1. Activao um processo reversivel que prepara os esporos para a germinao e normalmente resulta de tratamentos como o aquecimento; 2. Germinao a quebra do estado de dormncia do esporo. Este processo caracterizado pela dilatao do esporo, ruptura e absoro da tnica, perda da resistncia ao calor e a outros stress, perda da refractilidade, libertao dos componentes do esporo e aumento da activada metablica. A germinao aps a activao pode ser desencadeada por metabolitos ou nutrientes importantes (e.g., aminocidos e acares); 3. Desenvolvimento o protoplasto do esporo forma novos componentes, emerge das tnicas e desenvolve-se outra vez numa bactria activa. importante ter em conta que o endosporo no germinar com sucesso, mesmo num meio rico em nutrientes, a no ser que este seja activado. O endosporo difere das clulas vegetativas activas de vrios modos, sendo os principais factores que distinguem os endosporos e as clulas vegetativas resumidos do seguinte modo:
Propriedade Tnicas superficiais Aparncia microscpica cido dipicolinico-clcio Actividade da gua citoplasmtica Actividade enzimtica Sintese macromolculas Resistncia ao calor Resistncia a qumicos e cidos Resistncia radiao Sensibilidade lisossima Sensibilidade colorao Clulas vegetativas Parede celular de peptidoglicano tipico No refringente Ausente Alta Presente Presente Baixa Baixa Baixa Sensivel Sensivel Endosporos Tnica do esporo espessa, crtex e parede celular de peptidoglicano Refringente Presente no cerne Baixa Ausente Ausente Alta Alta Alta Resistente Resistente
NUTRIO MICROBIANA
Necessidades Nutricionais Comuns

Para obter energia e construir novos componentes celulares, os organismos devem ser capazes de ter uma fonte de matrias primas e de nutrientes: Nutrientes substncias usadas na biossintese e na produo de energia e, assim, so necessrias para o crescimento microbiano.
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Anlises da composio da clula microbiana mostram que mais de 95% do peso seco da clula composto por poucos elementos principais. Estes elementos so designados macroelementos ou macronutrientes pois so requeridos pelos microorganismos em quantidades elevadas e so: Carbono; Oxignio; Hidrognio; Azoto; Enxofre; Fsforo; Potssio; Clcio; Magnsio; Ferro.
Os primeiros seis (C, O, H, N, S e P) so componentes de carboidratos, lipidos, proteinas e cidos nucleicos. Enquanto os quatro restantes (K, Ca, Mg e Fe) existem na clula na forma de caties e tm vrias funes: O potssio (K+) necessrio para a actividade de vrias enzimas, incluindo algumas envolvidas na sintese proteicas; O clcio (Ca2+), entre outras funes, contribui para a resistncia ao calor dos endosporos bacterianos; O magnsio (Mg2+) serve como um cofator de muitas enzimas, complexa com ATP e estabiliza ribossomas e a membrana plasmtica; O ferro (Fe2+ e Fe3+) uma parte dos citocromos e um cofator de vrias enzimas e proteinas transportadoras de electres.
Para alm disso, todos os organismos, incluindo os microorganismos, requerem vrios micronutrientes ou elementos vestigiais. Estes elementos so tambm necessitados pela maior parte das clulas, no entanto, as clulas requerem muito poucas quantidades para sobreviver. Os principais micronutrientes so: Mangans; Zinco; Cobalto; Molibdnio; Niquel; Cobre.
Como estes micronutrientes so necessrios em muito baixas quantidades, muito dificil demonstrar a necessidade de um micronutriente. Na natureza, os micronutrientes so ubquos e provvelmente no limitam o crescimento. Os micronutrientes so normalmente uma parte das enzimas e cofatores, e ajudam na catlise de reaces e na manuteno da estrutura proteica: O zinco (Zn) est presente no local activo de algumas enzimas mas est tambem envolvido na associao das subunidades regulatrias e cataliticas na aspartato carbamoilase em E. coli; O mangans (Mn2+) ajuda vrias enzimas catalizando a transferncia de grupos fosfato; O molibdnio (Mo2+) necessrio para a fixao de azoto; O cobalto (Co2+) um componente da vitamina B12.
Para alm dos macronutrientes e micronutrientes comuns, os microorganismos podem ter requerimentos particulares que reflectem a natureza especial da sua morfologia ou ambiente. Por exemplo: As diatomcias necessitam de cido slicico (H4SiO4) para construir as suas paredes celulares de silica [(SiO2)n];
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Apesar da maior parte das bactrias no necessitar de grandes quantidades de sdio, muitas bactrias que crescem em lagos salinos e no oceano dependem da presena de grandes concentraes de io sdio (Na+).
Resumidamente, as necessidades nutricionais comuns dos microorganismos so:

Nutrientes Macronutrientes Carbono Oxignio Hidrognio Azoto Enxofre Fsforo Potssio Clcio Magnsio Ferro Micronutrientes Mangans Zinco Funes Componente dos carboidratos, proteinas, lipidos e cidos nucleicos Componente dos carboidratos, proteinas, lipidos e cidos nucleicos Componente dos carboidratos, proteinas, lipidos e cidos nucleicos Componente da proteinas e cidos nucleicos Componente das proteinas Componente das proteinas e dos cidos nucleicos Necessrio para a actividade de vrias enzimas, incluindo algumas envolvidas na sintese proteicas Contribui para a resistncia ao calor dos endosporos bacterianos Cofator de muitas enzimas, complexa com ATP e estabiliza os ribossomas e a membrana plasmtica Parte dos citocromos e um cofator de vrias enzimas e proteinas transportadoras de electres Ajuda vrias enzimas catalizando a transferncia de grupos fosfato Presente no local activo de algumas enzimas mas est tambem envolvido na associao das subunidades regulatrias e cataliticas na aspartato carbamoilase em E. coli Componente da vitamina B12 Necessrio para a fixao de azoto
Cobalto Molibdnio Niquel Cobre Outros nutrientes particulares cido slico Construir as suas paredes celulares de silica [(SiO2)n] das diatomcias Sdio Importante para as bactrias que vivem em lagos salinos e nos oceanos
No entanto, tem de ser enfatizado que os microorganismos requerem uma mistura balanada de nutrientes. Se um nutriente essencial existe em baixa quantidade, o crescimento microbiano ser limitado independentemente da concentrao dos outros nutrientes.
Necessidades de Carbono, Oxignio e Hidrognio

As necessidades de carbono, hidrognio e oxignio normalmente so satisfeitas em conjunto pois o carbono necessrio para o esqueleto de todas as molculas orgnicas e as molculas que servem como fonte de carbono normalmente tambm contribuem com tomos de hidrognio e de oxignio. Como estes nutrientes orgnicos so na maior parte das vezes reduzidos e apresentam electres que podem doar a outras molculas, elas tambm servem como fontes de energia. De facto, quanto mais reduzidas foram as molculas orgnicas, maior o seu conteudo energtico. Isto ocorre porque a transferncia de electres liberta energia quando os electres se movem de dadores reduzidos para aceitadores oxidados. Assim, as fontes de carbono normalmente servem como fontes de energia, apesar de no necessitarem de tal. No entanto, existem fontes de carbono que no funcionam como fontes de energia, devido ao seu estado de oxidao. Assim, podemos ter diferentes tipos de microorganismos dependendo do tipo de fontes de carbono que usam:
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Microorganismos autotrficos apenas estes microorganismos usam CO2 como fonte de carbono, apesar de provavelmente todos os microorganismos serem capaz de o fixar. O CO 2 uma fonte de carbono importante mas no fornece nem hidrognio nem energia, devido ao facto do CO2 estar oxidado e no apresentar hidrognio. Muitos microorganismos so autotrficos, e a maior parte efectua fotossintese e usa a luz como fonte de energia. Alguns autortficos oxidam tambm molculas inorgnicas e derivam energia das transferncias de electres; Microorganismos heterotrficos como a reduo do CO2 um processo que gasta muita energia, muitos microorganismos no so capazes de usar CO2 como unica fonte de carbono e baseiam-se na presena de molculas mais reduzidas e complexas, como a glucose, como fonte de energia. A maior parte dos microorganismos heterotrficos usam compostos orgnicos reduzidos como fontes de energia e de carbono.
A caracteristica nutricional mais extraordinria dos microorganismos a sua extraordinria flexibilidade de fontes de carbono. Experincias de laboratrio indicam que no existe nenhuma molculas orgnica que ocorra na natureza que no pode ser usada por algum microorganismo: As actomycetes so capazes de degradar alcool amilico, parafina e mesmo borracha; Algumas bactrias so capazes de usar quase qualquer coisa como fonte de energia, como as Burkholderia cepacia, que so capazes de usar mais de 100 compostos orgnicoas; Algumas bactrias so bastante fastidiosas e catabolizam apenas alguns compostos orgnicos; Culturas de bactrias metilotrficas metabolizam metano, metanol, monxido de carbono, cido frmico e molculas de um carbono relacionas; Membros parasitas do gnero Leptospira usam apenas cidos gordos de cadeia longa como as suas fontes de energia e de carbono principais.
Parece que, nos ambientes naturais, populaes complexas de microorganismos muitas vezes metabolizam mesmo substncias feitas pelo Homem relativamente indigestiveis, como os pesticidas. Estas molculas normalmente so oxidadas e degradas na presena de um nutriente promotor do crescimento que metabolizado ao mesmo tempo, um processo designado co-metabolismo. Os produtos deste metabolismo podem depois ser usados como nutrientes por outros microorganismos.
Tipos Nutricionais de Microorganismos

Em adio necessidade de carbono, hidrognio e oxignio, todos os organismos requerem fontes de energia e electres para ocorrer o crescimento. Assim, os microorganismos podem ser organizados em classes nutricionais com base no modo que usam para satisfazer estas necessidades:
Classificao Fontes de carbono Autotrficos Heterotrficos Fontes de energia Fototrficos Quimiotrficos Fontes de electres Litotrficos Organotrficos Joana Maria Soares Pereira Fontes de carbono, energia e electres CO2 ou fontes de carbono biossintticas principais Molculas orgnicas reduzidas produzidas por outros organismos Luz Oxidao de compostos orgnicos ou inorgnicos Molculas inorgnicas reduzidas Molculas orgnicas 79
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Apesar da grande diversidade metablica observada nos microorganismos, a maior parte pode ser colocado num de quatro tipos nutricionas principais de microorganismos com base nas suas fontes primrias de carbono, energia e electres:
Tipo nutricional Autotrofia fotolitotrfica (Fotolitoautotrficos) Hetrotrofia fotoorganotrfica (Fotoorganotrficos) Fontes de energia, hidrognio/electres e carbono Energia solar Dadores de hidrognio/electres (H/e ) inorgnicos CO2 como fonte de carbono Energia solar Dadores de H/e orgnicos Fontes de carbono orgnicas (CO2 tambm s vezes) Fontes de energia quimica (inorgnicas) Dadores de H/e inorgnicos CO2 como fontes de carbono Microorganismos representativos Algas; Bactrias de enxofre verdes e pprura; Cianobactrias Bactrias verdes e ppura no-sulfurosas Bactrias oxidantes de enxofre; Bactrias de hidrognio; Bactrias nitrificantes; Bactrias oxidantes de ferro Protozorios; Fungos; Maior parte das bactrias no fotossintticas (incluindo alguns patognio)
Autotrofia quimolitotrfica (Quimolitoautotrficos)
Heterotrofia quimoorganotrfica (Quimoorganoheterotrficos)
Fontes de energia quimica (orgnicas) Dadores de H/e orgnicos Fontes de carbono orgnicas
A grande maioria dos quimoorganoheterotrficos:
microorganismos
estudados
ou
so
fotolitoautotrficos
ou
Fotolitoautotrficos (fotoautotrficos) usam energia da luz e tm CO2 como a sua fonte de carbono. As algas eucariotas e as cianobactrias usam gua como dador de electres e libertam oxignio. Bactrias de enxofre verdes e prpura oxidam gua mas extraem electres de dadores inorgnicos como hidrognio, sulfeto de hidrognio e enxofre elementar; Quimoorganoheterotrficos (quimoheterotrficos) usam compostos orgnicos como fontes de energia, hidrognio, electres e carbono. Frequentemente, os mesmos nutrientes orgnicos satisfaro estes requerimentos todos. Essencialmente todos os microorganismos patognicos so quimoheterotrficos.
As outras duas classes nutricionais apresentam menos microorganismos mas so muitas vezes muito importantes ecologicamente: Fotoorganohetrotrficos algumas bactrias verdes e prpura so fotossintticas e usam matria orgncia como dadores de electres e fontes de carbonos. Estes microorganismos so habitantes comuns de lagos poluidos. Algumas destas bactrias so tambm capazes de crescer como fotoautotrficos como hidrognio molculas como fonte de energia; Quimolitoautotrficos oxidam compostos inorgnicos reduzidos como o ferro, o azoto ou enxofre para formar energia e electres para biossintese, sendo a fonte de carbono o dixido de carbono.
Alguns quimolitotrficos so tambm capazes de derivar o seu carbono de fontes orgnicas e, assim, serem heterotrficos. Os quimolitotrficos contribuem altamente para a transformao quimica dos elementos que ocorre continuamente no ecossistema.
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Apesar de uma espcie em particular normalmente pertencer a apenas um dos tipos nutricionais, alguns mostram uma grande flexibilidade metablica e alteram os seus padres metablicos em resposta a padres ambientais. Por exemplo, vrias bactrias prpura de no enxofre actuam como fotoorganoheterotrofes na ausncia de oxignio mas oxidam molculas orgnicas e funcionam quimotroficamente a niveis de oxignio normais. Quando o oxignio baixo, a fotossintese e o metabolismo oxidativo funcionam simultaneamente. Estes microorganismos so por vezes designados de mixotrficos porque combinam processos metabolicos. Isto parece complexo e confuso mas fornece ao seu possessor uma vantagem definitiva se as condies ambienteis alterarem frequentemente.
Necessidades de Azoto, Fsforo e Enxofre

Para crescer, um microorganismos deve ser capaz de incorporar grandes quantidades de azoto, fsforo e enxofre. Apesar destes elementos serem adquiridos a partir das mesmas fontes de nutrientes que fornecem carbono, os microorganismos normalmente usam fontes inorgnicas tambm. O azoto necessrio para a sntese de aminocidos, purinas, pirimidinas, alguns carboidratos e lipidos, cofactores de enzimas e de outras substncias: Muitos microorganismos so capazes de usar azoto em aminocidos, e a amnia directamente incorporada atravs da aco de enzimas como a glutamato desidrogenase ou glutamina sintetase e glutamato sintetase; A maior parte do fototrofes e muitos microorganismos no fotossintticos reduzem nitrato a amnia e incorporam a amnia; Uma variedade de bactrias (e.g., muitas cianobactrias e a bactria simbitica Rhizobium) so capazes de reduzir azoto atmosfrico assimilado usando o sistema nitrogenase.
O fsforo est presente nos cidos nucleicos, fosfolipidos, nucletidos como ATP, vrios cofatores, algumas proteinas e noutros componentes celulares: Quase todos os microorganismos usam fosfato inirgnico como fonte de fsforo e incorporamno directamente; Baixos niveis de fosfato limitam o crescimento microbiano em ambientes aquticos; E. coli consegue usar tanto fosfato orgnico como inorgnico. Alguns organofosfatos, como hexoses-6-fosfato, podem ser obtidos directamente por proteinas transportadoras e outros organofosfatos so muitas vezes hidrolizados no periplasma pela enzima fosfatase alcalina para produzir fosfato inorgnico, que depois transportado para o interior da clula. Quando existem fosfato inorgnico fora da clula, este atravessa a membrana externa pelas porinas e entra depois na clula; A grandes concentraes de fosfato, o transporte provavelmente devido ao sistema Pit. Quando as concentraes de fosfato so baixas, o sistema PST (phosphate-specific transport) o mais importante. O sistema PST tem uma maior afinidade para o fosfato, e um transportadors ABC que usa um proteinas de ligao periplasmtica.
O enxofre necessrio para a sintese de substncias como os aminocidos cisteina e metionina, alguns carboidratos, biotina e tiamina: Muitos microorganismos usam sulfato como uma fonte de enxofre e reduzem-no por reduo de sulfato assimilatria. Por outros lados, alguns requerem uma forma reduzida de enxofre como cisteina.
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Factores de Crescimento
Os microorganismos normalmente crescem e reproduzem-se quando minerais e outras fontes de energia, carbono, azoto, fsforo e enxofre so fornecidas. Estes organismos tm enzimas e vias necessrias para sintetizar todos os componentes celulares necessrios para o bem-estar. Muitos microorganismos, por outro lado, no apresentam uma ou mais enzimas essenciais. Assim, no so capazes de construir todos os constituintes indispensveis e tero de os obter ou aos seus precursores a partir do seu ambiente. Os componentes orgnicos necessrios porque so componentes celulares essenciais ou precursores de tais componentes e que no podem ser sintetizados pelo organismo so designados factores de crescimento, e existem trs classes: 1. Aminocidos necessrios para a sintese de proteinas; 2. Purinas e pirimidinas necessrias para a sintese de cidos nucleicos; 3. Vitaminas pequenas molculas orgnicas que normalmente englobam todos ou parte dos cofatores das enzimas, sendo que apenas quantidades muito pequenas sustm o crescimento. As vitaminas podem ter muitas funes:
Vitamina Biotina Funes Fixao de CO2 (carboxilao) Metabolismo de um carbono Rearranjos moleculares Metabolismo de um carbono carrega grupos metilo Metabolismo de um carbono Transferncia de grupos acilo Precursor da Co-A carrega grupos acilo (oxidao do piruvato, metabolismo de cidos gordos) Metabolismo de aminocidos (e.g., transaminao) Precursor de NAD e NADP carrega electres e tomos de hidrognio Precursor de FAD e FMN carrega electres ou tomos de hidrognio Transferncia de grupos aldedo (descarboxilao do piruvato, oxidao de -cetocidos) Exemplos de microorganismos Leuconostoc mesenteroides (B) Saccharomyces cerevisiae (F) Ochoromonas malhamensis (A) Acanthamoeba castallani (P) Lactobacillus spp. (B) Euglena gracilis (A) Diatomcias e outras algas Acanthamoeba castallani (P) Enterococcus faecalis (B) Tetrahymena pyriformis (P) Lactobacillus casei (B) Tetrahymena spp. (P) Proteus morganii (B) Hanseniaspora spp. (F) Paramecium spp. (P) Lactobacillus spp. (B) Tetrahymena pyriformis (P) Brucella abortus (B) Haemophilus influenzae (B) Blastocladia pringsheimii (F) Caulobacter vibrioides (B) Dictyostelium spp. (F) Tetrahymena pyriformis (P) Bacillus anthracis (B) Phycomyces blakesleeanus (F) Ochromonas malhamensis (A) Colpidium campylum (P)
Cianocobalamina (B12)
cido flico cido lipico cido pantotnico Piridoxina (B6) Niacina (cido nicitinico)
Riboflavina (B2)
Tiamina (B1)
(B) bactria; (F) fungo; (A) alga; (P) protozorio
Muitos microorganismos requerem vrias vitaminas. Mas, para alm destas vitaminas, tambm podemos encontrar outros factores de crescimento:
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Heme obtido dos citocromos e da hemoglobulina e necessrio po Haemophilus influenzae; Colesterol necessitado por alguns micoplasmas.
O conhecimento da necessidade de factores de crescimento especificos de muitos microorganismos torna possivel ensaios quantitativos de crescimento para uma variedade de substncias: 1. A bactria apropriada cresce numa srie de vasos de cultura, cada um contendo meio com excesso de todos os componentes necessrios excepo do factor de crescimento a ser testado. Uma quantidade diferente de factor de crescimento adicionada a cada vaso; 2. A curva padro preparada fazendo um grfico da quantidade do factor de crescimento em ordem ao crescimento total bacteriano. Idealmente, a quantidade de crescimento resultante directamente proporcional quantidade de factor de crescimento presente; 3. A quantidade de factor de crescimento numa amostra teste determinada comparando a extenso do crescimento causado pela amostra desconhecida com o resultado dos padres. Estes ensaios so especificos, sensiveis e simples. So tambm usados no estudos de substncias como vitamina B12 e biotina.
Uptake de Nutrientes pela Clula

O primeiro passo no uso de nutrientes o uptake de nutrientes necessrios pela clula microbiana. Para isso preciso ter em conta o seguinte: Os mecanismos de uptake devem ser especificos. Isto , as substncias necessrias, e no outras, devem ser adquiridas, o que permite que a clula no recolha nutrientes que no necessita e confere resistncia a determinados compostos; Visto que os microorganismos normalmente vivem em habitats pobres em nutrientes, eles devem ser capazes de transportar nutrientes de solues diluidas para a clula contra um gradiente de concentrao; As molculas de nutrientes devem passar atravs de uma membrana plasmtica selectivamente permevel que no permitir a livre passagem de muitas substncias.
Em virtude na enorme variedade de nutrientes e da complexidade da tarefa, no supreendente que os microorganismos faam uso de vrios mecanismos de transporte diferente, como: Difuso facilitada; Transporte activo; Translocao em grupo.
No entanto, microorganismos eucariotas no aprecem usar a translocao em grupos, mas recolhem nutrientes pelo processo de endocitose. Difuso Facilitada A difuso passiva, normalmente designada apenas como difuso, o processo no qual as molculas se movem de uma regio com maior concentrao para uma de menor concentrao devido agitao trmica aleatria, sendo que a sua taxa dependente do tamanho do gradiente de concentrao entre o exterior da clula e o seu interior: Um gradiente de concentrao relativamente grande necessrio para o uptake adequado de nutrientes por difuso passiva (i.e., a concentrao externa de nutrientes deve ser elevada);
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A taxa de uptake diminui quanto mais nutriente adquirido a no ser que este seja usado imediatamente.
Molculas muito pequenas, como H2O, O2 e CO2, e lipossuloveis, como glicerol, movem-se normalmente atravs das membranas por difuso passiva. No entanto, molculas maiores, ies e substncias polares no so capazes de atravessar as membranas por este mecanismo. Difuso Passiva Difuso Facilitada
A taxa de difuso atravs das membranas selectivamente permeveis altamente aumentada pelo uso de proteinas carregadoras, muitas vezes designadas permeases, que se encontram embebidas na membrana plasmtica. Como um carregador est a facilitar o processo de difuso, este processo designado de difuso facilitada: A taxa de difuso facilitada aumenta como o gradiente de concentrao muito mais rapidamente e a menores concentraes de molcula difusora do a difuso passiva; Os niveis de taxa de difuso alcanam um plateau acima de um valor de gradiente especifico pois os carregadores esto saturados, isto , a proteina carregadora est a ligar e a transportar o mximo de molculas de soluto possivel; A curva final semelhante a uma curva enzima-substrato e diferente da resposta linear observada para a difuso passiva.
As proteinas carregadoras so semelhantes a enzimas na sua especificidade para a substncia a ser transportada, sendo que cada carregador selectivo e ir transportar apenas solutos altamente relacionados. No entanto, apesar de uma proteina carregadora estar envolvida, a difuso facilitada verdadeiramente difuso pois: Um gradiente de concentrao atravs da membranar dirige o movimento de molculas; No necessria qualquer energia metablica; Se o gradiente de concentrao desaparecer, o movimento cessa.
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Contudo, o gradiente pode ser mantido por transformao do nutriente transportado noutro composto ou movendo-o para outro compartimento membranoso em eucariotas. Muito trabalho j foi feito sobre o mecanismo de difuso facilitada e parece que ocorre do seguinte modo: O complexo proteico carregador atravessa a membrana; Quando a molcula de soluto se liga no exterior do transportador, esta proteina muda de conformao e liberta a molcula no interior da clula; O carregador aletra subsequentemente a sua forma para a conformao original e fica pronto para recolher outra molcula; Assim, uma molcula insoluvel em lipidos capaz de entrar na clula em resposta ao seu gradiente de concentrao.
Como este mecanismo dirigido por gradientes de concentrao, ele tambm reversivel. Deste modo, se a concentrao de um soluto maior no exterior, ele ir mover-se para o exterior. No entanto, como a clula metaboliza os nutrientes aps a sua entrada, o influxo favorecido. A difuso facilitada no aparece ser importante em procariotas porque as concentraes de nutrientes so muitas vezes menores no exterior da clula de modo que a difuso facilitada no pode ser usada no uptake. O glicerol transportado por difuso facilitada em E. coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Bacillus e muitas outras bactrias. Por outro lado, este processo para ser mais proeminente nas clulas eucariotas onde usado para transposrtar uma variedade de acares e aminocidos. Transporte Activo Apesar dos carregadores da difuso facilitada serem capazes de mover molculas para o interior da clula quando a concentrao de soluto maior no exterior da clulas, estes no so capazes de recolher solutos que j esto mais concentrados no interior da clulas, isto , contra um gradiente de concentrao. No entanto, os microorganismos normalmente vivem em habitats caracterizados por fontes de nutrientes muito diluidos e estes devem ser capazes de transportar e concentrar esses nutrientes. Assim, os mecanismos de difuso facilitada no so sempre adequados e outras vias devem ser usadas, sendo os mecanismos mais importantes nestes casos: Transporte activo; Translocao em grupo.
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O transporte activo o transporte de molculas de soluto para concentraes mais elevadas, ou contra um gradiente de concentrao, com o uso de energia metablica. Como este mecanismo envolve a actividade de proteinas transportadoras, bastante semelhante difuso facilitada de vrios modos: As proteinas transportadoras, ou permeases, ligam solutos particulares com alta afinidade; Molculas semelhantes so capazes de competir para a mesma proteina transportadora; Ocorre efeito de saturao a altas concentraes de soluto.
No entanto, o transporte activo difere da difuso facilitada pelo uso de energia metablica e na sua habilidade de concentrar substncias. Assim, inibidores metablicos que bloqueiam a produo de energia iro inactivar o trabsporte activo mas no afectaro a difuso facilitada (pelo menos a um curto prazo). A maior parte dos transportadores usados no transporte activo so os transportadores ABC (ATPbinding cassette transporters), que esto activos em bacteria, archaea e eucariotas: Normalmente, consistem em dois dominios hidrofbicos membranares associados nas suas superficies citoplasmticas com dois dominios de ligao a nuceltidos, sendo que os dominios membranares formam um poro na membrana e os dominios de ligao a nucletidos ligam e hidrolizam ATP para dirigir o uptake. Usam proteinas especiais de ligao ao substrato, que se encontram no espao periplasmtico de bactrias gram-negativas ou se encontram ligadas a lipidos membranares de face externa da membrana plasmtica de bactrias gram-positivas. Estas proteinas de ligao ligam a molcula a ser transportada e interagem com as proteinas transportadoras para mover a molcula de soluto para o interior da clula; E. coli transporta uma variedade de acares (arabinose, maltose, galactose, ribose) e aminocidos (glutamato, histidina, leucina) por este mecanismo.
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As bactrias tambm usam gradientes de protes gerados durante o transporte de electres para dirigir o transporte activo e as proteinas membranares responsveis por este processo no apresentam proteinas periplasmticas de ligao ao soluto especiais. Podemos ter dois tipos de transporte por este mtodo: Simporte a lactose permease de E. coli uma proteina unica de peso molecular de 30.000 que transporta uma molcula de lactose para o interior ao mesmo tempo que um proto entra para a clula, ou seja, h tranporte de duas molculas na mesma direco. Uma maior concentrao de protes mantida no lado externo da membrana por actividade da cadeia transportadora de electres. Aqui, a energia armazenada como um gradiente de protes dirige o transporte de soluto. E. coli tambm usa este mecanismo para recolher aminocidos e cidos orgnicos como succinato e malato;
Antiporte um sistema de transporte de sdio em E. coli bombeia sdio para fora em resposta ao movimento de protes para o interior e este gradiente de sdio gerado pode depois dirigir a recolha de outros nutrientes. Assim, o antiporte consiste neste movimento de substncias em sentido contrrio.
Os sistemas de antiporte, normalmente esto associados indirectamente a outros mecanismos de transporte dependentes de gradientes, e muitas vezes estes mecanismos consistem em gradientes de ies sdio. O gradiente de ies sdio gerado pelo antiporte de protes dirige o uptake de acares e aminocidos e isso ocorre do seguinte modo: 1. Os protes so bombeados para o exterior da membrana plasmtica durante o transporte de electres; 2. O gradiente de protes dirige a expulso de ies sdio por um mecanismo de antiporte; 3. Um io de sdio liga-se a uma proteina carregadora; 4. A forma dos locais de ligao ao soluto altera e este liga o soluto (p.ex., aminocidos ou acares); 5. A conformao do carregador muda de novo de modo que o io sdio libertado no lado interno da membrana seguido de libertao do soluto no interior da clula.
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As proteinas transportadoras de E. coli carregam o acar melibiose o aminocido glutamato por gradiente de sdio. No enanto, este processo tambm importante em clulas eucariotas onde usado na recolha de acar e aminocidos, mas aqui o ATP, em vez de protes, que dirige normalmente o transporte de sdio em eucariotas. Normalmente, um microorganismo tem mais de um sistema de transporte para cada nutriente e estes sistemas diferem em propriedades como a sua fonte de energia, a sua afinidade para o soluto transportado e a natureza da sua regulao. Esta diversidade atribui ao seu possuidor uma vantagem competitiva num ambiente varivel. Translocao em Grupo Muitos procariotas tambm recolhem molculas por um outro processo dependente de energia definido por: Translocao em grupo - processo no qual uma molcula transportada para a clula enquanto quimicamente alterada e que pode ser classificado como um tipo de transporte dependente de energia devido ao uso de energia metablica.
O sistema de translocao em grupo melhor conhecido o sistema fosfoenolpiruvato:acar fosfotransferase (PTS) e este transporta uma variedade de acares para as clulas procariotas enquanto as fosofrila usando fosfoenolpiruvato (PEP) como dador de fosfato: PEP + acar (exterior) piruvato + acar-P (interior) Este mecanismo complexo e, em E. coli e Salmonella typhimurium, consiste em duas enzimas e numa proteina de peso molecular menor estvel ao calor (HPr): 1. HPr e enzima I (EI) so citoplasmticas; 2. Enzima II (EII) mais varivel em estrutura e composta por trs subuinidade ou dominios: EIIA (normalmente designado EIII) citoplasmtica e solvel; EIIB tambm hidrofilica mas encontra-se frequentemente ligada a EIIC; EIIC uma proteina hidrofbica que se encontra embebida na membrana e que confere especificidade ao sistema de transporte.
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Deste modo, o mecanismo de transporte ocorre do seguinte modo: Um fosfato de anta energia transferido de PEP para EII com a ajuda de EI e HPr; Depois, uma molcula de acar fosforilada enquanto carregada atravs da membrana pela EII.
A EII transporta apenas acares especificos e varia com o PTS, enquanto a EI e a HPr so comuns em todas as PTSs. Este sistema est altamente destribuido em procariotas. expeo de algumas espcies de Bacillus que apresentam ambos os sistemas de gliclise e fosfotransferase, bactrias aerobicas no apresentam PTSs. A maior parte dos carboidratos transportados por PTS em E. coli so: Glucose; Frutose; Manitol; Sacarose; N-acetilglucosamina; Celobiose.
No entanto, para alm do seu papel no transporte, as proteinas PTS so capazes de actuar tambm como quimoreceptores para a quimiotaxia. Uptake de Ferro Quase todos os microorganismos necessitam de ferro para o uso de citocromos e vrias enzimas. No entanto, o uptake de ferro dificultado pela insolubilidade extrema do ferro frrico (Fe3+) e seus derivados, o que leva a exista uma pequena quantidade de ferro livre para transporte. Muitas bactrias e fungos ultrapassaram esta difuldade secretando sideroferos, que so molculas de baixo peso molecular que so capazes de complexar ferro frrico e fornece-lo clula: So normalmente hidroxamatos ou fenolatescatecolatos; Trs grupos siderferos podem complexar com as orbitais do ferros para formar um complexo octaedrico, hexa-coordenado.
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Hidroxamate
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Phenolatescatecholate
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Microorganismos diferentes secretam sideroferos diferentes quando pouco ferro est disponivel no meio. Assim que o complexo ferro-siderofero chega superficie celular, ele liga-se a uma proteina receptora de siderofero. Depois o ferro libertado para entrar na clula directamente ou o complexo inteiro transportado para o interior por um transportador ABC. Depois do ferro entrar na clula, este reduzido forma ferrosa (Fe2+). Como o ferro to crucial para os microorganismos, estes devem usar mais de uma via para o uptake de ferro para assegurar um fornecimento adequado.
CRESCIMENTO MICROBIANO
Curva de Crescimento
O crescimento pode ser definido como um aumento nos constituintes celulares e pode ocorrer de dois modos: 1. Pode resultar de um aumento do numero de clulas quando os microorganismos se reproduzem por processos como fisso binria, sendo que as clulas individuais aumentam de tamanho e dividem-se para originar duas clulas filhas de tamanho semelhante; 2. Pode resultar quando clulas simplesmente aumentam de tamanho, o que ocorre em organismos multinucleados, em que as divises nucleares no podem ser acompanhadas por divisos celulares.
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No normalmente conveniente investigar o crescimento e reproduo de microorganismos individuais devido ao seu pequeno tamanho. Assim, estuda-se o crescimento seguindo alteraes no numero total da populao, analizando a curva de crescimento de uma cultura microbiana: Quando os microorganismos so cultivados num meio liquido, estes so incubados num vaso de cultura fechado com um unico fornecimento de meio; Como no fornecido meio fresco, as concentraes de nutrientes caiem e as concentraes de desperdicios aumentam; O crescimento de microorganismos em reproduo por fisso binria pode ser representado como o logaritmo de clulas viveis em funo do tempo de incubao e a curva resultante apresenta quatro fases distinctas.
Fase Lag Quando microorganismos so introduzidos em meio de cultura fresco, normalmente no ocorre aumento do numero de clulas imediato e, assim, este periodo designado fase lag. No entanto, apesar de no ocorrer diviso celular nem aumento da massa celular, a clula encontr-se a sintetizar novos componentes. Uma fase lag antes do inicio da diviso inicial pode ser necessrio por uma variedade de razes: As clulas podem ser velhas e no apresentar ATP, cofactores essenciais e ribossomas, que devem ser sintetizados antes do crescimento comear; O meio pode ser diferente daquele onde os microorganismos cresciam, sendo necessrias novas enzimas para usar nutrientes diferentes; Os microorganismos podem estar danificados e, assim, necessitam de tempo para recuperar.
Independentemente da causa, as clulas re-equipam-se com nova maquinaria, replicam o seu DNA, comeam a aumentar em massa e finalmente dividem-se, o que faz com que estas seja uma fase de adaptao. A fase lag varia consideravelmente em tamanho com a condio dos microorganismos e com a natureza do meio: Esta fase pode ser relativamente longa se o inculo for de uma cultura velha ou de uma que tinha sido refrigerada e se for feita a inoculao de uma cultura num meio quimicamente diferente; Quando uma cultura jovem, crescendo vigorosamente em fase exponencial, transferida para meio fresco com a mesma composio, a fase lag ser mais curta ou mesmo ausente.
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Fase Exponencial Durante a fase exponencial (ou fase log), os microorganismos crescem e dividem-se taxa mxima devido ao seu potencial gentico, natureza do meio e condies sob as quais crescem: A taxa de crescimento constante durante esta fase, isto , os microorganismos dividem-se e duplicam o seu numero em intervalos regulares; Como cada individuo de divide a momentos ligeiramente diferentes, a curva de crescimento aumenta suavemente em vez de em degraus discretos; A populao mais uniforme em termos de propriedades quimicas e fisicas durante estas fase e, assim, culturas em fase exponencial so normalmente usadas em estudos bioquimicos e fisiolgicos.
Podemos ter dois tipos de crescimento durante esta fase: Crescimento equilibrado todos os consituintes celulares so sintetizados a taxas constantes relativamente a cada um, o que ocorre em situaes de homeostasia; Crescimento desiquilibrado ocorre quando os niveis de nutrientes ou outras condies ambientais mudam. Durante este crescimento as taxas de sintese de componentes celulares variam relativamente a cada uma at que um novo estado de equilibrio seja alcanado, sendo sintetizados em maior taxas aqueles componentes necessarios para ultrapassar o desiquilibrio.
Quando o crescimento microbiano limitado pela baixa concentrao de um nutriente necessrio, o crescimento das clulas aumenta com a quantidade inicial de do nutriente limitante presente. No enatanto, a taxa de crescimento tambm aumenta com a concentrao de nutrientes mas de um modo hiperblico como observado para as enzimas. A forma da curva reflecte a taxa de uptake de nutrientes pelas proteinas de transporte microbianas. A niveis de nutrientes suficientemente elevados os sistemas de transporte esto saturados e a taxa de crescimento no aumenta com o aumento da concentrao de nutrientes.
Fase Estacionria Eventualmente, o crescimento populacional cessa e a curva de crescimento torna-se horizontal. Esta fase estacionria normalmente atingida pela bactrias a um nivel populacional de cerca de 109 clulas por ml, mas outros microorganismos no alcanam tais densidades populacionais: O tamanho final da populao depende da disponibilidade de nutrientes e de outros factores, tal como do tipo de microorganismo a ser cultivado; O numero de microorganismos viveis mantem-se constante o que pode resultar de um balano entre a diviso celular e a morte celular, ou a populao pode simplesmente parar de dividir mantendo-se metabolicamente activa.
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As populaes microbianas entram na fase estacionria por vrias razes: Se um nutriente severamente esgotado, o crescimento da populao abrandar. Organismos aerbicos muitas vezes so limitados pela disponibilidade de O2. O oxignio no muito soluvel e pode ser esgotada to rapidamente que apenas a superficie da cultura ter uma concentrao de O2 adequada para crescer. As clulas por baixo no sero capazes de crescer a no ser que a cultura seja agitada ou arejada de outro modo; O crescimento da populao tambm pode cessar devido acumulao de produtos txicos. Este factor limita o crescimento de muitas culturas anaerbicas. Por exemplo, streptococci so capazes de produzir tanto cido lctico e outros cidos orgnicos durante a fermentao de aucares que o seu meio torna-se acidico e o crescimento inibido; O crescimento da populao tambm cessa devido depleo de acares, no caso de culturas streptococcais; Existe tambm alguma evidncia de que o crescimento pra quando um nivel populacional critico alcanado.
Assim, a entrada na fase estacionria pode resultar de vrios factores a operarem em concerto. As bactrias em cultura fechada podem entrar em fase estacionria em resposta fome (falta de alimento), o que provavelmente ocorre muitas vezes na natureza tal como em ambientes que apresentam baixos niveis de nutrientes. Este caso pode ser uma experincia positiva para as bactrias: Muitas das bactrias no respondem com alteraes morfolgicas bvias como formao do endoesporo, mas apenas dimunem de algum modo de tamanho, normalmente acompanhado de encolhimento do protoplasto e condensao do nucleide; As alteraes mais importantes encontram-se na expresso gnica e na fisiologia.
Bactrias com falta de alimento produzem uma variedade de proteinas stravation, que tornam a clula muito mais resistente ao dano de vrios modos: Aumentam o cross-link do peptidoglicano e a fora da parede celular; As proteinas Dps (DNA-binding protein from straved cells) protegem o DNA; As chaperones previnem a desnaturao das proteinas e renaturam proteinas danificadas.
Como resultado destes e muitos outros mecanismos, as clulas em estado de falta de alimento tornamse mais dificeis de matar e mais resistentes falta de alimento por si s, ao dano por alteraes de temperatura, ao dano oxidativo e osmtico e a quimicos txicos como cloro! Estas alteraes so to efectivas que algumas bactrias so capazes de sobreviver falta de alimento durante anos e podem tornar as bactrias mais virulentas. Fase de Morte Aletraes ambientais prejudiciais como privao de nutrientes e acumulao de compostos txicos levam a um declino do numero de clulas viveis caracteristico da fase de morte: A morte de uma populao microbiana, tal como o seu crescimento exponencial, normalmente logaritmica, isto , uma proporo constante de clulas morre todas as horas.
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Normalmente, a unica forma de decidir se uma clula bacteriana vivel incubando-a num meio fresco: se a clula no crescer nem se reproduzir, assumida como morta. Assim, define-se a morte como a perda irreversivel da habilidade de se reproduzir. Apesar da maior parte de uma populao microbiana morrer de um modo logaritmico, a taxa de morte dever diminuir antes da populao ser drasticamente reduzida. Isto deve-se sobrevivncia extendida de clulas particularmente resistentes, j que nesta fase ocorre a formao do esporo. Matemtica do Crescimento O conhecimento das taxas de crescimento durante a fase exponencial indispensvel, pois os estudos destas taxas contribuem para a base da investigao fisiolgica e ecolgica e para a soulo de vrios problemas aplicados na industria. Durante a fase exponencial cada microorganismo se divide em intervalos constantes, assim, a populao duplicar em numero durante um periodo especifico designado tempo de gerao ou doubling time. Por exemplo, suponha-se que um tubo de cultura incubado com uma clula que se divide a cada 20 minutos: A populao ser 2 clulas aps 20 mminutos, 4 clulas aps 40 minutos, e por diante.
Como cada clula se duplica a cada gerao, o aumento da populao sempre: nmero de geraes
O aumento da populao resultante exponencial ou logaritmico! Estas observaes podem ser expressas como equaes para o tempo de gerao, sendo:
nmero inicial da populao populao no momento nmero de geraes no momento
A taxa de crescimento durante a fase exponencial em cultura fechada pode ser expressa em termos da constante da taxa de crescimento mdio ( ), que consiste no nmero de geraes por unidade de tempo, normalmente expressa como geraes por hora:
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O tempo que necessrio para uma populao duplicar em tamanho, isto , o tempo mdio de gerao ( ), pode agora ser calculado pois:
O tempo medio de gerao ( ) o inverso da constante da taxa mdia de crescimento ( ). Assim: O tempo mdio de gerao ( ) pode ser determinado directamente apartir do grfico semi-logaritmico; A constante de taxa de crescimento pode ser calculada apartir do valor de ( ); O tempo de gerao tambm pode ser calculado directamente das equaes anteriores.
Os tempos de gerao variam bastante com as espcies de microorganismos e com as condies ambientais, podendo variar entre menos de 10 minutos (0,17 h) para algumas bactrias at vrios dias em alguns microorganismos eucariotas. No entanto, necessrio ter em conta que os tempos de gerao na natureza so normalmente muito maiores do que em cultura:
Bactria Escherichia coli Bacillus megaterium Streptococcus lactis Streptococcus lactis Staphylococcus aureus Lactobacillus acidophilus Rhizobium japonicum Mycobacterium tuberculosis Treponema pallidum Meio de cultura Glucose-sais Sacarose-sais Leite Caldo lactosado Caldo Heart infusion Leite Manitol-extracto de levedura sinttico In vivo (coelho) Tempo de gerao 17 25 26 48 27-30 66-87 344-461 (5,5-7,5 h) 792-932 (13-16 h) 1980 (33 h)
Quantificao do Crescimento Microbiano

