Anda di halaman 1dari 23

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN MODUL I ENUMERASI MIKROBA METODE TOTAL PLATE COUNT

KELOMPOK 3 Aprilia Dyah Ayu M. R Fachri Artadi Febry Dahyani (0906515950) (0906515982) ( )

Asisten Tanggal Praktikum Tanggal Disetujui Nilai Paraf

: Ayu Erlinna : 6 Desember 2011 : : :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGY LINGKUNGAN PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN DEPARTEMEN SIPIL FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA 2011

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

I.

TUJUAN

Menghitung jumlah mikroba yang terkandung pada air sampel dengan metode Total Plate Count.

II. TEORI DASAR Karena keperluan berbagai bidang, manusia membutuhkan mikroba untuk dikembangbiakkan di dalam suatu medium. Penanaman dan pertumbuhan mikroba tersebut dinamakan pembiakan mikroba. Dengan menggunakan macammacam medium dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis, dan penentuan jumlah mikroba. Di dalam suatu populasi bakteri tidak semua sel mampu hidup. Yang dianggap sel hidup yaitu sel yang mampu membentuk koloni di dalam agar biakan atau membentuk suspensi dalam larutan biak (Adesahy, 2011). Pertumbuhan didefiniskkan sebagai penambahan jumlah sel atau biomassa yang berurutan dan teratur seiring dengan waktu. Pertumbuhan meliputi jumlah sel, berat kering, kandungan protein, kandungan asam nukleat, dan sebagainya (Syarif Fauzi, 2009).

2.1 Fase pertumbuhan bakteri Fase pertumbuhan bakteri adalah sebagai berikut : 1. Fase lag adalah fase dimana bakteri beradapatasi dengan lingkungannya dan mulai bertambah sedikit demi sedikit. 2. Fase logaritmik adalah fase dimana pembiakan bakteri berlangsung paling cepat. Jika ingin mengadakan piaraan yang cepat tumbuh, maka bakteri dalam fase ini baik sekali untuk dijadikan inokulum. 3. Fase stationer adalah fase dimana jumlah bakteri yang berkembang biak sama dengan jumlah bakteri yang mengalami kematian. 4. Fase autolisis (kematian) adalah fase dimana jumlah bakteri yang mati semakin banyak, melebihi jumlah bakteri yang berkembang biak. Keadaan ini dapat berlangsung beberapa minggu bergantung pada spesies dan keadaan medium serta faktor-faktor lingkungan. Kalau keadaan ini dibiarkan terus menerus, besar kemungkinan bakteri tidak dapat dihidupkan kembali dalam medium baru. Cara menghitung jumlah bakteri untuk membuat grafik pertumbuhan, yaitu dengan

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

metode

penuangan,

penghitungan

dengan

mikroskop

dengan

menggunakan haemocytometer, dan dengan menggunakan turbidometer.

Pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme dalam bahan (makanan), akan menyebabkan perubahan-perubahan tertentu yaitu : perubahan yang bersifat fisik dan dan kimiawi, sebagai contoh yaitu: konsistensi bahan menjadi lunak, timbul gas atau aroma tertentu dan zat racun yang membahayakan. Sel-sel yang dapat mampu terus hidup inilah yang dihitung dengan berbagai metode untuk menetapkan jumlah sel hidup. Pada jumlah total sel ikut dihitung semua sel yang nampak atau dapat dihitung dengan cara lain, sel-sel mati dan cacat ikut dihitung. Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung jumlah koloni dapat diketahui penyebaran bakteri yang ada pada bahan. Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat dihitung dengan berbagai macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya.

2.2 Faktor Pertumbuhan Bakteri Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri adalah penyediaaan nutrien yang sesuai untuk kultivasi bakteri, faktor fisika, dan faktor kimia. Meskipun medium yang digunakan amat beragam, namun sebagai makhluk hidup bakteri mempunyai kebutuhan dasar yang sama, yaitu meliputi air, karbon, dan mineral.

1. Faktor Fisik Kondisi fisik yang memungkinkan pertumbuhan optimum bakteri adalah sebagai berikut. a. Suhu Suhu setiap jenis bakteri bervariasi. Berdasarkan suhu pertumbuhan dibedakan menjadi : Mesofil, terdapat pada tanah, air, dan tubuh vertebrata, suhu pertumbuhan 10-470C. Suhu pertumbuhan optimum 30-400C.

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

Termofil, ditemukan pada habitat yang bersuhu tinggi, pembuatan kompos, susu, tanah, dan air laut. Mampu tumbuh pada suhu 45500C, dibedakan menjadi psikrodura yang mampu hidup dibawah 0 0 C dan termodura yang tahan hidup pada suhu diatas 500C.

b. Tekanan osmosis Jika tekanan osmose lingkungan lebih besar (hipertonis) sel akan mengalami plasmolisis. Sebaliknya tekanan osmose lingkungan yang hipotonis akan menyebabkan sel membengkak dan juga dapat mengakibatkan rusaknya sel. Olah karena itu dalam mempertahankan hidupnya, sel bakteri harus berada pada tingkat tekanan osmose yang sesuai, walaupun sel bakteri memiliki daya adaptasi, perbedaan tekanan osmose dengan lingkugannya tidak boleh terlalu besar. c. Kadar air d. Kadar oksigen

2.

Faktor Kimia Faktor kimia yaitu pH, setiap jenis bakteri mempunyai pH lingkungan yang optimal (Neutrofil 6.0-8.0), minimal (Asidofil 2.0-5.0), dan maksimal (Alkalofil, 8.4-9.5) dalam kegiatan fisiologisnya. Kegiatan fisiologis bakteri berguna dalam mempertahankan kelangsungan hidup dan melakukan proses biokimia yang berkelanjutan. Dimana proses ini dikatalisi oleh enzim-enzim. Kemudian adanya zat kimia, dapat berupa desinfektan dan antiseptik, seperti garam-garam logam, fenol,

formaldehid, alkohol, yodium, zat-zat warna, detergen/sabun, dan antibiotik.

2.3 Metode Enumerasi 2.3.1 Definisi Dalam bidang ilmu mikrobiologi terdapat analisia kualitatif suatu bahan. Analisis ini penting untuk mengetahui jumlah mikroorganisme yang ada pada suatu sampel tertentu. Analisis kualitatif biasa disebut dengan enumerasi mikroorganisme. Enumerasi, menurut Kamus Besar Bahasa Indonesia, diartikan

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

sebagai pencacahan satu per satu atau penjumlahan (nomina). Ini kemudian dijadikan sebagai metode perhitungan jumlah sel bakteri per mili liter sampel. Enumerasi mikroorganiame penting dalam mikrobiologi makanan dan mikrobiologi air. Pengukuran jumlah sel bakteri per mili liter, atau per gram, atau meter kubik sampel bergantung pada kondisi alami sampel. Ada 2 macam cara perhitungan jumlah mikroba/bakteri, yaitu perhitungan secara langsung dan tidak langsung. 2.3.2 Perhitungan Secara Langsung Dilakukan dengan cara sebagi berikut. a. Menggunakan ruang hitung (Counting Chamber). Cara ini

menghasilkan hitungan total. Sampel cairan atau larutan dimasukkan ke dalam ruang hitung yang telah diketahui volumenya. Ruang hitung tersebut dibagi menjadi 25 kotak dengan luas maupun volume tertentu. Jumlah mikroba di dalam masingmasing kotak dihitung dan selanjutnya dikalikan dengan volumenya sehingga didapat jumlah tiap millimeter sampel. Mikroorganisme dapat dihitung dalam bilik hitung Petroff-Hausser, terdiri dari kaca objek khusus bergaris kotak-kotak dengan luas 1/400 mm2; diatasnya dapat diletakkan kaca penutup dengan jarak 1/50 mm sehingga volume tiap kotak adalah 1/20.000 mm3. Dalam bilik ini dapat dihitung bakteri tanpa pengecatan dengan mikroskop fase-kontras. Bila biasanya terdapat 5 buah bakteri dalam tiap kotak maka jumlah bakteri adalah 5 x 20.000.000 atau 108. Kelemahan cara ini ialah bila bilangan bakteri dalam suspensi itu rendah maka penghitungan menjadi tidak cermat. Semua sel terhitung baik yang hidup maupun yang mati. Karena bakteri itu sangat kecil, maka untuk hitungan secara statisti dapat diterima, harus dibuat suspensi terlebih dahulu sekurang-kurangnya 107 bakteri per mililiter. Selain metode tersebut ada lagi metode lainya yaitu :