Existem vrios modos de quantificao do crescimento microbiano para determinar as taxas de gerao e os tempos de gerao: Aumento do nmero de clulas; Aumento da massa total da populao.
No entanto, no existe uma tcnica que seja sempre a melhor, sendo que a abordagem adequada depender da situao experimental. Quantificao do Nmero de Clulas
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O modo mais bvio de determinar nmeros microbianos atravs da contagem directa: Cmaras de contagem de Petroff-Hausser so usadas na contagem de procariotas; Hemacitmetros podem ser usados na contagem de procariotas e eucariotas.
As vantagens deste mtodo so: O uso de uma cmara de contagem fcil; um mtodo barato e relativamente rpido; capaz de dar tambm informaes sobre o tamanho e a morfologia dos microorganismos.
No entanto, existem algumas desvantagens nesta tcnica: A populao microbiana deve ser relativamente grande para uma contagem precisa pois as cmaras levam pouco volume de soluo bacteriana; dificil distinguir entre clulas mortas ou vivas nas cmaras de contagem sem o uso de tcnicas especiais.
Os procariotas so mais facilmente contados nestas cmaras se forem coloridos, ou quando usado um microscpio de contraste de fases ou de florescncia. Estas cmaras apresentam uma profundidade conhecida e uma grelha no fundo, sendo possivel fazer a contagem no microscpio a uma amplificao especifica e cacular o nmero de microorganismos numa amostra: Visto que existem 25 quadrados a cubrir uma rea de 1 mm2, o nmero total de bactrias em 1 mm2 de cmara ; A cmara tem 0,02 mm de profundidade e .
Microorganismos maiores, como protozorios, algas e levaduras no filamentosas, tambm podem ser quantificados directamente atravs de quantificadores electrnicos como o Quantificador Coulter (quantificador de particulas): 1. Uma suspenso microbiana forada atravs de um pequeno orificio;
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2. Uma corrente elctrica flui atravs do orificio e elctrodos de ambos os lados do orifico medem a sua resistncia elctrica; 3. Sempre que uma clula microbiana passa atravs do orificio, a resitncia elctrica aumenta (ou a condutividade cai) e a clula contada. O Quantificador de Coulter fornece resultados precisos com grandes clulas e extensivamente usado em laboratrios hospitalares para quantificar eritrcitos e leuccitos. No entanto, no til na contagem de bactrias devido interferncia de pequenas particulas, formao de filamentos, etc... Como as cmaras de contagem e os quantificadores electrnicos fornecem contagens de todas as clulas, tanto vivas como mortas, existem vrias tcnicas de contagem de bactrias viveis, ou seja, tcnicas especificas para clulas que so capazes de crescer e de se reproduzirem. Normalmente, a contagem feita com maior preciso pelo uso de um quantificador de colnias especifico. Assim, a tcnica de spread-plate ou pour-plate devem ser usadas para encontrar o nmero de microorganismos numa amostra pelo processo de plaqueamento de diluies: 1. Uma amostra diluida de bactrias ou outros microorganismos dispersa sobre uma superficie de agar slida; 2. Cada microorganismo ou grupo de microorganismos desenvolve-se num colnia distincta; 3. O nmero original de microorganismos viveis na amostra pode ser calaculado atravs do numero de colnias formadas e da diluio da amostra (deve-se escolher a palca com cerca de 30-300 colnias).
As tcnicas de plaqueamento apresentam algumas vantagens: So tcnicas simples; So bastante sensiveis; Podem ser usadas para quantificao de bactrias e outros microorganismos viveis em amostras de alimentos, gua e solo.
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No entanto, existem vrios problemas que podem levar a quantificaes imprecisas: Baixas contagens podem ser obtidas que aglomerados de clulas no forem quebrados e os microorganismos bem dispersos; Baixas contagens podem ser obtidas se o meio de agar empregue no suportar o crescimento de todos os microorganismos niveis presentes; O agar quante usado no pour-plate podem danificar ou matar clulas sensisveis, sendo que as tcnicas de espalhamento por vezes podem dar contagens superiores.
Como no possivel ter a certeza absoluta de que cada colnia teve origem numa clula individual, os resultados so normalmente expressos em unidades formadoras de colnias (CFU) em vez de em numero de microorganismos. Por outro lado, tambm se podem determinar nmeros microbianos atravs da contagem de colnias em crescimento em filtros membranares especiais que apresentam poros suficientemente pequenos para aprisionar bactrias. Esta tcnica designada filtrao em membrana e bastante til na anlise de amostras aquticas: 1. Uma amostra filtrada atravs de um filtro membranar especial; 2. O filtro depois colocado num meio de agar, ou numa placa com meio liquido, e incubado at que cada clula forme uma colnia separada; 3. A contagem das colnias fornece o nmero de microorganismos na amostra filtarada e podem ser usados meios especiais para seleccionar microorganismos especificos.
Quantificao da Massa Celular Aumentos na massa total de clulas, tal como do nmero de clulas, acompanham o crescimento populacional.assim, tcnicas de quantificao de alteraes na massa celular podem ser usadas para acompanhar o crescimento de uma colnia. Podemos fazer de trs modos distintos:
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1. Determinao do peso seco clulas em crescimento num meio liquido so recolhidas por centrifugao, lavadas, secas num forno e pesadas. Este o mtodo mais dorecto e especialmente til na quantificao do crescimento de fungos. No entanto, leva bastante tempo e no muito sensivel. Como as bactrias pesam to pouco, seria necessrio centrifugar vrias centenas de mililitros de cultura para recolher uma quantidade suficiente; 2. Quantificao de constituintes celulares se a quantidade de uma substncia de uma clula for constante, a quantidade total de constituintes celulares directamente proporcional massa microbiana totat. Por exemplo, uma amostra de clulas lavadas recolhidas de um volume de meio conhecido podem ser analizadas para o total proteico ou de azoto, sendo que um aumento da populao ser refelctida por niveis proteicos totais aumentados. De modo semelhante, podemos determinar a quantidade de clorofila para medir populaes de algas e a quantidade de ATP para estimar a quantidade de massa microbiana viva; 3. Turbidimetria baseia-se na refraco da luz por bactrias, sendo mais rpida e sensivel. Tcnicas mais rpidas e sensiveis, como a turbidimetria, dependem do facto das clulas microbianas refractarem a luz que as atinge. Como as clulas microbianas numa populao apresentam tamanhos relativamente constantes, a quantidade de luz refractada ser directamente proporcional biomassa de clulas presentes e indirectamente relacionada com o numero de clulas: Quando a concentrao de bactrias atinge cerca de 10 milhes de clulas por mL, o meio aparece turvo; Aumentos na concentrao resultam numa maior turvao e menos luz transmitida atarvs do meio; A extenso de refreco de luz pode ser quantificada por um espectrofotmetro e relaciona-se quase linearmente com a concentrao bacteriana a baixos niveis de absorvncia; Assim, o crescimento populacional pode ser facilmente medido espectrofotometricamente enquanto a populao grande o suficientemente para fornece uma turvao detectvel.
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Quorum Sensing e Crescimento Bacteriano

As populaes bacterianas no constiruem coleces de individuos a crescer e a comportarem-se independentemente. As bactrias so capazes de comunicar entre si e comportam-se cooperativamente. A principal forma disto ser alcanado atravs de um processo conhecido como: Quorum sensing (ou auto-induo) fenmeno no qual as bactrias monitorizam a sua prpria densidade populacional atravs da percepo dos niveis de molculas sinalizadoras, por vezes designadas auto-indutores porque so capazes de estimular a clula que as produz. Este processo observado em gram-negativo e em gram-positivo.
A concentrao destas molculas sinalizadoras aumenta ao longo que a populao bacteriana cresce qt que alcana um limite especifico e sinaliza bactria que a densidade populacional alcanou um nivel critico ou quorum. Este mecanismo tem um ptimo sentido prtico: Se compostos produzidos pelas bactrias fossem libertados apenas por algumas bactrias, eles iriam difundir-se e no seriam eficientes devido diluio; Com o controlo do quorum sensing, a bactria alcana uma densidade populacional elevada antes de libertar esses compostos e, como consequncia, os niveis de compostos so suficientemente concentrados para exercerem efeitos significativos.
Isto constitui uma vantagem no corpo do hospedeiro tal como em habitats solidos ou aquticos. Se um patognio conseguir alcanar niveis elevados num local particular antes de produzir factores de virulncia e escapar para tecidos vizinhos, ele tem maior possibilidade de contra-atacar as defesas do hospedeiro e espalhar-se mais facilmente. O quorum sensing foi primeiro descoberto em bactrias gram-negativas e melhor conhecido nestes microorganismos: Os sinais mais comuns so acil-lactonas homoserina (HSLs), que so pequenas molculas compostas por cadeias acil de 4 a 14 tomos de carbono ligadas por uma ligao amida a uma lactona homoserina. A cadeia acil dever ter um grupo ceto ou um grupo hidroxilo no seu terceiro carbono; Quando as acil HSLs alcanam um nivel suficientemente elevado, ligam a locais alvo no DNA e estimulam a transcrio de gene quorum-sensiveis; O gene necessrio para sintetizar acil HSL tambm produzido, amplificando o efeito pela produo e secreo de mais molculas auto-indutoras.
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Muitos processos sensiveis a sinais acil HSL e ao quorum sensing foram j identificados em bactrias gram-negativas: 1. 2. 3. 4. Produo de bio-luminescncia por Vibrio fischeri; Sintese e libertao de factores de virulncia em Pseudomonas aeruginosa; Conjugao de material gentico por Agrobacterium tumefaciens; Produo de antibiticos por Erwinia carotovora e Pseudomonas aureofaciens.
As bactrias gram-positivas tambm regulam actividades por quorum sensing, muitas vezes usando sinais oligopptidos: Reproduo em Enterococcus faecalis; Induo de competncia em Streptococcus pneumoniae; Estimulao da esporulao em Bacillus subtilis; Produo de muitas toxinas e outros factores de virulncia por Staphylococcus aureus; Desenvolvimento de micelas areas e produo de estreptomicina em Streptomyces griseus. Neste caso, o sinal ser -butirolactona em vez de oligopptidos.
O quorum sensing est tembm envolvido na formao de biofilmes pelo patognio Pseudomonas aeruginosa, tornando a bactria ainda mais patognio devido maior acumulao de acil HSLs e maior dificuldade de remoo. O quorum sensing um exemplo de comportamento multicelular onde as clulas so capazes de comunicar e coordenar a sua actividade para actuar como uma unidade.
Crescimento de Microorganismos em Cultura Continua

Em contraste com o crescimento de microorganismos em meio fechado, possivel crescer microorganismos em: Sistema aberto - um sistema com condies ambientais constantes mantidas atravs do fornecimento continuado de nutrientes e pela remoo contnua de desperdicios.
Estas condies so igualadas no laboratrio por um sistema de cultura contnua, sendo que uma populao microbiana pode ser mantida em fase de crescimento exponencial e a uma concentrao de biomassa constante por periodos extendidos: Quimiostato; Turbidostato.
O quimiostato construido de modo que meio estril introduzido num vaso de cultura mesma velocidade que meio contendo microorgansimos removido: O meio de cultura possui um nutriente essencial (e.g., um aminocido) em quantidades limitantes; Devido presena de um nutriente limitante, a taxa de crescimento determinada pela taxa pela qual o novo meio adicionado na cmara de crescimento e a densidade celular final depende da concentrao do nutriente limitante.
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A taxa de troca de nutrientes expressa como taxa de diluio ( ) e consiste na taxa pela qual o meio flui atarvs do vaso de cultura relativamente ao volume do vaso, onde a taxa de fluxo (mL/hr) e o volume do vaso (mL):
Tanto o nivel de populao microbiana como o tempo de gerao esto relacionados com a taxa de diluio: A densidade de populao microbiana mantem-se inalterada numa grande gama de taxas de diluio; O tempo de grao decai (i.e., a taxa de crescimento aumenta) quando a taxa de diluio aumenta pois o facto do nutriente limitante estar sempre a ser adicionado faz com que o seu efeito no seja sentido; Se a taxa de diluio for muito elevada, os microorganismos podem ser eliminados do vaso de cultura antes de se reproduzirem pois a taxa de diluio maior que a taxa mxima de crescimento e a concentrao de nutriente limitante aumenta porque pouco microorganismos esto presentes para o usar; A taxas de diluio muito baixas, um aumento de provoca um aumento na densidade celular e da taxa de crescimento devido ao aumento da concentrao de nutrientes.
Apenas um fornecimento limitado de nutrientes est disponivel a taxas de diluio baixas. Muita da energia disponivel deve ser usada na manuteno da clula e no para o crescimento e reproduo. Quando a taxa de diluio aumenta, a quantidade de nutrientes e da densidade cesular resultante aumenta porque existe energia disponivel para a manuteno e para o crescimento. A importncia dos mtodos de cultura continua baseia-se em vrios aspectos: importante na obteno de clulas em fase exponencial de crescimento, crescendo a uma taxa conhecida; Permite o estudo do crescimento a concentraes baixas de nutrientes, prximas das encontradas na natureza; Permite o estudo de interaces de microorganismos em condies semelhantes s encontradas em ambientes aquticos; bastante prtico na microbiologia industrial.
Influncia de Factores Ambientais no Crescimento

Os microorganismos devem ser capazes de responder a variaes nos niveis de nutrientes e, particularmente, limitao de nutrientes. Para alm disso, o crescimento de microorganismos tambm altamente afectado pela natureza quimica e fisica das suas vizinhanas. O conhecimento das influncias ambientais ajuda no controlo do crescimento microbiano e o estudo da distribuio ecolgica dos microorganismos!
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A habilidade de alguns microorganismos se adaptarem a ambientes extremos e inspitos notvel e os procariotas esto presentes em qualquer local onde possa existir vida. Muitos habitats onde procariotas se encontram mataria outros organismos e procariotas como Bacillus infernus so capazes de viver de 1,6 Km abaixo da superficie terrestre, sem oxignio e a temperaturas acima dos 60C. Assim define-se: Extremfilos microorganismos que crescem em condies extremas.
Conforme a resposta dos microorganismos a vrios factores ambientais, estes podem ser classificados de vrios modos:
Termo descritivo Definio Solutos e actividade da gua Capaz de crescer em vrias gamas de actividade Osmotolerante da gua ou concentrao osmtica Necessita de altos niveis de cloreto de sdio, Halofilo normalmente acima de 0,2 M, para crescer pH Acidfilo Neutrfilo Alcalfilo Temperatura Psicrofilo Psicotrfico Mesfilo Termfilo Hipertermotrfilo Crescimento ptimo entre pH 0 e 5,5 Crescimento ptimo entre pH 5,5 e 8,0 Crescimento ptimo entre pH 8,5 e 11,5 Cresce bem a 0C e apresenta uma temperatura de crescimento ptima de 15C ou mais baixo capaz de crescer a 0-7C. Apresentam um crescimento ptimo entre 20 e 30C e um mximo a 35C Apresenta um crescimento ptimo a 20-45C capaz de crescer a 55C ou mais; ptimo entre 55 e 65C Microorganismos representativos Staphylococcus aureus, Saccharomyces rouxii Halobacterium, Dunaliella, Ectothiorhodospira Sulfolobus, Picrophilus, Ferroplasma, Acontium, Cyanidium caldarium Escherichia, Euglena, Paramecium Bacillus alcalophilus, Natronobacterium Bacillus psyhrophilus, Chlamydomonas nivalis Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens E. coli, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis Bacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus, Cyanidium caldarium, Chaetomium thermophile Sulfolobus, Pyrococcus, Pyrodictium Micrococcus luteus, Pseudomonas, Mycobacterium; a maior parte das algas, fungos e protozorios Escherichia, Enterococcus, Saccharomyces cerevisiae Streptococcus pyogenes Clostridium, Bacteroides, Methanobacterium, Trepomonas agilis Campylobacter, Spirillum volutans, Treponema pallidum Photobacterium profundum, Shewanella banthica, Methanococcus jannaschii
Apresenta um crescimento ptimo entre 80 e 113C Concentrao de oxignio Aerbio obrigatrio Anaerbio facultativo Anaerbio aerotolerante Anaerbio obrigatrio Microaerofilo Presso Barfilo Cresce mais rapidamente a altas presses hidrostticas Completamente dependente de O2 atmosfrico para crescer No requer O2 para crescer, mas cresce melhor na sua presena Cresce igualmente bem na presena ou aisncia de O2 No tolera O2 e morre na sua presena Requer niveis de O2 abaixo de 2-10% para crescer e danificao pelo O2 atmosfrico (20%)
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Solutos e Actividade da gua Como uma membrana plasmtica selectivamente permevel separa os microorganismos do seu ambiente, eles podem ser afectados por alteraes na concentrao osmtica das suas vizinhanas: Se um microorganismo for colocado numa soluo hipotnica (com concentrao osmtica maior), a gua entra na clula e faz com que ela rebente a no ser que algo seja feito para o prevenir; Muitas bactrias, algas e fungos apresentam paredes celulares rigidas que mantm a forma e a integridade da clula e quando estes so colocados numa soluo hipotnica a gua sai e a membrana plasmtica encolhe. Isto desidrata a clula e pode danificar a membrana plasmtica. A clula fica muitas vezes metabolicamente inactiva e deixa de crescer.
Soluo hipotnica
Soluo isotnica
Soluo hipertnica
Nos casos de turgecncia, a concentrao osmtica do citoplasma pode ser reduzida por vrios mecanismos: A presena de corpos de incluso diminui a concentrao osmtica; Os procariotas podem conter canais sensiveis presso que abrem para permitir que os solutos escapem quando a osmolaridade do ambiente se torna menor do que a do citoplasma; Como os protozorios no apresentam uma parede celular, estes usam vacuolos contrcteis para eliminar o excesso de gua quando vivem em ambientes hipotnicos.
Por outro lado, muitos microorganismos mantm a concentrao osmtica do seu protoplasma acima da do seu habitat pelo uso de solutos compativeis, de modo que a membrana plasmtica se encontra sempre pressionada contra a parede celular e a plasmlise combatida. Define-se: Solutos compativeis solutos que so compativeis com o metabolismo e o crescimento quando se encontram a altas concentraes intracelulares.
O uso de solutos compativeis difere entre microorganismos, sendo que diferentes microorganismos usam diferentes tipos de solutos para aumentar a concentrao osmtica intracelular: A maior parte dos procariotas aumenta a sua concentrao osmtica interna num ambiente hipertnico atravs da sintese ou do uptake de colina, betaina, prolina, cido glutmico e outros aminocidos, e atravs do aumento dos niveis de potssio; Algas e fungos usam sacarose e poliis, como arabitol, glicerol e manitol; Alguns procariotas como Halobacterium salinarium aumenta a sua concentrao osmtica com ies de potssio. As suas enzimas foram alteradas de modo a que estes procariotas necessitam de altas concentraes de sal para uma actividade normal.
Os poliis e os aminocidos so ideias para a funo dos solutos compativeis porque no alteram a estrutura e a funo das enzimas!
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A quantidade de gua disponivel para os microorganismos pode ser reduzida por dois mtodos: Efeito osmtico interaco com molculas soluveis; Efeito matricial absoro por superficies slidas.
Como a concentrao osmtica de um habitat tem efeitos profundos nos microorganismos, util ser possivel expressar quantitativamente o grau de disponibilidade da gua, o que feito pela actividade da gua (aw): A actividade da gua de uma soluo 1/100 da humidade relativa da soluo, ou seja, expressa em percentagem; inversamente proporcinal presso osmtica, pelo que se a presso osmtica elevada, a actividade da gua elevada; equivalente razo da presso de vapor da soluo ( ) sobre a da gua pura ( ):
Os microorganismos diferem bastante na sua habilidade de se adaptarem aos habitats com baixa actividade da gua, sendo que um microorganismo deve fazer um esforo extra para crescer num habitat com um baixo valor de aw porque tem de ser capaz de manter uma concentrao de solutos interna para reter gua. A maior parte dos microorganismos apenas cresce bem a valores de aw de 0,98 (aproximado do valor da gua do mar) ou mais alto. O que explica porque que os alimentos secos ou a adio de grandes quantidades de sal e acar to eficiente na preveno de deteriorao dos alimentos. No entanto, podemos ter duas classes de microorganismos que conseguem sobreviver a valores baixos de aw importantes: 1. Microorganismos osmotolerantes so capazes de manter uma concentrao de solutos elevada de modo a reter gua e crescem em vrias gamas de aw ou concentrao osmtica. Por exemplo, S. Aureus pode crescer em meios que contm uma concentrao de NaCl ate 3 M, entando bem adaptada a viver na pele, a levedrua Saccharomyces rouxii cresce em solues de acar com valores de aw to baixos como 0,6, a alga Dunaliella viridis tolera concentraes de NaCl desde 1,7 M a uma soluo saturada, e alguns fungos so osmotolerantes estando envolvidos na deteriorao de alimentos secos ou salgados; 2. Halfilos adaptaram-se to completamente a condies hipertnicas, salinas, que necessitam de altos niveis de NaCl para crescer, concentraes entre 2,8 M e a saturao (cerca de 6,2 M) para bactrias halofilicas extremas. Halobacterium e outras bactrias extremamente halofilicas modificaram significativamente a estrutura das suas proteinas e membranas em vez de aumentarem simplesmente as concentraes intracelulares de solutos como os microorganismos osmotolerantes. Estes extremfilos acumulam grandes quantidades de potssio de modo a continuarem hipertnicos e as enzimas, ribossomas e proteinas transportadoras destas bactrias necessitam de altos niveis de potssio para serem estveis e funcionais. Em adio, a membrana plasmtica e a parede celular destas bactrias so estabilizadas por elevadas concentraes de io sdio. Os halfilos so capazes de produzir grandes quantidade de solutos orgnicos internos ou concentrar um soluto do seu ambiente. A acheae Halobacterium concentra no seu citoplasma grandes quantidades
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de potssio (K , como KCl) apartir do seu ambiente pelo uso de bombas de ies nicas que transportam ies do ambiente externo para o interior da clula. Estas bombas de ies usam retinal para a abertura do canal e, como este composto usa luz, estas bactrias apresentam uma cor vermelha caracteristica.
Bactrias haloflicas
Bactrias halofilicas extremas adaptaram-se com tanto sucesso a condies ambientais que destruiriam a maior parte dos microorganismos que se tornaram to especializadas ao ponto de perderem flexibilidade ecolgica, apenas sendo capazes de sobreviver em alguns habitats extremos. pH O pH a medida da actividade do io hidrognio numa soluo e definido como o logaritmo negativo da concentrao de io hidrognio (expressa em termos de molaridade): [ ]
A escala de pH extende-se desde pH 0,0 (1,0 M H+) a pH 14,0 (1,0x10-14 M H+), e cada unidade de pH representa uma alterao 10 vezes maior da concentrao de H+.
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Os habitats nos quais os microorganismos crescem variam amplamente e no supreendente que o pH afecte dramaticamente o crescimento microbiano, sendo que cada espcie apresenta uma gama de pH de crescimento definido e um pH ptimo para o crescimento, podendo ser distinguidas trs classes de microorganismos: Acidfilos o seu crescimento ptimo ocorre entre pH 0 e 5,5; Neutrfilos o seu crescimento ptimo ocorre entre pH 5,5 e 8,0; Alcalfilos o seu crescimento ptimo ocorre entre pH 8,5 e 11,5. Alcalfilos extremos crescem a pH 10 ou superior.
Em geral, diferentes grupos microbianos apresentam preferncias de pH caracteristicas: A maior parte das bactrias e dos protozorios so neutrfilos; A maior parte dos fungos preferem ambientes ligeiramente cidos, como pH 4-6; As algas parecem preferir ambientes cidos.
No entanto, existem algumas excepes a estas generalidades pois a alga Cyanidium caldarium e a archaea Sulfolobus acidocaldarius so habitantes comuns de locais quentes acidicos, crescendo a pH 1-3 a altas temperaturas.
Alcalfilos
Neutrfilos
Acidfilos
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Apesar dos microorganismos crescerem muitas vezes em amplas gamas de pH e longe do seu pH ptimo, existem limites tolerncia de variaes de pH: Variaes drsticas no pH citoplasmtico podem danificar os microorganismos rompendo a membrana plasmtica ou inibindo a actividade de enzimas e proteinas de transporte membranar; Alteraes no pH externo alteram a inonizao de molculas nutrientes e, assim, reduzem a disponibilidade destas molculas para o organismo.
Os microorganismos necessitam de um pH citoplasmtico prximo da neutralidade para sobreviverem, pelo que usam vrios mecanismos para sobreviverem a alteraes de pH e manterem a neutralidade de pH citoplasmtica: 1. A membrana plasmtica relativemente impermevel a protes e os neutrfilos parecem trocar potssio por protes usando um sistema de antiporte e os alclfilos extremos mantm o seu pH prximo da neutralidade trocando ies de sdio internos por protes externos; 2. Tampes internos so capazes de contribuir para a homeostasia de pH; 3. Nas bactrias, sistemas de antiporte de potssio/protes e sdio/protes corrigem pequenas variaes de pH; 4. Se o pH externo descer a 5,5-6, Salmonella typhimurium e E. coli sintetizam uma gama de novas proteinas como parte da sua resposta de tolerncia acidica. Uma ATPase translocadora de protes contribui para esta resposta, tanto produzindo mais ATP como bombeando protes para o exterior da clula; 5. Se o pH externo descer a 4,5 ou menor, chaperones como acid shock proteins e heat shock proteins so sintetizadas. Estas proteinas previnem a desnaturao cida de proteinas e ajudam na renaturao de proteinas desnaturadas; 6. Os microorganismos normalmente alteram o pH do seu prprio habitat produzindo produtos metablicos bsicos ou acidicos. Microorganismos fermentativos formam cidos orgnicos apartir de carboidratos, enquanto quimiolitotrficos como Thiobacillus oxidam componentes de enxofre reduzidos a cido sulfurico. Outros microorganismos tornam o seu ambiente mais alcalino gerando amnia atravs da degradao de aminocidos. Temperatura A temperatura ambiental afecta profundamente os microorganismos, tal como outros organismos. De facto, os microorganismos so particularmente susceptiveis porque so muitas vezes unicelulares e a sua temperatura varia com a do ambiente externo. Por estas razes, a temperatura da clula microbiana reflecte directamente a das vizinhanas das clulas. O factor mais importante da influncia da temperatura no crescimento a sensibilidade de reaces catalizadas por enzimas: A temperaturas baixas, um aumento de temperatura aumenta a taxa de crescimento porque a velocidade de uma reaco enzimtica duplicar a cada aumento de 10C na temperatura;
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Como a taxa de cada reaco aumenta, o metabolismo como um todo mais activo a meiores temperaturas e os microorganismos crescem mais depressa; Depois de um determinado ponto, aumentos continuados diminuem o crescimento e temperaturas suficientemente elevadas so letais.
Assim, em pontos extremos, diferentes niveis de temperatura tm efeitos diferentes nos microorganismos: Temperaturas muito elevadas danificam microorganismos desnaturando enzimas, proteinas transportadoras e outras proteinas. Membranas microbianas tambm so rompidas sendo que bicamada lipidica simplesmente derrete e desintrega-se. Assim, apesar de enzimas funcionais operarem mais rapidamente a temperaturas mais elevadas, os microorganismos podem ser danificados a tal extenso que o seu crescimento inibido porque os danos no so capazes de ser reparados; Temperaturas muito baixas solidifcam as membranas e as enzimas no so capazes de operar rapidamente.
Quando os organismos se encontram a temperaturas acima da temperatura ptima, a funo e estrutura celular so afectadas, e quando as temperaturas so muito baixas, a funo afectada mas no necessariamente a composio quimica e a estrutura da clula. Desvido a estas influncias opostas da temperatura, o crescimento microbiano apresentam uma dependncia da temperatura caracteristica com temperaturas cardinais distintas: Minima; ptima; Mxima.
Apesar da forma da curva de dependncia da temperatura poder variar, a temperatura ptima sempre mais prxima do mximo do que do minimo. Estas temperaturas no so rigidas para um organismos, dependendo muitas vezes de outros factores ambientais como o pH e os nutrientes disponiveis. As temperaturas cardinais variam altamente entre microorganismos. A temperatura ptima normalmente vai de 0C at 75C, mas o crescimento microbiano pode ocorrer entre de -20C e mais de 100C. O principal factor que determina esta gama de crescimento parece ser a gua, pois, mesmo a temperaturas extremas, os microorganismos precisam de gua liquida para crescer. A temperatura de crescimento varia para um microorganismo particular em cerca de 30C. No entanto, algumas espcies (e.g., Neisseria gonorrhoeae) apresentam um pequeno intervalo, enquanto outras (e.g., Enterococcus faecalis) crescem numa grande gama de temperaturas. Para alm disso, os grupos microbianos diferem entre si pela sua temperatura mxima de crescimento: Protozorios crescem numa taxa mxima a cerca de 50C; Os procariotas so capazes de crescer prximos de 100C, mas j foram identificadas estirpes que crescem a temperturas superiores;
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Algumas algas e fungos so capazes de crescer a temperaturas entre 55-60C.
Os procariotas so capazes de crescer a temperaturas bastante superiores aquelas a que os eucariotas crescem. Isto pode ser possivel pois os eucariotas no so capazes de manufacturar membranas para os organelos que sejam estveis e funcionais a temperaturas acima dos 60C. Para alm desta observao, parece que o aparelho fotossinttico ser relativamente instvel, pois no so encontrados organismos fotossintticos a temperturas elevadas. Dependendo da sua gama de temperturas de crescimento, os microorganismos podem ser divididos em cinco classes de microorganismos:
1. Psicrfilos crescem bem a 0C e apresentam uma temperatura ptima de 15C ou inferior e uma temperatura mxima a 20C. So isolados de habitats rticos ou antrticos e incluem, entre outros, a alga Chlamydomonas nivalis, as bactrias dos gneros Pseudomonas, Vibrio, Alcaligenes, Bacillus, Arthrobacter, Moritella, Photobacterium e Shewanella, e a archaea Methanogenium. Estes microorganismos adaptaram-se ao seu ambiente de vrios modos: As suas enzimas, sistemas de transporte e mecanismos de sintese proteica funcionam correctamente a temperaturas baixas; As suas membranas celulares apresentam niveis elevados de cidos gordos insaturados e mantm-se semi-slidas quando arrefecidas. No entanto, devido a este facto, quando a temperatura sobe acima de 20C, as membranas derretem. 2. Psicotrofos ou psicrfilos facultativos so capazes de crescer a 0-7C apesar de apresentarem crescimento ptimo entre 20 e 30C, e mximo a cerca de 35C. Bactrias e fungos deste tipo so factores importantes na degradao de alimentos refrigerados; 3. Mesfilos microorganismos com crescimento ptimo a cerca de 20-45C, apresentando normalmente temperatura minima de 15-20C. Incluem a maior parte dos microorganismos sendo que a maior parte dos patognios humanos se insere nesta categoria; 4. Termfilos so capazes de crescer a 55C ou superior. O seu crescimento minimo ocorre normalmente a 45C e so capazes de crescer optimamente entre 55-65C. A maior parte so
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procariotas, apesar de algumas algas e alguns fungos tambm j terem sido identificados. Estes microorganismos crescem em muitos habitats, incluindo pilhas de auto-aquecimento e linhas e nascentes de gua quente. Os termfilos diferem dos mesfilos apresentando: Enzimas mais estveis ao calor e sistemas de sintese proteica capazes de funcionar a temperaturas elevadas; Membranar lipidicas mais saturadas e com pontos de fuso mais elevados, mantendo-se intactas a temperaturas mais elevadas. 5. Hipertermfilos so termfilos capazes de crescer a 90C ou superior, podendo ter um mximo de 100C. Normalmente, no crescem bem a 55C e Pyrococcus abyssi e Pyrodictium occultum so exemplos de hipertermfilos marinhos encontrados em reas quentes fundo ocenico.
Bactrias termfilas muitas vezes apresentam pigmentos, colorindo os locais onde vivem.
Concentrao de Oxignio Dependendo da sua capacidade crescer na presena ou na ausncia de O 2 atmosfrico, os organismos podem ser classificados em duas categorias distintas: Organismos aerbios so capazes de crescer na presena de O2 atmosfrico; Organismos anaerbios so capazes de crescer na ausncia de O2 atmosfrico.
No entanto, a dependncia de oxignio pelos microorganismos no restrita a estas duas categorias, podendo existir necessidades intermdias. Assim, podemos distinguir cinco classes de microorganismos diferentes: 1. Aerbios obrigatrios inclui quase todos os organismos multicelulares, sendo este completamente dependentes de O2 atmosfrico para crescerem. O oxignio funciona como um aceitador final de electres na cadeia transportadora de electres aerbia, mas os eucariotas tambm o podem usar na sintese de esteris e cidos gordos insaturados; 2. Anaerbios facultativos no necessitam de O2 para crescer mas crescem melhor na sua presena. Na presena de oxignio, usam respirao aerbica; 3. anaerbios aero-tolerantes como Enterococcus faecalis, ignoram O2 e crescem igualmente bem na presena e na ausncia de O2; 4. anaerbios restritos ou obrigatrios no toleram O2 e morrem na sua presena. Estes organismos no so capazes de gerar energia atravs da respirao e devem usar as vias de
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fermentao ou respirao anaerbica. (e.g., Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium pasteurianum, Methanococcus); 5. Micro-aerofilos so aerbios como Campylobacter, que so danificados por niveis normais de O2 atmosfrico (20%) e necessitam de niveis de O2 entre 2-10% para crescerem. A natureza das respostas bacterianas ao O2 podem ser facilmente determinadas pelo crescimento de bactrias em tubos de cultura cheios de meio de cultura slido ou um meio especial como caldo de tioglicolato, que contem um agente redutor que diminui os niveis de O2:
Um grupo microbiano pode apresentar mais de um tipo de relao com o O 2 e diferentes tipos de microorganismos apresentam diferentes necessidades: Os cinco tipos de microorganismos podem ser encontrados entre procariotas e protozorios: Os fungos so normalmente aerbicos, mas um numero de espcies particularmente entre as leveduras so anaerbias facultativas; As algas so quase sempre aerbias obrigatrias.
A habilidade de crescer em ambientes aerbicos e anaerbicos fornece uma flexibilidade considervel e uma vantagem ecolgica. Apesar dos anaerbios restritos serem mortos pelo O2, estes podem ser encontrados em habitats que parecem ser aerbicos. Em tais casos, estes associam-se com anaerbios facultativos que usam o O2 disponivel fazendo com que o crescimento dos anaerbios restritos seja possivel. Estas diferentes relaes com o O2 parecem dever-se a vrios factores,incluindo: Inactivao de proteinas. As enzimas podem ser inactivadas quando grupos sensiveis so oxidados; Efeito txico de derivados de O2.
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O oxignio aceita electres e rapidamente reduzido porque os seus dois electres de valncia encontram-se desenparelhados. As flavoporteinas, outros constituintes celulares, e a radiao so capazes de promover a reduo do oxignio. Esta reduo normalmente resulta numa combinao de produtos de reduo: Radical superxido: Perxido de hidrognio: Radical hidroxilo: (ocorre acoplada reaco de oxidao de Fe2+ a Fe3+).
Estes produtos da reduo do oxignio so extremamente txicos porque so agentes redutores poderosos e destroem rapidamente componentes celulares. Assim, um microorganismos deve ser capaz de se proteger contra tais produtos de oxignio ou ento morrer. Os neutrfilos e os macrfagos usam estes produtos de oxignio para destruir patognios invasores. Muitos microorganismos possuem enzimas que constituem uma proteco contra estes produtos txicos: Superxido dismutase (SOD) catalisa a destruio de superxido: Catalase catalisa a destruio de perxido de hidrognio: Glutationa peroxidase catalisa a destruio de perxido de hidrognio: .
Estas enzimas esto presentes, ou no, em diferentes tipos de microorganismos, o que acaba por explicar o facto destes microorganismos serem capazes, ou no, de sobreviver em meios com O 2 ou na presena de quantidades especificas de O2: Anaerbios obrigatrios e anaerbios facultativos contm superxido dismutase e catalase, sendo capazes de combater os danos oxidativos das espcies reactivas de oxignio; Anaerbios aerotolerantes parecem no apresentar catalase mas na maior parte das vezes apresentam superxido dismutase. No entanto, o Lactobacillus plantarum aerotolerante usa ies mangansio em vez de superxido dismutase para destruir o radical superxido;
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Todos os anaerbios restritos no apresentam as duas enzimas ou apresentam-nas a concentraes muito baixas. Assim, no so capazes de tolerar O2; Microaerfilos apresentam superxido dismutase e catalase a baixas concentraes, sendo capazes de tolerar O2, mas s at um determinado ponto.
Comos os aerbios necessitam de O2 e os anaerbios so mortos por estas molcula, tm de ser usadas abordagens completamente diferentes quando crescemos este dois tipos de microorganismos. Presso As bactrias so capazes de viver em gamas de presso distintas, sendo encontrados dois extremos: A maior parte dos organismos vive em terra ou na superficie da gua, muitas vezes sujeitos a uma presso de 1 atmosfera (atm), e nunca so afectados por uma presso significante; No entanto, o oceano profundo (oceano com 1000 m ou mais de profundidade) constitui 75% do volume total do oceano e a presso hidrosttica capaz de alcanar 600 a 1100 atm, enquanto a temperatura de 2-3C.
Apesar destes extremos, as bactrias so capazes de sobreviver e de se adaptarem e podemos distinguir dois tipos de bactrias: Barotolerantes incluem a maior parte das bactrias. Um aumento de presso afecta de forma adversa o seu crescimento mas no tanto como s no-tolerantes; Barfilicas crescem mais rapidamente a presses altas. Algumas bactrias do intestino de invertebrados do oceano profundo so barfilicas e tm um papel importante na reciclagem de nutrientes no fundo do oceano.
At agora, j foram encontrados barfilos em vrios gnero bacterianos (e.g., Photobacterium, Shewanella, Colwellia) e alguns membros da Archaea so termobarfilos (e.g., Pyrococcus spp, Methanococcus jannaschii). Radiao O planeta bombardeado com radiao electromagntica de vrios tipos, sendo que quanto maior o comprimento de onda menor a energia associada a esse tipo de radiao. A luz solar a principal fonte de radiao na Terra e inclui: Luz visivel importante no ambiente pois toda a vida depende da habilidade dos organismos fotossintticos armazenarem energia luminosa do Sol; Radiao ultravioleta (UV) ao nivel do mar, encontrada pouca radiao UV abaixo de 290300 nm, pois essa radiao absorvida pela camada do ozono. Esta eliminao importante pois este tipo de radiao capaz de ionizar O2, danificando os organismos;
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Radiao infravermelha (IV) quase 60% da radiao solar encontra-se na regio infravermelha, sendo esta radiao a principal fonte de calor na Terra. Ondas rdio.
Muitas forma de radiao electromagntica so bastante perigosas para os microorganismos, sendo isto bastante observado para a radiao ionizante, radiao de comprimento de onda muito pequeno ou de muito alta energia, que capaz de provocar a ionizao atmica: 1. Raios-X; 2. Raios gamma, que so emitidos durante o decaimento radio-isotipico. Baixos niveis de radiao ionizante produziro mutaes e podem resultar indirectamente na morte, enquanto altos niveis so directamente letais. Apesar dos microorganismos serem mais resistentes radiao ionizante do que os organismos superiores, eles sero destruidos por uma quantidade suficientemente grande de radiao, podendo estas radiaes ser usadas para esterilizar items. Uma variedade de alteraes celulares podem ser devidas radiao ionizante: Quebra de ligaes de hidrognio; Oxidao de ligaes duplas; Destruio de estruturas em anel; Polimerizao de algumas molculas.
O oxignio aumenta estes efeitos destrutivos, provavelmente atravs da gerao de radicais hidroxilos (OH). Apesar de muitos tipos de constituintes podem ser afectados, a destruio do DNA ser a causa de morte mais importante. Em adio, a radiao ultravioleta (UV) destroi todos os tipos de microorganismos devido ao seu curto comprimento de onda (aproximadamente entre 10-400 nm) e sua elevada energia. A radiao UV mais letal apresenta uma comprimento de onda de 260 nm, o comprimento de onda mais facilmente absorvido pelo DNA: O principal efeito da radiao UV a formao de dimeros de tiamina no DNA, sendo que duas tiaminas adjacentes numa cadeias de DNA so covalentement ligadas; Isto inibe a replicao de DNA e a sua funo.
Apesar de muito pouca radiao UV abaixo de 290-300 nm alcanar a superficie da Terra, radiao de 325-400nm capaz de danificar os microorganismos, podendo induzir a quebra de triptofano a fotoprodutos txicos, que produzem qubras no DNA em conjunto com a prpria radiao.
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A luz visivel bastante benfica porque a fonte de energia para a fotossintese. Mesmo assim, quando presente com intensidade suficiente, a luz visivel capaz de danificar ou matar clulas microbianas. No entanto, normalmente so necessrios pigmentos fotossensiveis e O2: Todos os microorganismos possuem pigmentos como clorofila, bacterioclorofila, citocromos e flavinas, que absorvem energia, ficam excitados e actuam como pigmentos fotossensiveis; Estes pigmentos excitados (P) transferem energia para O2 gerando oxignio singleto (1O2).
O oxignio singleto muito reactivo, um agente oxidante forte que capaz de destruir a clula rapidamente, sendo provavelmente o principal agente usado pelos fagcitos para destruir bactrias fagocitadas. Muitos organismos que vivem em superficies expostas usam pigmentos carotenoides para proteco contra a foto-oxidao, pois estes pigmentos absorvem energia do oxignio singleto convertendo-o ao estado no excitado. Tanto microorganismos fotossintticos como no fotossintticos usam pigmentos deste modo.
Controlo do Crescimento de Microorganismos

de grande importncia proceder a mecanismos de controlo do crescimento de microorganismos para impedir contaminaes, degradao de alimentos, doenas, etc. Podemos faser isto de dois mtodos: 1. Conservao permite prevenir o crescimento de microorganismos, principalmente em alimentos, e faz-se atravs de: Frio: atravs da refrigerao ou congelao, impedindo o crescimento da maior parte dos microorganismos patognios, pois estes no so capazes de crescer a temperaturas to baixas (mesfilos); Desidratao: diminuir a actividade da gua por remoo desta permite impedir o crescimento de microorganismos pois estes necessitam de gua liquida para crescerem; Agentes osmticos: a adio de acares ou sal aumenta a concentrao osmtica do exterior das clulas microbianas, impedindo a difuso de gua para o interior da clula e, assim, o crescimento de microorganismos; Conservantes quimicos: adio de compostos qumicos que impedem o crescimento de microorganismos. 2. Esterilizao destroi os microorganismos, impedindo contaminaes. bastante usado em laboratrio, na industria alimentar e na sade. Pode ser feita atravs de: Radiao: o uso dos efeitos nefastos dos raios gama, raios-X e radiaes ultravioleta permite eliminar microorganismos de superficies slidas; Filtrao: permite a eliminao de microorganismos de solues. No garante que seja muito eficiente pois a soluo no pode ser toda filtrada; Agentes qumicos: o uso de agentes microbicidas, como xidos de etilena e aldeidos, permite a destruio de microorganismos; Calor: pode ser usado calor seco ou humido, mas este ultimo mais eficaz, para matar vrios tipos de microorganismos, dependendo da sua temperatura ptima. A esterilizao pelo calor pode ser feita a vrias temperaturas e diferentes mtodos apresentam sensibilidades diferentes:
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Temperatura <100C e pasteurizao podemos ter High temperature short-term (HTST) a 72C durante 15 segundos ou ultrahigh-temperature (UHT) a 140-150C durante 1-3 segundos. Estes mtodos no so bem esterilizao pois os esporos podem no ser eliminados apesar de existir destruio de microorganismos; Temperaturas 100C a estas temperaturas ocorre a ebulio da gua, podendo ser usado vapor de gua para eliminar microorganismos. Como existem microorganismos capazes de sobreviver a estas temperaturas, a esterilizao pode no ser total; Temperaturas >100C esta a temperatura encontrada numa autoclavagem e praticamente garante a eliminao de microorganismos e esporos. Este mecanismo gera temperaturas elevadas combinando vapor de gua com presso.
No entanto, material de plstico no esterilizado atravs do calor, mas sim por vapores de agentes quimicos e radiaes , para impedir que esse material derreta.
METABOLISMO MICROBIANO
Energia e Trabalho
A energia mais simplesmente definida como a capacidade de exercer tabalho ou causar alteraes particulares. Assim, todos os processos fisicos e quimicos so o resultado da aplicao ou do movimento de energia. As clulas exercem trs tipos principais de trabalho, e todos so essenciais aos processos vitais: Trabalho quimico envolve a sintese de molculas biolgicas complexas requeridas pelas clulas apartir de precursores mais simples. A energia necessria para aumentar a complexidade molecular da clula; Trabalho de transporte molculas e ies muitas vezes devem ser transportados atravs das membranas celulares contra um gradiente electroquimico e, de modo semelhante, um soluto deve ser exportado da clula contra um gradiente de concentrao. Este processo necessita de energia; Trabalho mecnico a energia necessria para alterar a localizao fisica dos organismos, clulas e das estruturas dentro das clulas.
A derradeira fonte de energia biolgica a luz solar visivel que incide na superficie da Terra. A energia luminosa recolhida por organismos fototrficos durante a fotossintese, na qual absorvida pela clorofila e outros pigmentos e convertida a energia quimica. Os quimolitotrficos derivam energia da oxidao de compostos inorgnicos em vez de a obterem da absoro de luz. A energia obtida por estes dois mtodos pode ser usada por fotolitoautotrficos e quimolitoautotrficos para transformar CO2 em molculas biolgicas como glucose. As molculas complexas manufacturadas por organismos autotrficos (tanto plantas como microorganismos) funcionam como fontes de carbono para quimioheterotrficos e outros consumidores que usam molculas orgnicas complexas para construir as suas estruturas celulares. Os quimiheterotrficos usam muitas vezes O2 como um aceitador de electres quando oxidam glucose e outras molculas orgnicas a CO2 na respirao aerbica com grande libertao de energia.
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Assim, no ecossistema, a energia recolhida por fotoautotrficos e quimiolitoautrficos sendo que alguma desta energia flui para quimioheterotrficos quando estes usam os seus nutrientes derivados de autotrficos. Assim, o fluxo de carbono e de energia no ecossistema esto intimamente relacionados.
As clulas devem transferir energia de modo eficiente dos seus aparelhos produtores de energia para os sistemas que exercem trabalho. Isto , as clulas devem apresentar uma forma prtica de ocorrncia de energia, o que feito na forma de adenosina trifosfato (ATP): Quando ATP quebrado a adenosina difosfato (ADP) e ortofosfato (Pi), energia fica disponivel para trabalho util; Mais tarde, a energia da fotossintese, respirao aerobica, respirao anaerbica e fermentao usada para re-sintetizar ATP apartir de ADP e Pi.
Viso Geral do Metabolismo