b. Menghitung dari preparat pengecatan Cara ini juga menghasilkan hitungan total. Sejumlah volume dioeskan pada luas kaca objek yang telah diukur, dicat dengan metilen biru atau

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

cat lain yang sesuai kemudian dihitung jumlah organisme pada bagian tertentu yang telah diketahui luasnya. Dengan mengetahui diameter bidang penglihatan dengan pengukuran sebelumnya (dengan stage micrometer) aka jumlah per milimeter dapat dihitung.

c. Menghitung dengan filter membran Contoh air yang telah ditakar disaring dengan filter steril yang terbuat dari membran berpori halus yang tidak meloloskan bakteri dengan demikian bakteri tertahan oleh filter an setelah dicat langsung dihitung. Dalam hal ini jumlah bakteri dalam cairan itu tidak boleh terlalu banyak dan tersebar rata. Untuk menghitung membran dibuat transparan dengan menyerapkan minyak imersi ke dalam membran itu. Cara ini menghasilkan hitungan total. d. Menghitung dengan alat penghitung elektronik Dengan alat ini dapat dihitung beribu-ribu bakteri dalam beberapa etik saja. Penggunaan alat ini didasarkan atas kerja dengan lubang pengintai elektronik. Kerjanya bergantung pada interupsi bekas cahaya elektronik yang melintasi ruang antara dua elektronik yang melintasi ruang antara dua elektrode yang berdekatan letaknya. (Usman, 1987).

1.1.1. Menghitung secara tidak langsung Dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut d. Penentuan volume total Cara ini adalah semacam modifikasi penentuan hematokrit pada pengukuran volume total butir-butir darah. Misalnya 10 ml biakan dimasukkan ke dalam tabung reaksi khusus atau disebut juga tabung hopkins yang bagian bawahnya berupa silinder dan bergaris ukuran. Organisme didapatkan dengan sentrifus pada kecepatan baku dan waktu yang tepat menurut ukurannya, kemuian volume totalnya dapat dibaca pada skala silindernya. Dengan mengetahui rata-rata masing-masing sel secara perkiraan dapat ditentukan jumlah sel.

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

e. Metode turbidometri Teknik ini sudah dipakai sebagai cara mengukur kekeruhan suspensi atas dasar penyerapan dan pemancaran cahaya yang dilintaskan sehingga suspensi yang mengandung lebih dari 107- 108 sel per milimeter.

Kelemahan cara ini ialah bahwa kesalahan dapat terjadi karena variasi dalam ukuran dan bentuk serta penggumpalan sel-sel. Juga karena perbedaan derajat tembus cahaya bermacam-macam spesies atau bahan lain dalam biakan tersebut. Tetapi cara ini merupakan salah satu cara tercepat yang paling sederhana serta cukup teliti. Dan cara ini tidak bisa menentukan jumlah bakteri secara eksponen bilangan sel, melainkan kekeruhan dapat dibakukan dalam sebutan jumlah sel dari penghitungan dalam hemasitometer dengan bilangan suspensi bakteri baku . (Usman, 1987).

f. Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.

Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFUs) per ml. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya.

Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut :

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

Satu koloni dihitung 1 koloni. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni. Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung. Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.

1.1. Media Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba. Proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Berikut ini beberapa media yang sering digunakan dalam mikrobiologi.

a. Lactose Broth Lactose broth digunakan untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (preenrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.

b. EMBA (Eosin Methylene Blue Agar) Media ini mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasi laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam.

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal, karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp, dapat menimbulkan keraguan. Media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli.

Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air.

c. Nutrient Agar Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Untuk komposisi nutrien adar adalah eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

d. Nutrient Broth Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut. o Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades. o Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama. o Atur pH sampai 7,0. o Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml. o Sterilisasi dengan autoklaf.

e. MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar) MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung: o Protein dari kasein 10 g/L o Ekstrak daging 8,0 g/L o Ekstrak ragi 4,0 g/L o D (+) glukosa 20 g/L o Magnesium sulfat 0,2 g/L o Agar-agar 14 g/L o dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L o Tween 80 1,0 g/L o Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L o Natrium asetat 5 g/L o Mangan sulfat 0,04 g/L

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk cair/broth.

f. Trypticase Soy Broth (TSB) TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen. Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. Dikalium fosfat ditambahkan sebagai buffer untuk

mempertahankan pH.

g. Plate Count Agar (PCA) PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121C). Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks.

h. APDA Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu

10

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat.

i. Potato Dextrose Agar (PDA) PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah didestilasi. campur dan panaskan serta aduk. Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121C selama 15 menit. Dinginkan hingga suhu 40-45C dan tuang dalam cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.

j. VRBA (Violet Red Bile Agar) VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri

Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa, sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati. Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu, glukosa, neutral red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan hingga 50-60C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4. Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri. Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar merupakan agen pemadat.

k. PGYA

11

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

Media ini berfungsi untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir. Dengan adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGYA dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroba terutama sel khamir. Untuk membuatnya, semua bahan dicampur dengan ditambah CaCO3 terlebih dahulu sebanyak 0,5 g lalu dilarutkan dengan akuades. Kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer dan disumbat dengan kapas lalu disterilisasi pada suhu 121C selama 15 menit.

III. A LAT DAN BAHAN Berikut alat dan bahan yang diperlukan dalam praktiukum. o Suspensi mikroba o 6 labu yang beris 9 ml akuades steril o 9 cawan petri steril dengan medium Plate Count Agar (PCA) o 7 pipet 1 ml o Alkhohol 70 % o Pembakar spirtus o Bulp

IV. PROSEDUR a. Dilusi dengan tingkat pengenceran 10-1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Telapak tangan dibersihkan dengan akhohol Sampel dikocok Pembakar spirtus dinyalakan Pipet diambil dan bulp dipasang Pipet dilewatkan ke api spirtus Sampel dipipet sebanyak 1 ml Tabung reaksi pertama diambil, tabung reaksi dipegang tangan kiri, pipet dipegang tangan kanan sementara kasa penutup tabung dijepit kelingking jari kanan 8. Mulut tabung reaksi dilewatkan ke api spirtus

12

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

9.

Sampel dipindahkan dari pipet ke dalam tabung reaksi pertama di dekat api spirtus

10. Pipet diletakkan dan tabung reaksi dikocok dengan arah telapak tangan maju mundur 11. Tabung reaksi dihentak-hentakkan ke telapak tangan Dilusi dengan tingkat pengenceran 10-2 1. 2. 3. 4. Pipet yang baru diambil dan bulp dipasang Pipet dilewatkan ke api spirtus Sampel dipipet 1 ml dari tabung reaksi pertama Tabung reaksi kedua diambil, tabung reaksi dipegang tangan kiri, pipet dipegang tangan kanan sementara kasa penutup tabungdijepit kelingking jari kanan 5. 6. Mulut tabung reaksi dilewatkan ke api spirtus Sampel dipindahkan dari pipet ke dalam tabung reaksi di dekat api spirtus 7. Pipet diletakkan dan tabung reaksi dikocok dengan arah telapak tangan maju mundur 8. Tabung reaksi dihentak-hentakkan ke telapak tangan

b.

c.