O metabolismo pode ser dividido em duas partes principais: Catabolismo molculas maiores e complexas so quebradas em molculas mais pequenas e simples com a libertao de energia. Alguma desta energia armazenada e tornada disponivel na forma de calor, o resto libertado como calor; Anabolismo usa a energia armazenada no catabolismo na sintese de molculas complexas a partir de outras mais simples. Usa energia de modo a aumentar a ordem do sistema.
Apesar da diviso do metabolismo em duas partes principais ser conveniente e muitas vezes empregue, nem todos os processos fornecedores de energia so englobados por esta definio de catabolismo a no ser que seja extendida de modo a incluir processos que no envolvem a degreadao de molculas orgnicas complexas. Num sentido mais amplo, os microorganismos normalmente usam uma de trs fontes de energia:
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Fotolitotrficos capturam energia do sol; Quimiorganotrficos oxidam molculas orgnicas para libertar energia; Quimiolitotrficos usam nutrientes inorgnicos como fontes de energia.
Os microorganismos variam no s nas suas fontes de energia, mas tambm nos aceitadores de electres usados por quimiotrficos. Podemos destinguir vrios tipos de aceitadores em diferentes processos: 1. Fermentao o substrato energtico oxidado e degradado sem a participao de um aceitador de electres externo ou derivado exogenamente. Normalmente, a via catablica produz um intermedirio como piruvato que actua como um aceitador de electres. A fermentao normalmente ocorre sob condies anaerbias, mas tambm pode ocorrer por vezes quando o oxignio est presente; 2. Respirao faz uso de aceitadores de electres exgenos ou derivados externamente e pode ser dividida em dois tipos: Respirao aerobica: o aceitador de electres final o oxignio; Respirao anaerobica: o aceitador de electres na maior parte das vezes inorgnico (e.g., NO3-, SO42-, CO2, Fe3+, SeO42-, e outros) mas aceitadores orgnicos como fumarato podem ser usados.
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A maior parte da respirao envolve a actividade de uma cadeia transportadora de electres e a quantidade de energia disponivel diferente na fermentao e na respirao: O aceitador de electres na fermentao encontra-se no mesmo estado de oxidao do nutriente original, no existindo oxidao gerao do nutriente. Assim, apenas uma quantidade limitada de energia se torna disponivel; O aceitador de electres na respirao apresenta um potencial de reduo muito mais positivo do que o substrato e, assim, muito mais energia ser libertada durante a respirao.
Tanto na respirao anaerobica como na respirao aerobica, formado ATP como resultado da actividade da cadeia transportadora de electres. Os electres da cadeia transportadora de electres podem ser obtidos de nutrientes inorgnicos e, assim, possivel derivar energia da oxidao de molculas inorgnicas em vez nutrientes orgnicos. Esta habilidade confinada a um pequeno grupo de procariotas designados quimiolitotrficos. preciso ter em conta que as definies microbianas de fermentao, respirao anaerobica e respirao aerobica so diferentes daquelas empregues em Bioquimica ou Biologia: Fermentao processo fornecedor de energia no qual as molculas orgnicas funcionam tanto como dadores e aceitadores de electres; Respirao processo fornecedor de energia no qual o aceitador uma molcula inorgnica, tanto oxignio (respirao aerbica) ou outro aceitador inorgnico (respirao anaerbica).
Como os microorganismos so muito flexiveis e variados no seu metabolismo energtico, estas definies so melhor usadas. Podemos definir trs etapas do metabolismo aerbico: Etapa 1 Molculas de nutrientes complexas (proteinas, polissacarideos e lipidos) so hidrolizadas ou quebradas nas suas partes constituintes e as reaces quimicas que ocorrem durante esta etapa no libertam muita energia; Etapa 2 Aminocidos, monossacarideos, cidos gordos, glicerol e outros produtos da primeira etapa so degradados a molculas mais simples nesta etapa. Normalmente, metabolitos como acetil coenzima A, piruvato e intermedirios do Ciclo de Krebs so formados. Os processos desta etapa so capazes de operar tanto aerobicamente como anaerobicamente e muitas vezes produzem ATP, NADH e/ou FADH2; Etapa 3 nutrientes carbonados so introduzidos no Ciclo de Krebs e so oxidados completamente a CO2 com a produo de ATP, NADH e FADH2 pela cadeia transportadora de electres. O oxignio, ou por vezes outra molcula inorgnica, o aceitador de electres final.
Apesar deste esquema ser simplificado, util para distinguir o padro geral do catabolismo. Os microorganismos comeam com uma grande variedade de molculas e reduzem o seu numero e diversidade em cada etapa. Isto , as molculas de nutrientes so afuniladas para alguns intermedirios metablicos at serem introduzidas no Ciclo de Krebs. Uma via comum degrada vrias molculas semelhantes sendo que a existncia de algumas vias catablicas comuns, cada degradando muitos nutrientes, aumenta bastante a eficincia metablica diminuindo a necessidade de uma flexibilidade metabolica.
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na fase catablica que os microorganismos exibem a sua diversiade nutricional. A maior parte das vias biossintticas microbianas so bastante homlogas s vias correspondentes nos organismos superiores. A peculiaridade do metabolism microbiano acenta na diversidade fonts apartir das quais o ATP e o NADH podem ser gerados. Os carboidratos e outros nutrientes apresentam duas funes no metabolismo de microorganismos heterotrficos: 1. So oxidados para libertar energia; 2. Fornecem carbonos ou blocos de construo para a sintese de novos constituintes celulares. Apesar de muitas vias anablicas estarem separadas das vias catablicas, existem vias anfiblicas que funcionam tanto catabolicamente como anabolicamente. As vias mais importantes nesta gama so a via glicolitica e o Ciclo de Krebs: A maior parte das reaces nestas duas vias so livremente reversiveis e podem ser usadas para sintetizar e degradar molculas;
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Alguns passos catabolicos irreversiveis so atravessados por enzimas especiais que catalizam a reaco inversa; A presena de duas enzimas, uma que cataliza a reaco inversa da outra, permite a regulao independente das funes catablicas e anablicas destas vias anfiblicas.
Degradao de Glucose a Piruvato

Os microorganismos usam vrias vias metablicas para catbolizar a glucose e outros acares. Divod a esta diversidade metablica, o seu metabolismos muitas vezes confuso mas, para evitar esta confuso, podemos determinar trs vias diferentes de metabolismo de acares nos microorganismos: 1. Gliclise; 2. Via das pentoses fosfato; 3. Via Entner-Doudoroff. Via Glicolitica A via glicolitica ou de Embden-Meyerhof sem duvida a via mais comum para a degradao de glucose a piruvato na fase dois do catabolismo. encontrada em todos os grupos principais de microorganismos e funciona na presena e na ausncia de O2. A gliclise localiza-se na matriz citoplasmtica de procariotas e eucariotas e a via num todo pode ser dividida em duas partes: 1. Na etapa inicial de seis carbonos, a glucose fosforilada duas vezes e convertida eventualmente em frutose-1,6-bifosfato. Outros acares so muitas vezes introduzidos nesta via pela converso a glucose-6-fosfato ou frutose-6-fosfato. Esta fase inicial no fornece energia, de facto, duas molculas de ATP so usadas por cada molcula glucose. Estes passos iniciais adicionam fosfatos em cada extermidade do acares e estes fosfatos sero depois usados na sintese de ATP; 2. A etapa de trs carbonos da gliclise comea quando a enzima frutose-1,6-bifosfato aldolase cataliza a clivagem de frutose-1,6,bifosfato em duas metades, cada uma com um grupo fosfato. Um dos produtos, o gliceraldeido-3-fosfato, convertido directamente a piruvato num processo de cinco passos. Como o outro produto pode ser facilmente convertido a gliceraldeido-3fosfato, as duas metades so convertidas a piruvato. Nesta etapa, duas molculas de ATP so formadas por cada molcula de trs
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carbonos que entra nesta ultima etapa a partir dos grupos fosfato introduzidos na etapa anterior (fosforilao ao nivel do substrato) e na oxidao por NAD+. A via glicolitica degrada uma molcula de glucose em duas de piruvato por uma sequncia de reaces, sendo tambm produzidas molculas de ATP e NADH. O rendimento energtico pode ser calculado tendo em conta as duas etapas da gliclise: Na etapa de seis carbonos, 2ATP so usados para formar frutose-1,6-bifosfato; Por cada gliceraldeido-3-fosfato transformado em piruvato, 1NADH e 2ATP so formados; Como duas molculas de gliceraldeido-3-fosfato surgem de uma unica molcula de glucose, a etapa de trs carbonos gera 4ATP e 2NADH por cada molcula de glucose: Etapa trs carbonos: Etapa seis carbonos: Rendimento final: 4ATP + 2NADH - 2ATP 2ATP + 2NADH
Assim, o catabolismo da glucose a piruvato na gliclise pode ser representado pela seguinte equao:
Via das Pentoses Fosfato A via das pentoses fosfato pode ser utilizada ao mesmo tempo que a via glicolitica ou a via de EntnerDoudoroff. Pode operar tanto aerobicamente como anaerobicamente e to importante na biossintese como no catabolismo.
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A via das pentoses fosfato comea com a oxidao da glucose-6-fosfato a 6-fosfogluconato seguida pela a oxidao de 6-fosfogluconato pentose ribulose-5-fosfato e a CO2. NADPH produzido durante estas oxidaes. A ribulose-5-fosfato depois convertida a uma mistura de acares fosfatos de trs a sete carbonos. Duas enzimas unicas desta via tm um papel fundamental nestas transformaes: Transcetolase cataliza a transferncia de grupos cetol de dois carbonos; Transaldolase transfere um grupo de trs carbonos da sedoheptulose-7-fosfato para gliceraldeido-3-fosfato.
O resultado final que trs molculas de glucose-6-fosfato so convertidas em duas molculas de frutose-6-fosfato, gliceraldeido-3-fosfato e trs molculas de CO2 e estes intermedirios so usados de dois modos: A frutose-6-fosfato pode ser convertida de novo a glucose-6-fosfato enquanto o gliceraldeido-3fosfato convertido a piruvato por enzimas glicoliticas; O gliceraldeido-3-fosfato pode tambm regressar via das pentoses fosfato atraves da formao de glucose-6-fosfato.
Isto resulta na degradao completa da glucose-6-fosfato a CO2 a na produo de uma grande quantidade de NADPH:
A via das pentoses fosfato apresenta vrias funes catablicas e anablicas, sendo resumidamente: 1. O NADPH da via das pentoses fosfato serve como uma fonte de electres para a reduo de molculas durante a biossintese; 2. A via sintetiza acares de quatro e cinco carbonos para uma variedade de efeitos. O acar de quatro carbonos eritrose-4-fosfato usado na sintese de aminocidos aromticos e da vitamina B6. A pentose ribose-5-fosfato um componente principal dos cidos nucelicos, e a ribulose-1,5bifosfato o aceitador de CO2 primrio na fotossintese. Para alm disso, quando os microorganismos crescem numa fonte de pentoses, a via tambm capaz de fornecer carbonos para a produo de hexoses (e.g., glucose necessria para a sintese de peptidoglicano); 3. Intermedirios da via das pentoses fosfato podem ser usados para produzir ATP. O gliceraldeido-3-fosfato da via capaz de entrar na etapa de trs carbonos da gliclise e ser convertido a ATP e piruvato. O piruvato, por sua vez, pode depois ser oxidado no Ciclo de Krebs para fornecer mais energia. Em adio, algums NADPH pode ser convertido a NADH, que fornece ATP quando oxidado pela cadeia transportadora de electres. Como pentoses so intermedirios desta via, a via das pentoses fosfato pode ser usada para catabolizar pentoses tal como hexoses. Apesar da via das pentoses fosfato poder ser uma fonte de energia em muitos organismos, a sua importncia mais elevada em biossintese.
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Via Entner-Doudoroff Apesar da via glicolitica ser a via mais comum para a converso de hexoses a piruvato, outra via com um papel semelhante foi descoberta, a via Entner-Doudoroff, que ocorre do seguinte modo: Comea com as mesma reaces da via das pentoses fosfato, a formao de glucose-6-fosfato e 6fofogluconato; Em vez de ser mais oxidada, o 6-fosfogluconato desidaratado pela 6-fosfogluconato desidratase para formar 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato (ou KDPG), o intermedirio chave da via; O KDPG depois clivado pela KDPG aldolase a piruvato e gliceraldeido-3-fosfato; O gliceraldeido-3-fosfato convertido a piruvato na poro final da via glicolitica.
6-fosfogluconate desidratase KDPG
Se a via Entner-Doudoroff degrar glucose a piruvato deste modo, ela fornece 1ATP, 1NADPH e 1NADH por cada glucose metabolizada. Esta via foi identificada em Pseudomonas, que no possuem uma aldolase usada na gliclise. Assim, pensou-se que esta via existiria apenas em bactrias que no apresentavam essa aldolase. No entanto, apesar da maior parte das bactrias apresentarem a via glicolitica e a das pentoses fosfato, algumas substituem a gliclise por esta via, apesar do menor rendimento energtico. Isto observa-se porque o KDPG (que unico desta via) encontrado em muitos meios onde as bactrias vivem, sendo um nutriente facil de conseguir. A via Entner-Doudoroff geralmente encontrada em Pseudomonas, Rhizobium, Azotobacter, Agrobacter e alguns outros gneros gram-negativos. Muito poucas bactrias gram-positivas apresentam esta via, com Enterococcus faecalis a ser uma excepo rara.
Fermentaes
Na ausncia de respirao aerbica ou anaerbica, o NADH no oxidado pela cadeia transportadora de elecetres porque nenhum aceitador de electres externo est disponivel. Assim, o NADH produzido na via glicolitica durante a oxidao do gliceraldeido-3-fosfato a 1,3-bifosfoglicerato deve na mesma ser oxidado de novo a NAD+. Se o NAD+ no for regenerado, a oxidao do gliceraldeido-3-fosfato cessa e a gliclise pra. Muitos microorganismos resolvem este problema abrandando ou parando a actividade da piruvato desidrogenase e usando o piruvato ou um dos seus derivados como aceitadores de electres e hidrognio para a re-oxidao do NADH num processo de fermentao: Este processo leva produo de mais ATP; O processo tao eficiente que alguns quimoorganoheterotrficos no fazem respirao mesmo quando oxignio ou outro aceitador de electres exgeno est disponivel.
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Existem vrios tipos de fermentaes, e so muitas vezes caracteristicos de grupos microbianos particulares. Devemos ter em conta dois pontos importantes quando examinamos as fermentaes microbianas: 1. Nas fermentaes, o NADH oxidado a NAD+; 2. O aceitador de electres o piruvato ou um derivado do piruvato; 3. Na fermentao, o substrato parcialmente oxidado, ATP formado por fosforilao ao nivel do substrato e no necessrio oxignio. Os principais tipos de fermantaes so: 1. Fermentao lctica consiste na reduo de piruvato a lactato e muito comum (nmero 1). Est presente em bactrias (bactrias lcticas, Bacillus), algas (Chlorella), alguns protozorios e mesmo no musculo esqueltico animal. Os fermentadores lcticos podem ser separados em dois grupos: Fermentadores homolcticos usam a via glicolitica e reduzem directamente quase todo o piruvato a lactato com a enzima lactato desidrogenase; Fermentadores heterolcticos formam quantidades substanciais de produtos para alm do lactato. Muitos produzem lactato, etanol e CO2 pela via fosfocetose. 2. Fermentao alcolica muitos fungos e algumas bactrias, algas e protozorios fermentam acares em etanol e CO2 (nmero 2). O piruvato descarboxilado a acetaldeido, que depois reduzido a etanol pela alcool desidrogenase com o NADH como dador de electres; 3. Fermentao a cido frmico muitas bactrias, especialmente membros da familia Enterobacteriaceae, so capazes de metabolizar piruvato a cido frmico e outros produtos (nmero 5). O cido frmico pode ser convertido a H2 e CO2. Existem dois tipos de fermentao do cido frmico: Fermentao dos cidos mistos resulta na excreo de etanol e de uma mistura complexa de cidos, particularmente cidos actico, lctico, siccinico e frmico. Se a enzima de converso do cido frmico estiver presente, o cido frmico degradado a H2 e CO2 (e.g., Escherichia, Salmonella, Proteus, e outros); Fermentao do butanediol (nmero 4) caracteristica de Enterobacter, Serratia, Erwinia e algumas espcies de Bacillus. O piruvato convertido a acetoina, que depois
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reduzida a 2,3-butanediol com NADH. Uma grande quantidade de etanol tambm produzida, em conjunto com menores quantidades de cidos encontrados na fermentao dos cidos mistos.
Os microorganismos podem fazer ainda outras fermentaes. Por exemplo, protozorios e fungos normalmente fermentam acares a lactato, etanol, glicerol, succinato, formato, acetato, butanediol e produtos adicionais. Por outro lado, membros do gnero Clostridium so capazes de fermentar aminocidos a acetato, e outros cidos orgnicos, como acetato, lactato, propionato e citrato tambm podem ser fermentados. Muitas destas fermentaes so de grande importncia prtica: O citrato pode ser convertido a diacetil e d sabor ao leite fermentado; As fermentaes alcoolicas e lcticas so bastante uteis pois as primeiras podem ser usadas na produo de bebidas alcoolicas e po e as segundas podem ser usadas na formao de iogurte, queijo e pickles; O cido propinico resultante da fermentao do oxaloacetato, aps converso do piruvato a oxaloacetato, est envolvido na produo de queijo suio; A acetona e o isopropanol resultantes da fermentao do cido actico so usados na produo de removedor de verniz, etc...; O cido actico resultante da fermentao do piruvato via acetil-CoA usado na produo de vinagre.
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Identificao Bacteriana Atravs da Fermentao As fermentaes do cido frmico so bastante uteis na identificao de membros das Enterobacteriaceae. Os fermentadores do butanediol podem ser distinguido dos fermentadores dos cidos mistos de trs modos: 1. O teste de Voges-Proskauer um procedimento colorimtrico que detecta o percursor acetoina do butanediol e positivo (vermelho) com fermentadores de butanediol mas no com fermentadores de cidos mistos;
2. Fermentadores dos cidos mistos produzem quatro vezes mais produtos acidicos que os neutros, enquanto os fermentadores de butanediol formam principalmente produtos neutros. Assim, fermentadores de cidos mistos acidificam os meios de incubao a uma extenso muito maior. Esta base do teste do vermelho de metilo. Este teste positivo apenas para a fermentao dos cidos mistos porque o pH desce abaixo de 4.4 e a cor do indicador muda de amarelo para vermelho;
3. CO2 e H2 so formados em quantidades iguais apartir do cido frmico durante a fermentao dos cidos mistos. No entanto, os fermentadores de butanediol produzem excesso de CO 2 e a razo CO2/H2 prxima de 5:1.
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Para determinarmos se uma bactria faz fermentao de um determinado acar e que tipo de fermentao faz, podemos fazer um teste simples que se baseia na produo de gs e acidificao. Normalmente, usa-se um sistema no qual introduzido um indicador de pH bastante sensivel (no ser o vermelho de metilo), de modo a ser determinada a existncia de acidificao, e introduzido tambm um tubo mais pequeno invertido, que mostrar a formao ou no de gs: Como em todas as fermentaes existe a formao de um cido, a alta sensibilidade do indicador permitir a identificao da fermentao por alterao da cor do indicador; A formao de CO2 na fermentao ocorre em alguns tipos de fermentaes (e.g., alcolica, do propionato, do butanediol, do isopropanol) mas noutras no se observa. Assim, se um tubo com resultado positivo para fermentao ocorrer formao de gs ficamos a saber que tipo de fermentao a bactria far. Se no houver formao de gs na presena de acidifcao, estaremos na presena de uma fermentao sem produo de gs, que tambm podemos identificar.
Ciclo de Krebs
Apesar de alguma energia ser obtida apartir da quebra da glucose a piruvato pelas vias anteriores, muita libertada quando o piruvato degradao aerobicamente a CO2 na terceira etapa do catabolismo: 1. Inicialmente, o complexo multienzimtico piruvato desidrogenase oxida o piruvato para formar CO2 e acetil-CoA, uma molcula rica em energia composta por cido actico e coenzima A ligados por uma ligao tioster de alta energia; 2. A acetil-CoA surge do catabolismo de muitos carboidratos, lipidos e aminocidos e pode depois ser degrada no Ciclo de Krebs. O substrato para o Ciclo de Krebs a acetil-CoA e os passos envolvidos nesta via so: Na primeira reaco, a acetil-CoA condensada com um intermedirio de quatro carbonos, o oxaloacetato, para formar citrato na etapa de seis carbonos; O citrato rearranjado para formar isocitrato, um alcool secundrio mais facilmente oxidado; O isocitrato subsequentemente oxidado e descarboxilado duas vezs para formar cetoglutarato, depois succinil-CoA; Neste ponto, duas molculas de NADH so formadas e dois carbonos so perdidos do ciclo como CO2. Como dois carbonos so adicionados como acetil-CoA no inicio, o balano mantido; O ciclo entra agora na etapa de quatro carbonos durante a qual dois passos de oxidao fornecem uma molcula de FADH2 e uma molcula de NADH por cada acetil-CoA; Em adio, GTP produzido apartir de succinil-CoA por fosforilao ao nivel do substrato; Eventualmente, o oxaloacetato reformado e fica pronto para ligar outra molcula de acetilCoA.
O Ciclo de Krebs gera duas molculas de CO2, trs molculas de NADH, uma molcula de FADH2 e uma molcula de GTP por cada molcula de acetil-CoA oxidada.
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No entanto, tambm podemos ver o Ciclo de Krebs como uma via de oxidao de acteil-CoA a CO2, que podemos dividir em trs passos: 1. O primeiro passo constitui a ligao de um grupo acetil ao carregador acetil, oxaloacetato, para formar citrato; 2. O segundo passo comea com o citrato e termina na formao de succinil-CoA. Aqui, a proo carregadora de acetil do citrato perde dois carbonos quando oxidada para dar origem a duas molculas de CO2; 3. O terceiro passo converte succinil-CoA a oxaloacetato, o carregador acetil, de modo que este capaz de recolher outro grupo acetil. As enzimas do Ciclo de Krebs so amplamente distribuidas entre os microorganismos: O Ciclo de Krebs completo parece estar funcional em muitas bactrias aerbicas, em protozorios livres e na maior parte das algas e fungos. Isto no supreendente porque o ciclo uma fonte de energia bastante importante; Contudo, o anaerbio facultativo E. coli no usa o ciclo completo sob condies anaerbicas ou quando a concentrao de glucose alta, mas usa em algumas vezes. Apesar destes microorganismos no apresentarem o ciclo completo, normalmente apresentam a maior parte das enzimas do ciclo porque uma das principais funes desta via fornecer esqueletos de carbono para uso em biossintese.
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Cadeia Transportadora de Electres e Oxidao Fosforilativa

Pouca quantidade de ATP sintetizada at este ponto. Apenas o equivalente a quatro molculas de ATP directamente sintetizado quando uma molcula de glucose oxidada a seis molculas de CO 2 pela via da gliclise e pelo Ciclo de Krebs. A maior parte do ATP gerado tem origem na oxidao de NADH e FADH 2 na cadeia transportadora de electres! Cadeia Transportadora de Electres A cadeia transportadora de electres mitocondrial composta por uma srie de carregadores de electres que operam em conjunto para transferir electres de dadores, como NADH e FADH 2, para ceitadores, como O2: Os electres fluem dos carregadores com potenciais de reduo mais negativos para aqueles como potenciais mais positivos e eventualmente combinam com O2 e H+ para formar gua; A diferena dos potenciais de reduo entre O2 e NADH grande, cerca de 1,14 volts, e torna possivel a libertao de uma grande quantidade de energia; As alteraes de potencial em vrios pontos da cadeia so suficientemente grandes para fornecer suficiente energia para a produo de ATP; A cadeia transportadora de electres reparte a grande energia geral em passos pequenos, sendo alguma da energia libertada armazenada na forma de ATP; O transporte de electres nestes pontos gera gradientes electricos e de protes, sendo que estes gradientes dirigem a sintese de ATP.
Os transportadores da cadeia transportadora de electres residem na membrana interna mitocondrial ou na membrana plasmtica bacteriana: O sistema mitocondrial arranjado em quatro complexos de carregadores, cada um capaz de transportar electres para O2; A coenzima Q e o citocromo c ligam os complexos uns aos outros.
O processo pelo qual a energia do transporte de electres usado para fazer ATP designado fosforilao oxidativa:
Trs molculas de ATP so sintetizadas a partir de ADP e Pi quando um par de electres passa de NADH para um tomo de O2; Como os electres apartir de FADH2 apenas passam dois pontos de fosforilao oxidativa, duas molculas de ATP so sintetizadas quando um par de electres passa de FADH 2 para O2.
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Apesar de algumas cadeias bacterianas serem semelhantes cadeia mitocondrial, elas frequentemente diferem entre si: Variam nos seus carregadores de electres (e.g., nos seus citocromos) e podem ser ramificadas; Os electres podem entrar em vrios pontos e sair atravs de vrias oxidases terminais; As cadeias bacterianas podem ser mais curtas e produzirem menores quantidades de ATP do que as cadeias mitocondriais.
As cadeias transportadoras de electres procariotas e eucariotas diferem em detalhes de construo apesar de operarem usando os mesmos principios fundamentais. As cadeias transportadoras de Escherichia coli e Paracoccus denitrificans servem como exemplo para estas diferenas: Apesar de E. coli transportar electres de NADH para aceitadores e mover protes atravs da membrana plasmtica, a sua cadeia transportadora de electres difere da mitocondrial apresentando uma gama diferente de citocromos e sendo ramificada. Coenzima Q ou ubiqunol doam electres a ambas as ramificaes, mas operam em condies diferentes de crescimento. A ramificao do citocromo d tem uma afinidade muito elevada por oxignio e funciona a baixos niveis de oxignio. No to eficiente como a ramificao do citocromo o porque no bombeia protes activamente. A ramificao do citocromo o tem afinidade moderada pelo O2, bombeador de protes e opera a concentraes de O2 superiores;
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A Paracoccus denitrificans uma bactria gram-negativa, anaerbia facultativa do solo que capaz de crescer heterotroficamente com uma variedade de nutrientes e autotroficamente em H2 e CO2 como NO3- como aceitador de electres. A bactria capaz de fazer respirao aerobica ou respirao anaerobica com nitrato como aceitador: a) A cadeia transportadora aerbica tem quatro complexos que correspondem cadeia mitocondrial. Em adio aos dadores como NADH e succinato, Paracoccus oxida metanol e metilamina e cresce no solo com esses compostos como fontes de carbono. Os electres entram na cadeia transportadora de electres ao nivel do citocromo c. O metanol oxidado a formaldeido, que convertido a CO2 e incorporado no Ciclo de Calvin; b) Quando a bactria cresce anaerobicamente com nitrato como o seu aceitador de electres, a cadeia estruturada de modo diferente. O complexo citocromo aa3 no funciona. Em vez disso, os electres no citocromo c movem-se para a nitrato redutase, xido nitrico redutase e oxido nitroso redutase. No so muitos os protes que atravessam a membrana neste arranjo, mas isto permite o crescimento anaerbico.
Cadeia transportadora de electres E. coli
Fosforilao Oxidativa
Cadeia transportadora de electres Paracoccus denitrificans
De acordo com a hiptese quimiosmtica, a cadeia transportadora de electres est organizada de modo a que protes movem-se para o exterior da matriz mitocondrial e electres so transportados para o interior: Protes movem-se pela aco de bombas de protes especiais que derivam a sua energia do transporte de electres; Protes movem-se por meio dos carregadores;
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O resultado uma fora motriz de protes, composta por um gradiente de protes e e um potencial de membrana devido destribuio assimtrica de cargas. Esta fora motriz est envolvida em: Sintese de ATP quando os protes voltam para a matriz mitocondrial devido fora motriz, o ATP sintetizado numa reaco de hidrlise de ATP inversa. Um processo semelhante ocorre em procariotas, com o movimento de electres a promover a saida de protes da clula; Transporte de molculas atravs da membrana como visto para o simporte e o antiporte; Rotao do flagelo bacteriano o movimento de protes para o interior da clula bacteriana fornece energia para a rotao do flagelo (ver pg. 67).
a hiptese quimiosmtica amplamente aceite em Microbiologia pois existe uma evidncia considervel da produo de gradientes de protes e de carga atravs da membrana. Contudo, a evidncia dos gradientes de protes como directores da fosforilao oxidativa ainda no conclusiva pois em algumas bactrias marinhas halofilicas, ies de sdio podem ser usados para dirigir a sintese de ATP. Independentemente do mecanismo, a sintese de ATP ocorre numa F1F0 ATPase ou ATP sintetase: O componente F1 mitocondrial surge como uma estrutura esfrica ligada superficie da membrana interna por uma haste e o componente F0 encontrase embebido na membrana; A F1F0 ATPase encontra-se na superficie interna da membrana plasmtica bacteriana; A F0participa no movimento de protes atarvs da membrana e este movimento atravs de um canal em F0 dirige a fosforilao oxidativa; F1 um grande complexo com trs subunidades intercaladas com trs subunidades . A subunidade extende-se para baixo do complexo 33, compondo parte da haste e interagindo com F0; Muito da subunidade encontra-se posicionado no
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centro de F1, revestida por subunidades e , e roda rapidamente na direco contrria ao dos ponteiros do relgio e leva a alteraes conformacionais que dirigem a sintese de ATP nas subunidades activas. Muitos quimicos inibem a sintese aerbica de ATP e podem mesmo matar clulas quando se encontram em concentraes suficientemente elevadas. Estes inibidores geralmente caem em duas categorias: Bloqueadores de transporte de electres bloqueiam directamente o transporte de electres, no permitindo que a cadeia transportadora de electres funcione. Por exemplo, o antibitico piericidina compete com a coenzima Q, o antibitico antimicina A bloqueia o transporte de electres entre citocromos b e c e tanto a cianida como a azida param a transferncia de electres entre citocromo a e O2 porque so anlogos estruturais de O2; Desacopladores param a sintese de ATP sem inibirem o transporte de electres. De facto, podem ainda aumentar a taxa de fluxo de electres. Normalmente, o transporte de electres fortemente acoplado fosforilao oxidativa de modo que a taxa de sintese de ATP controla a taxa de transporte de electres. Quanto mais rpida a sintese de ATP durante a fosforilao oxidativa, mais rapidamente funcionar a cadeia transportadora de electres para fornecer a energia mecessria. Os desacopladores desacoplam a fosforilao oxidativa do transporte de electres, assim, a energia libertada pela cadeia libertada como calor em vez de ATP. Muitos desacopladores como dinitrofenol e valinomicina permitem que ies hidrognio, potssio e outros atravessem a membrana sem activarem a ATP sintetase, destruindo os gradientes de ies e de pH. A valinomicina pode tambm ligar direcatmente ATP sintetase e inibir a sua actividade.
Respirao Anaerbica
Os electres derivados dos acares e outras molculas orgnicas so muitas vezes doados tanto a aceitadores de electres endgenos como a O2 molecular pela cadeia transportadora de electres. Contudo, muitas bactrias apresentam cadeia transportadoras de electres que so capazes de operar com aceitadores exgenos de electres para alm do O2. Este processo designado de respirao anaerbica e os principais aceitadores de electres so nitrato, sulfato e CO2, mas metais e algumas molculas orgnicas tambm podem ser reduzidas.
Aceitador de electres Respirao aerbica O2 Respirao anaerbica NO3 NO3 2SO4 CO2 0 S 3+ Fe 2HAsO4 2SeO4 Fumarato Produtos reduzidos H2O NO2 NO2 , N2O, N2 H2S CH4 H2S 2+ Fe HasO2 Se, HSeO3 Succinato
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Exemplos de microorganismos Todas as bactrias, fungos, protozrios e algas aerobicos Bactrias entricas Pseudomonas, Bacillus e Paracoccus Desulfovibrio e Desulfotomaculum Todos os metanognios Desulfuromonas e Thermoproteus Pseudomonas, Bacillus e Geobacter Bacillus, Desulfotomaculum, Sulfurospirillum Aeromonas, Bacillus, Thauera Wolinella
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Algumas bactrias so capazes de usar nitrato como aceitador de electres no final da sua cadeia transportadora de electres e mesmo assim produzir ATP. Muitas vezes, este processo designado de reduo dissimilatria de nitrato. O nitrato podem ser reduzido a nitrito pela nitrato redutase, que substitui a citocromo oxidase:
A reduo do nitrato a nitrito no um modo particularmente eficiente na produo de ATP, porque grandes quantidades de nitrato so necessrias para o crescimento (uma molcula de nitrato aceita apenas dois electres); O nitrito formado relativamente txico.
Deste modo, o nitrato muitas vezes completamente reduzido a azoto gasoso, um processo conhecido como desnitrificao. Cada nitrato ir assim aceitar cinco electres e o produto no ser txico:
A desnitrificao um processo em multiplos passos com quatro enzimas a participar: 1. Nitrato redutase: NO3- NO22. Nitrito redutase: NO2- NO 3. xido nitrico redutase: NO N2O 4. xido nitroso redutase: N2O N2
A nitrito redutase bacteriana encontra-se no espao periplasmtico em bactrias gram-negativas e a xido nitrico redutase cataliza a formao de xido nitroso como um complexo ligado a citocromo bc. Um exemplo de bactrias desnitrificantes Paracoccus denitrificans do solo gram-negativa, que reduz nitrato a N2 anaerobicamente. A sua cadeia contem uma nitrato redutase e uma xido nitrico redutase membranares, enquanto a nitrito redutase e a xido nitroso redutase so periplasmticas. A desnitrificao realizada por alguns membros do gnero Pseudomonas, Paracoccus e Bacillus. Eles usam esta via como uma alternativa respirao aerbica normal e podem ser considerados anaerobios facultativos. A desnitrificao em solos resulta na perda de azoto do solo e afecta negativamente a fertilidade do solo. Dois outros grupos principais usam a respirao anaerbica so anaerbios obrigatrios: Os que usam CO2 ou carbonato como aceitador terminal de electres so designados metanognios porque reduzem CO2 a metano; O sulfato tambm pode ser usado como aceitador final de electres em bactrias como Desulfovibrio, sendo reduzido a sulfeto (S2- ou H2S) aceitando oito electres.
A respirao anaerbica no to eficiente na sintese de ATP como a respirao aerobica, isto , no produzido tanto ATP por fosforilao oxidativa com nitrato, sulfato e CO2 como aceitadores. A reduo da produo de ATP resulta do facto de estes aceitadores de electres alternativos apresentarem potenciais de reduo menos positivos que o O2: A diferena de potenciais de reduo entre um dador como NADH e nitrato menor que a diferena entre NADH O2; Como a energia resultante directamente proporcional magnitude da diferena de potenciais, menos energia est diponivel para a produo de ATP na resiprao anaerbica.
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Todavia, a respirao anaerbica util porque mais eficiente que a fermentao e permite a sintese de ATP por transporte de electres e fosforilao oxidativa na ausncia de O 2. Esta respirao muito prevalente em solos e sedimento sem oxignio. Por exemplo, se O2, nitrato, io mangannsio, io frrico, sulfato e CO2 estiverm disponiveis num ambiente particular, uma sequncia especifica de oxidao ocorre quando um substrato oxidvel est disponivel para uma populao microbiana: 1. O oxignio usado primeiro como aceitador de electres porque inibe o uso de nitrato por microorganismos capazes de fazer respirao com O2 e nitrato. Enquanto o O2 est disponivel, os redutores de sulfato e os metanognios so inibidos porque estes grupos so anaerbios obrigatrios; 2. Quando O2 e nitrato so esgotados e produtos da fermentao, incluindo hidrognio, se acumularam, a competio pelo uso de outros oxidantes comea, sendo o mangansio e o ferro primeiro usados seguidos de competio entre redutores de sulfato e metanognios. Esta competio influenciada pela maior energia obtida com o sulfato como aceitador. Deteco da Respirao Anaerbica As bactrias podem libertar H2S durante o seu metabolismo a partir de dois tipos de reaces diferentes: 1. Dessulfurao da cisteina para sua utilizao como fonte de carbono; 2. Utilizao de composto inorgnicos de enxofre, por exemplo sulfato (SO 42-) e tiossulfato (S2O32-), como aceitadores finais de electres durante a respirao anaerbica. A libertao de H2S no universa e pode ser utilizada para distinguir bactrias durante o processo de identificao. Para detectar esta libertao, utilizam-se meios contendo tiossulfato e petona (dirigido de proteinas ricas em cisteina) como fontes de enxofre e um sal de ferro para detectar H2S. O meio mais utilizado o meio SIM.
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O meio SIM um meio de agar semi-slido usado para a identificao de membros da famila Enterobacteriaceae detectanto a formao de idole, sulfureto de hidrognio e mobilidade: Mobilidade quando o microorganismos introduzido no agar semi-slido numa direco paralela ao eixo do tubo, a bactria ir migrar por meio do seu flagelo para alm da linha de introduo. Isto porduz uma turvao por todo o meio. Uma bactria que no se move deixar o meio limpido. O cloreto de trifeniltetrazolium (TTC) um composto soluvel incorporado no meio. Quando recolhido por uma bactria, a substncia reduzida libertando cido formazan, um composto altamente pigmentado de vermelho e insoluvel. Assim, na presena deste pigmento, bactrias moveis levam a que o meio fico rosado e bactrias no moveis criam apenas uma linha rosa no meio; Sulfeto de hidrognio (H2S) enxofre incoporado no meio na forma de tiossulfato de sdio, com o indicador citrato de amnia frrico. Se H2S for produzido, ele reagir com o indicador para produzir sulfureto ferroso que precipita no meio, produzindo uma cor negra; Indole o triptofano incorporado no meio na forma de peptonas. Se o organismo produzir triptofanase, o triptofano ser quebrado nos seus produtos, particularmente indole. Este composto reage com o aldeido no reagente de Kovac para formar uma cor vermelha ou purpura. Uma reaco negativa no mostrar alterao de cor aps introduo do reagente.
Oxidao de Molculas Inorgni cas