Dilusi dengan tingkat pengenceran 10-3 1. 2. 3. 4. Pipet yang baru diambil dan bulp dipasang Pipet dilewatkan ke api spirtus Sampel 1 ml dipipet dari tabung reaksi kedua Tabung reaksi ketiga diambil, tabung reaksi dipegang tangan kiri, pipet dipegang tangan kanan sementara kasa penutup tabung dijepit kelingking jari kanan 5. 6. Mulut tabung reaksi dilewatkan ke api spirtus Sampel dipindahkan dari pipet ke dalam tabung reaksi di dekat api spirtus 7. Pipet diletakkan dan tabung reaksi dikocok dengan arah telapak tangan maju mundur 8. Tabung reaksi dihentak-hentakkan ke telapak tangan

13

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

d. Dilusi dengan tingkat pengenceran 10-4 1. 2. 3. 4. Pipet yang baru diambil dan bulp dipasang Pipet dilewatkan ke api spirtus Sampel 1 ml diambil dari tabung reaksi ketiga Tabung reaksi keempat diambil, tabung reaksi dipegang tangan kiri, pipet dipegang tangan kanan sementara kasa penutup tabung dijepit kelingking jari kanan 5. 6. Mulut tabung reaksi dilewatkan ke api spirtus Sampel dipindah dari pipet ke dalam tabung reaksi di dekat api spirtus 7. Pipet diletakkan dan tabung reaksi dikocok dengan arah telapak tangan maju mundur 8. 9. Tabung reaksi dihentak-hentakkan ke telapak tangan Sampel diambil kembali 0,1 ml dari tabung keempat dengan pipet yang sama. 10. Sampel dipindah dari pipet kedalam cawan pertama, kedua, dan ketiga Dilusi dengan tingkat pengenceran 10-5 1. 2. 3. 4. Pipet yang baru diambil dan bulp dipasang Pipet dilewatkan ke api spirtus Sampel diambil 1 ml dari tabung reaksi keempat Tabung reaksi kelima diambil, tabung reaksi dipegang tangan kiri, pipet tetap dipegang tangan kanan sementara kasa penutup tabung dijepit dengan kelingking jari kanan 5. 6. Mulut tabung reaksi dilewatkan ke api spirtus Sampel dipindah dari pipet ke dalam tabung reaksi di dekat api spirtus 7. Pipet dilewatkan dan tabung reaksi dikocok dengan arah telapak tangan maju mundur 8. Tabung reaksi dihentak-hentakkan ke telapak tangan

e.

14

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

9.

Sampel diambil kembali 0,1 ml dari tabung kelima dengan pipet yang sama.

10. Sampel dipipet ke dalam cawan keempat, kelima, dan keenam

f.

Dilusi dengan tingkat pengenceran 10-6 1. 2. 3. 4. Pipet yang baru diambil dan bulp dipasang Pipet dilewatkan ke api spirtus Sampel 1 ml dipipet dari tabung reaksi kelima Tabung reaksi keenam diambil, tabung reaksi dipegang tangan kiri, pipet dipegang tangan kanan sementara kasa penutup tabung dijepit kelingking jari kanan 5. 6. Mulut tabung reaksi dilewatkan ke api spirtus Sampel dipindah dari pipet ke dalam tabung reaksi di dekat api spirtus 7. Pipet diletakkan dan tabung reaksi tangan maju mundur 8. 9. Tabung reaksi ke dihentak-hentakkan telapak tangan Sampel kembali diambil 0,1 ml dari tabung kelima dengan pipet yang sama. 10. Sampel dipipet ke dalam cawan ketujuh, kedelapan, dan kesembilan dikocok dengan arah telapak

g.

Sampel distreak pada media agar di cawan 1. 2. Stik L dicelupkan ke dalam alkholol Stik L dilewatkan ke api spirtus hingga alkhohol menghilang/tidak ada yang menempel pada stik 3. 4. 5. Sampel distreak di cawan pertama dengan stik L Stik L dicelupkan lagi ke dalam alkholol Stik L dilewatkan ke api spirtus hingga alkhohol menghilang/tidak ada yang menempel pada stik 6. 7. Sampel distreak di cawan kedua dengan menggunakan stik L Demikian seterusnya hingga cawan kesembilan

15

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

h. Semua cawan diinkubasi dengan suhu 30oC selama 24-48 jam i. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dari setiap pengenceran dengan memilih cawan petri yang memenuhi syarat.

V.

PENGOLAHAN DATA Tabel 1. Data Praktikum Tingkat Pengenceran Jumlah koloni mikroba tiap cawan (CFU/plate) 1 10-4 2 3 4 10-5 5 6 7 10-6 8 9 terkontaminasi 92 98 18 Rata-rata jumlah koloni tiap pengenceran (CFU/plate)

95 Tidak memenuhi syarat

Maka angka lempeng total = CFU = 95 x 104 /0,1 = 95 x 105

= 95 x 104

VI. ANALISIS a. Analisis percobaan Sampel air diambil dari Danau Mahoni, di dekat jembatan Teksas. Lokasi dipilih berdasarkan di mana ada arus aliran. Sampel diambil dengan botol winkler. Tutup botol winkler dibuka di dalam arus dan air dibiarkan mengalir ke dalam botol. Sampel ditampung tidak sampai penuh. Ruang udara tetap disisakan agar mikroba tidak mati. Sampel kemudian disimpan di suhu udara. Berbeda dengan percobaan lainnya di laboratorium Teknik Lingkungan, percobaan perhitungan bakteri pada ikrobiologi lingkungan ini sangat

mengutamakan kesterilan. Hal ini sangat penting untuk menghindari kontaminasi

16

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

karena kontaminasi dapat mengacaukan perhitungan bakteri. Maka alat praktikum dibungkus dan sebelum mulai praktikum praktikan membersihkan telapak tangan dengan cairan akhohol. Gunanya agar bakteri dari tangan terbunuh dan tidak dapat mengontaminasi alat dan bahan. Praktikan juga mengenakan masker selama praktikum berlangsung agar bakteri dari mulut tidak dapat mengontaminasi alat dan bahan. Terdapat beberapa syarat untuk melakukan enumerasi. Antara lain CFU sebesar 30-300 per ml sampel. Untuk mencapai rance tersebut, sampel perlu didilusi atau diencerkan. Jika tidak, jumlah koloni bakteri akan jauh lebih besar dari rance dan tidak dapat dihitung. Dilusi dilakukan secara serial atau bertingkat dari tingkat pengenceran 10 -1 sampai 10-6. Dilusi dilakukan secara serial karena tidak mungkin mengambil sampel sebesar 10-6 ml untuk diencerkan menjadi 10 ml juga tidak mungkin mengambil sampel 1 ml untuk diencerkan menjadi 106 ml. Dilusi dimulai dari tingkat pengenceran 10 -6. Pengenceran tidak diperkenankan menggunakan pipet yang sama untuk tingkat pengenceran yang berbeda. Maka disediakan 6 buah pipet. Sebelum dipipet, sampel dikocok terlebih dahulu untuk menghomogenkannya. Tabung winkler dengan posisi berdiri dikocok sesuai putaran jarum jam secara bolak-balik. Praktikan membuka bungkus pipet, memasanginya dengan bulp dan melewatkannya ke api spirtus. Tujuannya untuk membunuh bakteri yang kiranya menempel pada pipet. Begitu juga ketika praktikan hendak memasukkan sampel ke dalam tabung reaksi, mulut tabung reaksi distrerilkan dulu dengan api spirtus. Sambil tangan kiri praktikan memegang tabung reaksi, tangan tangan kanan praktikan tetap memegang pipet. Kasa penutup tabung dibuka dan dijepit dengan jari kelingking. Ini bertujuan untuk efisiensi agar praktikan dapat melakukan pemindahan sampel dari pipet ke dalam tabung sendiri tanpa bantuan praktikan lain. Sebenarnya akan lebih baik jika semua prosedur dilakukan oleh seorang praktikan. Ini akan memperkecil adanya kontaminasi dari mulut dan pemipetan, pen-streak-an yang seragam di semua cawan. Dengan demikian hasilnya akan lebih mudah dianalisa.