Na respirao aerbica e na respirao anaerbica, o ATP formado como um resultado da actividade da cadeia transportadora de electres. No entanto, electres para esta cadeia podem tambm ser obtidos apartir de nutrientes inorgnicos, e possivel derivar energia da oxidao de molculas inorgnicas em vez de de nutrientes orgnicos. Esta habilidade est confinada a uma grupo de bactrias designadas quimiolitotrficos, sendo que cada espcie especificas na sua perferncia de dadores e aceitadores de electres:
Bactria Alcaligenes, Hydrogenophaga, Pseudomonas spp. Nitrobacter Nitrosomonas Thiobacillus denitrificans Thiobacillus ferrooxidans Dador de electres H2 NO2 + NH4 0 S , H2S 2+ 0 Fe , S , H2S Aceitador de electres O2 O2 O2 NO3 O2 Produtos H2O NO2 , H2O NO2, H2O 2SO4 , N2 3+ Fe , H2O, H2SO4
O aceitador normalmente O2, mas sulfato e nitrato so tambm usados; Os dadores de electres mais comuns so hidrognio, compostos reduzidos de azoto, compostos reduzidos de enxofre e ferro ferroso (Fe2+).
As bactrias quimiolitotrficas so muitas vezes autotrficas e usam o Ciclo de Calvin para fixar CO 2 como a sua fonte de carbono. Contudo, alguns quimiolitotrficos so capazes de funcionar como heterotrficos se compostos orgnicos reduzidos estiverem disponiveis: Energia considervel necessria para reduzir CO2 a carboidratos pois a incorporao de CO2 no Ciclo de Calvin requer trs ATP e dois NADPH; Muito menos energia est disponivel da oxidao de molculas inorgnicas do que da oxidao completa da glucose a CO2.
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As razes P/O para a fosforilao oxidativa em quimilitotrficos so provavelmente volta de 1,0. Devido produo de ATP ser to baixa, os quimiolitotrficos devem oxidar uma grande quantidade de material inorgnico para crescer e reproduzir, e isto magnifica o seu impacto ecolgico. Vrios gneros bacterianos so capazes de oxidar gs hidrognio para produzir energia porque possuem uma enzima hidrogenase que cataliza a oxidao do hidrognio:
Os electres so doados tanto cadeia transportadora de electres como ao NAD+, dependendo da hidrogenase; Se NADH for produzido, ele pode entrar na sintese de ATP pela cadeia transportadora de electres e pela fosforilao oxidativa, com O2 como aceitador terminal de electres; Estes microorganismos oxidantes de hidrognio usam muitas vezes compostos orgnicos como fontes de energia quando tais nutrientes esto disponiveis.
Os quimiolitotrficos oxidantes de azoto mais bem estudados so bactrias nitrificantes. Estas bactrias do solo e aquticas so de alto significado ecolgico e a oxidao de amnia a nitrato depende da actividade de pelo menos dois gneros diferentes: Nitrosomonas e Nitrosospira oxidam amnia a nitrito: NH4+ + 1 O2 NO2- + H2O + 2H+; O nitrito depois oxidado por Nitrobacter e Nitrococcis para formar nitrato: NO2- + O2 NO3; A energia libertada na oxidao da amnia e do nitrato usada para formar ATP pela fosforilao oxidativa.
Quando dous gnero trabalham em conjunto, a amnia no solo oxidada a nitrato num processo designado nitrificao. Contudo, os microorganismos necessitam de uma fonte de electres tal como uma fonte de ATP de modo a reduzir CO2 e outras molculas: Como molculas como amnia e nitrato apresentam potenciais de reduo mais positivos que o NAD+, elas no conseguem doar directamente os seus electres para formar NADH e NADPH necessrios; Bactrias oxidantes de enxofre apresentam a mesma difuldade.
Ambos os tipos de quimiolitotrficos resolvem este problema usando a fora motriz de electres para reverter o fluxo de electres nas suas cadeias transportadoras de electres e reduzir NAD + com electres de dadores azotados e de enxofre: Como energia usada para gerar NADH e ATP, o ATP obtido no final muito pouco;
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Os quimiolitotrficos so capazes de sustentar esta ineficincia pois no apresentam competidores srios para as suas unicas fontes de energia.
As bactrias oxidantes de enxofre so o terceiro gupo principal de qumiolitotrficos. Bactrias como Thiobacillus oxidam enxofre (S0), sulfeto de hidrognio (H2S), tiossulfato (S2O32-) e outros compostos de enxofre a cido sulfrico, apresentando um impacto ecolgico significante: Geram ATP por fosforilao oxidativa e por fosforilao ao nivel do substrato envolvendo adenosina fosfosulfato (APS),uma molcula de alta energia formada apartir de sulfito e adenosina monofosfato; Alguns destes procariotas so extraordinariamente flexiveis a nivel metablico, podendo crescer aerobicamente como bactrias oxidantes de enxofre e fazendo respirao anaerbica na ausncia de O2 com enxofre molecular como aceitador final; Como outros quimolitotrficos, so capazes de usar CO2 como fonte de carbono. Mas muitas podem crescer heterotroficamente se lhes forem fornecidos fontes de carbono orgnico como glucose ou aminocidos.
Fotossintese
Muitos microorganismos so capazes de capturar energia luminosa e usa-la para sintetizar ATP e NADH ou NADPH. Este processo no qual a energia luminosa recolhida e convertida a enrgia quimica designado fotossintese: Normalmente, um organismos fotossinttico reduz e incorpora CO2, reaces que so tambm consideradas como parte deste processo; A fotossintese um dos processos metablicos mas significativos na Terra porque quse toda a nossa energia no fim de contas derivada da energia solar; Fornece aos organismos fotossintticos com ATP e NADPH necessrios para sintetizar o material organico necessrio para o crescimento. Assim, estes organismos funcionam como base para a maior parte das cadeias alimentares na biosfera;
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responsvel por repor os fornecimentos de O2, um processo importante feito por uma variedade de organismos, tanto eucariotas como procariotas; Apesar de sempre se associar a fotossintese s plantas superiores, cerca de metada da fotossintese na Terra efectuadas por microorganismos.
Organismos procariotas Cianobactrias (algas azul-verde) Bactrias verdes sulfurosas Bactrias verdes no-sulfurosas Bactrias prpura sulfurosas Bactrias prpura no-sulfurosas Prochloron
Organismos eucariotas Plantas superiores Algas verdes, castanhas e vermelhas multicelulares Algas unicelulares (e.g., euglenoides, dinoflagelados, diatomceas)
A fotossintese num todo em dividida em duas partes: 1. Reaces de luz aqui, a energia luminosa recolhida e convertida a energia qumica; 2. Reaces de escuro aqui, a energia quimica obtida na parte anterior usada para reduzir ou fixar CO2 e sintetizar constituintes celulares. Podemos distinguir dois tipos de fotossinteses: Fotossintese oxignica realizada em eucariotas e cianobactrias; Fotossintese anoxignica realizada por todas as outras bactrias.
Reaces de Luz em Eucariotas e Cianobactrias Todos os organismos fotossintticos apresentam pigmentos para a absoro de luz: 1. Clorofilas so os pigmentos mais importantes e so grandes aneis planares compostos por quatro aneis pirrlicos substituidos com um tomo de magnsio coordenado por quatro tomos de azoto centrais. Vrias clorofilas foram identificadas em eucariotas, sendo as duas mais importantes a clorofila a e a clorofila b. estas duas molculas diferem ligeiramente nas suas propriedades estruturais e espectrais. Ambas absorvem luz vermelha e luz vermeha, mas como a absoro na gama do vermelho maior, luz verde transmitida. A longa cauda hidrofbica ligada ao anel de clorofila ajuda a sua ligao a membranas, o local das reaces de luz;
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2. Carotenoides so outros pigmentos e constituem molculas longas, com uma cor amarelada, que possuem um sistema de ligaes duplas extensivamente conjugado. O -caroteno est presente em Prochloron e na maior parte das divises de algas. A fucoxantina encontrada em diatomceas, dinoflagelados e algas castanhas; 3. Ficobiliproteinas consistem numa proteina com uma tetrapirrole ligada e encontrada em algas vermelhas e cianobactrias. A ficoeritrina um pigmento vermelho e a ficocianobilina azul. Os carotenoides e as ficobiliproteinas so muitas vezes designados pigmentos acessrios devido ao seu papel na fotossintese. Estes pigmentos so capazes de absorver energia em comprimentos de onda que a clorofila no consegue e transferir essa energia para a clorofila. Assim, tornam a fotossintese mais eficiente. Para alm disso, estes pigmentos protegem os microorganismos de luz solar intensa, que poderia oxidar e danificar o aparelho fotossinttico na sua ausncia. Os pigmentos fotossintticos encontram-se altamente organizados em estruturas designadas antennas, cuja finalidade criar uma grande rea de superficie para recolher o mximo de fotes possiveis. A energia luminosa capturada numa estrutura destas e transferida de clorofila para clorofila at alcanar um centro de reaco de clorofila especial directamente envolvido no transporte de electres fotossinttico. Existem dois tipos de fotossistemas: 1. Fotossistema I absorve luz de comprimento de onda longo ( 680 nm) e afunila a energia para uma molcula de clorofila a especial designada P700; 2. Fotossistema II absorve luz de comprimentos de onda mais curto ( 680 nm) e transfere energia para uma clorofila especial P680. Quando o fotossistem I transfere energia luminosa para o centro a clorofila P700, esta absorve a energia e fica excitada. O seu electro de elevada energia depois doado a um aceitador especifico. O electro e eventualmente transferido para feredoxina e capaz de viajar em duas direces:
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Fotofosforilao ciclica o electro move-se numa via ciclica atravs de uma srie de carregadores de electres e volta ao P700 oxidado antes de passar pela cadeia transportadora de electres. PMF formado durante este transporte na regio do citocromo b6 e usado para sintetizar ATP; Fotofosforilao aciclica a ferredoxina reduzida reduz NADP+ a NADPH. Como os electres constribuiram para esta reaco, eles no podem ser usados para reduzir o P700 oxidado. Assim, a participao do fotossistema II necessria. O fotossistema II doa electres ao P700 oxidado e gera ATP no processo. O P680 oxidado obtem um electro da oxidao da gua a O 2. Parece que esta via leva produo de uma molcula de ATP e de uma de NADH quando dois electres viajam por ela.
Tal como o transporte de electres mitocondrial, o transporte de electres fotossinttico ocorre numa membrana. As membranas dos cloroplastos contm tanto os fotossistemas como as antennas e o movimento de electres ocorre tal como na hiptese quimiosmtica: Protes movem-se para o interior dos tilacoides durante o transporte de electres fotossinttico e voltam ao estroma quando ATP formado; Acredita-se que as lamela do estroma possuem apenas fotossistemas I e esto envolvidas na fotofosorilao ciclica; Em cianobactrias, as reaces luminosas fotossintticas tambm se encontram nas membranas.
As reaces de escuro requerem trs molculas de ATP e duas de NADPH para reduzir CO2 e usa-lo na sintese de carboidratos: O sistema no ciclico gera uma molcula de NADPH e uma de ATP por par de electres, assim, um total de 8 quanta de energia luminosa (4 por cada fotossistema) necessrio para propulcionar quatro electres da gua para NADP+;
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Como a razo de ATP/NADPH necessrio para a fixao de CO2 3:2, pelo menos mais uma molcula de ATP deve ser fornecida para gerar ATP extra, o que requer a absoro de outros 2-4 quanta; Assim, cerca de 10-12 quanta de energia luminosa so necessrios para reduzir e incorporar uma molcula de CO2 durante a fotossintese.
Reaces de Luz em Bactrias Verdes e Prpura As bactrias verdes e prpura diferem das cianobactrias e dos organismos fotossintticos eucariotas em vrios fundamentos: As bactrias verdes e purpura no usam gua como fonte de electres ou produzem O2 fotossintticamente, isto , so anoxignicas, enaquando as cianobactrias e os organismos eucariotas fazem uso desse dador (so oxignicos); O NADPH no produzido directamente na reaco luminosa da fotossintese das bactrias purpura, mas bactrias verdes so capazes de o fazer; Para sintetizar NADH e NADPH, bactrias verdes e prpura devem usar dadores de electres como hidrognio, sulfeto de hidrognio, enxofre elementar e compostos orgnicos que apresentam potenciais de reduo mas negativos que a gua e so assim mais fceis de oxidar; As bactrias verdes e prpura possuem pigmentos fotossintticos ligeiramente diferentes, bacterioclorofilas, que apresentam absoro mxima a comprimentos de onda elevados na regio infravermelho, o que lhes permite uma melhor adaptao aos seus nichos ecolgicos.
Existem quatro grupos de bactrias fotossintticas verdes e prpura, cada um contendo vrios gneros: Bactrias verdes sulfurosas (Chlorobium); Bactrias verdes no sulfurosas (Chloroflexus); Bactrias prpura sulfurosas (Chromatium); Bactrias prpura no sulfurosas (Rhodospirillum, Rhodopseudomonas).
Eucariotas Clorofila a Presente H2O Oxignico ATP + NADPH CO2 Cianobactrias Clorofila a Presente H2O Oxignico ATP + NADPH CO2 Bactrias verde e prpura Bacterioclorofila II Ausente H2, H2S, S, matria orgnica Anoxignico ATP Orgnico e/ou CO2 144
Propriedade Pigmento fotossinttico Fotossistema II Dadores de electres fotossintticos Padro de produo de O2 Principais produtos de converso energtica Fonte de carbono Joana Maria Soares Pereira
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Muitas diferenas encontradas em bactrias verdes e prpura devem-se falta de fotossistema II, no podendo usar gua como um dador de electres no transporte de electres aciclico. Sem fotossistema II no so capazes de produzir O2 apartir da gua fotossinteticamente e esto restritas fotofosforilao ciclica. De facto, quase todas as bactrias verdes e purpura de enxofre so anaerobio restritos. O transportador de electres nestas quatro bactrias ocorrer do seguinte modo: 1. Quando um centro reactivo de clorofila P870 especial escitado, ele doa um electro bacteriofeofitina; 2. Os electres fluem depois para quinonas e atravs de uma cadeia transportadora de electres de novo para o P870 dirigindo a sintese de ATP.
Bactrias prpura
Bactrias verde
Apesar de ambas as bactrias verdes e prpura noa presentarem dois fotossistemas, as bactrias prpura tm um aparenho fotossinttico semelhante ao fotossistema II, enquanto as bactrias verdes sulfurosas apresentam um sistema semelhante ao fotossistema I. As bactrias verde e prpura enfrentam outro problema porque requerem NADH ou NADPH para a incorporao de CO2. Elas podem proceder sintese de NADH de trs modos: 1. Se estiverem a crescer na presena de hidrognio gasoso, que tem um potencial de reduo mais negativo que o NAD+, o hidrognio pode ser usado directamente para produzir NADH; 2. Como os quimiolitotrficos, muitas bactrias prpura fotossintticas usam a fora motriz de protes para reverter o fluxo de electres numa cadeia transportadora de electres e move-oes de dadores inorgnicos ou orgnicos para NAD+; 3. Bactrias verdes de enxofre como Chlorobium parecem apresentar uma forma simples de fluxo de electres no ciclico para produzor NAD+.
Devido ao uso de compostos inorgnicos como dadores de electres, estas bactrias muitas vezes provocam a deposio de precipitados, como ocorre na oxidao de H2S a S2. Isto tem impacto ambiental importante.
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Principios que Governam a Bios sintese

O metabolimos biossinttico parece seguir certos padres ou moldado por alguns principios gerais: 1. A clula microbiana contem grandes quantidade de proteinas, cidos nucleicos e polissacarideos, todos sendo macromolculas ou molculas muito grandes que so polimeros ou pequenas unidades juntas. A construo de molculas complexas apartir de unidades estruturais mais simples poupa capacidade de armazenamento gentico, material biossinttico e energia; 2. A clula muitas vezes economiza materiais adicionais e energia usando enzimas comuns no catabolismo e no anabolismo; 3. Apesar de muitas enzimas em vias amfiblicas participarem tanto no catabolismo como no anabolismo, alguns passos so catalizados por duas enzimas diferentes. Uma enzima cataliza a reaco na direco catablica e a outra reverte esta converso. Assim, as vias catabolicas e anabolicas nunca so idnticas apesar de partilharem algumas enzimas, o que permite uma regulao independente; 4. Para sintetizar molculas de modo eficiente, as vias anabolicas devem operar irreversivelmente na direco da biossintese. As clulas podem alcanar isto ligando algumas reaces biossintticas quebra de ATP e outros nuclesido trifosfatos. Quando estes dois processo so acoplados, a energia livre disponibilizada dirige a reaco biossinttica; 5. As vias biossintticas de microorganismos eucariticos localizam-se frequentemente em diferentes compartimento calulares relativamente s suas vias catablicas correspondentes, o que facilita as vias a operar simultanea mas independentemente; 6. As vias anablicas e catablicas muitas vezes usam diferentes co-factores. Normalmente, as oxidaes catablicas produzem NADH, um substrato para transporte de electres. Em contraste, quando um redutor necessrio durante a biossintese, o NADPH usado em vez de NADH. Depois das macromoleculas serem construidas apartir de percursores mais simples, elas so montadas em estruturas mais complexas como sistemas supramoleculares e organelos. As macromoleculas normalmente contm a informao necessria para se formarem espontaneamente.
Fixao Fotossinttica de CO 2
Apesar da maior parte dos microorganismos serem capazes de incorporar ou fixar CO 2, pelo menos nas reaces anapleroticas, apenas autotrficos usam CO2 como a sua fonte unica ou principal de carbono: A reduo e incorporao de CO2 requer muita energia;
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Normalmente, os autotroficos obtm energia armazenando energia durante a fotossintese, mas alguma energia deriva da oxidao de dadores de electres inorgnicos reduzidos; A fixao de CO2 autotrfica crucial para a vida na Terra porque fornece a matria orgnica da qual os heterotrficos dependem.
Os microorganismo so capazes de fixar CO2 ou converter esta molcula inorgnica a carbono orgnico e assimila-lo de trs modos: Ciclo de Calvin usado pela maior parte dos autotrficos micorbianos. Encontrado em eucariotas fotossintticos e na maior parte dos procaiotas fotossintticos. Est ausente em Archaea, algumas bactrias anaerbicas obrigatrias e algumas bactrias microaerfilas; Ciclo de Krebs reverso usado por algumas archaea (Thermoproteus, Sulfolobus) e por bactrias como Chlorobium e Desulfobacter; Ciclo do hidroxipropionato encontrado em metanognios, redutores de sulfato e bactrias que so capazes de formar acetato apartir de CO2 durante a fermentao.
Ciclo de Calvin O ciclo de Calvin encontrado en locais diferentes dependedo do tipo de organismo: Estroma dos cloroplastos de autrotoficos microbianos eucariotas; Em carboxissomas nas cianobactrias, algumas bactrias nitrificantes e tiobacilos. Estes cosntituem corpos de incluso que contm a enzima ribulose-1,5-bifosfato carboxilase (Rubisco) e sero locais de fixao de CO2 ou de armazenamento da carboxilase e outras proteinas.
O ciclo pode ser divido em trs fases: 1. Carboxilao; 2. Reduo; 3. Regenerao. Fase de Carboxilao A fixao de CO2 feita pela enzima ribulose-1,5bifosfato (Rubisco), que cataliza a adio de CO2 a ribulose-1,5-bifosfato (RuBP), formando duas molculas de 3-fosfoglicerato (PGA). Fase de Reduo Aps PGA ser formado por carboxilao, reduzido a gliceraldeido-3-fosfato. A reduo, feita por duas enzimas, essencialmente uma reaco inversa de uma poro da via glicolitica, apesar da gliceraldeiso3-fosfato desidrogenase diferir da enzima glicolitica pelo uso de NADP+ em vez de NAD+.
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Fase de Regenerao Esta fase regenera RuBP e produz carboidratos como gliceraldeido-3-fosfato, frutose e glucose. Esta poro do ciclo semelhante via das pentoses fosfato e envolve as reaces das transcetolases e transaldolases: O ciclo completa-se quando a fosforribulocinase reforma RuBP; Para sintetizar frutose-6-fosfato ou glucose-6-fosfato apartir do CO2, o ciclo deve operar seis vezes para formar a hexose desejada e reformar seis molculas de RuBP; A incorporao de uma molcula de CO2 em material orgnico requer trs molculas de ATP e duas molculas de NADPH.
A formao de glucose apartir de CO2 pode ser sumariada pela seguinte equao:
O ATP e o NADPH so fornecidos pelas reaces fotossintticas dependentes de luz ou por oxidao de molculas inorgnicas em quimioatotrficos. Os acares formados no Ciclo de Calvin podem depois ser usados para sintetizar outras molculas essenciais. Ciclo de Krebs Reverso e Ciclo do Hidroxipropionato Outras bactrias fazem uso de dois ciclos distintos para incorporar CO2: Ciclo de Krebs Reverso usado por Thermoproteus e possivelmente Sulfolobus. Pode tambm ser observada em bactrias verdes de enxofre: Ciclo do Hidroxipropionato usado para incorporar CO2 por archaea metanognicas e a maior parte do termfilos extremos. Uma via semelhante tambm est presente em bactrias acetognicas e bactrias autotrficas sulfato-redutoras.
Ciclo de Krebs reverso
Ciclo do hidroxibutirato
Sintese de Acares e Polissacridos

Muitos microorganismos no so capazes de fazer fotossintese e so heterotrficos que devem sintetizar acares apartir de molculas orgnicas reduzidas em vez de CO 2.
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A sintese de glucose apartir de precursores no-carboidratos designada gluconeognese e apesar desta via no ser idntica via glicolitica, elas partilham sete enzimas. Trs vias glicoliticas so irreversiveis na clula: 1. A converso de fosfoenolpiruvato a piruvato; 2. A formao de frutose-1,6-bifosfato apartir de frutose-6-fosfato; 3. A fosforilao da glucose. Estes passos devem ser ultrapassados quando a via opera biossinteticamente! A via sintetiza glucose e frutose. Assim que estes acares so formados, outros acares comuns podem ser manufacturados: Manose surge directamente da frutose por rearranjo simples; Vrios acares so sintetizados enquanto ligados a um nuclesido difosfato, sendo o mais importante o glucose uridina difosfato (UDPG); A poro UDP do UDPG reconhecido por enzimas e transporta a glucose pela clula para a participao em reaces enzimticas; UDP-galactose sintetizada apartir de UDPG atravs de rearranjo de um grupo hidroxilo.
Acares nuclesido difosfato apresentam tambm um papel central na sintese de polissacarideos como amido e glicognio. Mais uma vez, a biossintese no simplesmente um inverso directo do catabolismo: O catabolismos de glicognio e amido ocorre tanto por hidrlise para formar acares livres ou por adio de fosfato a esses polimeros com a produo de glucose-1-fosfato. Nucleosidos difosfato no so usados; Durante a sintese de glicognio e amido em bactrias e algas, glucose adenosina difosfato formada apartir de glucose-1-fosfato e depois doa glucose extermidade crescente das cadeias de amido e glicognio.
Acares nuclesido difosfato tambm participam na sintese de molculas complexas como paredes celulares bacterianas.
Assimilao de Azoto
Como o azoto o principal componente das proteinas, cidos nucelicos, coenzimas e muitos coutros constituintes celulares, a habilidade da clula assimilar azoto inorgnico extremamente importante: Apesar do azoto gasoso ser abundante na atmosfera, poucos microorganismos so capazes de o usar como fonte de azoto; A maior parte dos microorganismos devem incorporar amnia ou nitrato.
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Incorporao de Amnia O azoto da amnia pode ser incorporado em material orgnico facilmente e directamente porque este mais reduzido do que o azoto inorgnico: Alguns microorganismos formam o aminocido alanina numa reaco de aminao redutiva catalizada pela alanina desidrogenase:
Muitas vezes, a principal via de incorporao de amnia a formao de glutamato apartir de cetoglutarato. Muitas bactrias e fungos usam a glutamato desidrogenase, pelo menos quando a concentrao de amnia elevada:
Diferentes espcies variam na sua habilidade de usar NADPH e NADH como agente redutor na sintese de glutamato.
Assim que tanto a alanina ou o glutamato so sintetizados, o grupo -amino formado pode ser transferido para outros esqueletos de carbono por reaces de transaminao para formar diferentes aminocidos. As transaminases possuem a coenzima piridoxal fosfato, que responsvel pela transferncia do grupo amino: Os microorganismos apresentam um numero de transaminases, cada uma catalizando a formao de vrios aminocidos usando o mesmo aminocido como dador de grupos amino; Quando a glutamato desidrogenase funciona em cooperao com transaminases, amnia pode ser incorporada numa variedade de aminocidos.
Uma segunda via de incorporao de amnia envolve duas enzimas que actuam em sequncia, as glutamina sintetase e glutamato sintase: Amnia usada para sintetizar glutamina apartir de glutamato, depois o azoto amida da glutamina transferido para -cetoglutarato para gerar uma nova molcula de glutamato; Como o glutamato actua como um dador amino nas reaces das transaminases, a amnia pode ser usada para sintetizar todos os aminocidos comuns quando a transaminase correcta est presente.
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Tanto ATP como uma fonte de electres, como NADPH ou ferrodoxina reduzida, so necessrios. Esta via est presente em Escherichia coli, Bacillus megaterium e outras bactrias. As duas enzimas actuando em sequncia operam bastante eficientementes a baixas concentraes de amnia, ao contrrio da via da glutamato desidrogenase, e a glutamina sintetase regulada alostericamente e por modificao covalente reversivel. Reduo Assimilatria de Nitrato O azoto no nitrato (NO3-) muito mais oxidado do que na amnia. O nitrato deve ser primeiro reduzido a amnia antes do azoto ser convertido a uma forma orgnica. Esta reduo do nitrato designada reduo assimilatria de nitrato, o que no o mesmo que ocorre durante a respirao anaerbica: O nitrato incorporado em material orgnico e no participa na produo de energia; O processo est amplamente disperso entre bactrias, fungos e algas.
A reduo assimilatria de nitrato ocorre no citoplasma da bactria e pode ser dividida em dois passos: 1. O primeiro passo consiste na reduo do nitrato a nitrito pela nitrato redutase, uma enzima que contem tanto FAD como molibdnio, sendo NADPH a fonte de electres; 2. O nitrito depois reduzido a amnia com uma srie de adies de dois electres catalizada pela nitrito redutase, e possivelmente outra enzima; 3. A amnia depois incorporada em aminocidos pelas vias anteriormente descritas. Fixao de Azoto A reduo de azoto gasoso atmosfrico a amnia designada fixao de azoto. Como os niveis de amnia e nitrato muitas vezes so baixos e apenas alguns procariotas so capazes de fazer fixao de azoto (as clulas eucariotas no so capazes de a fazer), a taxa deste processo limita o crescimento de plantas em muitas situaes. Este processo ocorre em: 1. Bactrias livres (e.g., Azotobacter, Klebsiella, Clostridium e Mathenococcus); 2. Bactrias que vivem simbioticamente em associao com plantas (Rhizobium); 3. Cianobactrias (Nostoc e Anabaena). A reduo de azoto a amnia catalizada pela enzima nitrogenase. Apesar dos intermedirios ligados enzima ainda serem desconhecidos, acredita-se que o azoto reduzido por adies de dois electres: Este um processo bastante exoenergtico mas a reaco tem uma grande energia de activao porque o azoto molecular um gs inerte com uma ligao tripla entre os dois tomos de azoto; A reduo do azoto dispendiosa e necessita de uma grande quantidade de ATP; Pelo menos 8 electres e 18 molculas de ATP, 4 ATP por cada electro, so necessrios.
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Os electres sugem da ferredoxina que foi reduzida por uma variedade de meios: Pela fotossintese em cianobactrias; Por processos respiratrios em fixadores aerobicos de azoto; Fermentaes em bactrias anaerbicas.
A reduo de N2 a NH3 ocorre em trs passos, cada um necessitando de um par de electres. Assim, ocorrem seis transferncias de electres e isto necessitam de um total de 12 ATP por N2 reduzida. O processo geral necessita de facto de 8 electres e 16 ATP porque a nitrogenase tambm reduz protes a H2. O H2 reage com diimina (NH-NH) para formar N2 e H2.
Este ciclo futil produz algum N2 sob condies favorveis e torna a fixao de azoto ainda mais dispendiosa. Assim que o azoto molecular reduzido a amnia, a amnia pode ser incorporada em compostos orgnicos. No fixador de azoto simbitico Rhizobium, parece que a amnia se difunde da bactria e assimilado na clula vegetal vizinha. A via primria de assimilao de am+onia parece ser a sintese de glutamina. Contudo, substncias como alantoina e cido alantico tambm so sintetizadas e usada para transporte de azoto para outras partes da planta.
Sintese de Aminocidos e Integrao do Metabolismo

Os microorganismos variam em respeito ao tipo de fonte de azoto que usam, mas a maior parte capaz de assimilar alguma forma de azoto inorgnico. A sintese de aminocidos tambm necessita da construo de esqueletos de carbono e, muitas vezes, este um processo complexo que envolve vrios passos. Devido necessidade de conservar azoto, carbono e energia, a sintese de aminocidos altamente regulada por mecanismos alostricos e de feedback e relaciona-se com vias anfiblicas: Os esqueletos de aminocidos derivam de acetil-CoA e de intermedirios do ciclo de Krebs, gliclise e via das pentoses fosfato; Para maximizar a eficincia e economia, os precursores dos aminocidos so fornecidos por poucas vias anfiblicas; As sequncias que leva a aminocidos individuais ramificam-se dessas vias centrais; A alanina, o asparatato e o glutamato so construidos por transaminao directa do piruvato, oxaloacetato e -cetoglutarato, respectivamente; A maior parte das vias biossintticas so mais complicadas e intermedirios comuns so usados na sintese de familias de aminocidos relacionados de modo a haver uma maior economia.
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Vias Anaplerticas
Os intermedirios do Ciclo de Krebs so usados na sintese de pirimidinas e de uma variedade de aminocidos. De facto, as funes biossintticas desta via so to essenciais que a maior parte ela deve ocorrer anaerobicamente para fornecer precursores biossintticos, apesar do NADH no ser necessrio para transporte de electres e para a fosforilao oxidativa na ausncia de oxignio.
Existe uma grande exigncia do Ciclo de Krebs para fornecer carbonos para a biossintese, e intermedirios do ciclo sero esgotados se nada for feito para manter os seus niveis. Contudo, os microorganismos apresentam reaces que re-abastecem intermedirios do ciclo de modo que o Ciclo de Krebs pode continuar a funcionar quando a biossintese activa est a ocorrer. Tais reaces so designadas de reaes anaplerticas.
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A maior parte dos microorganismos capaz de substituir intermedirios do ciclo de Krebs por fixao de CO2, na qual CO2 inorgnico convertido a carbono orgnico e assimilado. No entanto, esta via no tem a mesma funo da via de fixao de CO2 usada pelos autotrficos no fornecimento de carbonos: Em autotroficos, a fixao de CO2 fornece a maior parte ou todo o carbono necessrio para o crescimento; As reaces anaplerticas de fixao de CO2 simplesmente substituem intermedirios do ciclo de Krebs e mantm o baano metablico.
Normalmente, o CO2 adicionado a uma molcula aceitadora, ou piruvato ou fosfoenolpiruvato, para formar o intermedirio oxaloacetato: Alguns microorganismos (e.g., Arthrobacter globiformis) usam a piruvato carboxilase neste papel. Esta enzima necessita de biotina como co-factor e usa energia do ATP para ligar CO2 e piruvato: Outros microorganismos, como as bactrias Escherichia coli e Salmonella typhimurium, apresentam a enzima fosfoenol carboxilase:
Algumas bactrias, algas, fungos e protozorios so capazes de cresceer com acetato como unica fonte de carbono usando-o para sintetizar intermedirios do Ciclo de Krebs no Ciclo do Glioxilato. Este ciclo possivel devido aco de duas enzimas, a isocitrato liase a a malato sintase, que catalizam as seguintes reaces:
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O ciclo do glioxilato de facto um Ciclo de Krebs modificado: As duas descarboxilaes da ltima via (os passos da isocitrato desidrogenase e da cetoglutarato desidrogenase) so ultrapassados, tornando possivel a converso de acetil-CoA para formar oxaloacetato sem perda do carbono da acetil-CoA como CO2; Deste modo, o acetato e qualquer molcula que capaz de originar acetato podem contribuir com carbono para o ciclo e suportat a vida microbiana.
Este ciclo do glioxilato pode constituir um modo de virulncia de vrias bactrias, pois assim estas so capazes de sobreviver intracelularmente com cidos gordos como unica fonte de carbonos.
Ciclos de Nutrientes no Ambiente

Os microorganismos, no decurso do seu crescimento e metabolismos, interagem uns cons os outros na ciclizao de nutrientes, incluindo: Carbono, Enxofre, Azoto, Fsforo; Ferro; Mangans.
Estes ciclos de nutrientes, designados ciclos biogeoquimicos quando aplicados ao ambiente,envolvem tanto processos biolgicos como quimicos. Os nutrientes so transformados e transferidos ciclicamente, normalmente por reaces de oxidao-reduo que so capazes de alterar as caracteristicas quimicas e fisicas do nutriente:
Significantes componentes gasosos ocorrem nos ciclos de carbono e azoto e, a uma menor extenso, nos ciclos de enxofre; Assim, os microorganismos de ambientes de solo, aquticos ou marinhos so capazes de fixar formar gasosas de compostos de carbono e azoto; Em ciclos sedimentrios, como para o ferro, no so necessrios componentes gasosos.
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Ciclo do Carbono O carbono pode estar presente nas formas reduzidas, como metano (CH4) ou matria orgnica, e nas formas mais oxidadas, como monxido de carbono (CO) e dixido de carbono (CO 2).
Redutores (e.g., hidrognio, que um forte redutor) e oxidantes (e.g., O2) influenciam o curso das reaces biolgicas e quimicas que envolvem o carbono: Hidrognio pode ser produzido durante a degradao de matria orgnica, especialmente sob condies anaerbicas quando ocorre a fermentao; Se hidrognio e metano forem produzidos, estes so capazes de se mover das reas anaerbicas para as reas aerbicas; Isto cria uma oportunidade dos oxidantes aerobicos de hidrognio e metano funcionarem; A fixao de carbono ocorre atravs da actividade de cianobactrias e algas verdes, bactrias fotossintticas (e.g., Chromatium e Chlorobium) e quimilitoautotrficos aerobicos.
A degradao de matria orgnica, quando formada, influenciada por uma srie de factores: 1. Nutrientes presentes no ambiente; 2. Condies abiticas (pH, potencial redox, O2, condies osmticas); 3. Comunidade microbiana presente. Apenas a biomassa microbiana contem todos os nutrientes necessrios para o crescimento microbiano, e estes contm grandes quantidades de azoto. Se estes substratos so usados para o crescimento, o excesso de azoto e outros minerais que no so usado sero libertados no ambiente, no processo de mineralizao. Este processo pelo qual a matria orgnica decomposta para lobertar comportos inorgnicos mais simples (e.g., CO2, NH4+, CH4, H2). Outros substratos contm apenas carbono, hidrognio e oxignio e se os organismos crescerem usando estes substratos, eles tero de adquirir o resto dos nutrientes do ambiente. As relaes de oxignio para o uso destes substratos tambm so importantes porque maior parte deles pode ser degradado facilmente na ausncia ou presena de oxignio, dependedo do tipo de metabolismo que os microorganismos so capazes de efectuar. Para alm disso, a presena ou ausncia
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de oxignio tambm afecta os produtos finais que se acumulam quando substratos orgnicos so processados: Sob condies aerbicas, produtos oxidados como nitrato, sulfato e dixido de carbono resultaro da degradao microbiana de matria orgnica complexa; Sob condies anaerbicas, produtos reduzidos tendem a acumular-se, incluindo io amnia, sulfeto e metano.
Estas formas oxidadas e reduzidas, se ficarem retidas nos ambientes aerbicos ou anaerbicos onde foram formadas, iro apenas servir como nutrientes. Se ocorrer mistura, as espcies oxidadas iro mover-se para uma zona mais reduzida ou a espcies reduzidas iro mover-se para uma zona mais oxidada. Sob tais circunstncias, possibilidades energticas so criadas, levando a mais ciclizao de nutrientes enquanto estes oxidantes e redutores so explorados pela comunidade microbiana.
Ciclo do Enxofre Os microorganismos contribuem altamente para o ciclo do enxofre: 1. Microorganismos fotossintticos transformam enxofre usando sulfeto como uma fonte de electres, permitindo que Thiobacillus e qumiolitoautotrficos funcionem; 2. Quando sulfato se difunde para habitats reduzidos, ele fornece uma oportunidade para diferentes grupos de microorganismos fazerem reduo do sulfato: Reduo dissimilatria, ocorre quando um microorganismo (como Desulfovibrio, Desulfuromonas, archaea termofilicas e cianobactrias em sedimentos hipersalinos) usa sulfato como um oxidante quando um redutor orgnico est disponivel;
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Reduo assimilatria, ocorre quando existe reduo do sulfato para uso na sintese de aminocidos e proteinas. 3. Sulfeto outro intermedirio critico que pode ser reduzido a sulfito por uma variedade de microorganismos, incluindo Alteromonas e Clostridium, tal como Desulfovibrio e Desulfotomaculum.
Em adio aos oxidantes de enxofre fotolitotrficos bastante importantes como Chromatium e Chlorobium, que actuam sob condies anaerbicas restritas, um grande e variado grupo de bactrias fazem fotossintese aerbica anoxignica. Estas bactrias usam bacterioclorofila a e carotenides e so encontradas em ambientes marinhos e de gua fresca, e incluem Erythromonas, Roseococcus, Porphyrobacter e Roseobacter. Compostos secundrios no ciclo do enxofre tm papeis importantes em biologia, pois o dimetilsulfoniopropionato (DMSP), que usado por bacterioplancton como fonte de enxofre para a sintese proteica e transformado em dimetilsulfito (DMS), uma forma de enxofre voltil que capaz de afectar processos atmosfricos. Para alm disso, quando as condies de pH e redoz so favorveis, vrias transformaes chave no ciclo do enxofre tambm ocorrem como resultados de reaces quimicas na ausncia de microorganismos.
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Ciclo do Azoto Existem vrios aspectos importantes no ciclo de azoto bsico: O processo de nitrificao; O processo de desnitrificao; O processo de fixao de azoto.
Os heterotrficos so capazes de efectuar nitrificao e alguns destes heterotrficos (planctomycetes) combinam a nitrificao com a desnitrificao anaerbia, oxidando assim o io amnia a N 2O e N2 na ausncia de oxignio. A ocorrncia de oxidao de io amnia anxica (anammox) significa que a nitrificao no apenas um processo anaerbico. Isto fornecer um meio pelo qual o azoto pode ser removido dos efluentes de plantas para diminui o fluxo de azoto em ecossistemas marinhos e de gua fresca sensiveis.
A nitrificao o processo de oxidao de io amnia (NH4+) e subsequente oxidao de nitrito (NO2-) a nitrato (NO3-): Bactrias do gnero Nitrosomonas e Nitrosococcus, por exemplo, tm um papel importante no primeiro passo e Nitrobacter e bactrias qumiolitoautotrficas relacionadas efectuam o segundo passo; Nitrosomonas eutropha parece oxidar io amnia anaerobicamente a nitrito e xido nitrico (NO) usando dixido de azoto (NO2) como um oxidante numa reaces de desnitrificao relacionada; A nitrificao heterotrfica por bactrias e fungos contribui significativamente para estes processo em ambientes mais acidicos.
O processo de desnitrificao necessita de um grupo diferente de condies ambientais: Este processo dissimilatrio, no qual o nitrato usado como um oxidante na respirao anaerbica, normalmente envolve heterotrficos como Pseudomonas denitrificans; Os principais produtos incluem azoto gasoso (N2) e xido nitroso (N2O), apesar de nitrito (NO2) tambm poder ser acumulado; O nitrito de importncia ambiental pois capaz de contribuir para a formao de nitrosaminas cancerigenas;
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O nitrato pode ser transformado a amnia na reduo dissimilatria por uma variedade de bactrias, incluindo Geobacter metallireducens, Desulfovibrio spp, Clostridium.
A assimilao de azoto ocorre quando azoto inorgnico usado como um nutriente e incorporado em nova biomassa microbiana: O io amnia, como j est reduzido, pode ser incorporado directamente sem gastos energticos: Contudo, quando o nitrato assimilado, este deve ser reduzido com um gasto de energia elevado: Neste processo, o nitrito pode acumular-se como um intermedirio transiente.
A fixao de azoto pode ser realizada tanto por procariotas aerobicos ou anaerbicos mas nunca por eucariotas: Sob condies aerbicas, uma larga gama de gneros microbianos livres (Azotobacter, Azospirillum) contribuem para este processo; Sob condies anaerbicas, os fixadores de azoto livres mais importantes so membros do gnero Clostridium; A fixao de azoto por cianobactrias como Anabaena e Oscillatoria capaz de levar ao enriquecimento de ambientes aquticos com azoto; A fixao de azoto pode ocorrer atravs das actividades de bactrias que desenvolvem associaes simbiticas com plantas.
O processo de fixao de azoto envolve uma sequncia de passos de reduo que requerem gastos energticos elevados. A amnia, o produto da reduo do azoto, imediatamente incorporada em matria orgnica como uma amina. Os processos reductivos sp extremamente sensiveis ao oxignio e devem ocorrer sob condies anaerbicas mesmo em microorganismos aerbicos.
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GENTICA E BIOLOGIA MOLECULAR MICROBIANA

GENES: EXPRESSO E REGULAO
Niveis de Regulao Metablica

O metabolismo pode ser regulado a vrios niveis: Regulao ao nivel da proteina; Regulao ao nivel da transcrio.
A regulao ao nivel da proteina consiste na modulao da sua actividade conforme as necessidades da clula e pode ser feita de vrios modos: Alterao da conformao inibidores podem ligar as enzimas e alterar a sua conformao. Esta alterao pode diminuir ou aumentar a actividade enzimtica e regular assim a via metablica; Alterao quimica o exemplo mais importante consiste na fosforilao das enzimas. Esta fosforilao pode activar ou inactivar a enzima, sendo um mecanismo de regulao. bastante mais comum em eucariotas.
No entanto, estas vias de regulao necessitam que as proteinas sejam transcritas, processadas e alteradas, o que requer um gasto energtico elevado. Deste modo, como a regulao da transcrio impede estes gastos energticos, este segundo mecanismo de regulao de grande importncia em microbiologia.
Transcrio do DNA
A sintese de RNAsob direco do DNA designada transcrio. O produto de RNA apresenta uma complementariedade sequencial do DNA molde que dirigiu a sintese. A transcrio gera trs tipos de RNA: RNA mensageiro (mRNA) carrega a mensagem para a sintese proteica; RNA de transferncia (tRNA) carrega aminocidos durante a sintese proteica; RNA ribossomal (rRNA) so componentes dos ribossomas.
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Transcrio em Procariotas O mRNA procariota uma molcula de RNA de cadeia simples de comprimento varivel que contem direces para a sintese de um de muitos polipptidos. No entanto, as molculas de mRNA tambm apresentam sequncias que no codificam polipeptideos:
Existe uma sequncia leader no-standard de 25-150 bases na terminao 5 que precede o codo de iniciao; mRNAs polignicos (os que dirigem a sintese de mais de um polipptidos) apresentam regies spacer que separam segmentos que codificam polipeptidos individuais. Os polipptidos de mRNAS polignicos funcionam em conjunto de algum modo (e.g., como parte da mesma via metablica); na terminao 3, aseguir ao codo de terminao, existe um trailer que no traduzido.
O RNA mensageiro sintetizado sob a direaco do DNA pela RNA polimerase, existindo uma quantidade enorme de enzimas deste tipo numa clula bacteriana, o que permite estejam vrias enzimas activas ao mesmo tempo: A regio qual a RNA polimerase liga para que a transcrio ocorra designa-se promotor; Existem tambm sinais stop para marcar o fim de um gene ou de uma sequncia de genes. Estes terminadores so reconhecidos pela RNA polimerase e a transcrio terminada.
Transcrio em Eucariotas Os processos transcripcionais em microorganismos eucarioticos (e outras clulas eucariotas) diferem em vrios modos da transcrio procariota: Existem trs RNA polimerases principais, no apenas uma como nos procariotas, sendo a do tipo II a usada na sintese de mRNA; Ao contrrio da polimerase bacteriana, a polimerase do tipo II requer factores de transcrio extra para reconhecer os seus promotores, ligando ligeiramente ao inicio da sequncia codificante; Os promotores eucariotas diferem dos promotores bacterianos apresentando uma combinao de vrios elementos; Uma variedade de factores de transcrio, factores especificos de promotores, e elementos de promotores so encontrados em diferentes clulas eucariotas; Cada gene eucariota regulado diferentemente.
O mRNA eucariota surge de modificao post-transcripcional de precursores de RNA maiores: O RNA precursor clivado por uma endonuclease para eliminar sequncias no codificantes que se encontram entre sequncias codificantes; Os mRNA eucariotas apresentam sequncias cap a 5, ao contrrio do procariota;
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Ambos os tipos de clulas podem ter mRNA como 3 poli-A, mas os procariotas apresentam estas sequncias a uma muito menor extenso; Os mRNA eucariotas normalmente so monognicos em contraste com os procariotas. Este facto permite a regulao individual de cada proteina, no sedo uma via completamente afectada quando existe regulao.
Muitos genes eucariotas diferem dos genes procariotas sendo interrompidos, o que leva a outro tipo de processamento post-transcripcional: Exes so sequncias expressadas, regies que codificam para RNA que terminam no produto de RNA final (e.g., mRNA); Intres separam os exes, so sequncias intrusas e que codificam para RNA que no surge no produto final.
O transcripto de RNA inicial apresenta as sequncias intrnicas do gene interrompido. Excepto as cianobactrias e as Archaea, os genes interrompidos no so encontrados em procariotas. Os intres so removidos do transcripto de RNA inicial por um processo designado de RNA splicing, sendo as extremidades dos intres marcadas para remoo. Este processamento feito em complexos expecificos mas parece consistir numa reaco auto-catalitica em alguns casos.
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Regulao da Sintese de mRNA

O controlo do metabolismo pela regulao da actividade enzimtica um mecanismo que actua rapidamente para ajustar a actividade metablica em alguns momentos. Por outro lado, os microorganismos so tambm capazes de controlar a expresso do seu genoma, em grandes intervalos de tempo: A regulao da expresso de genes serve para conservar energia e materia-prima, para manter o balano entre as quantidades de vrias proteinas celulares e para permitir uma adaptao a longo termo a um ambiente em alterao; Assim, o controlo da expresso gnica complementa a regulao da actividade enzimtica.
Em bactrias, a organizao do genoma diferente da organizao gentica eucariotica. Os genes das bcatrias que pertencem ou esto relacionados com o mesmo processo bioquimico esto agrupados, ao contrrio do que acontece nos eucariotas em que estes esto dispersos no genoma. A organizao gentica dos procariotas permite que os genes envolvidos no processo sejam regulados de uma maneira coordenada. Deste modo, em bactrias podemos encontrar a estrutura tipica de: Opero serie de genes estruturais envolvidos numa determinada via metablica e cujas expresses so reguladas em conjunto pela interaco de uma proteina reguladora com o perador, o prprio operador e o promotor, isto , o opero equivale ao genes estruturais em conjunto com o operador e o promotor.
Induo e Represso Existem dois tipos de operes: 1. Operes indutiveis (e.g., da lactose) quando a expresso gentica activada numa bactria atravs da adio de uma substncia ao meio, os genes so ditos indutiveis. A substncia reguladora que provoca a induo do gene designada indutor. Assim, ao ser adicionado ao meio, o indutor provoca a sintese de enzimas especificas ou de proteinas no enzimticas. O indutor tambm um exemplo de uma classe de pequenas moleculas efectoras que esto envolvidas no controlo da expresso de muitos genes que so regulados. A transcrio de um gene indutivel ocorre apenas em resposta a um acontecimento particular de regulao que ocorra numa sequncia especifica de DNA, prxima da sequncia que codifica a proteina, desginada local de controlo. Quando o acontecimento regulador ocorre, a RNA polimerase ligaJoana Maria Soares Pereira 164
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se ao promotor e a transcrio iniciada. O gene activado, o mRNA sintetizado e a proteina codificada pelo gene produzida. As enzimas indutiveis s so necessrias quando o seu substrato est disponivel e no esto presentes na ausncia de indutor; 2. Operes repressiveis (e.g., do triptofano) os genes que codificam enzimas envolvidas na biossintese de aminocidos e de outras substncias respondem quase sempre de forma difernete dos genes que codificam enzimas catablicas. Um aminocido presente pode inibir a formao das enzimas responsveis pela sua biossintese. Este facto faz sentido porque os microorganismos so necessitam da biossintese de enzimas para uma substncia particular se esta j est disponivel. As enzimas cuja quantidade reduzida pela presena do produto so enzimas repressiveis e os metabolitos que causam a diminuio destas enzimas so designado repressores. As enzimas repressiveis so muitas vezes necessrias para a sintese e esto sempre presentes, a menos que o produto final do seu caminho esteja disponivel. Opero Indutivel Opero Repressivel
Apesar de variaes nos niveis enzimticos poderem ser devidos a alteraes nas taxas de degradao enzimtica, a maior parte das enzimas so relativamente estveis em bactrias em crescimento. A induo e a represso resulta principalmente de alteraes dos niveis de transcrio. Controlo Negativo e Opero da Lactose Um factor de controlo pode tanto inibir como activar a transcrio. Apesar das respostas na presena de metabolitos ser diferente, tanto a induo como a represso so formas de controlo negativo: A sintese de mRNA ocorre mais rapidamente na ausncia de factor controlador activo!
A taxa de sintese de mRNA controlada por proteinas repressoras especiais que so sintetizadas sob a direco de genes regulatrios. O repressor liga-se a uma local especifico de DNA designado operador. Os repressores devem existir tanto nas formas activa como inactiva porque a transcrio nunca ocorreria se eeste estivesse sempre na forma activa:
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Num sistema indutivel, o gene regulador dirige a sintese de um repressor activo. O indutor estimula a transcrio por ligao reversivel ao repressor, inactivando o repressor; Num sistema repressivel, ocorre exactamente o mesmo mas ao contrrio. A proteina repressora encontra-se inicialmente no estado inactivo e activada quando o co-repressor de liga a ela.
A sintese de vrias proteinas normalmente regulada por um unico repressor, devido organizao dos genes bacterianos em operes. Isto bastante vantajoso pois permite o controlo coordenado da sintese de vrias enzimas metabolicamente relacionadas. Opero da Lactose O sistema de controlo negativo mais bem estudado o opero da lactose de E. coli:
O opero da lactose, ou opero lac, apresenta trs genes estruturais e controlado pelo repressor lac: Um gene codifica para a -galactosidades; Um segundo gene dirige a sintese de -galactosideo permease, a enzima responsvel pelo uptake de lactose; Um terceiro gene que codifica a enzima -galactosidase transacetilase, cuja funo ainda no bem conhecida.
A presena dos dois primeiros genes no mesmo opero assegura qua as taxas de uptake de lactose e quebra desta variam em conjunto. O opero lac tem trs operadores e a proteina repressora encontra o operador num processo em dois passos: 1. O repressor liga-se a uma molcula de DNA; 2. Depois desliza rapidamente ao longo da unidade de DNA at encontrar um operador e parar. Uma poro do repressor encaixa numa fenda principal do local do operador no DNA e a forma da proteina repressora alterada para uma ligao especifica ao DNA. O promotor encontra-se proximo do operador e o repressor liga-se simultaneamente a mais de um operador e dobra o segmento de DNA que contem o promotor. O promotor dobrado no permite uma ligao apropriada da RNA polimerase e/ou impede que a polimerase proceda transcrio. A ligao do indutor, neste caso a lactose, activa atranscrio por inibio do repressor e o metabolismo da lactose aumenta.
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Controlo Positivo Alguns operes funcionam apenas na presena de um factor controlador, isto , encontram-se sob controlo positivo.
O opero da lactose encontra-se tambm sob controlo positivo para alm do controlo negativo, ou seja, duplamente controlado! A funo do opero lac regulada pela proteina catablica activadora (CAP) ou proteina receptora de AMP ciclico e pelo cAMP, tal como pela proteina repressora lac: O promotor lac contem um local CAP ao qual a CAP se deve ligar antes da RNA polimerase poder ligar ao promotor e comear a transcrio; A CAP capaz de ligar ao local CAP apenas quando complexada com cAMP; Aps a ligao, a CAP dobra o DNA cerca de 90 em duas voltas helicais e interaces da CAP com a RNA polimerase estimulam a transcrio.
Assim, este mecanismo de controlo positivo permite que o opero da lactose apenas esteja activo quando os niveis de lactose e cAMP esto elevados, ou seja, quando no existe glucose no meio. Isto indica clula que outras fontes de energia no esto presentes e que a clula tem de usar lactose como fonte de energia. Quando os niveis de glucose so elevados, a CAP est inactiva pois no h cAMP e a clula fica a saber que no necessrio usar a lactose porque existe glucose como fonte de energia.
Atenuao
As bactrias so capazes de regular a transcrio de outros modos, como pode ser observado no opero do triptofano de E. coli: O opero do triptofano contem genes estruturais para cinco enzimas na via biossinttica do triptofano; O opero est sob controlo de uma proteina repressora codificada pelo gene trpR e excesso de triptofano inibe a transcrio do opero destes genes actuando como um co-repressor e activando a proteina repressora;
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Apesar do opero ser regulado principalmente pro represso, a continuao da transcrio tambm regulada.
Existem dois pontos de deciso envolvidos no controlo da transcrio, a iniciao da transcrio e a continuao da transcrio.
A regio leader encontra-se entre o operador e o primeiro gene estrutural no opero e responsvel pelo controlo da continuao da transcrio aps a RNA polimerase se ligar ao promotor: A regio leader contem um atenuador e uma sequncia que codifica para a sintese do pptido leader; Existem quatro sequncias em toda a regio leader e estas apresentam complementariedade de bases entre si e so capazes de emparelhar umas com as outras para formar hairpins; Na ausncia de um ribossoma, segmentos de mRNA 1 e 2 emparelham para formar um hairpin enquanto os segmentos 3 e 4 geram um segundo hairpin. O hairpin formado por 3 e 4 pra a transcrio; Se o segmento 1 no formar pares de bases com o segmento 2, o segmento 2 est livre para se associar com o segmento 3 e assim, no se forma hairpin entre 3 e 4; A sequncia que codifica o pptido leader contem dois codes adjacentes que codificam para o aminocido triptofano. Assim, o pptido completo s sintetizado quando existe um fornecimento adequado de triptofano.
Isto mais facilmente compreendido se olharmos para o comportamento do ribossoma ao longo da traduo do mRNA (o que ocorre ao mesmo tempo da transcrio): Quando temos baixos niveis de triptofano, o ribossoma fica retido na sequncia do mRNA que codifica para os dois triptofanos. Assim, o segmento 1 no est disponivel e o segmento 2 emparelha com o 3, deixando o 4 livre e promovendo a transcrio pela RNA polimerase dos genes envolvidos na biossintese deste aminocido; Quando temos altos niveis de triptofano, o ribossoma no fica retido e h emparelhamento de 1 com 2 e 3 com 4, o que inibe a continuao da transcrio.
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A utilidade deste mecanismo de atenuao obvia, pois se a bactria deficiente num aminocido para alm do triptofano, a sintese proteica ir abrandar e o triptafonao acumular, sendo a sintese de triptofano inactivada. Quando a proteica comea sintetizar proteinas activamente, o triptofano ir ver os seus niveis diminuidos e a atenuao reduzida, aumentando a sintese de aminocido. Ao actuarem em conjunto, a represso e atenuao so capazes de coordenar a taxa de sintese de enzimas biossintticas do aminocido com a disponibilidade de produtos finais de aminocidos e com a taxa geral de sintese proteica. A atenuao parece ser importante tambm na regulao de vrias vias biossintticas de aminocidos. Pelo menos outros cinco operes apresentam sequncias de pptido leader semelhantes ao sistema do triptofano em organizao.
GENTICA BACTERIANA
Organizao do DNA nas Clulas

Apesar do DNA existir como um dupla hlice tanto em procariotas como em eucariotas, a sua organizao difere nos dois tipos de clulas: Em procariotas, o DNA est organizado na forma de um circulo fechado em quase todos os organismos (o cromossoma de Borrelis e uma molcula de DNA linear). Esta dupla hlice circular torcida em DNA super-enrolado e associa-se com proteinas bsicas mas no com histonas. Estas proteinas semelhantes a histonas perecem ajudar a organizar o DNA bacteriano numa estrutura super-enrolada; Em eucariotas, o DNA muito mais organizadoe est asociado com uma variedade de histonas. Estas pequenas proteinas bsicas ricas em aminocidos lisina e/ou arginina podem ser de cinco tipos. O DNA enrola-se na superficie de estruturas construidas pelas histonas formando um nucelossoma. Estas estruturas so capazes de se condensar e quando a condensao mxima observamos os cromossomas.
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Replicao do DNA e Mecanismos de Alterao Gentica

A replicao do DNA um processo complexo e extraordinariamente complexo, do qual a vida depende: As duas cadeias da dupla hlice desligam-se uma da outra e separam-se; Nucletidos livres alinham-se ao longo de duas cadeias parentais atravs de complementariedade de bases; Quando estes nucletidos so ligados por uma ou mais enzimas, resultam duas rplicas, cada uma contendo uma cadeia parental e uma cadeia recem formada.
Os padres de replicao so de algum modo diferentes em procariotas e eucariotas: Quando o cromossoma circular de E. coli copiado, a replicao comea num unico ponto, a origem. A sintese ocorre no grafo de replicao, o local no qual a hlice de DNA desligada e as cadeias individuais so replicadas. Dois garfos de replicao movem-se apartir da orgem at copiarem todo o replico, a poro do genoma que contem uma origem e replicada como uma unidade. Quando os garfos de replicao se movem volta do circulo, uma estrutura semelhante letra teta () formada. Por fim, como o cromossoma bacteriano um unico replico, os garfos encontram-se no outro lado e dois cromossomas separados so libertados; Durante a conjugao do cromossoma de E. coli e a reproduo de virus, ocorre o mecanismo rolling-circle. Um cadeia quebrada e a extremidade 3 extendida por enzimas de replicao. Enquanto a extremidade 3 alongada, o DNA circular rola e a extremidade 5 da cadeia forma uma longa cauda. A cauda de cadeia simples dever ser convertida forma de cadeia dupla por sintese da cadeia complementar. Isto bastante util em virus porque permite uma produo rpida e continua de muitas cpias do genoma apartir de um unico evento de iniciao; O DNA eucariota linear e mauito mais longo que o procariota. Assim, muitos garfos de replicao devem copiar o DNA eucariota simultaneamente de modo que a molcula podem ser duplicada num periodo de tempo relativamente curto. De facto, existem vrios replices ao longo do genoma eucariota e os garfos de replicao movem-se para alm destes pontos encontrando eventualmente garfos que estavam a copiar DNA adjacente.
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Replicao em eucariotas
Replicao em virs
Replicao em E. coli
A alterao gentica das bactrias bastante importante porque pode fornecer um mecanismo principal na adquirio de resistncias. Isto pode ocorrer de dois modos distintos: 1. Mutao mutaes pontuais, deleces, inseres, alteram a informao contida no gene mutado, alterando o modo como este actua. Estas mutaes podero ser positivas se conferirem algo novo e especial clula afectada; 2. Transferncia gentica horizontal as bactrias sofrem bastante este tipo de alterao, recolhendo novo material gentico por transformao, transduo e conjugao. Este mecanismo fornece material gentico que no existia na estirpe afectada, conferindo uma vantagem selectiva da clula afectada.
Conjugao Bacteriana
A evidncia inicial de conjugao bacteriana, a transferncia de informao gentica por contacto celular directo,surgiu de uma experincia simples: Fez-se uma mistura de duas estripes auxotrficas, incubou-se a cultura durante vrias horas num meio nutritivo e depois esta foi plaqeuada num meio minimo; Para reduzir a hiptese delas resultarem de simples reverso, foram usadas estirpes auxotrficas duplas e triplas assumindo que este numero de reverses no irio ocorrer simultaneamente;
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Por exemplo, uma estirpe necessitava de biotina, fenilalanina e cistena para crescer e outra necessitava de treonina, leucina e tiamina; Colnias prototrficas recombinantes surgiram no meio minimo aps incubao.
Os cromossomas de dois auxotrficos foram capazes de se associar e sofrer recombinao. Esta experincia no provou contacto entre bactrias, apenas provou que existe troca de material gentico entre diferentes estirpes de modo ser fornecida a uma estripe diferente capacidades que ela no teria. A evidncia de contacto surgiu mais tarde com a seguinte experincia: Fou contruido um tubo em U que consistia em duas peas de tubo de vidro curvadas fundidas na base para formar uma forma em U com um filtro de vidro entre as duas metades; O filtro permite a passagem de meio mas no de bactrias; O tubo foi cheio com meio nutritivo e cada lado inoculado com uma diferente estirpe auxotrfica de E. coli; Durante a incubao, o meio foi bombeado para trs e para frente atravs do filtro para assegurar a troca de meio entre as duas metades; Aps 4h de incubao, as bactrias foram plaqueadas em meio minimo; Observou-se que no havia transferncia de material gentico.
necessrio contacto directo entre as bactrias para que a recombinao ocorra! Conjugao F + x F A transferncia de genes polar, isto , existe um dador definido (F+) e um receptor definido (F-), e a transferncia de genes no reciproca. Na transferncia F+ x F-, a progenia apenas raramente alterada em casos de auxotrofia (isto , os seus genes no so alterados), mas as estirpes F- tornam-se frequentemente F+. Isto explicado em termos do factor F: Estirpes F+ contm uma factor F extracromossomal que carrega genes para a formao de pili e transferncia de plasmideos; Durante a transferncia F+ x F- ou conjugao, o factor F replica pelo mecanismo de rolling-circle e uma cpia move-se para o receptor; A cadeia inteira copiada para produzir DNA de cadeia dupla.
Como genes do cromossoma bacteriano so raramente transferidos com o factor F independente, a frequncia de recombinao baixa. Ainda no se sabe completamente como que ocorre o
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movimento do plasmideo, o pilus liga o dador e o receptor e a transferencia de DNA pode ocorrer por esse canal ou por uma ponte de conjugao formada aps o contacto. Apesar de muita da investigao em plasmideos e conjugao ter sido feita com E. coli e outras bactrias gram-negativas, plasmideos auto-transmissivos esto presentes em bactrias gram-positivas de gneros como Bacillus, Streptoccus, Enterococcus, Staphylococcus e Streptomyces. Muito menos sabido sobre estes sistemas mas parece que alguns genes de transferncia esto envolvidos, possivelmente porque no parece ser necessrio um pilus. Conjugao Hfr Como certas estirpes dadoras transferem genes bacterianos com grande eficincia e no alteram normalmente bactrias receptoras em bactrias dadoras, existe um segundo tipo de conjugao: O factor F um epissoma e capaz de se integrar no cromossoma bacteriana em vrias localizaes diferentes por recombinao entre sequncias de insero homlogas presentes tanto no plasmideo como no cromossoma do hospedeiro; Quando integrado, o opero tra do plasmideo F continua funcional, sendo capaz de dirigir a sintese de pili, fazer replicao em rolling-circle e transferir paterial gentico para uma clula receptora F-.
Um dador deste tipo designado estirpe Hfr (high frequency recombination) porque exibe uma grande eficincia para transferncia de genes cromossomais em comparao com clulas F+.
A transferncia de DNA comea quando o factor F integrado clivado no seu local de origem de transferncia. Enquanto replicado, o cromossoma move-se atravs do pilus ou da ponte de conjugao que liga os dador e o receptor. Como apenas parte do factor F transferido ao inicio (devido ao facto da quebra inicial ser dentro do plasmideo F), o receptor F- no se torna F+ a no ser que o cromossoma inteiro seja transferido e isto normalmente no ocorre porque leva bastante tempo e a ligao quebra antes de ser possivel tal transferncia.
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Quando uma estirpe Hfr participa na conjugao, genes bacterianos so frequentemente transferidos para o receptor e a transferncia de genes pode tanto ser na direco dos ponteiros do relgio ou na direco inversa dependendo da orientao do factor F integrado. Aps o cromossoma dador replicado entrar na clula receptora, ele pode ser degradado ou incorporado no genoma F - por recombinao. Conjugao F Como o plasmideo F um epissoma, ele pode deixar o cromossoma bacteriano. Por vezes, durante este processo, o plasmideo comete um erro de exciso e recolhe uma poro do material cromossmico para formar um plasmideo F: No ususal observar a incluso de um ou mais genes em plasmideos F excisados; A clula F retem todos os seus genes, apesar de alguns deles estarem no plasmideo, e ainda capaz de transferir material gentico com um receptor F-.
A conjugao F x F- virtualmente idntica conjugao F+ x F-, sendo o plasmideo transferido mas genes no cromossoma bacteriano no: Os genes bacterianos no plasmideo F so transferidos com ele e no necessitam de ser incorporados no cromossoma do receptor para serem expressos; O receptor torna-se F e constitui um merozigoto parcialmente diploie visto que apresenta dois grupos dos genes carregados pelo plasmideo; Deste modo, genes bacterianos especificos espalham-se rapidamente numa populao bacteriana.
Tipos de Plasmideos Para alm do factor F, que tem como principal caracteristica a atribuio de capacidade de formao de pilus e conjugao, existem outros plasmideos, que quando transferidos, conferem outro tipos de fentipos:
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Palsmideo R confere resistncia a vrios compostos; Plasmideo Col importante na produo de colicina, que consiste num composto txico para e produzido por E. coli; Plasmideos de virulncia envolvidos na produo de endotoxinas, antignios de aderncia, siderferos, etc.; Plasmideos metablicos envolvidos na metabolizao de determinados substratos metablicos.
Transformao
O segundo modo pelo quando o DNA capaz de se mover entre bactrias atravs da transformao, que consiste no uptake por uma clula de uma molculas de DNA livre ou de um pequeno fragmento do DNA apartir do meio e na incorporao desta molcula no cromossoma receptor de uma forma herditria. Este mecanismo foi descoberto em 1928 por Fred Griffith sendo que os seus primeiros trabalhos sobre a transferncia da virulncia no patognio Streptococcus pneumoniae foram essenciais na demostrao do DNA como o material gentico: Griffith descobriu que se bactrias virulentas fossem levadas ebolio e depois injectadas num ratinho, o ratinho no era afectado e nenhumas bactrias poderiam ser recolhidas do animal; Quando injectava uma combinao de bactrias virulentas mortas e uma estirpe no virulenta viva, o ratinho morria e era possivel recuperar bactrias virulentas vivas do ratinho morto;
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Assim, houve transferncia de material gentico entre as duas estirpes.
Na transformao natural, o DNA surge de um dador bacteriano e o processo aleatrio, sendo que qualquer poro de um genoma pode ser transferido entre bactrias: Quando as bactrias lisam, elas libertam quantidades considerveis de DNA para o ambiente vizinho. Estes fragmentos podem ser relativamente grandes e contm vrios genes; Se um fragmento contacta com uma clula competente (uma clula capaz de recolher DNA e ser transformada), ele pode ligar celula e ser recolhido para o seu interior.
A frequncia de transformao de clulas muito competentes cerca de 10-3 para a maior parte dos gneros quando um excesso de DNA usado. Isto , cerca de uma clula em cada 1000 ir recolher e integrar o gene. A competncia um fenmeno complexo e dependente de vrias condies: As bactrias necessitam de uma certa etapa de crescimento (e.g., S. Pneumoniae torna-se competente durante a fase exponencial quando a populao atinge uma certa densidade populacional); Quando uma populao se torna competente, bactrias como pneumococci secretam uma pequena proteina designada factor de competncia que estimula a produo de novas proteinas necessrias para a transformao.
A transformao natural foi descoberta at agora em certos gneros gram-positivos e gram-negativos: Streptococcus,
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Bacillus, Thermoactinomyces, Haemophilus, Neiserria, Moraxella, Acinetobacter, Azotobacter e Pseudomonas. A transferncia de genes por este processo ocorre no solo e nos ambientes matinhos e pode ser uma via importante de troca gentica na natureza. O mecanismos de transfromao em S. Pneumoniae o seguinte: 1. Uma clula competente liga um fragmento de DNA de cadeia dupla se o fragmento for moderadamente grande, num processo aleatrio, sendo que os fragmentos dadores competem entre si; 2. O DNA depois clivado por endonucleases a fragmentos de cadeia dupola de 5-15 kb; 3. O uptake de DNA requer energia. Uma cadeia hidrolizada por uma exonuclease associada com o invlucro durante o uptake e a outra cadeia associa-se com pequenas proteinas e move-se atravs da membrana plasmtica; 4. Este fragmento de cadeia simples capaz de alinhar com a regio homloga do genoma e ser integrado. No entanto, a transformao em Haemophilus influenzae, uma bactria gram-negativa, difere deste mecanismo em vrios modos, o que mostra que este mecanismo no geral. A transformao artificial feita em laboratrio por um variedade de tcnicas: Tratamento das clulas com cloreto de clcio, o que torna as membranas mais permeveis ao DNA. Esta tcnica util at em bactrias que no so naturalmente competentes, como E. coli; Concentraes de DNA relativamente altas, superiores encontradas normalmente na Natureza, so usadas para aumentar a frequncia de transformao;
mais fcil transformar com plasmideos, visto que os plasmideos no so facilmente degradados como os fragmentos lineares e so capazes de se replicar na clulas hospedeira. Para alm disso, conseguimos introduzir nos plasmideos qualquer informao que quisermos.
Transduo
Os virus bacterianos ou bacteriofagos participam no terceiro modo de transferncia de genes bacterianos: Estes virus apresentam estruturas relativamente simples nas quais o material gentico do virus est revestido por uma pelicula externa compostas principalemente ou apenas por proteinas. Esta pelicula protege o genoma e transmite-o entre clulas hospedeiras.
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Aps infectar uma clula hospedeira, o bacteriofago muitas vezes assume o controlo e fora o hospedeiro a fazer muitas cpias do virus. Eventualmente, a bactria hospedeira lisa e liberta os novos fagos. Este ciclo replicativo designado ciclo litico porque termina na lise da clula hospedeira, sendo este fagos virulentos. Este ciclo apresenta quatro fases: 1. A particula de virus liga-se a um local receptor especifico na superficie bacteriana e o material gentico, que normalmente de cadeia dupla, entra na clula; 2. Aps adsoro e penetrao, o cromossoma viral fora a bactria a faser novas proteinas e cidos nucelicos virais; 3. Aps a sintese de componentes viricos, os fagos so montados apartir deste componentes. Este processo complexo, mas em todos os casos os cidos nucelicos do fago so empacotados no invlucor proteico; 4. Os virus maduros so libertados por lise celular. Muitos fagos de DNA, como o fago lambda, so tambm capazes de fazer relaes diferentes com o seu hospedeiro, tendo um ciclo lisognico: 1. Aps absoro e penetrao, o genoma viral no assume o controlo do seu hospedeiro nem a destroi produzindo novos fagos; 2. O genoma mantem-se na clula hospedeira e reproduzido ao mesmo tempo que o cromossoma bacteriano; 3. Surge, assim, um clone de clulas infectadas e estas podem crescer ao longo de vrios periodos de tempo parecendo completamente normais; 4. Cada uma destas clulas infecatadas so capazes de produzir fagos e lisar sob condies ambientais apropriadas; 5. A induo da lise e libertao dos fagos pode ocorrer por radiao UV.
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Assim, podemos definir dois tipos de fagos: Fagos virulentos fagos que assumem o controlo do hospedeiro e provocam a sua lise; Fagos temperados fagos capazes de establecer uma relao com bactrias que apenas produzem particulas fgicas sob determinadas condies. A forma latente do genoma viral que fica dentro da clula hospedeira sem a destruir designado pro-fago, sendo normalmente integrado no genoma bacteriano.
A transduo a transferncia de genes bacterianos por virus pois genes bacterianos so incorporados numa cpside fgica devido a erros feitos durante o ciclo fgico. O virus que contem estes genes injectaos noutra bactria, completando a transferncia. Este mecanismo ser o mecanismo de troca gentica mais comum em bactrias. Podemos distinguir dois tipos: Generalizada ocorre com fagos virulentos. O DNA cromossmico transferido pode ser de qualquer regio; Especializada ocorre com fagos temperados. O DNA cromossmico transferido localiza-se no local de insero do pro-fago.
Transduo Generalizada A transduo generalizada ocorre durante o ciclo litico de gfagos virulentos e liticos e capaz de transferir qualquer parte do genoma bacteriano:
1. Durante a etapa de montagem, quando o cromossoma viral empacotado em cpsides proteicas, fragmentos aleatrios do cromossoma bacteriano parcialmente degradado tambm podem ser empacotados por engano; 2. Como a cpside apenas capaz de conter uma quantidade limitada de DNA, o DNA viral deixado para trs. A quantidade de DNA bacteriano carregado depende principalmente do tamanho da cpside; 3. A particula viral resultante normalmente injecta o DNA noutra clula bacteriana mas no inicia o ciclo litico. Este fago resultante conhecido como particula de transduo generalizada e simplesmente um carregador de informao gentica de uma clula bacteriana para outra;
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4. Tal como na transformao, assim que o DNA injectado, este deve ser incorporado no cromossoma da clula receptora para preservar os genes transferidos. O DNA mantem-se em dupla hlice durante a transferncia e ambas as cadeias so integradas no genoma; 5. Cerca de 70-90% do DNA transferido no integrado mas muitas vezes capaz de subreviver e expressar-se sozinho. Transduo Especializada A transduo especializada ou restrita, a particula transdutora carrega apenas pores especificas do genoma bacteriano, sendo esta transduo possivel devido a um erro no ciclo lisognico:
1. Quando um pro-fago induzido a deixar o cromossoma hospedeiro, a exciso por vezes ocorre de modo imprprio; 2. O genoma fgico resultante contem pores do cromossoma bacteriano prximo do local de integrao, tal como no caso dos plasmideos F;
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3. O genoma de um fago trasdutor normalmente deficiente e no apresenta parte do seu local de ligao; 4. A particula transdutora injectar genes bacterianos noutras bactrias, apesar do fago deficiente no ser capaz de se reproduzir em assistncia; 5. Os genes bacterianos sero estavelmente incorporados sob condies adequadas. Consequncias da Infeco Fgica Os mecanismos de transduo aliam-se s aces virulentas dos virus, sendo as principais consequncias da infeco: Lise bacteriana para libertao dos fagos; Alteraes do genoma bacteriano por insero de novo material, tanto virico como de origem bacteriana; Alteraes da virulncia bacteriana a insero de novos genes confere novas caracteristicas s clulas bacterianas. Novos factores de virulncia podem ser transferidos por transduo (e.g., toxina de Shiga) e toxinas codificadas por fagos podem ser introduzidas no genoma bacteriano (e.g., diftrica, botulinica, pertussica, da clera). Para alm disso, podem tambm ser intriduzidos factores reguladores da virulncia, enzimas e componentes estruturais fgicos patognicos.
No caso da toxina da clera, esta tem origem em estirpes patognicas de V. Cholerae: Normalmente, estas bactrias encontram-se num estado no patognico; No entanto, infeco por TCP promove a formao de fimbrias nas clulas bacterianas, que funcionam como receptor do fago CTX, que codifica a toxina da colera; Ambos os bacteriofagos so capazes de se integrar no genoma bacteriano e formar intermedirios de replicao epissomais; A produo da toxina da colera e a biognes do CTX dependem de uma secretina codificada no genoma bacteriano.
Importncia do Estudo da Gentica Bacteriana

O conhecimento da estrutura do genoma das bactrias e deste modo de alterao do conteudo gentico mostra a importncia do estudo da gentica bacteriana: Permite compreender como funcionam os microorganismos; Permite compreender os mecanismos pelos quais alguns microorganismos provicam doenas; Permite compreender como se propagam determinadas caracteristicas nefastas dos microorganismos; Funciona como modelo para compreender a gentica dos outros seres vivos; Permite a introduo de genes estranhos nos microorganismos, de forma a obt-los em grandes quantidades e estudar a sua funo; Permite usar microorganismos para produzir proteinas em grande quantidade.
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Este estudo permite tambm compreender a evoluo e a capacidade de diferentes clulas bacterianas inserirem material gentico estranho. Por exemplo, anlises do genoma de vrias espcies bacterianas mostraram a distribuio de DNA adquirido e possivel concluir que genomas maiores apresentam maiores quantidades de material gentico obtido por transferncia lateral:
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VIRUS E PROTOZORIOS
INTRODUO E CARACTERISTICAS GERAIS DOS VIRUS
Propriedades Gerais dos Virus

Os virus so um grupo nico de agentes infecciosos que se distiguem pela sua organizao acelular e simples e pelo seu padro de duplicao: Uma particula de virus completa ou virio consiste numa ou mais molculas de DNA ou RNA inclusas numa cpside proteica, e por vezes outras camadas; Estas camadas adicionais podem ser muito complexas e conter carboidratos, lipidos e proteinas adicionais.
Os virus podem existir em duas fases: Fase extracelular os viries possuem poucos se nenhumas enzimas e no so capazes de se reproduzir independentemente das clulas vivas; Fase intracelular os virus existem primariamente como cidos nucelicos em replicao que induzem o metabolismo do hospedeiro a sintetizar componentes do virio. Eventualmente, particulas de virus completas os viries so libertadas.
Assim, resumidamente, os virus diferem das clulas vivas em pelo menos trs pontos: 1. Apresentam uma organizao mais simples e acelular; 2. Quase todos apresentam ou DNA ou RNA, mas nunca ambos ( excepo do citomegalovirus humano, que apresenta um genoma de DNA e quatro mRNAs); 3. No so capazes de se reproduzir independentemente das clulas e fazer diviso celular como as clulas eucariotas e procariotas. No entanto, os virus devem ser distinguidos dos parasitas intracelulares obrigatrios, porque estes ultimos no se enquadram nos dois primeiros pontos.
Purificao e Quantificao de Virus

Os virologistas devem ser capazes de purificar e determinar com preciso as suas concentraes de modo a estudarem a estrutura, duplicao e outros aspectos da biologia virica.
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Purificao de Virus A purificao fas uso de vrias propriedades dos virus: Os viries so muito grandes relativamente s proteinas; Os viries so normalmente mais estveis que os componentes celulares normais; Os viries apresentam proteinas superficiais.
Assim, nuitas tcnicas uteis para o isolamento de proteinas e organelos podem ser usadas para isolar virus, sendo as mais usadas: 1. Centrifugao diferencial e em gradiente de densidade as clulas do hospedeiro nas etapas terminais da infeco que contm viries maturos so usadas como fonte de material. As clulas infectadas so primeiro destruidas num tampo para produzir uma supenso de componentes celulares e virus. Os virus podem depois ser isolados por centrifuo diferencial. Os virus tambm podem ser purificados com base no seu tamanho e densidade numa centrifugao em gradiente; 2. Precipitao de virus os virus, como outras proteinas, podem ser purificados atravs de precipitao com sulfato de amnia concentrado. Inicialmente, sulfato de amonia suficiente adicionado para aumentar a sua concentrao apenas um pouco abaixo daquela que precipita os virus. Aps a precipitao de contaminantes, mais sulfato de amnia adicionado e os virus precipitados so recolhidos por centrifugao. Por outro lado, virus sensiveis a sulfato de amonia so normalmente purificados com polietileno glicol; 3. Desnaturao de contaminantes frequentemente, os virus so menos facilmente desnaturados do que a maior parte dos constituintes celulares normais. Os contaminantes podem ser desnaturados e precipitados com calor ou alterao de pH para os virus serem purificados. O uso de solventes organicos tambm permite a purificao porque os virus tambm toleram estes compostos; 4. Digesto enzimtica de constituintes celulares proteinas celulares e cidos nucelicos podem ser removidos de vrias preparaes viricas atravs de degradao enzimtica porque os virus normalmente so mais resistentes ao ataque por nucelases e proteases do que as proteinas e os cidos nucelicos. Quantificao de Virus A quantidade de virus numa amostra pode ser determinada por: Contando numeros de particulas; Medindo a concentrao de unidades infecciosas.
Apesar da maior parte dos vires normais serem provavelmente infecciosos, muitos no iro infectar as clulas do hospedeiro porque no contactam com o local prprio de infeco. Assim, a contagem total de particulas deve ser de 2-1 milhes de vezes superior ao numero de unidades infecciosas dependendo da natureza do virio e das condies experimentais. Para alm disto, ambas as abordagens so valiosas. Particulas de virus podem ser contadas directamente com o microscpio electrnico:
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A amostra de virus misturada com uma concentrao conhecida de pequenas contas de latex e dispersas numa grelha; As contas e os virus so cintados e a concentrao de virus calculada apartir destas contagens e da concentrao de contas.
Esta tcnica normalmente opera bem com preparaes concentradas de virus de morfologia conhecida. Os virus podem ser concentrados por centrifugao antes da contagem se a preparao for muito diluida. No entanto, se as contas e os virus no foram bem distribuidos (o que por vezes ocorre), a contagem final no precisa. Por outro lado, uma variedade de ensaios de permitem a anlise do numero virus em termos da sua infectividade. No ensaio em placa, vrias diluies de virus bacterianos ou animais so plaqueados com clulas do hospedeiro apropriadas: Quando o numero de virus plaquados muito menor que as clulas do hospedeiro disponiveis para infeco e quando os virus so igualmente distribuidos, cada placa (destruio das clulas) ter surgido da reproduo de uma unica particula de virus (neste caso, tm de ser virus virulentos); Assim, a contagem das placas produzidas numa diluio em particular fornece o numero de viries infecciosos ou unidades formadoras de placas (PFU), e a concentrao de unidades infecciosas na amostra original pode ser facilmente calculada; Os virus que produzem diferentes morfologias de placa na mesma cultura devem ser contados separadamente; Apesar do numero de PFU no igualar o numero de particulas viricas, as suas razes so proporcionais.
Existem ainda outros mtodos de quantificao, mas estes dois so os mais importantes.
Estrutura dos Virus

A morfologia dos virus bastante simples de perceber, o que permite o seu estudo facil. Progressos neste campo foram feitos pelo uso de vrias tcnicas:
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Microscopia electrnica; Difraco de raios-X; Analise bioquimica; Imunologia.
Apesar do conhecimento estar incompleto devido ao grande numero de diferentes virus, a natureza geral de estrutura dos virus comea a tornar-se clara. Tamanho do Virio Os viries variam am tamanho desde 10-300 ou 400 nm de dimetro: Os virus mais pequenos so um pouco maiores do que os ribossomas, enquanto os poxvirus, como vaccinia, so quase do tamanho da bactrias mais pequena e pode ser observado ao microscpio ptico; Contudo, a maior parte dos virus so demasiado pequenos para serem visiveis ao microscpio ptico e devem ser observados ao microscpio electrnico.
Propriedades Estruturais Gerais Todos os vires, mesmo que possuam outros constituintes, so contruidos volta de um centor nucleocpside (de facto, alguns virus consistem apenas no nucleocpside). O nucleocpside composto por: cidos nucleico, ou DNA ou RNA, revestido por uma cpside proteica, que protege o material gentico e ajuda na sua transferncia entre as clulas hospedeiras por facilitar a adeso dos virus nus s clulas hospedeiras.
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Existem quatro tipos gerais de morfologia da cpside e da estrutura do virio: Icosadrica um icosaedro um poliedro regular com 20 faces triangulares equilaterais e 12 vertices (h, j, k, l). Estas cpsides parecem esfricas quando vistas a uma menor ampliao ao microscpio electrnico; Helical parecem hlices e cilindros proteicos ocos, que podem ser tanto rigidos como flexiveis (m); Invlucro alguns virus podem conter este revestimento, uma camada membranar externa que reveste o nucleocpside. Virum com invlucro apresentam uma forma aproximadamente esfrica mas de algum modo varivel apesar do seu nucleocpside poder ser tanto icosadrico ou helical (b, c, i); Virus complexos apresentam simetria da cpside que nem ecosadrica nem helical (a, d, f, g). Podem tambm possuir caudas e outras estruturas (e.g., muitos bacteriofagos) ou apresentar paredes complexas com multiplas camadas a revestir os cidos nucelicos (e.g., poxvirus como vaccinia).
Tanto as cpsides helicais como icosadricas so grandes estruturas macromoleculares construidas apartir de muitas cpias de um ou mais alguns tipos de subunidades proteicas ou protmeros. Provavelmente, a maior vantagem desta estratgia de design ser a poupana de espao no material gentico, permitindo um uso mais eficiente deste: Quando formados e expostos a condies adequadas, os protmeros normalmente interagem entre si especificamente e associam-se espontaneamente para formar a cpside; Como a cpside construida sem qualquer ajuda exterior, o processo designado automontagem.
Por outro lado, alguns virus mais complexos possuem genes para factores especiais que no so incorporados no virio mas so necessrios para a sua montagem. Cpsides Helicais As cpsides helicais so bastante semelhantes a tubos ocos com paredes proteicas, sendo o virus do mosaico do tabaco o principal exemplo:
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Um unico tipo de protmero associa-se num arranjo helical ou em espiral para produzir um tubo longo e rigido, de 15-18 nm de dimetro do 300 nm de comprimento; O material gentico enrolado numa espiral e posicionado ao longo do interior da cpside onde se mantm numa fenda formada pelas subunidades proteicas.
No entanto, nem todas as cpsides helicais so to rigidas como as do virus do mosaico do tabaco. Por exemplo, os RNAs do virus influenza so fechadas numa estrutura helical fina e fexivel revestida por um invlucro.
Virus do mosaico do tabaco
Virus influenza
O tamanho da cpside helical influenciado tanto pelos protomeros como pelo cido nucelico aramzenado na cpside: O dimetro da cpside uma funo do tamanho, forma e das interaces dos promotores; O cido nucleico determina o comprimento da cpside helical porque a cpside no se extende para alm das terminaes do DNA ou do RNA.
Cpsides Ecosadricas O icosaedro uma das formas favoritas da natureza, a hlice ser provavelmente a mais popular. Os virus usam a forma ecosadrica porque esta a forma mais eficiente de manter uma forma. Alguns genes, por vezes apenas um, so capazes de codificar proteinas que fazem auto-montagem para formar a cpside. Deste modo, um pequeno numero de genes lineares sao capazes de especificar uma grande estrutura tridimensional especifica. Quando virus ecosadricos so negativamente corados e observados no microcpio electrnico de transmisso, uma estrutura ecosadrica complexa da cpside revelada: As cpsides so construidas normalmente por unidades em anel designadas capsmeros, aca feita normalemente de 5-6 protmeros;
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Os pentmeros apresentam sinco subunidades e localizam-se nos vrtice do ecosaedro; Os hexmeros apresentam seis subunidades e as faces triangulares.
Diferentes virus podem ter diferentes numeros de capsmeros, constituindo estruturas de tamanho diferente. Em muitos virus de RNA bacterianos e de plantas, tanto os pentmeros como os hexmeros de uma cpside so construidos com apenas um tipo de subunidade, enaquanto os pentameros adenovirus so compostos por diferentes proteinas relativamente aos hexameros adenovirus. Os protomeros juntam-se para formar capsmeros atravs de ligaes no-covalentes. As ligaes entre proteinas nos pentameros e hexameros so mais fortes do que aquelas nos capsmeros separados. cidos Nucleicos Os virus so excepcionalmente flxiveis no que diz respeito natureza do seu material gentico. Empregam todos os quatro tipos de cidos nucleicos possiveis: DNA de cadeia simples; DNA de cadeia dupla; RNA de cadeia simples; RNA de cadeia dupla.
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Todos os quatro tipos so encotrandos em virus animais. Os virus de plantas muitas vezes apresentam genomas de RNA de cadeia simples. Apesar dos fagos apresentarem DNA de cadeia simples ou RNA de cadeia simples, os virus bacterianos normalmente contm DNA de cadeia dupla. O tamanho do material gentico viral tambm varia bastante: Os genomas mais pequenos (os dos virus MS2 e Q) tm cerca de 1x106 daltons, suficientemente grandes para codificar trs a quatro proteinas. Virus deste gnero podem slavar espao sobrepondo alguns genes; No outro extremo, bacteriofagos T-even, herpesvirus e virus vaccinia apresentam genosmas 1.0 a 1.6x108 daltons e podem ser capazes de dirigir a sintese de mais de 100 proteinas.
Os virus de DNA curto, como bacteriofagos X174 e M13 ou parvovirus, possuem genomas de DNA de cadeia simples (ssDNA). Alguns destes virus apresentam peas de DNA linear enquanto outros usam um unico circulo fechado para o seu genoma. A maior parte dos virus usa DNA de cadeia dupla (dsDNA) como o seu material gentico. dsDNA linear, variadamente modificado, encontrado em muitos virus, enquanto outros apresentam dsDNA circular. Por exemplo, o fago apresentam dsDNA linear com terminaes em cadeia simples coesivas complementares que so capazes de ciclizar o DNA quando formam pares entre elas:
A maior parte dos virus de RNA usa RNA de cadeia simples (ssRNA) como material gentico e, dependendo da sequncia codificada neste cido nucleico, podemos ter dois tipos de ssRNA: RNA positivo a sequncia de bases do RNA idntica com a do mRNA viral (e.g., virus polio, do mosaico do tabaco, etc). Para alm da semelhana directa da sequncia, apresentam poli-A e uma sequncia cap, podendo ser directamente tranduzidos; RNA negativo a seuquncia de bases do RNA a complementar da sequncia do mRNA (e.g., virus influenza, etc).
A maior parte destes genomas de ssRNA so genomas segmentados, isto , so divididos em partes separadas. Acredita-se que cada fragmento o segmento codifica uma proteina. Normalmente, todos os segmentos so fechados na mesma cpside apesar de alguns genomas de virus serem compostos por cerca de 10-12 segmentos. No entanto, no necessrio que todos os segmentos estejam localizados no mesmo virio para uma duplicao com sucesso.
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Alguns virus apresentam genomas de RNA de cadeia dupla (dsRNA). Todos parecem ser segmentados, podendo ser encontrados 10-12 segmentos em reovirus. Estes virus de dsRNA so conhecidos por infectarem animais, plantas, fungos e mesmo algumas espcies bacterianas. Invlucro e Enzimas Virais Muitos virus animais, algumas virus de plantas e pelo menos um virus bacteriano so ligados por uma camada membranar externa designada invlucro: Os invlucros de virus animais normalmente surgem das membranas plasmtica ou nuclear do hospedeiro, sendo os seus lipidos e carboidratos constituintes normais do hospdeiro; A proteinas do invlucro so codificadas por genes virais e podem ainda projectar-se da superficie do invlucro como espiculas; As espiculas podem estar envolvidas na adeso do virus superficie das clulas do hospedeiro e, como variam entre espcies de virus, podem ser usadas na identificao de virus.
Como o invlucro uma estrutura membranar flxivel, os virus com invlucro frequentemente apresentam uma forma varivel e so designados pleomrficos. Contudo, os invlucros de alguns virus esto firmemente ligados ao nucelocpside e faz com que o virio tenha uma forma contante. Em alguns virus, o invlucro destruido por solventes como ter e nesse casos diz-se que o virus sensivel ao ter. O virus influenza um exemplo bem estudado de virus com invlucro: As suas espiculas projectam-se cerca de 10 nm da superficie em intervalos de 7-8 nm; Algumas espiculas possuem a enzima neuraminidase, que ajuda o virus a penetrar as camadas mucosas do epitlio respiratrio para alcanar as clulas hospedeiras; Outras espiculas paresentam enzimas hemaglutininas, assim designadas porque so capazes de ligar os viries membrana dos eritrcitos e provocar hemaglutinao.
Proteinas, como as proteinas das espiculas que so expostas na superficie externa do invlucro, so normalmente glicoproteinas, isto , as proteinas apresentam carboidratos ligados a si. No etanto, uma proteina no glicosilada encontrada na superficie interna do invlucro e ajuda a estabiliza-lo. Apesar de originalmente se pensar que os viries apresentavam apenas proteinas da capside estruturais e no apresentavam enzimas, provou-se que esse no o caso. Em alguns casos, enzimas encontram-se associadas com o invlucro ou a cpside (e.g., neuraminidase influenza). A maior parte das enzimas virais esto provavelmente localizadas na cpside e muitas esto envolvidas na replicao de cidos nucleicos: O virus influenza usa RNA como material gentico e carrega uma RNA polimerase dependente de RNA que actua tanto como replicase e como RNA transcriptase que sintetiza mRNA sob direco do seu prprio RNA; A polimerase encontra-se associana com uma ribonucleoproteina.
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Apesar dos virus no apresentarem metabolismos e no serem capazes de se reproduzir independentemente de clulas vivas, eles podem possuir uma ou mais enzimas essenciais para completarem os seus ciclos replicativos. Virus Com Cpside Complexa Apesar da maior parte dos virus apresentar cpside ecosadricas ou helicais, alguns virus no se encaixam em nenhuma destas categorias. Os poxvirus e grandes bacteriofagos so dois exemplos importantes. Os poxvirus so os maiores virus animais (cerca de 400x240x200 nm em tamanho) e podem ainda ser observados co um microscpio de contraste de fases ou em preparaes coradas: Possuem uma estrutura interna excepcionalmente complexa com um exterior ovoide; O dsDNA est associado com proteinas e contido num nucleide, uma estrutura central coma forma de um disco bicncavo e revestido por uma membrana; Dois corpos laterais encontram-se entre o nucleide e o invlucor externo, uma membrana e uma camada espessa camada coberta por uma camada de tubulos ou fibras.
Alguns bacteriofagos grandes so ainda mais elaborados que os poxvirus, sendo que os fagos T2, T4 e T6 que infectam E. coli altamente estudados: So semelhantes a um ecosadro alongados por uma ou dous linhas de hexameros no meio e contm genoma em DNA; A cauda composta por uma juno com a cabea, um tubo central, uma folha a revestir o tubo e uma base complexa; A folha +e deita de 144 cpias de proteina gp18 arranjada em 24 aneis, cada contendo seis cpias; Em fagos T, a base hexagonal e apresenta um pin e uma tail fiber ligada em cada canto; As tail fibers so responsveis pela adeso do virus ao local adequado na supeficie bacteriana.
Existe uma variao considervel na estrutura entre os grande bacteriofagos, mesmo entre aqueles que se encontram a infectar uma clula: Em contraste como os fagos T, muitos colifagos apresentam cabeas verdadeiramente ecosadricas; Os fagos T1, T5 e apresentam caudas sem revestimento que no contm uma base e terminam em tail fibers rudimentares; Os colifagos T3 e T7 apresentam caudas pequenas e no contr+acteis sem tail fibers.
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Para alm destas diferenas, virus bacterianos complexos com cabea e cauda apresentam simetria binal porque possuem uma combinao de simetria ecosadrica (cabea) e helical (cauda).
Bacteriofago T4
O virus da bola difere destas duas estruturas complexas apresentadas apresentando uma estrutura ramificada ou filamentosa com um incvlucro constituido por uma membrana com vrias glicoproteinas. Dentro da cpsula encontra-se um nucleocpside helical dentro do qual se encontra uma molcula de ssRNA negativo intercalado por nucleoproteinas:
Principios da Taxonomia Viral

A classificao dos virus encontra-se num estado muito menos satisfatrio relativamente dos microorganismos procariotas e eucariotas. Em parte, isto deve-se falta de conhecimento da sua origem e histria evolutiva. Normalmente, os virus so divididos em vrios grandes grupos com base na sua preferncia: Virus animais; Bacteriofagos; Virus de plantas; Etc... Virus bacterianos; No passado, os virologistas que trabalhavam com estes grupos era incapazes de chegar a acordo com um sistema uniforme de classificao e nomenclatura. Em 1971, o comit de taxonomia viral desenvolvem um sistema de classificao uniforme e agora divide os virus em trs ordens, 56 familias, 9
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subfamilias, 233 gneros e 1550 especies de virus. O comit usou algumas propriedades para definir as familias: Tipo de cido nucleico; Numero de cadeias do cido nucleico; Sentido dos genomas ssRNA; Presena ou ausncia de um inv+olucro; Hospedeiro.
Os virus so divididos em vrios grupos taxonomicos com base nas caracteristicas que esto relacionadas com o tipo de uso de hospedeiro, estrutura e composio do virio, modo de replicao, e natureza de qualquer doena causada. Algumas das caracteriticas mais importantes so: 1. Hospedeiro animal, planta, bacteria, insecto, fungo; 2. Caracteristicas do cido nucleico DNA ou RNA, cadeia simples ou dupla, peso molecular, segmentao e numero de peas de cido nucelico (virus de RNA), sentido das cadeias de ssRNA; 3. Simetria da cpside ecosadrica, helical, binal, complexa; 4. Presena de um invlucro e sensividade a ter; 5. Dimetro do virio ou nucleocpside; 6. Numero de capsmeris em virus ecosadricos; 7. Propriedades imunolgicas; 8. Numero de genes e mapa genmico; 9. Localizao intracelular de replicai viral; 10. Presena ou ausncia de um intermedirio de DNA (ssRNA) e presena de transcriptase reversa; 11. Tipo de virus libertado; 12. Doena causada e/ou caracteristicas clinicas especiais, mtodo de tansmisso.
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BACTERIOFAGOS E VIRUS DOS EUCARIOTAS
Classificao dos Bacteriofagos