17

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

Perlakuan terhadap mulut cawan juga tidak jauh berbeda. Sedangkan stik L, karena stik ini yang langsung menyentuh sampel berikut media PCA, maka stik ini dicelupkan ke dalam akhohol dan dilewatkan ke api spirtus hingga alkhohol terbakar seluruhnya. Stik L kemudian digerakkan di udara agar panas akibat api spirtus mereda dan tidak membunuh mikroba saat perataan. Sampel diambil dari tingkat pengenceran 10 -4, 10-5, dan 10-6 masing-masing sebanyak 0,1 ml untuk menjadi perbandingan dalam perhitungan. Namun semua cawan melalui inkubasi yang sama. Diambil 0,1 ml saja agar tidak dihasilkan banyak air yang dapat mengganggu pertumbuhan mikroba di media. Selain itu juga agar CFU yang dihasilkan termasuk dalam rance yang disyaratkan. Pola pen-streak-an tersebar atau spread streak. Ini dilakukan sampai terasa kesat. Ini dilakukan di dekat api spirtus agar ketika cawan petri dibuka untuk distreak, media PCA tidak terkontaminasi oleh udara. Setelah distreak, cawan dibalik, tutup cawan diletakkan di bawah. Ini dilakukan agar jika ada air atau embun tidak akan menetes ke media dan mengganggu pertumbuhan mikroba. Cawan ini, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 2448 jam. Suhu ini merupakan suhu dimana mikroba pada umumnya mampu tumbuh. Setelah tumbuh barulah dipilih cawan petri yang memenuhi syarat perhitungan untuk kemudian dihitung berapa CFU per plate. Syarat dalam enumerasi mikroba antara lain adalah luas koloni tidak lebih dari setengah cawan dan jumlah koloni termasuk dalam rance 30-300 CFU per ml sampel. Jika syarat tersebut terpenuhi, barulah dilakukan perhitungan secara manual. Praktikan menandai koloni dengan spidol untuk memudahkan perhitungan.

Praktikan juga menggunakan coloni counter untuk memperjelas tampilan koloni di cawan. CFU kemudian dihitung dengan rumus yang ada.

b. Analisis hasil Tabel 2. Data praktikum Tingkat Pengenceran 10-4 Jumlah koloni mikroba tiap cawan (CFU/plate) 1 92 Rata-rata jumlah koloni tiap pengenceran (CFU/plate) 95

18

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

2 3 4 10-5 5 6 7 10-6 8 9

98 18 Tidak memenuhi syarat

terkontaminasi

Dari 9 cawan yang ada, hanya cawan pertama dan kedua yang memenuhi syarat enumerasi bakteri. CFU di cawan ketiga terlalu kecil di bawah range persyaratan. Nilai CFUnya 18 dari yang seharusnya minimal 30. Hal ini bisa disebabkan perataan atau pen-streakan yang kurang merata. Pen-streak-an yang kurang merata ini menyebabkan pertumbuhan koloni yang saling bertumpuk. Pada persyaratan enumerasi disebutkan bahwa koloni yang bertumpuk dihitung satu koloni. Karena banyak koloni yang bertumpuk maka hasil perhitungan semakin sedikit. Dengan demikian CFU cawan ketiga tidak dapat dihitung. Cawan yang tersisa menunjukkan luas koloni bakteri yang lebih dari setengah cawan. Inipun tidak sesuai dengan persyaratan enumerasi. Keanehan juga terlihat ketika pada tingkat pengenceran yang lebih rendah mengandung jumlah koloni yang lebih besar dibanding tingkat pengenceran yang lebih tinggi. Hal ini bisa jadi disebabkan oleh adanya kontaminasi. Kontaminasi bisa berasal dari mulut praktikan. Sebenarnya kontaminasi dari mulut praktikan ini sudah diantisipasi dengan menggunakan masker. Namun, masker ini dimungkinkan hanya mampu menahan debu agar tidak masuk ke mulut. Masker tidak mampu mencegah bakteri dari mulut agar tidak mengontaminasi alat dan bahan. Kontaminasi juga dapat berasal dari udara sekitar karena saat memindah sampel dari cawan ke dalam tabung reaksi atau ke dalam cawan, praktikan masih sering secara tidka sengaja menjauhkan tabung dan cawan dari api spirtus Berikut ini, praktikan juga membandingkan hasil praktikum sendiri dengan hasil praktikum kelompok lain. Tabel 3. Data Praktikum Kelompok Lain