Apesar das propriedades como gama de hospedeiros e relaes imunolgicas serem usadas na classificao de fagos, as mais importantes so: Morfologia do fagos; Propriedades dos cidos nucleicos.
O material gentico pode ser tanto DNA como RNA, mas a maior parte dos bactriofagos conhecidos apresenta DNA de cadeia dupla. Quanto morfologia, a maior parte pode ser inserida em alguns grupos morfolgicos: Fagos icosadricos sem cauda; Virus com caudas contrcteis; Fagos filamentosos.
Existem ainda alguns fagos com invlucro. A forma mais complexa de fago so os fagos com caudas contrcteis, por exemplo, os fagos T de E. coli.
Replicao de Fagos de DNA de Cadeia Dupla: Ciclo Litico

Aps os bacteriofagos de DNA se replicarem numa clula hospederira, muitos deles so libertados quando a clula destruida por lise: Um ciclo replicativo de fago que culmina com a expluso da clula hospedeira e libertao de viries designado ciclo litico.
O principal exemplo de virus que actuam deste modo so os fagos T de E. coli, que constituem bacteriofagos de dsDNA com caudas contrcteis complexas e que pertencem familia Myoviridae. Adsoro Clula Hospedeira e Penetrao Os bacteriofagos no se ligam aleatoriamente superficie de uma clula hospedeira. Em vez disso, eles reconhecem estruturas de superficie especificas designadas receptores locais. A natureza destes receptores variam com o fago: LPS e proteinas da parede celular; cidos teicicos; Flagelina; Pilina.
Os fagos T de E. coli usam o LPS ou proteinas da parede celular como receptores, sendo variaes nas propriedades do receptor responsveis em parte pelas preferncias de um fago para um hospedeiro.
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A adsoro do fago T envolve vrias estruturas da cauda: 1. A adeso do fago comea quando uma tail fiber contacta o receptor local apropriado; 2. Quanto mais tail fibers fazem contacto, a base estabelece-se na superficie. A ligao deve-se provavelmente a interaces electrostticas e influenciada pelo pH e pela presena de ies como Mg2+ e Ca2+; 3. Apis a base se ligar firmemente superficie celular, ocorrem alteraes conformacionais na base e na folha que reveste a causa e esta reorganiza-se de modo a ser encurtada de um anel com 24 aneis para um com 12 aneis. Assim, o tubo central puxado para parede celular; 4. Finalmente, o DNA libertado da cabea, atravs do tubo da cauda, e entra na clula hospedeira. O tubo deve interagir com a membrana plasmtica para formar um poro atravs do qual o DNA passa.
Os mecanismos de penetrao de outros bacteriofagos muitas vezes parecem diferir deste apresentado para os fagos T mas ainda no foram estudados em detalhe. Por exemplo, no caso do fago PRD1, este possui uma actividade muralitica. Este fago no apresenta causa mas tem enzimas no seu invlucro que degrada o peptidoglicano e permite a entrada de material gentico na clula hospedeira. Sintese de cidos Nucleicos e Proteinas Fgicas Aps a injeco do DNA do fago, a sintese de DNA, RNA e proteinas do hospedeiros interrompida, e a clula forada a produzir constituintes virais:
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A RNA polimerase de E. coli comea a sintetizar mRNA fgico em dois minutos; Este mRNA e todos os mRNA iniciais (mRNA transcripto antes do DNA fgico ser feito) dirigem a sintese de factores proteicos e enzimas necessrias para tomar conta da clula e manufacturar cidos nucleicos virais; Algumas enzimas virais iniciais especificas degradam DNA do hospedeiro a nucletidos, interrompendo ao mesmo tempo a expresso de genes do hospedeiro e forncendo materia prima para a sintese de DNA viral; Em cinco minutos, a sintese de DNA viral comea e mRNA tardio transcripto; Quando muitas cpias de DNA foram feitas, cerca de 6 a 10 cpias so juntas pelas suas extremidades redundantes com a ajuda de vrias enzimas; Estas cadeias de DNA bastante longas compostas por vrias unidades ligadas em conjunto so designadas concatameros e durante a montagem so clivadas de modo que o genoma ligeiramente mais longo que o grupo de genes T4.
Montagem de Particulas Fgicas A montagem de fagos T4 um processo excepcionalmente complexo de auto-montagem. O mRNA tardio, ou aquele produzido aps replicao do DNA, dirige a sintese de trs tipos de proteinas: 1. Proteinas estruturais do fago; 2. Proteinas que ajudam na montagem do fago sem fazerem parte da estrutura do virio; 3. Proteinas envolvidas na lise e libertao do fago. A transcrio de mRNA tradio comea cerca de 9 minutos aps a injeco de DNA T4 em E. coli. Todas as proteinas necessrias para a montagem do fago so sintetizadas simultaneamente e depois usadas em quatro linhas de montagem independentes: A base construida apartir de 15 produtos de genes; Aps a base estar acabada, o tubo da cauda construido na base e o revestimento montado volta do tubo; A pro-cabea ou pro-capside do fago construida separadamente apartir de mais de 10 proteinas e depois espontaneamente combina com a cauda. A pro-capside montada com a ajuda de proteinas scaffolding que so degradadas ou removidas aps a construo estar concluida; As tail fibers ligam base aps a cabea e a cauda estarem em conjunto.
Apesar de muitos destes passos ocorrerem espontaneamente, alguns requerem proteinas virais especiais ou factores das clulas do hospedeiro. A introduo do DNA, contudo, ainda no bem conhecida, mas o DNA deve ser introduzido com a ajuda de ATP.
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Libertao de Particulas Fgicas Muitos fagos lisam as suas clulas hospedeiro no final da sua fase intracelular. A lise de E. coli ocorre aps cerca de 22 minutos a 37C e aproximadamente 300 particulas de T4 so libertadas. Vrios genes esto neste processo: Um dirige a sintese de uma endolisina que ataca o peptidoglicano da perede celular; Outro proteina fgica designada holina produz uma leso na membrana plasmtica que para a respirao e permite o ataque da endolisina ao peptidoglicano. Persumivelmente, isto forma buracos na membrana.
Classificao dos Virus Animais

Quando se comeou a fazer classificao de virus animais, esta era feita em termos de caracteristicas como preferncias de hospedeiropara cada virus. Infelizmente, nem todos os critnios so igualmente uteis: Muitos virus infectam uma variedade de animais; Um animal particular pode ser ivadido por vrios virus diferentes.
Assim, as preferncias do hospederido no apresentam especificidade para distinguir precisamente diferentes virus. Classificaes modernas baseiam-se principalmente em: Morfologia do virus provavelmente a caracteristica mais importante na classificao dos virus; Natureza quimica e fisica dos constituintes dos viries; Relao gentica as propriedades dos cidos nucleicos como tipo geral (DNA ou RNA), numero de cadeias, tamanho e segmentao so bastante uteis. Estas podem ser estimadas por tcnicas como hibridizao de cidos nucleicos, sequenciao de cidos nucleicos e proteinas e determinao da habilidade de sofrer recombinao.
A replicao de virus animais bastante semelhante dos fagos e pode ser dividida em vrios passos: 1. 2. 3. 4. 5. Adsoro; Penetrao; Replicao de cidos nucelicos virais; Sintese e montagem de cpsides virais; Libertao de virus maduros.
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Adsoro de Viries Animais

O primeiro passo do ciclo replicativo de virus animais a adsoro superficie da clula hospedeira: Ocorre atravs de uma coliso aleatria do virio com um receptor na membrana plasmtica, frequentemente uma glicoproteina; Como a capacidade de um virus infectar uma clula depende altamente da sua habilidade de ligar clula, a distribuio das proteinas receptoras apresentam um papel importante na especificidade de tecido e hospedeiro dos virus animais.
As proteinas receptoras especificas da clula hospedeira s quais os virus ligam variam bastante mas so sempre proteinas superficiais necessrias clula. Os virus ligam fortemente clula hospedeira ligando a molculas superficiais que normalmente so usadas em endocitose e, assim, o virus muitas vezes internalizado por este mecanismo. Estes receptores so passivelmente carregadas pelas clulas e muitas vezes podem tambm ser receptores de hormonas e outras molculas importantes.
Virus Adenovirus Virus Epstein-Barr Virus Hepatite A Virus Herpes simplex, tipo I Virus da imunodeficincia humana Virus influenza A Virus measles Poliovirus Virus da raiva Rhinovirus Reovirus, tipo 3 Totavirus Virus vaccinina Proteina receptora Proteina receptora do adenovirus Coxsackie (CAR) Receptor para C3d nos linfcitos B humanos -2-macroglobulina Receptor de factor de crescimento de fibroblastos; um membro da familia de receptores de TGF + CD4 em clulas T CD4 , macrfagos, moncitos; receptor CXCR-4 Glicoproteina contendo cido silico Proteina reguladora do complemento CD46 Superfamilia de imunoglobulinas Receptor de acetilcolina nos neurnios Molculas de adeso intercelular (ICAMs) na superficie de clulas epiteliais respiratrias Receptor -adrenrgico cido silico acetilado em glicoproteinas Receptor do factor de crescimento epidermal
O local na superficie do virus que reconhece o receptor pode ser: Uma proteina estrutural da cpside ou um arranjo de tais proteinas. Em algusn virus, o local de ligao encontra-se no fundo de uma depresso superficial. Este local capaz de ligar a projeces da clula hospedeira mas no pode ser alcanado por anticorpos; Glicoproteinas do invlucro; Projeces especiais como fibras que se extendem dos cantos de icosaedros adenovirus ou espiculas de virus com invlucro. Por exemplo, no caso do virus influenza, as espiculas hemaglutinina parecem estar envolvidas na ligao ao receptor na clula do hospedeiro e reconhece cido silico.
Penetrao de Viries Animais

Os virus penetram na membrana plasmtica e entram na clula hospedeira pouco depois da adsoro e a remoo da cpside e libertao do cido nucleico viral ocorre durante ou pouco depois da penetrao. Todo o processo desde a penetrao at remoo total da cpside pode demorar de minutos a horas.
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Os mecanismos de penetrao e remoo da cpside devem variar com o tipo de virus porque os virus diferem bastante em estrutura e modo de replicao: Virus com invlucro entram na clula de um modo diferente dos virus ns; Alguns virus injectam apenas os seus cidos nucelicos, enquanto outros devem assegurar que uma RNA ou DNA polimerase associada com o virus tambm entra na clula hospdeira ao mesmo tempo que o genoma viral.
possivel a existncia de trs mecanismos de entrada: 1. Penetrao directa de virus ns Pelo menos alguns virus ns, como poliovirus, sofrem um alterao da estrutura da cpside durante a adsoro membrana plasmtica. Assim, apenas os seus cidos nucelicos so libertados no citoplasma;
2. Fuso de virs com invlucro com a membrana plasmtica o invlucro de paramyxovirus, e possivelmente alguns outros virus com invlucro, parece fundri directamente com a membrana plasmtica da clula hospedeira. A fuso podem envolver glicoproteinas de fuso especiais que ligam a proteinas da membrana plasmtica. Depois, ocorrem duas coisas: lipidos membranares rearranjam e as metades adjacentes ao contacto fundem-se, e formam-se poros de fuso revestidos por proteinas. Finalmente, o nucleocpside entra na matriz citoplasmtica do hospedeiro, onde a remoo da cpside completa. Uma polimerase virica, associada como o nucleocpside, comea a transcrever o RNA virico mesmo antes dele sair do cpside;
3. Endocitose de virus com invlucro a maior parte dos virus com invlucor podem entrar nas clulas atravs de endocitose mediada por endocitose para formar vesiculas. Os viries ligam a regies membranares especializadas revestidas no lado citoplasmtico pela proteina clatrina. A ligao do virio desencadeia a formao de vesiculas cheias com o virus e estas fundem-se com lisossomas antes da clatrina ser removida. As enzimas lisossomais ajudam a remoo da cpside e os pH baixo endossomal desencadeia este processo. Pelo menos em alguns casos, o invlucro do virus funde-se com a membrana lisossomal e o nucleocpside libertado na matriz citoplasmtica (as proteinas da capside tero de ter sido parcialmente removidas por enzimas lisossomais). Quando no citoplasma, o cido nucleico viral ser libertado da cpside aps remoo completa ou pode funcionar enaquanto se encontra ligado a componentes da cpside.
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Replicao e Transcrio de Virus Animais de DNA

A parte inicial da fase sinttica, governada por genes iniciais, caracteristica pelo controlo da clula hospedeira e pela sintese de RNA e DNA viral: Alguns virus animais virulentos inibem a sintese de DNA, RNA e proteinas do hospedeiro. No entanto, o DNA celular no normalmente degradado; Virus no virulentos podem estimular a sintese de macromolculas do hospedeiro; A replicao de DNA ocorre normalmente no nucleo da clula hospedeira, excepo dos poxvirus vistor que os seus genomas so replicados no citoplasma; O mRNA, pelo menos o mRNA precoce, transcripto apartir do DNA por enzimas do hospedeiro, excepo do mRNA precoce de poxvirus, que sintetizado pela polimerase viral.
Os principais virus de DNA de animais so os seguintes:
Os parvovirus, com um genoma composto por uma pequena molcula de ssDNA com cerca de 4800 bases, so os virus de DNA mais simples. O genoma to pequeno que dirige a sintese de apenas trs polipptidos, todos componentes do cpside:
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O virus deve fazer uso de genes sobrepostos para que os trs genes se encaixem numa molcula to pequena. Assim, as sequncias de base dos trs genes so lidas em open-reading frames diferentes; Como o genoma no codifica nenhuma enzima, o virus deve usar enzimas da clula hospedeira para todos os processos biossintticos; Assim, o DNA viral apenas capaz de se replicar aps ser transformado em cadeia dupla e durante o periodo S do ciclo celular, que quando a clula hospedeira replica o seu DNA.
Os herpesvirus so um grande grupo de virus icosadricos, com invlucro e dsDNA responsveis por muitas doenas humanas e animais importantes. O seu genoma uma pea linear de DNA com cerca de 160000 pares de bases em tamanho e contem pelo menos 50100 genes: 1. Imediatamente aps a remoo da cpside, o DNA transcripto pela RNA polimerase do hospedeiro pata formar mRNAs; 2. Isto dirige a sintese de vrias proteinas precoces, principalmente enzimas regulatrias necessrias para a replicao do DNA viral; 3. O DNA circulariza e a replicao com uma DNA polimerase especifica do virus comea no nucleo da clula hospedeira 4 horas aps a infeco; 4. A sintese de DNA do hospedeiro gradualmente abranda durante a infeco virica letal, mas nem todas as infeces por herpes resultam na morte celular imediata.
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Os poxvirus como o virus vaccinia so os maiores virus conhecidos e so morfologicamente complexos. O seu dsDNA possui cerca de 200 genes: O virus entra atarvs de endocitose mediada por receptores em vesiculas revestidas por clatrina, e o nucleo central escapa do lisossoma e entra na matriz citoplasmtica; O nucleo contem tanto DNA como uma RNA polimerase dependente de DNA que sintetiza mRNAs precoces, um dos quais dirige a produo de uma enzima que completa a remoo do cpside viral; A DNA polimerase e outras enzimas necessrias para a replicao de DNA so tambm sintetizadas inicialmente no ciclo replicativo e a replicao comea cerca de 1,5 horas aps a infeco; Quando a replicao de DNA comea, a transcrio de mRNA tardio iniciada; Muitas proteinas tardias so proteinas estruturais usadas na construo do capside.
Os hepadnovirus, como o virus da hepatite B, so bastante diferentes dos outros virus de DNA no que diz respeito replicao do genoma. Eles apresentam genomas de dsDNA circular mas replicam-no usando a enzima transcriptase reversa: Aps infectarem, o seu DNA libertado no nucleo; A transcrio ocorre no nucleo usando RNA polimerase do hospedeiro e fornece vrios mRNAs, incluindo um grande RNA de 3,4 kb; Os RNAs movem-se para o citoplasma e so traduzido para produzir proetinas viricas como as proteinas centrais e uma polimerase que apresenta trs actividades (DNA polimerase, transcriptase reversa, Rnase); Depois, o grande RNA associa-se com a DNA polimerase e proteinas centrais para formar uma particula virica imatura; A transcriptase reversa subsequentemente transcreve o RNA usando uma proteina primer para formar uma cpia de DNA do +RNA; Aps quase toda a molcula de RNA ser degradada pela Rnase, o fragmento de RNA que se mantem serve como um primer para a DNA polimerase copiar o DNA e formar dsDNA. Finalemente o nucleocpside completo.
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Replicao e Transcrio de Virus Animais de RNA

Os principais virus de RNA de animais so os seguintes:
Os virus de RNA so muito mais diversos nas suas estratgia reprodutivas do que os virus de DNA. A maior parte dos virus de RNA pode ser introduzido em quatro grupos gerais com base nos seus modos de replicao e transcrio, e as suas relaes com o genoma da clula hospedeira: 1. Virus de ssRNA positivo os picornavirus como poliovirus so os mais bem conhecidos. Usam o seu genoma RNA como uma mRNA gigante e os ribossomas do hospedeiro sintetizam um pptido enorme que depois clivado ou processado por enzimas codificadas pelo hospedeiro e pelo virus para formar os polipptidos adequeados;
2. Virus de ssRNA negativo - como o genome complementar sequncia de bases do mRNA, virus como orthomyxovirus e paramyxovirus devem usar uma RNA polimerase dependente de RNA associada ao virus, ou transcriptase, para sintetizar mRNA;
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3. Virus de dsRNA constituem os reovirus e carregam uma RNA polimerase dependente de RNA associada com o virus que copia a cadeia negativa do genoma para gerar mRNA. Mais tarde uma polimerase codificada pelo virus constinua a transcrio;
4. Retrovirus virus como o virus da imunodeficincia humana possuem genomas ssRNA mas diferem dos outros virus de RNA no facto de sintetizarem mRNA e replicarem o seu genoma por meio de intermedirios de DNA. O virus tem uma DNA polimerase dependente de RNA ou transcriptase reversa (RT) que copia +RNA para formar uma cpia de DNA. A transferncia de RNA feita pelo virus e serve como o primer necessrio para a sintese de cidos nucleicos. A transformao de RNA em DNA ocorre em dois passos. Primeiro, a transcriptase reversa copia +RNA para formar um hibrido RNA-DNA. Depois um componente da transcriptase reversa degrada as cadeias de +RNA e deixa a de DNA. Aps sintetizar DNA, a transcriptase reversa copia esta cadeia para produzir um dsDNA que capaz de dirigir a sintese de mRNA e novas cpias de +RNA do virio. O dsDNA formado capaz de se inserir no DNA do hospedeiro e por vezes podem criar clulas tumorais.
A natureza da replicao do RNA tambm varia com o tipo de material gentico. O RNA viral replicado na matriz citoplasmtica do hospedeido: Virus de ssRNA, excepto retrovirus, usam uma replicase viral que converte o ssRNA em dsRNA designado forma replicativa. A cadeia apropriada deste intermedirio dirige depois a sintese de novos genomas de RNA viaris. Isto , a replicao governada pelo principio da complementariedade. A cadeia de genoma parental dirige a sintese de uma cadeia complementar, que depois serve como um modelo para a sintese de novos genomas virais; Reovirus diferem deste padro. O virio contem 10 a 13 diferentes dsRNA, cada codificando um mRNA. Tarde no ciclo reprodutivo, uma cpia de cada mRNA associa-se com outro mRNA e proteinas especiais para formar um grande complexo. Os RNAs neste complexo so depois copiados pela replicase viral para forma um genoma de cadeia dupla que incorporado num novo virio.
Tendo em conta todas as estratgia de obteno de mRNA tanto por virus de RNA como por virus de DNA, existe a classificao de Baltimore, que divide os virus em sete grupos dependendo do tipo de estratgia e de cido nucleico presente no virus:
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Sintese e Montagem da Cpside Viral em Animais

Alguns genes tardios dirigem a sintese de proteinas da cpside e estas fazem auto-montagem espontaneamente para formar a cpside tal como na morfognese do bacteriofago: Pr-capsides vazias so primeiro sintetizadas; O cido nucleico depois inserido por um mecanismo desconhecido.
O local de morfognese varia com o virus, sendo observados grandes agrupamentos paracristalinos de viries completos ou pro-capsides nos locais de maturao virica.
Virus Virus de DNA Adenovirus Hepadnavirus Herpesvirus Papilomavirus Parvovirus Poliomavirus Poxvirus Virus de RNA Coronavirus Orthomyxovirus Paramyxovirus Picornavirus Reovirus Retrovirus Rhabdovirus Togavirus Replicao de cidos nucleicos Nucleo Citoplasma Nucleo Nucleo Nucleo Nucleo Citoplasma Citoplasma Nucleo Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma e nucleo Citoplasma Citoplasma Montagem da cpside Ncleo Citoplasma Membrana nuclear Nucleo Nucleo Nucleo Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Membrana plasmtica Citoplasma Citoplasma Membrana usada no invlucro
Reticulo endoplasmtico Nucleo
Golgi e Reticulo endoplasmatico Membrana plasmtica Membrana plasmtica
Membrana plasmtica Membranas plasmtica e intracitoplasmticas Membranas plasmtica e intracitoplasmticas
A montagem da cpside de virus com invlucro geralmente semelhante aquela de virus nus, excepto no caso do poxvirus. Estes so montados no citoplasma por um processo complexo e lento que comea com o enclausuramento de uma poro da matriz citoplasmtica atravs da construo de uma
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nova membrana. O DNA recem sintetizado condensa, passa atravs da membrana e move-se para o centro do virus imaturo. A construo do nucleoide e do corpo eliptical ocorre na mebrana.
Libertao do Virio de Virus Animais

Os mecanismos de libertao do virio diferem entre virus nus e com invlucro: 1. Os viries nus parecem ser libertados por lise da clula hospederira; 2. Em contraste, a formao de invlucro e a libertao de viries com invlucro so normalmente processos concorrentes e a clula do hospedeiro continua a libertao do virio por algum tempo. No caso dos viries com invlucro, primeiro, proteinas codificadas pelo virus so incorporadas na membrana plasmtica. Depois, o nucleocpside simultaneamente libertado e o invlucro formado por brotamento da membrana:
Libertao do virus influenza
Em vrias familias, uma proteina M especial ou proteina matriz liga a membrana plasmtica e ajuda no brotamento; Apesar da maior parte dos invlucros ter origem na membrana plasmtica, em herpesvirus, o brotamento e a formao de invlucro normalmente envolve o invlucro nuclear; O reticulo endoplasmtico, o Golge e outras membrana internas podem tambm ser usada para formar invlucros.
Libertao do virus HIV
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Infeco Litica e Dano Celular

Uma infeco que resulta na morte celular uma infeco litica. Os virus animais so capazes de danificar as clulas do hospedeiro de vrios modos e na maior parte das vezes isto leva morte da clula hospedeira: 1. Efeitos citopticos alteraes degenerativas microscpicas ou macroscpicas nas clulas e tecidos do hospedeiro, resultando normalmente de infeces virais. Existem sete mecanismos possiveis de dano da clula hospedeira: 1. Muitos virus so capazes de inibir a sintese de DNA, RNA e proteinas do hospedeiro. Virus citocidas (e.g., picornavirus, herpesvirus e adenovirus) so particularmente activos nesta tarefa. No entanto, o mecanismo de inibio ainda no claro; 2. Os lisossomas celulares podem ser danificados, resultando na libertao de enzimas liticas e destruio celular; 3. Infeces por virus podem alterar drasticamente as membranas plasmticas atravs da insero de proteinas especificas do virus de modo que as clulas infectadas so atacadas pelo sistema imune. Quando infectadas por virus como herpesvirus e virus do sarampo, mais de 50-100 clulas podem fundir-se num clula gigante, anormal e polinucleada, ou sincicio designada policaricito. Isto possiveml porque as proteinas expressas na superficie das clulas actuam como ligandos virais para receptores na clula do hospedeiro, fazendo com que a clula infectada actue como um virus;
4. Altas concentraes de proteinas de vrios virus (e.g., mumps virus e virus influenza) so capazes de ter efeito txico directo nas clulas e organismos; 5. Estruturas intracelulares designadas corpos de incluso so formadas durante muitas infeces por virus. Estes podem resultar do agrupamento de subunidades ou viries dentro do nucelo ou do citoplasma (e.g., corpos de Negri nas infeces de raiva). Estes podem tambm conter componentes celulares como ribossomas (infeces por adenovirus) ou cromatina (herpesvirus). Independentemente da sua composio, estes corpos de incluso so capazes de corromper directamente a estrutura celular; 6. Rupturas cromossmicas podem resultar de infeces pode herpesvirus e outros;
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7. A clulas hospedeira pode no ser directamente destruida mas transformada numa clula maligna por transformao neoplsica.
Corpos de incluso pelo virus bola (setas)
Corpos de incluso pelo herpes virus (no citoplasma e nucleo)
preciso ter em conta que mais de um destes mecanismos podem estar envolvidos num efeito citoptico.
Infeces Virais Persistentes, Latentes e Lentas

Podemos classificar dois tipos principais de infeco: 1. Infeco aguda so rpidas e duram um curto periodo de tempo. o caso de infeces pelo virus influenza, por exemplo. o que ocorre numa inflamao; 2. Infeco persistente so infeces que podem durar anos devido ao facto do virus persistir no hospedeiro. Existem vrios tipos, entre eles: Infeces virais crnicas o virus quase sempre detectvel e os sintomas clinicos podem tanto estar ausentes como ser mdios durantes longos periodos de tempo. Exemplos so o virus da hepatite B (hepatite srica) e o virus HIV; Infeces virais latentes o virus pra de replicar e mantem-se dormente durante um periodo antes de se tornar activo de novo. Exemplos soo o virus herpes simplex, o virus varicella-zoster, o citomegalovirus e o virus Epstein-Barr. O virus herpes simplex tipo 1 normalmente infecta crianas e depois torna-se dormente nos gnglios do sistema nervoso e nos mais tarde pode ser activado, por exemplo. O mesmo pode ser dito para o virus da varicela, que infecta crianas e depois mais tarde pode voltar a ser activado em casos de stress.
As causas da persistncia e da latncia podem ser multiplas, apesar de alguns mecanismos precisos ainda serems desconhecidos:
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O genoma do virus pode ser integrado no genoma do hospedeiro; Os virus podem tornar-se menos antognicos e, assim, menos susceptiveis ao ataque pelo sistema imunitrio; Os virus podem mutar-se para formas menos virulentas e que se replicam mais lentamente. Por vezes, uma mutao de deleco produz uma particula que no capaz de se replicar mas abranda a replicao normal do virus, reduzindo assim o dano do hospedeiro e establecendo uma infeco crnica.
Para alm disso, um pequeno grupo de virus causa infeces que se desenvolvem muito lentamente, normalmente designadas infeces lentas, nas quais os sintomas levam anos a emergir. No entanto, muitos virus lentos podem no ser virus de todo, mas sim pries.
Virus e Cancro
O cancro um dos problemas mdicos mais srios e o foco de grande investigao: Tumor um crescimento de tecido resultanto de uma neoplasia ou crescimento e reposduo anormais de novas clulas devido a uma perda de regulao.
As clulas tumorais apresentam formas aberrantes e membranas plasmticas alteradas que contm antignios tumorais distintos. Estas clulas invadem tecidos vizinhos para formar massas celulares desorganizadas. Muitas vezes, estas clulas perder actividades metablicas especializadas caracteristicas de diferentes tecidos e baseiam-se bastante no metabolismo anaerbicos. Esta reverso a um estado mais primitivo ou menos diferenciado desigana anaplasia. Existem dois tipos principais de tumores no que diz respeito ao padro geral de forma ou crescimento: 1. Tumor benigno quando as clulas se mantm no local onde a neoplasia ocorreu para formar uma massa compacta; 2. Tumores cancerosos ou malignos so capazes de se espalhar activamente por todo o corpo num processo designado metstase, muitas vezes flotoando no sangue e establecendo tumores secundrios. Alguns cancros no so slidos, mas sim suspenses de clulas. Por exemplo, as leucemias so compostas por leuccitos malignos que circulam por todo o corpos. De facto, vrios tipos de cancros surgem de uma variedade de tipos celulares e podem atingir todos os tipos de organismos.
Ser de esperar, apartir da grande diversidade de cancros, que existam muitas causas de cancro: Algumas esto directamente relacionadas com virus; Possivelmente mais de 30-60% dos cancros podem estar relacionados com a dieta; Muitos quimicos na nossa vizinhana so carcinognicos e podem causar cancro induzindo mutaes genticas ou interferindo com a diferenciao celular normal.
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A carcinogenese um processo complexo em vrios passo: 1. Pode ser iniciada por um quimico, normalmente um mutagnio, mas um cancro no parece desenvolver-se at pelo menos mais um evento desencadeador (possivelmnete a exposio a outro quimico) ocorrer; 2. Genes causadores de cancro, oncogenes, esto directamente envolvidos e podem ter origem na prpria clula ou ser contribuidos por um virus. Muitos dos oncogenes esto envolvidos na regulao do crescimento e da diferenciao celulares, por exemplo, codificando partes de factores de crescimento que regulam o crescimento celular.
Vrios cancros podem surgir atravs de diferentes combinaes de causas. Assim, no ser supreendente que alteraes no desenvolvimento de cancro possasm surgir com a idade porque uma pessoa mais velha ter sido exposta a carcinognios e outros factores causadores por um longo periodo de tempo. Para alm disso, a defesa imune tambm ser mais deficiente numa pessoa mais velha. Apesar de se saber que os virus podem causar cancro em animais, bastante dificil provar que este o caso com cancros humanos devido ao facto de se ter de usar mtodos e indirectos e no se poder aplicar completamente os postulados de Koch. No entanto, por vezes possivel obter uma boa correlao entre a presena de um virus e o cancro pelos segunintes mtodos: Tentar encontrar particulas e componentes viricos em clulas tumorais usando tecnicas como microscopia electrnica, testes imunolgicos e ensaios enzimticos; Isolar virus cancerigenos suspensos pelo cultivo em culturas tecidulares e outros animais.
At agora, os virus foram relacionados na gnese de pelo menos oito cancros humanos: 1. Virus Epstein-Barr um dos virus cancerigenos mais bem estudados. um herpesvirus e a causa de dois cancros. O linfoma de Burkitt um tumor maligno do maxilar e do abdomen encontrado em crianas da frica central e o carcinoma nasofaringeal tambm pode ser causado por este virus. Tanto particulas viricas como o seu genoma j foram encontrados em clulas tumorais e pacientes com o linfoma de Burkitt tambm apresentam niveis elevados de anticorpos sricos para o virus. Parece que por alguma razo uma pessoa tambm deve ter tido malria para desenvolver o linfoma e factores ambientais tambm devem ter um papel importante no seu desenvolvimento. Por exemplo, nos Estados Unidos, a prevalncia deste virus elevada mas o linfoma no observado, talvez devido a baixa incidncia de malria;
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2. Virus da hepatite B parece estar associado com uma forma de cancro hepatico (carcinoma hepatocelular) e pode estar integrado no genoma humano; 3. Virus da hepatite C causa cirrose do figado, o que pode levar a cancro hepatico; 4. Herpesvirus humano 8 est associado com o desenvolvimento de sarcoma de Kaposi; 5. Papilomavirus humano algumas estirpes esto envolvidas no desenvolvimento de cncro do clo do utero; 6. Retrovirus pelo menos dois (o virus linfotrpico de clulas T humano tipo I (HTLV-1) e o HTLV2, parecem ser capazes de causar cancro, leucemia de clulas T adeulta e leucemia de hairy-cell, respectivamente. Parece que os virus apresentam vrios mecanismos de oncogenese: Os virus podem fornecer e inserir os seus prprios oncogenes clula. O virus do sarcoma Raus (um retrovirus) apresenta um gene src que codifica um tirosina cinase. Esta enzima localiza-se principalmente na membrana plasmtica e fosforila o aminocido tirosina de vrias proteinas celulares. Como a actividade de muitas proteinas regulada por fosforilao e vrios oncogenes tambm codificam para proteinas citases, muitos cancros podem resultar pelo menos parcialmente devido actividade cinase alterada. Os virus HTLV-1 e HTLV-2 parecem transformar clulas T produzindo uma proteina regulatria que por vezes activa genes envolvidos na diviso celular tal como estimulanto a reproduo viral;
Virus V. sarcoma felino V. sarcoma murino V. leucemia murino V. sarcoma rato Oncogene viral fms, kit fos, mos, raf abl ras
A insero do virus no genoma da clula interfere na expresso de um oncogene alguns virus oncognicos carregam um mais promotores ou enhancers bastante efectivos. Se estes virus se integrarem prximo de um oncogene celular, o promotor ou enhancer ir estimular a sua transcrio, levando a cancro. Neste caso, o oncogene ser necessrio para o crescimento celular normal e apenas causa cancro quando funciona bastante rapidamente ou no momento errado. Por outro lado, a insero do virus tambm pode diminuia a expresso de supressores tumorais.
No caso do papilomavirus, este virus apresenta no seu genoma genes para as proteinas da cpside mas tambm dois genes (E6 e E7) que se ligam a proteinas que contralam o ciclo celular e corrompem a habilidade das clulas infectadas controlarem a sua proliferao: E6 estimula a destruio de p53, impedindo a apoptose que seria induzida por esta proteina aps o dano celular; E7 liga Rb e inibe a capacidade das clulas se dirigirem para a fase G0 do ciclo celular.
A insero do genoma do papilomavirus normalmente ocorre prximo de locais frgeis do genoma humano, mas no existem locais especificos aparentes para a insero. Aps a insero, os genes E6 e E7 so continuadamente mantidos mas outras pores do DNA viral podem ser eliminados ou a sua
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expresso inibida. A perda de expresso dos genes estruturais do virus e genes repressores pode ser critica para a progresso maligna do tumor. Assim, a manuteno de E6 e E7 necessria para que o cancro prossiga.
PROTOZORIOS
Definio e Importncia dos Protozorios

Os microorganismos designados protozorios so: Protistas eucariotas unicelulares; Quimioorganoheterotrficos; Sem parede celular; Geralmente mveis.
Estes organismos distinguem-se das algas por serem quimioorganoheterotrficos e dos fungos por no apresentarem parede celular. Como vivem na gua, devido a este ultimo facto, so mais sensiveis presso osmtica.
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Os protozorios tm um papel bastante importante na natureza. Por exemplo, constituem grande parte do fitoplancton, pequenos organismos que flutuam e que so uma importante ligao nas cadeias alimentares aquticas e redes alimentares dos ambientes aquticos. Os protozorios so tambm uteis em estudos bioquimicos e biolgicos pois muitas das vias bioquimicas usadas pelos protozorios esto presentes em todas as clulas eucariotas. Para alm disso, algumas das doenas animais e humanas mais importantes so causadas por protozorios, podendo ser definidos quatro grupos principais de protozorios que incluem patognios para o Homem:
Grupo Ciliados Amibas Caracteristicas comuns Movem-se e alimentam-se por cilios; Reproduo assexuada, por fisso binria; Possibilidade de conjugao Movem-se e alimentam-se por pseudpodes Reproduo assexuada, por fisso binria (diviso multipla nos cistos) Movem-se por flagelos Reproduo assexuada, por fisso binria No tm orgos de locomoo aparentes Parasitas intracelulares obrigatrios Pordem ter reproduo sexuada Podem necessitar de mais do que um hospedeiro para completar o ciclo de vida Doenas Balantidiase Desinteria amebiana Giardiase Tricomonase Leishmaniose Tripanossomiase Malria Toxoplasmose Coccidioses
Flagelados
Esporozorios
Estrutura, Morfologia e Movimento

Como os protozorios so clulas eucariotas, em vrios aspectos a sua morfologia e fisiologia a mesma das clulas dos animais multicelulares: Ribossomas; Ncleo; Reticulo endoplasmtico; Complexo de Golgi; Mitocndrias; Lisossomas; Citoesqueleto de actina, miosina e microtubulos (permitem a capacidade de endo- e exocitose); Etc...
Contudo, como so muito primitivos, muitos no apresentam uma organizao to complexa como a das clula eucariotas mais superiores, e como todas as funes vitais devem ser realizadas na clula, algumas caracteristicas morfolgicas e fisiolgicas so unicas das clulas protozorias: Ectoplasma em algumas espcies, o citoplasma semislido ou gelatinoso, dando alguma rigidez ao corpo celular. As bases dos flagelos ou cilios e as suas estruturas fibrilares encontramse aqui embebidas;
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Pelicula constutui a membrana plasmtica e as estruturas imediatamente por baixo dela; Endoplasma uma rea dentro do ectoplasma. mais fluida e granular em composio e contem a maior parte dos organelos; Hidrogenossomas - a maior parte dos protozorios anaerbicos (como Trichonympha, que vive no intestino de trmitas) no apresentam mitocndrias, nem citocromos e tm um ciclo de Krebs incompleto. Contudo, alguns apresentem estes pequenos organelos delimitados por uma membrana que contm uma via de transferncia de electres unica na qual uma hidrogenase transfere electres para protes formando hidrognio molecular.
Alguns protozorios apresentam um nucleo e outros apresentam dois ou mais nucleos idnticos. Para alm disso, outros protozorios apresentam dois tipos de nucleos distintos: Macronucleo quando presente, tipicamente maior e encontra-se associado como actividades trficas e processos de regenerao; Micronucleo diploide e est envolvido tanto na recombinao gentica durante a reproduo como na regenerao de macromolculas.
Um ou mais vacuolos esto muitas vezes presentes no citoplasma dos protozorios, e podemos tre de trs tipos: Vacuolos contrcteis funcionam como organelos osmorreguladores nos protozorios que vivem em ambientes hipotnicos, como lagos de guas fresca. O balano osmtico mantido por expulsa continua de gua. Muitos protozorios marinhos e espcies parasiticas so isotnicas ao seu ambiente e no apresentam tais vacuolos; Facuolos fagociticos so notaveis em espcies holozoicas e parasiticas e so o local de digesto de alimentos; Vacuolos secretrios normalmente contm enzimas especificas que desempenham vrias funes.
Alguns protozorios no so mveis, no entanto, a maior parte pode mover-se por um de trs tipos de organelos locomotrios: Pseudpodes so extenses citoplasmticas encontradas em amibas que so responsveis pelo movimento e captura de alimento, e podem existir vrios tipos. a presena de citoesqueleto que permite este movimento; Flagelo este um flagelo diferente do bacteriano pois estas clulas so eucariotas, sendo constituidos por microtubulos; Cilios so tambm diferentes dos bacterianos apresentando uma estrutura semelhante ao flagelo e cilios eucariotas. No devemos confundir estas estruturas com as fimbrias ou pili bacterianas.
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Flagelo bacteriano
Flagelo e cilios eucariotas
Reproduo dos Protozorios

A maior parte dos protozorios reproduzem-se assexuadamente mas alguns so tambm capazes de exercer reproduo sexuada. Os mtodos mais comuns de reproduo assexuada so: Fisso binria o mtodo mais comum e, durante este processo, o nucleo primeiro sofre mitose e depois o citoplasma divide-se por citocinese para formar dius individuos idnticos. Normalmente, diferentes grupos de protozorios apresentam eixos de diviso caracteristicos. Diviso multipla normalmente o genoma multiplicada vrias vezes, formando uma clula multinucleada. Depois, pode ocorrer diviso multipla por formao de vrios eixos de diviso. Tal como na fisso binria, os eixos variam com o grupo de protozorios.
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Diviso multipla
Diviso binria
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O mtodo mais comunm de reproduo sexuada a conjugao. Neste processo existe uma troca de gmetas entre protozorios emparelhados de tipos complementares. A conjugao mais prevalente em protozorios ciliados e o exemplo mais bem estudado Paramecium caudatum: No inicio, duas unidades ciliadas fundem as sua peliculas num ponto de contacto e macromolculas em cada uma das unidades so degradadas; Os micronucleos individuais dividem-se duas vezes por meiose para formar quatros pro-nucleos haploides, trs dos quais so desintegrados; O pro-nucleo restante divide-se de novo mitoticamente para formar dois nucleos gameticos, um estacionrio e outro migratrio; Depois, os ciliados separam-se, os nucleos gamticos fundem-se e o nucleo zigtico resultante sofre trs rondas de mitose; Os oito nucleos resultantes apresentam diferentes destinos: um nucleo retido como um micronucleo, trs outros so destruidos e quatros desenvolvem-se em macronucleos; Cada ciliado separado sofre agora diviso celular e eventualmente progenia como um macronucleo e um micronucleo formada.
Protozorios Ciliados
Os protozorios ciliados so um grupo caracterizado pela presena de cilios, que so idnticos en estrutura aos flagelos mas tipicamente mais curtos e presentes em muito maior numero com um padro ondulatorio tambm diferente do do flagelo:
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Os cilios ocorrem em todos os membros do grupo (apesar de alguns os poderem apresentar apenas durante um determinado periodo do seu ciclo de vida) e so bastante uteis no movimento na gua, adeso, alimentao e sensao.
Os ciliados so um dos grupos mais importantes de protozorios, vivendo em quase qualquer local que apresente gua: Lagos; Oceanos; Rios; Solos; Etc..
Os ciliados apresentam vrios membros ectossimbitios e endossimbiticos, tal como alguns parasitas obrigatrios e oportunistias. Estes protozorios tendem a ser grandes clulas, sendo que alguns atingem 2 mm em comprimento e alguns so dos protozorios mais complexos em estrutura. Uma caracteristica bastante importante dos ciliados a sua habilidade de capturar vrias particulas num curto periodo de tempo pela aco de cilios volta da cavidade bucal (citostoma): O alimento primeiro entra no citostoma e passa para os vacuoles fagociticos que se fundem com lisossomas aps se desligarem do citostoma; O contudo do vacuolo digerido quando o vacuole acidificado e os lisossomas libertam enzimas digestivas para o seu interior; Aps o material digerido ser absorvido para o citoplasma, o vacuole funde-se com uma regio especial da pelicula e liberta o seu material desnecessrio para o exterior.
A maior parte dos protozorios ciliados apresentam dois tipos de nucleos: Micronucleo pequeno diploide e contem os cromossomas somticos normais. Divide-se por mitose e transmite informao gentica atravs de meiose e reproduo sexuada; Macronucleo maior derivado do micronucleo por uma srie de passos complexos. Aqui encontram-se corpos de cormatiba, cada content muitas cpias de apenas um ou dois genes. assim poliploide e divide-se por elongao e depois constrio. Produz mRNA para dirigir a sintese proteica, mantendo funes celulares rotineiras e controlando o metabolism cellular normal.
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Alguns coliados reproduzem-se assexuadamente por fisso binria transversa, formando duas clulas filhas iguais. No entanto, a maior parte dos ciliados tambm se reproduz por conjugao, como descrito anteriomente. Apesar da maior parte dos ciliados viver livremente, existem formas simbiticas, e podemos ter protozorios ciliados a viver como comonesais inofensivos (e.g., Entodinium no rumen de carneiro, e Nyctotherus no colon de sapos). No entanto, outros ciliados so parasitas restritos (e.g., Balantidium coli vive no intestine de mamiferos, e Ichthyophthirius vive na gua onde capaz de se ligar a espcies de peixes produzindo ctio).
Ichthyophthirius multifillis como agente do ctio (ou doena do ponto branco) em peixes
Balantidium coli Balantidium coli uma espcie parasitica de protozorios ciliados que causa a doena balantidiase e o unico membro do grupo dos parasitas ciliados conhecido como patognico para humanos. Este protozorio apresenta dois estados de desenvolvimento diferentes: Fase trofozoito nesta fase, os dois nucleos esto visiveis. O macronucleo mais longo e com uma forma de salsicha e o micronucleo esfrico encontra-se junto a ele, normalmente escondido pelo primeiro. Uma abertura, conhecida como peristoma, na extremidade enterior leva ao citostoma. a forma activa, vegetativa, e capaz de vive rem animais de sangue quente; Fase cistica os cistos so mais pequenos que os trofozoitos e apresentam uma parede resistente de uma ou duas camadas. Normalmente, apesna macromoleculas e por vezes cilios e vacuoles contrcteis so visiveis no cisto. a forma latente.
Trofozoito
Cisto
Balantidium o unico protozorio ciliado conhecido a infectar humanos. A balantidiase uma doena zoonotica e adquirida por humanos via transmisso fecal oral apartir do hospedeiro normal, o porco, onde assimptomtico. gua contaminada o modo mais comunm de transmisso.
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O Balantidium coli vive no ceco e colon de humanos, porcos, ratos e outros animais e no prontamente transmissivel de uma espcie de hospedeiro para outra porque requer um period de tempo para se ajustar flora simbitica do novo hospedeiro. Assim, o seu ciclo de vida o seguinte: 1. A infeco ocorre quando o hospedeiro ingere um cisto, o que normalmente ocorre durante a ingesto de gua ou alimentos contaminados; 2. Assim que o cisto ingerido, ele passa atravs do sistema digestive do hospedeiro; 3. Enquanto o cisto recebe alguma proteco da degradao pelo ambiente acidico do estmago atraves do uso da sua parede exterior, ele destruido a pH inferior a 5, permitindo que viva em estmagos de pessoas malnutridas; 4. Assim que o cisto alcana o intestino grosso, trofozoitos so produzidos; 5. Os trofozoitos colonizam depois o intestino delgado, onde vivem no lumen e alimentam-se da flora intestinal; 6. Alguns trofozoitos invadem a parede do colon usando enzimas proteoliticas e multiplicam-se, e alguns regressam ao lumen; 7. No lumen, os trofozoitos desintregam-se ou formam cistos; 8. A formao de cistos desencadeada pela desidratao dos components intestinais e normalmente ocorre no intestine delgado distal, mas tambm pode ocorrer fora do hospedeiro nas fezes; 9. Agora na sua forma matura cistica, os cistos so libertados no ambiente onde podem infectar um novo hospedeiro. Os trofozoitos de Balantidium coli produzem enzimas proteoliticas (hialuronidase) que quebram e digerem o epitlio intestinal, o que provoca disenteria: Desenvolve-se ulcerao do colon o que permite a infiltrao de linfcitos e leuccitos polimorfonucleares, podendo ocorrer diarreia com uma frequncia de 20 minutos; Hemorragias e infeces bacterianas secundrias desenvolvem-se depois; Em casos mais srios, ocorre perforao do intestino e do apendice seguida de morte.
Infeces por Balantidium em individuos imunocompetentes no se manifestam, mas raramente pode causar uma doena sria do tracto gastrointestinal. Ela capaz de prosperar no tracto gastrointestinal enquanto existe um balance entre o protozorio e o hospedeiro sem causar sintomas disenteriacos. A infeco ocorre com maior probabilidade em pessoas mal nutridas devido a baixa acides do estmago ou em pessoas com sistemas imunes comprometidos.
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Balantidium coli na mucosa intestinal
Protozorios Que se Movem por Emisso de Pseudopodes: Amibas