19

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

Rata-rata jumlah Tingkat Pengenceran Jumlah koloni mikroba tiap cawan (CFU/plate) koloni tiap pengenceran (CFU/plate) 1 10
-4

CFU

3 42

2 3 4

22,5

22,5 x 104

19 5

10

-5

5 6 7

12

12 x 106

118 10

10

-6

8 9

64

64 x 106

CFU

= = 76,225 x 106 x 10 = 77 x 107 per ml sampel

Hasil yang berbeda ini disebabkan karena lokasi dan waktu pengambilan sampel yang berbeda. Meski sampel diambil dari danau yang sama tapi bisa jadi praktikan mengambil sampel dari bagian danau yang berbeda.

c. Analisis kesalahan Human error yang bisa terjadi selama praktikum antara lain sebagai berikut 1. Pada saat udara di bulp dibuang, udara tidak terbuang seluruhnya dari bulp, udara ini mungkin akan mengontaminasi pipet 2. Pemipetan yang tidak akurat 3. Pemindahan sampel ke cawan atau tabung reaksi yang tidak dilakukan di dekat api, sehingga memungkinkan kontaminasi dari udara sekitar 4. Praktikan berbicara selama praktikum. 5. Saat inokulasi ke tabung ataupu cawan tidak dilakukan oleh satu praktikan sehingga memperbesar peluang kontaminasi dari mulut praktikan dan ketidakseragaman hasil kerja

20

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

6. Pada saat meratakan sampel dengan stik L, stik L tidak benar-benar bersih. Bisa jadi alkhohol yang digunakan sudah rusak. Atau jika alkhohol masih bagus namun ketika stik L dilewat ke api tidak benar-benar menghilangkan alkhohol. Sehingga alkhohol itu akan membunuh bakteri selama penyetrikan.

VII. KESIMPULAN 1. Hasil perhitungan koloni sampel adalah 95 x 105 CFU per ml sampel. 2. Jumlah koloni akan semakin sedikit jika tingkat pengenceran semakin rendah

VIII. REFERENSI Gusniani, Irma dkk. 2011. Modul Praktikum Laboratorium Lingkungan (Env 22002). Laboratorium Teknik Penyehatan dan Lingkungan. Program Studi Teknik Lingkungan. Departemen Teknik Sipil. Fakultas Teknik. Universitas Indonesia. Santoso, Iman. 2011. Enumerasi. Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Kampus UI Depok Ruly.2008. Media Pertumbuhan Mikroorganisme. http://dunia-

mikro.blogspot.com/2008/08/media-pertumbuhan-mikroorganisme.html (diakses tanggal 11 Desember 2011)

21

Laporan Praktikum Mikrobiology Lingkungan Enumerasi Mikroba

Modul I

LAMPIRAN 1 DOKUMENTASI PERCOBAAN

Gambar 1. 9 cawan setelah perhitungan

Gambar 2. Hasil pertumbuhan bakteri

Gambar 3. Coloni Counter

Gambar 4. Tabung Reaksi

Gambar 5. Inokulasi ke tabung reaksi

Gambar 6. Streaking sampel ke cawan

22