Centenas de espcies de amibas so encontradas por todo o planeta tanto em gua doce como em gua salgada, mas podem tambm ser encontrada no solo: Muitos tipos de amibas so parasitas de animais; A sua reproduo ocorre por fisso, ou por diviso directa em duas clulas de volume igual; As amebas no apresentam parede cellular, flagelo, meiose e qualquer forma de sexualidade; Sofrem mitose por um mecanismo semelhante aos outros eucariotas.
As amibas movem-se por meio de pseudopodes. Estes so projeces citoplasmticas que se extendem e puxam a amiba para a frente ou engulfam particulas de alimento. Uma amiba lana um pseudpode para a frente e move-se na sua orientao. Microfilamentos de actina e miosina semelhante aos encontrados nos musculos esto associados com este movimento. Como os pseudopods se podem forma rem qualquer ponto do corpo cellular, a clula capaz de se mover em qualquer direco. A sua estrutura a seguinte: Os organelos e o citoplasma da clula esto envoltos numa membrane cellular, obtendo o seu alimento por fagocitose; As amibas apresentam um unico pseudpode grande e tubular na sua extremidade anterior e vrios pseudopods secundrios ao longo da clula; Podem conter um ou mais nucleos; Apresentam um vacuole contractile para manter o equilibrio osmtico; Os alimentos recolhidos pela amiba so armazenados e digeridos em vacuolos; Apresentam uma forma varivel.
Como a maior parte das clulas, as amibas so afectadas negativamente pela presso osmtica excessive causada prla gua extramente salina ou diluida. As amibas previnem o influx de sale m gua salina, resultando numa perda de gua, enquanto que numa gua extremanente diluida a clula internaliza gua para os seus vacuolos, aumentando de volume (podendo mesmo rebentar).
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Em ambientes que so potencialmente letais para a clula, uma amiba pode tomar uma forma dormente, assumindo uma forma normalmente esfrica e como uma membrane protectora desginada cisto. A clula mantem-se neste estado at encontrar condies mais favorveis. Em algumas espcies parasiticas, como Entamoeba histolytica, os cistos permitem que a amiba seja resitente digesto pelos seus animais hospedeiros.
Entamoeba histolytica Entamoeba histolytica uma protozorio parasita anaerobico, que infecta principalmente humanos e outros primatas, sendo causadora da doena amibiase Mamiferos como ces e gatos podem ser infectados transientemente, mas parecem no constribuir significativamente para a transmisso. Este protozorio apresenta dois estados de desenvolvimento diferentes: Trofozoito esta forma tem uma aparncia amiboide e tem cerca de 15-30 micrometro de dimetro, apesar de algumas estirpes mais invasivas poderem ser maiores. O organismo tem um unico nucleo com um cariossoma pequeno distinto central. O endoplasma granular fino pode conter eritrcitos ingeridos. A cromatina nuclear igualmente distribuida ao longo da periferia do nucleo; Cisto so esfricos, com uma parede refractile. O citoplasma contem corpos cromatoides que so corados de escuro e 1 a 4 nucleos com um cariossoma central e cromatina perifrica igualmente distribuida.
Trofozoito
Cisto
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A infeco por Entamoeba histolytica ocorre por ingesto de cisto em solos e mos contaminadas fecalmente, sendo o seu ciclo de vida o seguinte: 1. O cisto entra no tubo digestive do hospedeiro; 2. O cisto resistente ao ambiente gstrico e passa para o intestine delgado onde se transforma em trofozite; 3. Este divide-se em quarto e depois oito amibas que se movem para o intestine grosso; 4. A maior parte dos organismos so eliminados do corpo com as fezes mas algumas amibas ligam e envadem o tecido mucoso dormando leses nesta; 5. Os organismos formam cistos e so transmitidos pelas fezes, no havendo hospedeiros reservatrio ou intermediarios.
Como o nome sugere, este protozorio patognico, sendo que a infeco pode levar a disenteria amibica ou mesmo a danos hepaticos: Disenteria fulminante; Diarreia com perda de sangue; Perda de peso; Fadiga; Dor abdominal; Amiboma granuloma amobemico, formao de granulao anelar do colon.
A amiba capaz de perfurar a parede intestinal, causando leses e sintomas intestinais, e pode atingir a corrente sanguinea. Apartir daqui, capaz de alcanar diferentes orgos vitais do corpo humano, normalmente o figado, mas por vezes os pulmes, o crebro, o bao, etc. Um resultado comum desta invaso dos tecidos sera um abcesso heptico, que pode ser fatal quando no tratado. Em algumas reas tropicais, mais de metade da populao pode ser infectada e disperso da disenteria amibica pode ser limitada por saniamento e hygiene adequados.
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Protozorios Flagelados
Os protozorios flagelados so um grupo de protozorios caracterizados por possuirem, pelo menos em algum momento do seu ciclo de vida, um ou mais flgaelos para locomao e sensao do mundo externo: Muitos flagelados apresentam uma pelicula firme e fina; A reproduo pode ser assexuada (normalmente por fisso longitudinal) ou sexuada; Os flagelados so divididos taxonomicamente em duas classes: aqueles semelhantes a plantas (fitoflagelados) e aqueles semelhantes a animais (zooflagelados).
Os fitoflagelados apresentam cloroplastos e clorofila enquanto os zooflagelados no apresentam estes constituintes. Estes ultimos podem ser holozicos, saprozoicos ou simbiticos, sendo aqueles mais importantes para estudo no caso dos humanos, pois incluem as espcies com potencial patolgico.
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Giardia lamblia Giardia lamblia um protozorio parasita flagelado que coloniza e se reproduz no intestine Delgado, causando giardiase. Este protozorio encontra-se distribuido por todo o planeta e a fonte mais comum de doena intestinal protozoria nos Estados Unidos e a principal causa de doenas causadas pela ingesto de gua contaminada. Este protozorio apresenta dois estados de desenvolvimento diferentes: Trofozoito tem cerca de 12-15 micrometros e uma forma de meia pra com 8 flagelos arranjados numa simetria bilateral. Existem dois discos de suco localizados anteriormente e o citoplasma contem dois nucleos com dois corpos parabasais, formando um aspecto semelhante a um smile; Cisto so clulas elipsoidais com 9-12 micrometros rodeadas por uma parede suave bem definida. O citoplasma contem quatro nucleos e muitas das estruturas observadas no trofozoito.
Trofozoito
Cisto
Este parasita liga-se ao epitlio por um disco adesivo ventral e reproduz-se por fisso binria. No entanto, a giardiase no se espalha pela corrente sanguinea nem para outras partes do tracto gastrointestinal. Os seus trofozoitos absorvem os seus nutrientes apartir do lumen do intestino delgado e so anaerobios. A giardia infecta humanos, mas tambm um dos parasitas mais comun que infectam ces, gatos e passaros e o seu ciclo de vida o seguinte: 1. A infeco ocorre por ingesto de cistos, normalmente em guas contaminadas; 2. A transformao em trofozoitos ocorre no duodeno e estes colonizam o intestino delgado superior onde podem nadar livremente ou ligar-se ao epitlio mucoso via o seu disco de suco ventral;
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3. Os trofozoitos livres formam cistos enquanto se movem para o final do intestino e ocorre mitose durante este processo; 4. Os cistos so transferidos nas fezes. O homem o principal hospedeiro apesar de outros mamiferos poderem ser tambm infectados e funcionarem como resrvatrios. A infeco por giardia pode ocorrer atravs da ingesto de cistos dormentes em gua e alimentos contaminados ou por via fecal-oral (atravs de pobres prtica de higiene): O cisto capaz de sobreviver durante semanas a meses em guas frias e, assim, podem contaminar poos e sistemas de gua, especialmente guas estagnadas; Podem ocorrer em reservatorios de gua e persistem aps o seu tratamento, pois so resistentes aos mtodos comuns usados.
A colonizao do intestino resulta em inflamao e atrofia das vilosidades intestinais, com reduo da capacidade absorptiva do intestino. Em humanos, a infeco assimptomtica apenas em 50% das vezes. Os sintomas da infeco incluem: Diarreia; Indisposio; Flatulncia; Esteatorreia (formao de fezes volumosas, acizentadas, com grandes quantidades de cidos gordos); Dor gstrica; Nauseas; Diminuio do apetite; Vomitos; Perda de peso.
Em individuos saudveis, a condio auto-limitante, apesar da infeco poder ser prolongada em pacientes que so imunocomprometidos, ou apresentem uma secreo gstrica diminuida. Assim, nos casos dos protozorios que causam infeces intestinais, temos: Espcies Balantidium coli, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia; Transmisso via fecal-oral; Preveno boa higiene individual e comunitria; Diagnstico pesquisa de cistos nas fezes; Tratamento metranidazol e outros nitromidazois (inibem a sintese de cidos nucleicos pelo parasita).
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Kinetoplastidea: Tripanosomatideos Os quinetoplastideos so um grupo de protozorios flagelados, incluindo um numero de parasitas responsveis por srias doenas em humanos e outros animais, tal como vrias formas encontaradas em ambientes aquticos e do solo. Distinguem-se de outros flagelados por apresentarem: Um quinetoplasto, um grnulo que contem DNA localizados numa nica mitocndria e associado com a base flagelar.
A maior parte apresenta um flagelo direita e outro esquerda, sendo que este ultimo pode ou no estar ligado lateralmente clula e muitas vezes usado na adeso e deslizamento em superficies. Um grupo de quinotoplastideos, os tripanosomatideos, apenas apresentam um unico flagelo emergente e incluem vrios gneros exclusivamente parasiticos como: Leishmania causa da leishmaniose; Trypanosoma causa da doena de sono e da doena de Chagas.
Os tripanosomatideos apresentam citostomas reduzidos ou ausentes, alimentamdo-se inteiramente atravs de absoro, e quinetoplastos mais pequenos do que os outros tipos de parasitas deste grupo. Normalmente, apresentam ciclos de vida complexos, envolvendo mais de um hospedeiro (ciclo de via heteroxnico) e passam por variadas etapas morfolgicas.
Parasitas do sangue e dos tecidos. Leishmania spp Leishmania um gnero de protozorios tripanosomatideo, e o parasita responsvel pela doena leishmaniase. espalhado atravs da fmea de uma pequena mosca (sandfly) do gnero Phlebotomus no Novo Mundo e do gnero Lutzomyia no Novo Mundo. Estes insectos funcionam como hospedeiro secundrio sendo o principal hospedeiro um vertebrado. Vrias espcies de Leishmania so patognicas para o homem:
Espcie L. major L. tropica L. aethiopica L. mexicana L. braziliensis L. donovani L. infantum L. chagasi Distribuio geogrfica Norte e centro de frica, Mdio Oriente, Sul da frica Mdio Oriente, Sul da frica Etipia Amrica Amrica frica e sia Sul da Europa e Norte de frica Amrica do Sul Patologia Leses cutneas
Leses meso-cutneas Leishmaniose visceral (Kala-azar)
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Estes parasitas podem surgir em duas formas: Promastigota mede 14-20 micros por 1,5-4 microns e mais longa e mais fina do que a forma amastigota. Contem um nucelo central, um quinetoplasto e um flagelo anterior; Amastigota contem um nucleo, um quinetoplasto e um flagelo interno. Tem um corpo oval e tem cerca de 2-5 microns por 1-3 microns.
Promastigota
Amastigota
Os parasitas de Leishmania so transmitido pelas picadas de moscas fmeas infectadas, que injectam uma pequena quantidade de promastigotas infecciosos na pele e o seu ciclo de vida ocorre do seguinte modo: Aps a picada, os promastigotas so opsonizados eficientemente por componentes do soro e recolhidos por macrfagos, onde residem em fagolisossomas e se transformam em amastigotas que se podem replica; Os macrografos infectados so recolhidos pelas moscas quando estas picam o hospedeiro; Estes macrgafos so lisados no aparelho digestivo da mosca, libertando parasitas que se transformam rapidamente em promastigotas no infecciosos em diviso; Estas formas sofrem um processo de ligao parede do sistema digestivo do insecto, libertao e migrao anterior que acompanhada pela sua diferenciao em promastigotas metaciclicos que no se dividem que podem ser transmitidos quando a mosca pica mais um individuo.
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Os sintomas de uma infeco com Leishmania dependem da espcie que causou a infeco e podemos ter trs doenas principais: Leishmaniase visceral (kala-azar) organismos de L. donovani na leishmaniase visceral so rapidamente eliminado do local de infeco, havendo assim uma rara leso local, apesar de terem sido j descritas algumas ppulas em crianas. So localizadas e multiplicam-se nos fagcitos mononucleares do bao, figado, nodos linfticos, medulla ssea, mucosa intestina e outros orgos. Um a quarto meses aps a infeco, ocorre febre acompanhada de arrepios e suores. O bao e o figado tornam-se progressivamente alargados. Com a progresso da doena, a pele desenvolve reas granulomatosas hiperpigmentadas (kala-azar significa doena negra) e a doena crnica torna os pacientes suceptiveis a outras infeces. A doena no tratada resulta em morte;
Leishmaniase visceral
Kala-azar
Leishmaniase cutnea o organismos (L. tropica) multiplica-se localmente, produzindo uma papula, 1-2 semanas ou at 1-2- meses aps a picada. A ppula cresce gradualmente para formar uma ulcera relativamente no dolorosa. O centro da ulcera incrusta enquanto papulas satellite se desenvolvem na periferia. A ulcera sara em 2-10 meses, mesmo quando no tratada mas deixa uma cicatriz desfigurante. A doena pode disseminar no caso de uma funo immune diminuida; Leishmaniase mucocutnea os sintomas inicias da leishmaniase mucocutnea so os mesmos da leishmaniase cutnea, except no caso de nesta doena o organism ser capaz de metastizar e espalhar as leses para os tecidos mucosos (tecidos oral, faringeal e nasal) e levam destruio e a vrias deformaes. Os organismos responsveis so L. braziliensis, L. Mexicana e L. peruviana.
Leishmaniase cutnea
Leishmaniase mucocutnea
A patognese da leishmaniase deve-se a uma reaco immune ao organismos, particularmente pela imunidade mediada por clulas. Examinao laboratorial revela uma leucopenia marcada com relative
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monocitose e linfocitose, anemia e trombocitopenia. Os niveis de IgM e IgG so extremamente elevados devido activao de anticorpos especificos e policlonal. O diagnostico feito com base em: Historial de exposio s sandflies; Sintomas; Isolamento de organismos apartir de uma biopsia da leso, por examinao directa ou cultura; Um teste de pele (teste Montenegro) e a deteco de anticorpos anti-leishmania por imuno-fluorescncia so indicativos de exposio.
Trypanosoma spp Trypanosoma um gnero de quinetopastideos, um grupo de protozoa flagelados parasitas unicelulares. Tal como Leishmania, todos os trypanosomas requerem mais de um hospedeiro obrigatrio para completar o seu ciclo de vida, sendo transmitidos por um vector. Diferentes vectores transmitem diferentes espcies e causam diferentes doenas: T. cruzei tem maior incidncia na Amrica, causa doena de Chagas, sendo transmitido por triatomineos, isectos conhecidos como barbeiros; T. brucei tem maior incidncia em frica, ceusa doena do sono, sendo transmitido por glossina, conhecida como a mosca de Ts-ts.
Estes parasitas, na maior parte das vezes, vivem no sangue e nos tecidos fluidos e so tambm capazes de habitar locais intracelulares no corpo do hospedeiro. O Trypanosoma evolui uma estratgia para escapar resposta imune do hospedeiro implementando uma variao antignica. A variao antignica o processo pelo qual o parasita altera proteinas na sua superficie. Particularmente, os tripanosomas usam a variao antignica numa glicoproteina superficial, cobrindo a sua membrana com a homloga do hospedeiro. Assim, o parasita capaz de se mascarar e escapar resposta imune do hospedeiro. No caso do Trypanosoma brucei, o seu ciclo de vida : A forma metaciclica, infectiva, do tripanosoma injectada no hospedeiro primrio durante uma picada pelo vector, a mosca de ts-ts; O organismo transforma-se numa forma sanguinea de tripanossoma em diviso (tripomastigota) enquanto entra na corrente linftica e sanguinea;
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Esta forma entra no vector durante outra picada e viaja atravs do canal alimentar para a glndula salivar onde prolifera como uma forma critidial (epimastigota) e matura-se para formas metaciclicas infecciosas; Os tripomastigotas so capazes de atravessar as paredes dos capilares sanguineos e linfticos para os tecidos conjuntivos e, numa etapa mais tardia, atravs dos plexos coroides para o crebro e o fluido cerebrospinal; O organismo pode ser transmitido atravs de transfuso sanguinea.
Os sintomas clinicos da infeco por T. brucei so caracteristicos mas diferem em severidade e durao entre estirpes. No entanto, os sintomas so mas severos em caucasianos do que na populao africana local. Classicamente, a progresso da tripanosomiase africana dividem-se em trs etapas: Reaco de picada forma-se uma ulcera no-postular, dolorosa e que causa comicho, em 1-3 semanas aps a picada e dura cerca de 1-2 semanas. No deixa cicatriz; Parasitemia parasitemia e invaso dos nodos linfticos marcada por ataques de febre que comeam 2-3 semanas aps a picada, sendo acompanhada por indisposio, fraqueza, insnia com dor de cabea e linfoadenopatia e edema. Pode desenvolver-se sensibilidade dolorosa nas palmas em alguns caucasianos. Os episdios de febre podem durar entre meses a anos. A parasitemia mais proeminente durante a fase aguda em vez de em episdidos recurrentes; Etapa do CNS marcada por alteraes no carcter e personalidade. Incluem perda de interesse pelo trabalho, evaso de conhecimentos, atitude rabugenta e melanclica alternada com exaltaso, reflexos alterados, etc. Existe um envolvimento progressivo e lento do tecido cardiaco. Estas etapas finais so caracterizadas por um surgimento descontrolado de sono. A morte resulta de coma, infeco intercurrente ou falha cardiaca.
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O diagnstico feito com base em: Deteco do parasita na corrente sanguinea, secrees linfticas e aspiraes de nodos linfticos aumentados fornece um diagnsticos definitivo de etpas de fase aguda; O parasita no sangue pode ser concentrado por centrifugao ou pelo uso de meio de suporte aninico; O fluido cerebrospinal deve ser sempre examinado; Imuno-serologia pode ser indicativo mas no fornece um diagnstico definitivo.
No caso do Trypanosoma cruzi, o seu ciclo de vida :
A transmisso ocorre durante a picada do insecto, que normalmente pica na rea facial (normalmente desiganado, kissing bug) e tem o hbite de defecar durante a picada; Os tripomastigotas metaciclicos, contidos no material fecal, ganham acesso ao tecido mamifero atraves da ferida que normalmente friccionada pelo individuo que picado; Subsequentemente, os tripomastigotas entram em vrias clulas, incluindo macrfagos, onde se diferenciam em amastigotas e se multiplicam por fisso binria; Os amastigotas diferenciam-se em tripomastigotas no replicativos e as clulas rompem para liberta-los no sangue; Clulas adicionais do hospedeiro, de uma variedade de tipos, so capazes se tornar infectadas e os tripomastigotas mais uma vez formam amastigotas dentro das clulas; Insectos vectore no infectado adquirem o organismo quando se alimentam em animais infectados ou pessoas contendo tripomastigotas circulantes no seu sangue; Dentro do tracto alimentar do vector, os tripomastigotas diferenciam-se para formar epimastigotas e dividem-se longitudalmente no intestino do insecto onde se desenvolvem em tripomastigotas metaciclicos infectivos;
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A transmisso tambm pode ocorrer de Homem para Homem por transfuso sanguinea e pela via transplacentaria.
Mais de uma centena de espcies mamiferas de animais domsticos e selvagens so naturalmente infectadas por T. cruzi e servem como um reservatrio. Os sintomas da doena de Chagas pode ser dividida em trs fases: Leso primria chagoma, surge no local de infeco, dentro de poucas horas aps a picada, e consiste num placa eritromatosa no-porolenta e achatada revestida por uma rea varivel de edema severo. normalmente encontrado na face, plpebras, bochechas, lbios ou conjuntiva, mas tambm pode ocorrer no abdmen ou nos membros. Qando o chagoma primrio ocorre na face, existe um aumento das glndula pr- e post-auricular e submaxilar no lado da picada. A infeco na plpebra, resultante de conjuntivite unilateral e edema orbital (sinal de Romana), a forma mais comum; Etapa aguda surge 7-14 dias aps a infeco. caracterizada por sonolncia, indisposio, exausto aumentada, arrepios, febre, dores sseas e musculares. Outras manifestaes da fase aguda so adenite cervical, axiliar e ilica, hepatomegalia, erupo eritematosa e miocardite aguda. Existe uma reaco edematosa geral associada com linfadenopatia. Miocardite difusa, por vezes acompanhada por pericardite e endocardite aguda, bastante frequente durante a fase inicial da doena. Em crianas, a doena de Chagas pode causar meningo-encefalite e coma. Morte ocorre em 5-10% das crianas. Examinao hematolgica revela linfocitose e parasitemia; Etapa crnica a fase aguda muitas vezes no reconhecida e normalmente resolve-se com pequeno ou nenhum dano imediato e o hospedeiro infectado mantem uma carreira assimptmatica. Uma proporo desconhecida (talvez 10-20%) das victimas desenvolvem uam doena crnica. Alternam entre periodos de remisso assimptomticos e lapsos caracterizados por sintomas observados na fase aguda. Arritmia cardiaca comum. A doena crnica resulta numa funo anromal dos rgos ocos, particularmente o corao, o esfagos e o clon. As alteraes cardiacas incluem insuficincia miocardial, cardiomegalia, disturbios de conduo atrio-ventricular e o sindrome Adam-Stoke. Disturbios peristaltismo levam a mega-esfago e mega-colon.
Sinal de Romana
Mega-esfago e mega-clon
O diagnstico clinico normalmente mais fcil entre crianas em reas endmicas, e pode basear-se em:
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Dilatao cardiaca, mega-colon e mega-esfago em individuos de reas endmicas indicam a presena ou ex-infeco; Diagnstico definitivo requer a demonstrao de tripanosomas por microscopia ou testes biolgicos (em isectos ou ratinho); Anticorpos so muitas vezes detectveis por fixao ou imunofluorescncia e fornecem possiveis diagnsticos.
Protozorios Esporozorios
Os esporozorios caracterizam-se por apresentarem uma etapa de formao de esporos no seu ciclo de vida e por no apresentarem organelos locomotores especiais (excepto nos gmetas masculinos): So parasitas intracelulares obrigatrios; Distinguem-se por uma combinao unica de fibrilhas, microtubulos, vacuolos, e outros organelos, colectivamente designados complexo apical, que se localiza nume extremidade da clula.
O complexo apical contem vrios componentes: Um ou dois aneis polares na terminao apical; O conoide consiste num como de firbras espiralmente arranjadas que se encontram proxmais aos aneis; Microtubulos subpeliculares radiam dos aneis polares e provavelmente servem como elemntos de suporte; Dois ou mais rhoptries extendem-se para a membrana plasmtica e secretam os seus conteudos na superficie da clula. Estas secrees ajudam na penetrao da clula hospedeira; Um ou mais microporos podem funcionar no intake de nutrientes.
Os esporozorios apresentam ciclos de vida complexos nos quais certos estadios ocorrem num hospedeiro (um mamifero) e outros estadios ocorrem num hospedeiro diferentes (normalmente um mosquito): O ciclo de vida possui fases de reproduo assexuada e sexuada; Caracteriza-se por alternar entre geraes haploides e diploides; Em algum ponto da reproduo assexuada, ocorre um processo de esquizogonia. Este consiste num srie de eventos mitticos rpidos produzindo vrios organismos infectivos atravs da formao de vrios brotoamentos uninucleares; A reproduo sexuada envolve a fertilizao de um grande macrogameta feminino por um pequeno gmeta masculino flagelado. O zigoto resultante torna-se um cisto designado oocisto.
Existem vrios esporozorios importantes para a saude do Homem, e podemos distinguir dois grupos de parasitas com propriedades diferentes que causam diferentes patologias em humanos:
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2009/2010 Coccideos Parasitam clulas do epitlio intestinal Mono- ou heteroxnico Hospedeiro(s) vertebrado(s) Isospora, Sarcocystis, Cryptosporiudium, Toxoplasma
Microbiologia geral Hematozorios Parasitam clulas do sangue Heteroxnico Hospedeiro vertebrado e invertebrado Plasmodium
Dentro destes grupos, dois parasitas so de grande importncia: Plasmodium causa da malria; Toxoplasma causa da toxoplasmose.
Plasmodium Plasmodium um gnero de protozorios parasitas e infeco por estes organismos conhecida como malria. So conhecidas cerca de 200 espcies deste gnero e novas espcies continuam a ser reconhecidas. Das mais de 200 espcies de Plasmodium conhecidas, pelo menos 10 infectam humanos e outras espcies podem infectar animais, incluindo macacos, roedores, aves e rpteis. As espcies que so responsveis pela malria em humanos so: Plasmodium falciparum; Plasmodium vivax; Plasmodium ovale; Plasmodium malariae.
Todas as espcies de Plasmodium que causam malria em humanos so trasmitidas por espcies de mosquito do gnero Anopheles. No entanto, espcies de mosquitos do gnero Aedes, Culex, Culiseta, Mansonia e Theobaldia so tambm capazes de transmitir malria mas no a humanos. Estima-se que existem cerca de 200 milhes casos globais de malria levando morte de mais de um milho de pessoas por ano:
P. falciparum e P. malariae so as espcies mais comuns de parasita da malria e so encontradas na sia e em frica;
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P. vivax predomina na Amrica Latina, India e Paquisto; P. ovale quase exclusivamente encontrada em frica.
O parasita da malria passa por vrios estadios durante o seu ciclo de vida, no entanto, as formas mais importantes so: Esporozoito a forma que infecta o hospedeiro mamifero. So clulas que se desenvolvem nas glndulas salivares do mosquito, deixam-no durante a picada e entram no figado onde se multiplicam; Merozoito - o resultante da multiplicao dos esporozoitos no figado. Infectam eritrcitos e depois reproduzem-se assexuadamente. Este processo leva destruio dos eritrcitos e, assim, os merozoitos podem ir infectar outras clulas sanguineas; Trofozoitos constituem as clulas no interior dos eritrcitos e tm uma forma anelar, com cerca de 1-2 microns, apesar de se poderem encontrar outras formas; Gametocito a forma sexual do parasita e muita maior em tamanho, com cerca de 7-14 microns. Em P. falciparum maior e em forma de banana enquanto outros so mais pequenos e redondos.
Formas intra-eritrocitrias e gametcitrias de Plamodium
Os parasitas da malria so transmitidos pela fmea de mosquito infectada que injecta esporozitos presentes na sua saliva e, assim, o ciclo de vida do parasita o seguinte: 1. Aps picada do insecto, os esporozoitos infectam as clulas do parenquima heptico onde se mantm dormentes (hipnozoitos) ou sofre etapas de esquinozogonia para produzir esquizontes e merogonia para produzir merozoitos;
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2. Quando as clulas do parenquima rebenta, milhares de merozoitos so libertados para o sangue e infectam eritrcitos. P. ovale e P. vivax infectam eritrcitos imaturos enquanto P. malariae infectam eritrcitos maturos. P. falciparum infectam ambos; 3. Nos eritrcitos, os parazitas maturam-se em trofozoitos. Estes trofozoitos sofrem esquizogonia e merogonia nos eritrcitos que resulta numa exploso dos eritrcitos e libertao de merozoitos filhos; 4. Alguns dos merozoitos transformam-se em gametocitos femininos e masculinos enquanto outros entram nos eritrcitos para continuar o ciclo eritrocitico; 5. Os gametcitos so ingeridos pelo mosquito fmea, o gametcitos feminino transforma-se num ovo, fertilizado e forma-se um oocito no intestino; 6. O oocito produz esporozoitos que migram para a gladula salivar e ficam prontos para infectar outro hospedeiro.
O ciclo heptico (extra-eritrocitico) dura cerca de 5-15 dias enquanto o ciclo eritrocitico demora de 4872 horas (P. malariae). A malria pode ser transmitida por transfuso e transplacentariamente. A sintomatologia da malria depende da parasitemia, da presena de organismo em diferentes orgos e da carga parasitria: O periodo de incubao varia geralmente entre 10-30 dias; Quando a carga parasitria comea a ser significante, o paciente desenvolve dor de cabea, lassitude, dor vaga nos ossos e articulaes, arrepios e febre; Enquanto a doena progride, os arrepios e a febre tornam-se proeminantes; Em casos mais extremos, pode ocorrer malria cerebral; Como seria de esperar, h um caso de anemia.
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Plasmodium falciparum efectua replicao intra-eritrocitria sincronizada. Isto , o rebentamento de eritrcitos ocorre ao mesmo momento de todos os outros eritrcitos, sendo que todos os eritrocitos apresentam num determinado momento as mesmas formas de parasita intra-celular. Isto faz com que os sintomas sejas ciclicos, sendo observados casos de febres altas peridicas, por exemplo. Estes sintomas e a procura de intermedirios intra-eritrocitrios permitem o diagnstico de uma infeco por malria. Assim, nos casos de infeces por protozorios transmitidos por insecto, temos: Espcies Leishmania, Trypanosoma, Plasmodium; Distribuio distribuio geogrfica bastante restrita; Preveno inclui controlo de vectores; Diagnstico pesquisa de parasitas no sangue ou tecidos infectados; Tratamento especifico para cada infeco, em geral com baixa eficcia e com elevada toxicidade.
Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii uma espcie de protozorio parasita e o seu hospedeiro definitivo o gato, mas pode tambm ser carregado por vrios animais de sangue quente, como pssaros e mamiferos. Este parasita responsvel pela doena taxoplasmose: Frequentemente pouco importante e auto-limitante mas pode ter efeitos srios ou mesmo fatais num feto cuja me contraiu a doena durante a gravidez ou num individuo imunocomprometido; Est distribuido por todo o planeta e cerca de 20-75% da populao mundial seropositiva sem qualquer episdio sintomtico.
O ciclo de vida normal deste parasita ocorre em gatos e pequenos roedores, apesar do parasita poder crescer em orgos (crebro, olho, musculo esqueltico, etc) de muitos mamiferos e pssaro. Ocorre do seguinte modo: 1. Os gatos ficam infectados pela ingesto de cistos em carne; 2. A decistao ocorre no intestino delgado e os organismos penetram as clulas epiteliais da submucosa onde sofrem vrias geraes de mitose, resultando finalmente no desenvolvimento de micro- (masculino) e macro- (feminino) gametocitos; 3. Os macro-gametocitos fertilizados desenvolvem-se em oocitos que so lanados no lumen intestinal e excretados; 4. Os oocitos formam esporos em ambientes quentes e so infecciosos para uma variedade de animais incluindo roedores e humanos; 5. Os eporozoitos libertados apartir do oocito no intestino delgado penetram a mucosa intestinal e alojam-se em macrfagos, onde se dividem muito rapidamente (da o nome taquizoito) e forma um cisto que pode ocupar tida a clula;
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6. As clulas infectadas rebentam e libertam os taquizoitos para que estes entre noutras clulas, incluindo clulas musculares e nervosas, onde esto protegidas do sistema imune do hospedeiro e se multiplicam muito lentamente (bradizoitos); 7. Estes cistos so infecciosos para carnivoros (incluindo humanos) e, ao menos que o carnivoro seja ingerido por um gado, este um hospedeiro terminal.
Assim, temos que: Taquizoito forma do parasita que se desenvolve rapidamente dentro dos eritrcitos e so libertadas deste quando este explode devido a uma grande quantidade de parasitas. Tm uma forma de pera; Cisto clula infectada e que contm taquizoitos ou bradizoitos; Bradizoitos forma do parasita que se desenvolve lentamente dentro de outras clulas do hospedeiro mamifero, formando cistos, e que podem ser transmitidos aos gatos quando estes ingerem carne.
Taquizoitos
Cisto
Apesar da infeco por Toxoplasma ser comum, ela raramente produz sintomas em individuos normais. As suas consequncias srias so limitadas a mulheres grvidas e hospedeiros imunodeficientes:
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Infeces congnitas ocorrem em cerca de 1-5 grvidas em 100, das quais 5-10% resultam em aborto espontneo e 8-10% resultam em danos srios no crebro e olho do feto. 10-13% dos bebs tero deficincias visuais; Apesar de cerca de 58-70% das mulheres infectadas darem luz um recem-nascido normal, uma pequena proporo dos bebs desenvolver retino-cordite activa ou atraso mental na infncia ou na juventude; Em adultos imunocompetentes, a toxoplasmose pode produzir sintomas semelhantes gripe, por vezes associados a linfoadenopatia; Em individuos imunocompetentes, a infeco resulta em parasitemia generalizada envolvendo o crebro, figado, pulmo e outros orgos, e muitas vezes a morte.
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INTERACO PARASITA-HOSPEDEIRO
RESISTNCIA DEFESA DO HOSPEDEIRO
Viso Geral da Defesa do Hospedeiro

Para estabelecer uma infeco, um microorganismo patognico deve primeiro ultrapassar vrias barreiras superficiais, como enzimas e muco, que so directamente microbicidas ou inibem a ligao dos microorganismos ao hospedeiro. Como nem a superficie da pele nem as cavidades corporais revestidas por muco so ambientes ideais para muitos microorganismos, alguns patognicos devem ultrapassar estas barreiras e passar para os tecidos subjacentes. Qualquer microorganismo que penetra estas barreiras encontra dois niveis de resistncia: 1. Outros mecanismos no especificos (resposta imune inata); 2. Resposta imune especifica. Os vertebrados, incluindo os humanos, so continuadamente expostos a microorganismos e aos seus produtos metablicos, que podem causar doena. Felizmente, estes animais esto equipados com um sistema imune que os protege das consequncias adversas dessa exposio: Sistema imune composto por clulas, tecidos e rgos amplamente distribuidos que reconhecem substncias e microorganismos estranhos e actuam de modo a neutralizar ou destrui-los; Imunidade habilidade geral de um hospedeiro resistir a uma infeco ou doena particular; Imunologia cincia que se centra nas respostas imunes a um desafia estranho e no modo como essas respostas so usadas para resitir infeco.
Existem fundamentalmente dois tipos de respostas imunes aos microorganismos invasores e a material estranho: Imunidade inata oferece resitncia a quelquer microorganismo ou material estranho encontrado pelo hospedeiro vertebrado. Inclui mecanismos gerais herdados como uma parte da estrutura e funo inata do animal, e actua como uma primeira linha de defesa. No apresenta
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memria imunolgica, isto , a resposta no especifica ocorre na mesma extenso cada vez que um microorganismo ou corpo estranho encontrado; Imunidade adquirida especifica, respondendo a um agente estranho particular. As respostas imunes especificas melhoram numa exposio repetida a um agente estranho como virus, bactria e toxina. Substncias que so reconhecidas como estranhas e provocam respostas imunes so designadas antignios. Anticorpos ligam e inactivam um antignio especifico. Outras clulas destroem clulas infectadas por virus.
A imunidade inata e a imunidade adaptativa operam em conjunto para eliminar microorganismos patognicos e outros agentes estranhos. (Para informao mais aprofundada, ver Sebenta de Imunologia.)
Relaes Hospedeiro-Parasita
Se um simbionte vive ou danifica a uma extenso outro organismo (o hospedeiro), ele um organismo parasita, e a relao que mantm designada parasitismo: Nesta relao, o corpo do hospedeiro pode ser visto como um microambiente que protege e suporta o crescimento e a multiplicao do organismo parasita; O organismo parasita normalmente mais pequeno que o hospedeiro e metabolicamente dependente deste.
Existem vrios agentes parasitas entre os virus, bactrias fungos, plantas e animais. No entanto, por convenso, quando o termo parasita usado sem qualificao, este refere-se a um organismo protozorio ou helminta (nematode, trematode). Exsitem vrios tipos de parasitismo: Ectoparasita se um organismo vive na superficie do seu hospedeiro; Endoparasita se um organismo vive no interior do seu hospedeiro.
E os hospedeiros tambm podem ser classificados em quatro tipos: Hospedeiro final hospedeiro no qual o organismo obtem maturidade sexual ou se reproduz;
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Hospedeiro intermedirio um hospedeiro que funciona como um ambeinte temporrio mas essencial para algumas etapas do desenvolvimento; Hospedeiro de transferncia no necessrio para que o ciclo de vida do organismo se complete mas usado como um veiculo para alcanar um hospedeiro final; Hospedeiro reservatrio hospedeiro infectado com um organismo parasita que tambm capaz de infectar humanos.
Como, por definio, os organismos dependem dos seus hospedeiros, a relao simbitica entre o hospedeiro e o parasita dinmica: Quando um parasita est a crescer e se multiplica num hospedeiro, diz-se que o hospedeiro tem uma infeco; A natureza da infeco pode variar amplamente no que diz respeito sua severidade, localizao, e numero de organismos envolvidos, podendo ou no causar doena; Um doena infecciosa uma qualquer alterao do estado de saudo na qual parte ou todo o corpo do hospedeiro no capaz de desempenhar as suas funes normais devido presena de um organismo ou seus produtos.
Um organismo que produz tais doenas dito um patognio e a habilidade do patognio causar doena dita patogenicidade: Patognio primrio qualquer organismo que causa doena num hospedeiro saudvel por interaco directa; Patognio oportunista um organismo que capaz de viver livremente ou como uma parte da microbiota normal do hospedeiro, mas que pode adoptar um papel patognico sob certas condies, como quando o sistema imune est comprometido.
Por vezes, um organismo infeccioso capaz de entrar num estado latente no qual no existe actividade do organismo nem sintomas da sua presena. Esta latncia pode tanto ser intermitente como quiescente: Latncia intermitente exemplificada pelo herpesvirus. Aps uma infeco inicial, os sintomas baixam. Contudo, o virus fica retido no sistema nervoso e pode ser activado semanas ou anos depois por factores como stress ou luz solar; Latncia quiescente o organismo persiste mas mantm-se inactivo por longos periodos de tempo, normalmente anos. Por exemplo, o virus da varicela causa esta doena em crianas e mantm-se depois da doena diminuir. No adulto, sob certas condies, o mesmo virus pode levar a uma doena designada herpes.
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Deste modo, o resultado de uma relao parasita-hospedeiro depende de trs factores principais: 1. Numero de organismos presentes no hospedeiro quanto maior o numero de organismos num hospedeiro, maior a probabilidade de desenvolvimento de doena; 2. Defesas ou grau de resistncia do hospedeiro a resistncia de um hospedeiro pode cair tanto que a sua prpria microbiota pode causar doena; 3. Virulncia do organismo; O termo virulncia refere-se ao grau ou intensidade de patogenicidade, sendo determinado por trs caracteristicas do patognio: Invasividade habilidade do organismo penetrar tecidos adjentes e outros; Infectividade habilidade do organismo establecer focos de infeco; Patogenicidade habilidade do organismo causar dano ao hospedeiro, por exemplo por produo de toxinas ou imunomodulao.
A virulncia muitas vezes medida experimentalmente determinado a dose letal 50 (LD50) ou dose infecciosa 50 (ID50): Estes valores referem-se dose ou numero de patognios que matam ou infectam, respectivamente, 50% de um grupo experimental de hospedeiros num periodo especifico; Quanto menor o valor de LD50 ou ID50 mais virulento o patognio (estirpe A mais virulenta do que a estirpe B).
No entanto, preciso tambm ter em conta que uma doena pode tambm ser o resultado de uma resposta imune exacerbada, e no directamente do efeito de determinados composto txicos.
Patogenicidade de Doenas Microbianas

Os passos para uma infeco por uma bactria patognica incluem: 1. Manuteno de um reservatrio. Um reservatrio um local para viver antes e depois de provocar uma infeco; 2. Ser inicialmente transportada para o hospedeiro; 3. Aderir, colonizar e/ou invadir o hospedeiro; 4. Multiplicar-se (crescer) ou completar o seu ciclo de vida no hospedeiro ou em clulas do hospedeiro; 5. Escapar aos mecanismos de defesa inicias do hospedeiro; 6. Possuir a habilidade de danificar o hospedeiro; 7. Deixar o hospedeiro e voltar ao reservatrio ou entrar num novo hospedeiro. Os primeiros cinco factores influenciam o grau de infectividade e invasividade, e a toxigonicidade tem um papel importante no sexto.
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Manuteno de um Reservatrio de Patognios Todos os patognios bacterianos devem ter pelo menos um reservatrio. Os reservatrios mais comuns para patognios humanos so outros humanos, animais, e o ambiente e estes constituem parte de um ciclo infeccioso. Transporte de Patognio para o Hospedeiro Uma caracteristica essencial do desenvolvimeto de uma doena infecciosas o transporte inicial do patognio microbiano para o hospedeiro: O meio mais bvio feito atravs de contacto directo, de hospedeiro para hospedeiro (tosse, espirro, contacto corporal); Os micrbios podem tambm ser transmitidos indirectamente de vrios modos; Os hospedeiros infectados perdem microorganismos para o seu ambiente. Quando no ambiente, os micrbios podem ser depositados em vrias superficies, apartir dos quais so capazes de ser ressuspendido no ar ou indirectamente transmitidos ao hospedeiro mais tarde; Vectores e fmites (objectos inanimados que albergam e transmitem patognios) tambm podem estar envolvidos.
Aderncia e Colonizao Aps serem transmitidos a um hospedeiro, patognios bacterianos devem ser capazes de aderirem e colonizarem clulas e tecidos do hospedeiro. Assim, neste contexto, define-se: Colonizao estabelecimento de um local para reproduo microbiana no hospedeiro. No resulta necessariamente na invaso ou dano do tecido. Depende da habilidade da bactria competir com sucesso com a microbiota normal do hospedeiro para nutrientes essenciais. Estruturas especializadas (pili, fimbrias, cpsulas) permitem que a bactria compita por locais de adeso essenciais tambm necessrios colonizao.
Os patognios bacterianos e outros no-patognios aderem com alto grau de especificidade a tecidos particulares. Os factores de aderencia, designados adesinas, so uma das razes de especificidade: As adesinas so molculas especializadas ou estruturas na superficie da clula bacteriana que ligam locais receptores complementares na superficie da clula hospedeira.
Fimbrias de E. coli
Vibrios aderidos a epitlio
Fungo aderido por fimbrias
Assim, os principais factores de aderncia em bactrias so:
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Fimbrias estruturas filamentosas que ajudam a ligar a bactria a outras bactrias ou superficies slidas; Cpsula ou glicoclice uma camada de fibras de exopolissacarideo com uma margem esterna que reveste vrias clulas. Inibe a fagocitose e ajuda na aderncia. Quando a camada bem organizada e no pode ser eliminada designa-se cpsula; Pili estrutura filamentosa que liga procariotas para tranferncia de material gentico; S layer camada mais externa do invlucro celular de algumas archaebactrias e eubactrias que pode promover a aderncia a superficies; Slime layer filme bacteriano que meno compacto do que uma cpsula e facilmente removido; cidos teicoico e lipoteicoico componentes da parede celular em bactrias gram-positivas que ajudam na sua adeso.
Deste modo, estes componentes do patognio constituem factores de virulncia, contribuindo para a patogenicidade ou virulncia dos micrbios. Para alm disso, existem molculas nos patognios que permitem a aderncia e estes factores so especificos para varias espcies: E. coli enteropatognica apresenta intimina, que a liga s clulas hospedeiras. Estes patognios apresentam tambm sistemas de secreo do tipo III que lhes confere virulncia mas de modo diferente da adeso e colonizao.
Invasividade do Patognio A entrada nas clulas e tecidos do hospedeiro uma estratgia especializada usada por muitos patognios bacterianos para sobrevivncia e multiplicao. Os patognios muitas vezes penetram activamente as membranas mucosas e o epitlio aps a adeso superficie epitelial e isto pode ser feito alcanado atraves da produo de substncias liticas que alteram o tecido do hospedeiro atravs de: 1. Atacando as substncias e as membranas basais dos integumentos e que limitam o intestino; 2. Degradando complexos proteinas-carboidratos entre clulas ou na superficie das clulas (o glicoclice); 3. Corrompendo a superficie celular. Por vezes, o patognio bacteriano capaz de penetrar a superficie epitelial por mecanismo passivos no relacionados com o patognio por si s: 1. 2. 3. 4. 5. Pequenos cortes, leses, ou ulceras nas membranas mucosas que permitem uma entrada inicial; Feridas, abrases, ou queimaduras na superficie da pele; Vectores artropodes que criam pequans feridas quando se alimentam; Dano tecidular causado por outros organismos; Vias de internalizao eucariota (endocitose e fagocitose).
Uma vez ultrapassada a membrana mucosa, o patognio bacteriano pode penetrar para tecidos profundos e continua a disseminar atraves do corpo do hospedeiro. Uma via do patognio conseguir isto atraves da produo de produtos especificos e/ou enzimas que promovem a propagao, e constituem factores de virulncia.
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As bactrias podem tambm entrar em pequenos capilares linfticos terminais que revestem as clulas epiteliais. Este capilares emergem em grande vasos linfticos que eventualmente drenam para o sistema circulatrio. Aqui, a bactria tem acesso a todos or rgos e sistemas do hospedeiro.
Ilhas de Patogenicidade Muitas bactrias (Yersinis spp., Pseudomonas aeruginose, Shigella flexneri, Slamonella typhimurium, E. coli enteropatog+enica) so patognicas porque apresentam longos segmentos de DNA, desginados ilhas de patogenicidade, que carregam genes responsveis pela virulncia: Estas ilhas de patogenicidade foram adquiridos durante a evoluo por transferncia de genes horizontal; Um patognio pode ter mais de uma ilha de patogenicidade.
Um excelente exemplo de genes de virulncia carregados numa ilha de petogenicidade so aqueles envolvidos na secreo de proteinas. At agora, cinco vias de secreo de proteinas (tipo I-IV) foram descritos em bactrias gram-negativas: Sistema de secreo tipo III cerca de 20 genes codificam este mecanismo que permite que bactrias gram-negativas secretem proteinas de virulncia para o interior da clula eucariota do hospedeiro.
Ao contrrio de outros sistema secretorios bacterianos, o sistema tipo III desencadeado especificamente por contacto com clulas hospedeiras, o que ajuda a escapar activao de defesas hospedeiras inapropriadas. A secreo destas proteinas de virulncia na clula hospedeira desencadeia uma cross-talk bioquimica sofiticada entre o patognio e o hospedeiro: As proteinas injectadas so semelhantes a factores eucariotas que sinalizam funes de transduo e so capazes de interferir com vias de sinalizao eucariotas;
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A redireco da transduo de sinal celular desarma a resposta imune do hospedeiro ou reorganiza o citosqueleto, estabelecendo nichos subcelulares para colonizao bacteriana.
As ilhas de ptogenicidade normalmente aumentam a virulncia microbiana e no esto presentes em mebros no patognicos do mesmo gnero ou espcie. Um exeplo especifico encontrado em E. coli: A E. coli enteropatognica possui grandes fragmentos de DNA que contm genes virulentos ausentes em E. coli; Alguns destes genes codificam proteinas que alteram os microfilamentos de actina nas clulas intestinais do hospedeiro; Como consequncia, a superficie da clula do hospedeiro altera e desenvolve-se num pedestal ao qual a clula liga fortemente.
Mecanismos Microbianos de Resistncia Defesa do Hospedeiro

Durante o curso da evoluo microbiana e humana, os patognios evoluiram modos de escapar s defesas do hospedeiro. Muitos destes mecanismos so encontrados por todo o mundo microbiana. Escape s Defesas do Hospedeiro Por Virus A patologia associada a uma infeco viral pode ser devida a: 1. Resposta imune do hospedeiro, que ataca clulas infectadas por virus ou produz reaces de hipersensibilidade; 2. Consequncia directa de multiplicao viral nas clulas do hospedeiro. Os virus evoluiram uma variedade de modos para suprimir ou escaparem resposta do sistema imune do hospedeiro. Estes mecanismo esto a comear a ser agora reconhecidos atravs de anlise genmica e funcional de vrios produtos de genes: Mutaes que alteram os antignios expressos superficie; Infeco das clulas do sistema imune, diminuindo as suas funes; Infeco de clulas com niveis baixos de expresso de molculas MHC; Produo de proteinas que inibem as funes das molculas do MHC; Produo de antignios soluveis, que se ligam aos anticorpos neutralizantes.
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Escape s Defesas do Hospedeiro Por Bactrias As bactrias tambm evoluiram vrios mecanismos para escaparem s defesas do hospedeiro. Como as bactrias no tero nada produtivo com a morte do seu hospedeiro ou com a sua prpria morte, a sua estratgia de sobrevivncia centra-se na proteco contra as defeas do hospedeiro em vez da destruio do hospedeiro: 1. Mecanismos de resistncia ao complemento; 2. Mecanismos de resistncia aos fagcitos; 3. Mecanismos de resitncia ao sistema imune adquirido. Para escaparam actividade do complemento, algumas bactrias tm: Cpsulas previnem a activao do complemento; Cadeias de antignio-O alongadas previnem a activao do complemento; Lipooligossacarideos interferem com a formao do complexo de ataque membrana, o que constitui uma resitncia srica.
Para escapar resposta imune especifica, algumas bactrias produzem: Cpsula que no so antig+enicas visto que so semelhantes aos componentes tecidulares do hospedeiro; Variao antignica de antignios de superficie, de modo que os anticorpos especificos so inuteis; Proteases da IgA, que um anticorpo presente nas mucosas. Assim, a ausncia deste anticorpo permite a adeso; Proteinas que interferem com a opsonizao mediada por anticorpos; Hiperestimulao por superantignios.
Antes de uma clula fagocitica ser capaz de fagocitar uma bactria, ela deve primeiro contactar directamente a superficie da bactria. Assim, as bactrias so capazes de resistir fagocitose de vrios modos: Algumas produzem cpsulas, que impedem a fagocitose; Outras produzem proteinas de superficie especializadas (como proteina M) que bloqueiam a adeso do fagcito; Algumas bactrias, como Staphylococcus, produzem leucocidinas que destroem os fagcitos antes da fagocitose poder ocorrer; Certas bactrias, como Streptococcus pyogenes, libertam proteases que quebram o factor C5a do complemento e, assim, inibe a habilidade desta atrair fagcitos para a rea infectada.
Algumas bactrias evoluiram a habilidade de sobreviver dentro de neutrfilos, moncitos e macrfagos. Tais patognios so bastante patognicos porque so insenssiveis a outros mecanismos protectores do hospedeiro mais importantes. Os mecanismos de sobrevivncia dentro de fagcitos so: Escape dos fagossomas antes da fuso com lisossomas, como observado em Listeria monocytogenes, Shigella e Rickettsia; Inibio da fuso do fagossoma com lisossomas;
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Resistncia aos produtos txicos do fagolisossoma, como observado em Mycobacterium tuberculosis, talvez em parte devido sua caracteristica parede celular;
Anlise Microbiolgica da gua

A gua para consumo humano um meio potencialmente eficaz para a transmisso de patognios. Muitos desses patognios tm um ciclo de transmisso fecal-oral: So bactrias, virus ou protozorios que causam doenas intestinais ou cuja infeco se inicia por via oral e em que existe um eliminao atravs das fezes.
Um dos objectivos das anlises microbiolgicas da gua detectar a presena de bactrias do intestino (mesmo que no patognias) de modo a determinar se houve ou no contaminao da gua com material fecal. Apesar da maior parte dos patognio poderem ser detectados directamente, usam-se geralmente organismos indicadores como um indice de possivel contaminao da gua como patognios humanos, e os critrios para escolha de tais indicadores so: 1. A bactria indicadora deve ser adequada para a anlise de todos os tipos de gua: corrente, rio, do solo, apreendida, recreacional, esturiana, mar e desperdicios; 2. A bactria indicadora deve estar presente sempre que patognios entricos esto presentes; 3. A bactria indicadora deve sobreviver mais tempo do que o patognio entrico mais duradouro; 4. A bactria indicadora no se deve reproduzir na gua contaminada e produzir um valor inflacionado;
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5. O procedimento do ensaio para o indicador deve ter grande especificidade. Isto , outras bactrias no devem dar resultados positivos. Em adio, o procedimento deve ter alta sensibilidade e detectar baixos niveis de inidicador; 6. O mtodo de teste deve ser fcil de fazer; 7. O indicador deve ser inofencivo para humanos; 8. O nivel de bactria indicadora na gua contaminada deve ter alguma relao directa ao grau de poluio fecal. As bactrias mais frequentemente estudadas so os coliformes, os enterococcus e o Clostridium perfringens. Os coliformes so definidos como: Bactrias gram-negativo, sendo oxidase negativos, anaerbios facultativos e fermentadores de lactose (com produo de cido e gs em 48 horas a 35C; Crescem em meios contendo sais biliares; Pertencem familia das Enterobacteriaceae e incluem bactrias do gnero Escherichia, Enterobacter e Klebsiella; Constituem cerca de 10% dos microorganismos intestinais humanos e outros animais; Perdem viabilidade em gua fresca a taxas inferiores aos patognios intestinais microbianos principais; Quando no so detectados num volume de 100 mL de gua, a gua considervel potvel, ou adequada para consumo humano.
Infelizmente, os coliformes incluem uma grande gama de bactrias cuja fonte primria pode no incluir o tracto intestinal. Assim, desenvolveram-se testes para a identificao de coliformes fecais, gnero Escherichia, que se destinguem dos coliformes totais pela produo de indol apartir da utilizao de triptofano. Vrios mtodos tm sido utilizados para determinar a presena de coliformes em amostras de gua: Teste do numero mais provavel o mais antigo e ainda usado como mtodo de referncia. Tem a desvantagem de ser moroso e utilizar uma grande quantidade de material; Teste aps filtrao membranar o mais corrente para as guas de consumo, desde que sejam pobres em particulas, que poderiam impedir a utilizao de filtros; Testes que utilizam substratos definidos para detectar enzimas como a galactosidase e a glucoronidase, presentes respectivamente em todos os coliformes e nos coliformes fecais.
A adequao das metodologias regulamentada pelo Instituto Portugus de Qualidade pelo que, para saber qual utilizar, dever ser contactado o IPQ que transpe as regras da International Organization for Standardization (ISO) para a legislao portuguesa. Nos meios aquticos naturais, possivel isolar, no s bactrias, mas virus que as utilizam como clulas hospedeira, os bactriofagos. Tal procedimento pode seguir o j mencionado no capitulos dos virus, pela formao de placas fgicas. No entanto, este mtodo apenas permite quantificar fagos liticos.
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QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA
Desenvolvimento da Quimioterapia
A medicina moderna depende de agentes quimioterapeuticos, agentes quimicos que so usados para tratar doenas: Destroem patognios oi inibem o seu crescimento a concentraes suficientemente baixas para impedir danos indesejados ao hospedeiro; Muitos so antibiticos, produtos microbianos ou seus derivados que so capazes de matar microorganismos suceptiveis ou inibir o seu crescimento; Drogas como sulfonamidas so por vezes designados antibiticos apesar de serem agentes quimioterapeuticos sintticos, no sintetizados por microorganismos.
A era moderna da quimioterapia comeou com o mdico alemo Paul Ehrlich (1854-1915): Argumentou que um quimico com toxicidade selectiva que mataria patognio e no clulas humanas poderia ser eficiente no tratamento de uma doena; Esperou encontrar uma molcula corante txica, uma bala mgica, que se ligaria especificamente aos patognios e os destruia, comeando a experimentar corantes; Em 1904 descobriu um corante vermelho que era eficaz contra trypanosomas que causavam a doena do sono em Africa e que podi ser usada terapeuticamente; Subsequentemente, Ehrlich e um jovem cientista Japons chamado Sahachiro Hata testaram uma variedade de arsnicais em coelhos infectados por sifilis e descubriram que o composto 606, arsefenamina, era activa contra a sifilis.
O sucesso de Ehrlich na quimioterapia da doena do sono e da sifilis estabeleceu o seu conceito de toxicidade selectiva e levou ao teste de centenas de conpostos com potencial terapeutico. Em 1927, o gigante da industria quimica alem, I. G. Farbenindustrie, comeou a pesquisa a longo termo de agentes quimioterapeuticos sob a direco de Gerar Domagk: A companhia forneceu um vasto numero de corantes e outros quimicos que Domagk testou para actividade contra bactrias patognicas e para toxicidade em animais; Durante este programa, Domagk descobriu que um novo corante no era txico para animais e que protegia completamente ratinhos contra streptococci e staphylococci patognicos; Estes resultados foram publicados em 1935, e no mesmo ano os cientistas franceses Jacques e Therese Trefouel mostraram que esse corante era convertido no corpo a sulfanilamida, o verdadeiro factor activo.
A histria da descoberta e desenvolvimento da penicilina, o primeiro antibitico a ser usado terapeuticamente, complexa e fascinante: Apesar da penicilina ter sido descoberta em 1896 por um estudante de medicina francs de 21 anos chamado Ernest Duchesne, o seu trabalho foi esquecido e a penicilina foi re-descoberta pelo mdico escocs Alexander Fleming;
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fleming estava interessado em descobrir algo que mataria patognios desde que trabalhava com infeces de feridas durante a Primeira Guerra Mundial; Um dia em Setembro de 1928, um esporo de Penicilliu notatum caiu acidentalmente na superficie de uma placa de petri exposta antes desta ser inoculada com staphylococci, e uma nova era mdica nasceu; Apesat dos eventos precisos ainda no serem bem conhecidos, parece que Fleming deixou a placa contaminada na bancada do laboratrio enquanto foi de frias; Como os primeiros dias de frias foram frios, os fungo cresceu mais depressa que as bactrias e produziu penicilina; Quando o tempo aqueceu, as bactrias comearam a crescer e foram lisadas; Quando regressou, Flemimg reparou que a colnia de fungo crescia num lado da placa e que as bactrias na vizinhana tinham sido destruidas; Em vez de descartar a placa contaminada, ele deduziu correctamente que o seu contaminante produzia uma substncia difusivel e letal para staphylococci; Ele iniciou esforos para caracterizar o que ele chamou de penicilina e descobriu que um caldo de uma cultura de Penicillium continha penicilina e que o antibitico era capaz de destruir vrias bactrias patognicas; Infelizmente, as experincias seguintes de Fleming convenceram-no que a penicilina no se manteria activa no corpo tempo suficiente para destruir patognios, abandonando a pesquisa.
Em 1939, Howard Florey, um professo de patologia da Universidade de Oxford, testava a actividade bactericida de vrias substncias, incluindo lisossima e sulfonamidas. Aps ler o trabalho de Fleming, um dos ajudantes de Florey, Ernst Chain, obteve Penicillium cultivado por Fleming e purificou penicilina com a ajuda do bioquimico Norman Heatley. Estes cientistas mostraram a eficcia da penicilina injectando-a em ratinhos. A descoberta da penicilina estimulou a procura de outros antibiticos: Em 1944, Selman Waksman anunciou que tinha encontrado um novo antibitico, estreptomica, produzida pela actomycete Streptomyces griseus; Microorganismos produtores de cloranfenicol, neomicina, terramicina e tetraciclina foram isolados em 1953.
A descoberta dos agentes quimioterapeuticos e o desenvolvimento de drogas novas, mais potentes, transformou a medicina moderna e aliviou de modo significativo o sofrimento humano. Para alm disso, os antibiticos provaram ser excepcionalmente uteis na pesquisa microbiolgica.
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Caracteristicas Gerais das Drogas Antimicrobianas

Para ter sucesso, um agente quimioterapeutico deve ter: Toxicidade selectiva deve matar ou inibir o patognio microbiano enquanto o dano do hospedeiro o minimo possivel.
O grau de toxicidade selectiva pode ser expresso em termos de: 1. Dose terapeutica, o nivel de droga necessria para tratamento clinico de uma infeco particular; 2. Dose txica, o nivel de droga no qual o agente torna-se demasiado txico para o hospedeiro. Assim, o indice terapeutico a razo da dose txica em relao dose terapeutica. Deste modo, quanto maior o indice terapeutico, melhor ser o agente quimioterapeutico: Uma droga que corrompe uma funo microbiana no encontrada nas clulas eucariotas animais tem uma melhor toxicidade selectiva e um indice terapeutico maior; Uma droga pode ter um baixo indice terapeutico quando inibe o mesmo processo nas clulas do hospedeiro ou danifica a clula hospedeira noutros modos. Estes efeitos indesejados, efeitos secundrios, so de vrios tipos e envolvem quase qualquer rgo.
Como os efeitos secundrios podem ser severos, os agentes quimioterpaeuticos devem ser administrados com grande precauo!
As drogas variam bastante no seu especrto de aco: Drogas de espectro reduzido so efectivas apenas contra uma variedade limitante de patognios; Drogas de largo espectro atacam muitos tipos diferentes de patognios.
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Para alm disso, podem tambm ser classificadas de acordo com o grupo geral de patognios contra os quais actuam, mas alguns agentes podem ser usados contra mais de um grupo: Anti-bacterianos; Anti-fungicos; Anti-protozorios; Anti-virais.
Os agentes quimioterapicos podem ser sintetizados por microorganismos ou manufacturados por procedimentos quimicos independentes de actividade microbiana: Antibiticos naturais so os mais usados e so completamente sintetizados por uma de poucas bactrias ou fungos; Antibiticos sintticos as mais comuns so sulfonamidas, trimetoprima, cloranfenicol, ciprofloxacina, isoniazida e dapsone. Muitas drogas anti-virais e anti-protozorios so sintticos; Antibiticos semi-sintticos so antibiticos naturais que foram quimicamente modificados pela adio de grupos quimicos extra para os tornar menos susceptiveis inactivao por patognios. Exemplos so a ampicilina, carbenicilina e meticilina. como os
Os agentes quimioterpicos, desinfectantes, podem ser tanto:
Agentes estticos (static) inibem reversivelmente o crescimento. Se o agente for removido, os microorganismos podem recuperar e crescer de novo; Agentes cidas (cidal) apesar de matarem o patognio alvo, a sua actividade depende da concentrao e o agente pode ser apenas esttico a baixos niveis.
Um efeito de um agente tambm varia com a espcie alvo: um agente pode ser cida para uma espcie e esttico para outra. Como os agentes estticos no destroem directamente o patognio, a eliminao da infeco depende dos mecanismos de resistncia do prprio hospedeiro. Um agente esttico pode no ser eficiente se a resistncia do hospedeiro demasiado baixa.
Determinao do Nivel de Actividade Antimicrobiana

A determinao da eficincia antimicrobiana contra um patognio especifico essencial para uma terapia adequada: Os testes so capazes de mostrar quais os agentes que so mais eficientes contra um patognio e fornece uma estimativa para a dose terapeutica adequada.
Testes de Susceptibilidade Diluio Os testes de susceptibilidade de diluio podem ser usados para detrminar: Valor de concentrao inibitria minima (MIC) concentrao minima de droga que inibe o crescimento de um aptognio particular;
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Valor de concentrao letal minima (MLC) concentrao minima de droga que mata um patognio particular.
Neste teste, usa-se uma srie de tubos de caldo (normalmente caldo Mueller-Hinton) que contem concentraes de antibitico que variam entre 0,1-128 g/mL preparados e inoculados com numeros standard de organismo teste: A concentrao de antibitico mais baixa resultante em nenhum crescimento apes 16-20 horas de incubao a MIC; O MLC pode ser obtido se os tubos que no apresentam crescimento forem cultivados em meio fresco sem antibitico. A concentrao mais baixa de antibitico apartir da qual os microorganismos no recuperam e crescem quando trasferidos para o meio fresco a MLC.
Testes dos Discos de Difuso Se um patognio aerobico ou facultativo a crescer rapidamente como Staphylococcus ou Pseudomonas est a ser testado, uma tcnica de discos de difuso pode ser usada para salvar tempo e meio. O principio no qual esta tcnica se baseia muito simples: Quando um disco impregnado de antibitico colocada em agar previamente inoculada com a bactria teste, o disco perde antibitico e este difunde-se rapidamente atravs di agar, produzindo um gradiente de concentrao no agar; O antibitico est presente a altas concentraes perto do disco e afecta mesmos microorganismos minimamente susceptiveis (organismos resistentes crescem volta do disco); Quando a distncia ao disco aumenta, a concentrao de antibitico cai e apenas parognios mais susceptiveis so danificados; Uma zona ou um anel limpo est presente volta de um disco de antibitico aps a incubao se um agente inibir o crescimento bacteriano; Quanto maior a zona volta do disco, mais susceptivel o patognio.
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A largura do anel tambm uma funo da concentrao inicial do antibitico, sua solubilidade e sua taxa de difuso atravs do agar. Assim, esta dimenso no pode ser usada para comparar directamente a eficincia de dois antibiticos diferentes. Normalmente, o teste de discos de difuso mais usado o mtodo de Kirby-Bauer, que foi desenvolvido nos inicios dos anos 1960s na Universidade de Washington: Uma colnia de patognio a crescer em cultura isolada e depois usada para inocular um tubo de caldo de cultura; A cultura incubada por algumas horas a 35C at esta se tornar ligeiramente tuva e diluida para igualar a turvidez strandard; Esta cultura usada para inocular a superficie toda de uma placa de agar Mueller-Hinton; Aps a superficie de agar estar seca, os discos de antibiticos teste so colocados na placa; A placa imediatamente colocada num incubador a 35C; Aps cerca de 16-18 horas de incubao, os dimetros das zonas de inibio so medidas em mm.
Os resultados do teste de Kirby-Bauer so interpretados usados uma tabela que relaciona o dimentro e o grau de resistncia microbiano:
Quantificao da Concentrao de Droga no Sangue A droga deve alcanar uma concentrao no local de infeco acima da MIC do patognio para ser efectiva. Em casos severos, em doenas de risco de vida, muitas vezes necessrio monitorizar a concentrao de droga no sangue outros fluidos corporais. Isto pode ser alcanado por: Ensaios microbiolgicos; Ensaios quimicos; Ensaios imunolgicos; Ensaio enzimticos; Ensaios cromatogrficos.
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Mecanismos de Aco dos Agentes Antimicrobianos

importante saber algumas coisas quanto aos mecanismos de aco de drogas porque tal conhecimento ajuda na explicao da natureza e do grau de toxicidade selectiva de drogas individuais e por vezes ajuda no design de novos agente quimioterapeuticos. As drogas antimicrobianas so capazes de danificar os microorganismos de vrios modos, intereferindo com vrios processos celulares: Sintese de parede celular e.g., penicilinas, cefalosporinas, vancomicina, e bacitracina. Estas drogas tm altos indices terapeuticos porque as paredes celulares bacterianas tm uma estrutura unica no encontrada nas clulas eucariotas; Sintese de proteinas e.g., estreptomicina, gentamicina, eritromicina, e muitas outras. Inibem a sintese proteica ligando o ribossoma procariota. Como estas drogas distinguem entre ribossomas procariotas e eucariotas, o seu indice terapeutico bastante alto, mas no to favorvel como os inibidores da sintese de parede celular. Algumas drogas ligam a subunidade 30S (pequena), enquanto outros ligam a subunidade 50S (maior) do ribossoma. Vrios passos diferentes nos mecanismos de sintese proteica podem ser inibidos; Sintese de cidos nucleicos as drogas que inibem estes processos ou danificam as paredes celulares normalmente no so to selectivamente toxicos como os outros antibiticos. Isto deve-se ao facto dos eucariotas e procariotas no diferirem muito no que diz respeito aos mecanismos de sintese de cidos nucleicos e de membranas. Bons exemplos de drogas que afectam a sintese de cidos nucleicos ou a estrutura das membranas so as quinolonas e polimixinas; Reaces metablicas vrias drogas actuam como antimetabolitos, bloqueando a funo de vias metablicas por inibirem competitivamente o uso de metabolitos por enzimas chave. As sulfonamidas e outras drogas inibem o metabolismo do cido flico. Estes antibiticos apresentam grande indice terapeutico porque os humanos no so capazes de sintetizar cido flico e devem obt-lo da dieta. A maior parte dos patognios bacterianos sintetizam o seu prprio cido flico e so, assim, susceptiveis a estes inibidores. No entanto, podem existir outros anitmetabolitos envolvidos noutras vias.
Drogas Antibacterianas
Existem vrios quimioterpicos antimicrobianos conhecidos, naturais e sintticos, e muitos deles tm uso clinico ou industrial.
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Sulfonamidas ou Sulfas Um bom modo de inibir ou matar patognios pelo uso de compostos que so anlogos estruturais, molculas estruturalmente semelhantes a intermedirios metablicos: Competem com metabolitos nos processos metablicos devido sua similaridade, mas so diferentes o suficiente para no funcionarem normalmente no metabolismo celular; Os primeiros antimetabolitos usados com sucesso foram as sulfonamidas, descobertas por Domagk.
As sulfonamidas ou sulfas so quimioterpicos sintticos estruturalmente relacionados com a sulfanilamida, um anlogo do cido p-benzico, que usada na sintese do cofactor cido flico:
Quando as sulfanilina ou outra sulfonamida entra numa clula bacteriana, ela compete com o cido p-benzico para o centro activo de uma enzima envolvida na sintese de cido flico, e a concentrao de folato cai; O declino do cido flico prejudicial bactria porque o cido flico essencial para a sintese de pirimidinas e purinas, as bases usadas na contruo dos cidos nucleicos ou noutros constituintes celulares importantes; A inibio resultante leva interrupo do crescimento bacteriano ou morte do patognio.
As sulfonamidas so selectivamente txicas para muitos patognios porque estas bactrias manufacturam o seu prprio folato e no so capazes de o obter do exterior. Em contraste, os humanos no so capazes de sintetizar forlato e devem obte-lo na dieta.
As sulfonamidas no afectam o hospedeiro! A eficincia das sulfonamidas limitada pelo aumento da resitncia a este compostos por muitas bactrias. Alm disso, mais de 5% dos pacientes que recebme drogas sulfas experimentam efeitos secundrios adversos, normalmente na forma de respostas alrgicas (febre, urticria, erupes).
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Quinolonas Um segundo grupo de agentes anitmicrobianos sintticos bastante usado para tratar uma variedade de infeces. As quinolonas so drogas sinteticas que contm o anel 4-quinolona: A primeira quinolona, cido nalidixico, foi sintetizada em 1962; Mais recentemente, uma familia de fluoroquinolonas tem sido produzida; Existem trs ciprofloxacina, norfloxacina e ofloxacina que so bastante usadas nos Estados Unidos e mas fluoroquinolonas tm sido sintetizadas e testadas; As quinolonas so eficientes quando administradas oralmente; Por vezes causam efeitos secundrios adversos, particularmente gastrointestinais.
As quinolonas actuam inibindo a DNA girase bacteriana, ou topoisomerase II, provavelmente ligando o complexo DNA girase: Esta enzima introduz tores negativas no DNA e ajuda a separar as suas cadeias; A sua inibio corrompe a replicao de DNA e a reparao, transcrio, separao do cromossoma bacteriano durante a diviso, e outros processo que envolvem o DNA; As fluoroquinolonas tambm inibem a topoisomerase IV, outra enzima que actua sobre o DNA durante a replicao;
As quinolonas so bactericidas! As quinolonas so drogas de largo espectro. So altamente eficientes contra bactrias entricas como E. coli e Klebsiella pneumoniae. Podem ser usadas como Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas aeruginosa e outros patognio gram-negativos. As quinolonas tambm so activas contra bactrias grampositivas como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e Mycobacterium tuberculosis. Actualmente, as quinolonas tm sido usados para tratar infeces do tracto urinrio, doenas sexualmente transmossiveis causadas por Neisseria e Chlamydia, infeces gastrointestinais, infeces do tracto respiratrio, infeces de pele e osteomielite.
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Penicilinas A penicilina G ou benzilpenicilina, o primeiro antibitico a ser amplamente usado em medicina, apresenta as propriedades caracteristicas da familia das penicilinas: A maior parte derivam do cido 6-aminopencilanico e diferem entre si no que diz respeito cadeia lateral ligada ao seu grupo amino; A caracteristica mais crucial da molcula o seu anel -lactmico, que parece ser essencial para a actividade; A penicilinase, a enzima sintetizada por muitas bactrias resistentes penicilina, destroem a actividade da penicilina hidrolizando uma ligao deste anel.
O mecanismo de aco das penicilinas ainda no est completamente conhecido: A sua estrutura semelhante da D-alanil-D-alanina terminal encontrada na cadeia lateral pptido do peptidoglicano; As penicilinas devem inibir a enzima que cataliza a reaco de transpeptidao devido sua semelhana estrutural, que bloquear a sintese de um peptidoglicano e leva a lise osmtica;
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Este mecanismo consistente com a observao de que as penicilinas actuam apenas em bactrias em crescimento que sintetizam novo peptidoglicano. Contudo, mais recentemente, descobriu-se que as penicilinas so capazes de ligar a vrias proteinas ligadoras de penicilina e podem destruir as bactrias activando as suas prprias enzimas autoliticas. Existe alguma evidncia que as penicilinas matam bactrias mesmo na ausncia de autolisinas ou hidrolases e a lise pode ocorrer depois da bactria perder viabilidade. Assim, as penicilinas podem estimular proteinas especiais designadas bacterial holins para formar buracos ou leses na membrana plasmtica.
O mecanismo da penicilina parece ser mais complexo do que o que inicialmente se pensava! As penicilinas diferem entre si em vrios modos: A penicilina G eficiente contra gonococci, meningococci e vrios patognios grampositivos somo streptococci e staphylococci, mas deve ser administrada por via parentrica porque destruida pela acidez do estmago; A penicilina V semelhante penicilina G, mas mais resistente ao cido e pode ser administrada orralmente; A ampicilina pode ser administrada oralmente e tem um largo espectro de actividade sendo efectiva contra bactrias gram-negativas como Haemophilus, Slamonella e Shigella; As carbanicilina e ticarcilina tambm tm um largo espectro e so particularmente potentes contra Pseudomonas e Proteus; Um numero aumentado de bactrias so resistentes penicilina e uma srie de penicilinas resistentes penicilinase, como meticiclina, nafcilina e oxacilina, so frequentemente usadas contra esses patognicos bacterianos.
Apesar das penicilinas serem os antibiticos menos txicos, cerca de 1-5% dos adultos nos Estados Unidos so alrgicos a estes compostos. Ocasionalmente, um pessoa morrer por uma resposta alrgica violente. Assim, os pacientes devem ser questionados quanto a alergia penicilina antes de comearem um tratamento. Cefalosporinas As cefalosporinas so uma familia de antibiticos originalmente isolados em 1948 do fungo Cephalosporium, e a sua estrutura -lactmica bastante semelhante das penicilinas: Como ser esperado das semelhanas estruturais, as cefalosporinas so semelhantes s penicilinas inibindo a reaco de transpeptidao durante a sintese de peptidoglicano; So drogas de largo espectro frequentemente administradas em pacientes com alergias penicilina; Bactrias resistentes apresentam cefalosporinase que, tal como a penicilinase, quebra uma ligao do anel -lactmico.
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Muitas cefalosporinas so usadas e existem trs grupos ou geraes destas drogas que diferem no espectro da sua actividade: Cefalosporinas de 1 gerao so mais efectivas contra patognios gram-positiva relativamente a gram-negativo; Cefalosporinas de 2 gerao acutam contra muitos patognios gram-negativos como grampositivos; Cefalosporinas de 3 gerao so partivularmente eficientes contra patognios gram-negativos, e muitas vezes tambm alcanam o sistema nervoso.
A maior parte das cefalosporinas (incluindo cefalotina, cefocitina, ceftriaxona e cefaperazona) so administradas por via parentrica. A cefoperazona resistente destruio por -lactamases e efectiva contra muitas bactrias gram-negativas, incluindo Pseudomonas aeruginosa. A cefalexina e a cefixima so administradas oralmente em vez de parentericamente. Tetraciclinas As tetraciclinas so uma familia de antibiticos com uma estrutura com quatro aneis qual uma srie de cadeias laterais esto ligadas: Oxitetraciclina e clorotetraciclina so naturalmente produzidas por algumas espcies de actomycete do genero Stretomyces, outras so dorgas semi-sintricas;
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Estes antibiticos inibem a sintese proteica combinado-se com a pequena subunidade (30S) do ribossma e inibindo a ligao de molculas de aminoacil tRNA ao local A do ribossoma; Devido sua actividade apenas bacteriosttica, a eficincia do tratamento depende da resistncia activa do hospedeiro ao patognio.
As tetraciclinas so antibiticos de largo espectro activos contra bactrias gram-negativas, grampositivas, rickettsiasis, chlamydiae e mycoplasma. No entanto, estes antibiticos so capazes de ligar clcio, o que diminui a sua actividade e induz a descalcificao dos dentes e ssos. Assim, altas doses podem resultar em nausea, diarreia, dentes amarelados em crianas e danos no figado e rins. Estes antibiticos eram muito usados em pecuria como promotores do crescimento, devido ao seu largo espectro prevenindo infeces. Mas devido aos seus efeitos nefastos no hospedeiro (e.g., no humano) esse uso foi proibido. Antibiticos Aminoglicosideos Existem vrios antibiticos aminoglicosideos importantes: A estreptomicina, canamicina, neomicina e tobramicina so sintetizados por Streptomyces, enquanto gentaminica tem origem noutra bactria relacionada, Micromonospora purpurea; Apesar de existir uma variao considervel entre diferentes aminoglocosideos, todos contm um anel ciclohexano e acares amino.
Estes antibiticos ligam pequena subunidade ribossomal e interferem com a sintese proteica de dois modos: Inibem directamente a sintese proteica; Provocam leitura incorreta da mensagem gentica no mRNA.
Os aminoglicosideos so os unicos inibidores da sintese proteica bactericida e tendem a ser mais activos contra patognio gram-negativos: A utilidade da estreptomicina diminuiu bastante devido resistncia droga, mas continua a ser efectiva contra a tuberculose e a peste; A gentamicina usada para tratar infeces por Proteus, Escherichia, Klebsiella e Serratia.
Os aminoglicosideos so txicos e podem causar muitos efeitos secundrios.
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Vancomicina A vancomicina um glicopeptido antibitico produzido por Streptomyces orientalis: Tem uma estrutura em forma de copo e composta por um pptido ligado a um dissacarideo; O antibitico bloqueia a sintese de peptidoglicano inibindo o passo de transpeptidao que liga vrias cadeias de peptidoglicano adjacentes; O peptidoglicano resultante mecanicamente fraco e as clulas lisam osmoticamente; A poro pptida da vancomicina liga especificamente sequencia D-alanil-D-alanina terminal na poro peptida do peptidoglicano; Este complexo bloqueia a aco da transpeptidase.
O antibitico bactericida para Staphylococcus e alguns membros dos gneros Clostridium, Bacillus, Streptocccus e Enterococcus, que constituem estirpes resistentes penicilina. administrada oralmente e intravenosamente, e particularmente importante no tratamento de infeces por staphyloccocus e enterococcus, que so resistentes aos antibiticos. Estirpes resistentes vancomicina de Enterocccus encontram-se espalhadas e recentemente descobriram-se alguns casos de Staphylococcus aureus resistentes. Cicloserina e Bacitracina A cicloserina produzida por Streptomyces e tem uma estrutura semelhante D-alanina: Constitui um inibidor competitivo das enzimas D-alanina racemase e D-alanil-D-alanina sintetase; Inibe, assim, a sintese de peptidoglicano no passo inicial de sintese de D-alanil-D-alanina; No entanto, tem um espectro de aco reduzido e no um antibitico de primeira escolha.
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Por outro lado, a bacitracina produzida por Bacillus e tambm um inibidor da sintese de peptidoglicano, actuando na etapa final em que o bactoprenol reciclado: Inibe o transporte de bactoprenol do exterior da membrana plasmtica para o citosol, impedindo que o ciclo de sintese de peptidoglicano continue; Tem um espectro de aco reduzido, sendo efectivo apenas para gram-positivos e Neisseria; usado praticamente s em aplicao tpica.
Eritromicina e Outros Macrlidos A eritromicina o antibitico macrlido mais frequentemente usado e sintetizados por Streptomyces erythraeus: O macrolido contem um anel lactona de 12 ou 22 carbonos ligado a quatro ou mais acares; A eritromicina normalmente bacteriosttica e liga o 23S rRNA da subunidade 50S ribossomal para inibir a elongao de pptidos durante a sintese proteica; Tem um espectro relativamente largo contra bactrias gram-positivas, mycoplasma e algumas bactrias gram-negativas; usada em pacientes alrgicos penicilina e no tratamento de difteria e diarreia causada por Campylobacter e pneumonia por infeces por Legionella ou Mycoplasma.
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Novos macrolidos so j usados: Clindamicina efectiva contra uma variedade de bactrias incluindo estafilococcie e anaerbios como Bacteriodes; Azitromicina particularmente efectiva contra Chlamydia trachomatis.
Estes antibiticos so capazes de atingir elevadas concentraes no interior das clulas eucariotas, sendo indicados no tratamento de infeces intracelulares. Cloranfenicol Apesar do cloranfenicol ter sido inicialmente produzido apartir de culturas de Streptomyces venezuelae, isso agora feito atravs de sintese quimica: Como a eritomicina, o cloranfenicol liga a 23S na subunidade 50S ribossomal; Inibe a peptidil transferase e, assim, bacteriosttico.
Este antibiticos tem um espectro de aco muito largo mas, infelizmente, txico, podendo levar a reaces alrgicas ou reaces neurotxicas. O efeito secundrio mais comum a depresso temporria ou permanente da funo ssea, levando a anemia aplastica e a um numero diminuido dos leuccitos. O cloranfenicol usado apenas em situaes de risco de vida quando mais nenhuma droga adequada.
Resistncia a Antibiticos
A propagao da resistncia aos antibiticos um dos problemas mais srios do tratamento de uma doena microbiana, havendo vrios mecanismos usados pelas bactrias para adquirir e propagar a sua resistncia.
Mecanismos de Resistncia As bactrias tornam-se resistentes de vrios modos. Um tipo particular de mecanismo de resistncia no est confinado a uma unica classe de drogas. Duas bactrias podem usar diferentes mecanismos de resistncia para escaparem ao mesmo agente quimioterapeutico. Mutantes resistentes esto continuadamente a surgir. Mutantes no so criados directamente por exposio droga:
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1. Os patognios muitas vezes so resistentes simplesmente prevenindo a entrada da droga: Muitas bactrias gram-negativas no so afectadas pela penicilina G porque esta no capaz de penetrar na membrana externa; Alteraes em proteinas de ligao penicilina tambm causam resistncia celular; Uma diminuio da permeabilidade pode levar a resistncia a sulfonamidas; As mycobacterias resistem a vris drogas devido ao elevado conteudo em cidos miclicos numa camada lipidica complexa no exterior do seu peptidoglicano; 2. Uma outra estratgia bombear a droga para o exterior da clula aps esta ter entrado. Alguns patognios tm translocases na sua membrana que expelem as drogas. Como estas bombas so relativamente inespecificas e so capazes de bombear vrias drogas diferentes, estas proteinas transportadoras so bombas de resistncia a multiplas dorgas. Tais sistemas so encontrados em E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium smegmatis e Staphylococcus aureus; 3. Muitos patognios bacterianos resistem ao ataque inactivando drogas atravs de modificao quimica. O exmeplo mais bem conhecido a hidrlise do anel -lactmico de muitas penicilinas pela enzima penicilinase. As drogas podem tambm ser inactivadas por adio de grupos pois organismos resistentes podem fosforilar ou acilar aminoglicosideos e acetilar cloroanfenicois; 4. Como cada quimioterapeutico actua num alvo especifico, resistncia pode surgir quando a enzima ou organelo alvo modificado de modo que j no susceptivel droga. Por exemplo, a afinidade do ribossoma para eritromicina e cloranfenicol pode ser diminuida por alterao da 23S rRNA qual estes ligam; 5. Os microorganismos tambm podem usar como mecanismo de resistncia uma via alternativa aquela que atingida pela actividade do antibitico. Por exemplo, algumas espcies resistentes vancomicina usam um termino peptido no peptidoglicano diferente de D-alanil-D-alanina. Origem e Propagao da Resistncia Os genes para a resistncia a drogas esto presentes tanto no cromossoma como nos plasmideos bacterianos: Mutaes espontneas no cromossoma bacteriano, apesar de no ocorrem muito frequentemente, tornaro a bactria resistente. Normalmente, tais mutaes resultam numa alterao no receptor da droga, no permitindo que esta actue. Muitos mutantes provavelmente so destruidos pelos mecanismos naturais de resistncia do hospedeiro. Contudo, quando um paciente tratado extensivamente com antibiticos, alguns mutantes resistentes podem sobreviver e crescer; Frequentemente, um patognio bacteriano resistente a uma droga porque tem uma plasmideo com um ou mais genes de resistncia, como os plasmideos R. Normalmente, estes genes codificam enzimas que destroem ou modificam as drogas.
Estes plasmideos podem ser transmitidos por conjugao, ou ento, a informao contida no cromossoma bacteriano pode ser transmitida por transduo. Para alm disso, a ressitncia pode
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tambm ser obtida por transformao, o que ocorre quando uma bactria resistente a uma dorga morta por outras causas e liberta o seu conteudo gentico. Assim, a transferncia de resistncia no se limita a bactrias semelhantes:
Por vezes, a resistncia a uma dorga reversivel, sendo isso observado quando uma droga deixa de ser usada por observao de resistncia e anos mais tarde pode voltar a ser usada. Isto deve-se a uma reverso que possivelmente pode ser devida ao facto de o estado natural da bactria ser o mais equilibrado para ela, e no o transformado, no ambiente em que vive.
Deste modo, deve haver uma preveno da energncia de novas resistncias atraves de: Usar os antibiticos em concentraes altas e durante o tempo necessrio para curar a infeco; Quando necessrio, usar vrios quimioterpicos simultneos; Eliminar o uso de antibiticos na criao de animais; Restringir o uso de antibiticos s situaes absolutamente necessrias.
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Frmacos Anti-Virais
bastante dificil encontrar frmacos virais devido dificuldade de encontrar alvos selectivos e possivel toxicidade. Assim, normalmente usa-se designe molecular para tal. Os principais alvos dos frmacos anti-virais so: Bloqueio dos receptores de entrada do virus; Bloqueio da descorticao (e.g., amantadina); Inibio da replicao (maioria dos frmacos disponiveis no momento); Inibio da traduo/modificaes ps-traducionais (e.g., inibidores de proteases); Bloqueio da montagem e libertao; Interferes.
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Mycobacterium leprae lcool-cido resistente

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Klebsiella pneumoniae Colorao negativa

Bacillus cereus Colorao de esporos

Spirillum volutans Colorao do flagelo

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Em todos os casos, a forma da clula bacteriana determinada pela parede celular.

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Estas clulas so morfologicamente mais simples que as clulas eucariotas.

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Os principais organelos eucarioticos so:

Evoluo Microbiana e Diversidade

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Principais Caracteristicas usadas em Taxonomia

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Parede Celular Procaritica

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Clostridium perfringens Gram-positivo

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