ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI BIJI ROSELA (Hibiscus sabdariffa) I.

PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Protease merupakan enzim penghidrolisa protein yang banyak digunakan dalam bidang industri, seperti pembuatan keju, penjernih bir, pembuatan roti, pengempuk daging, detergent, hidrolisat protein, dan sebagainya. Protease juga banyak digunakan dalam berbagai aplikasi komersial, seperti dalam bidang farmasi, proses medis, proses laboratorium, dalam pengurutan asam amino (Anonymous,2008). Pemakaian enzim protease meningkat dari tahun ke tahun. Pada tahun 1983 penjualan enzim protease mencapai 40% dari total penjualan enzim dunia, tahun 1995 meningkat sampai 60%, yang bernilai lebih dari 2 milyar dollar AS (Word, 1983 disitasi dari Witono, 2008). Bahkan Amerika Serikat telah mengimpor 200 ton getah pepaya tiap tahunnya khusus untuk pengempuk daging (Suhartono, Lestariono, dan Tanoyo, 1995). Kebanyakan enzim protease yang digunakan secara komersial berasal dari hewan dan mikroba, namun permasalahan yang timbul adalah adanya kontaminasi dan penanganan yang spesifik dari hewan serta jumlah yang sangat sedikit dari protease yang dihasilkan oleh mikroba (Anonymous, 2008). Oleh karena itu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk isolasi enzim protease dari sumber tanaman. Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim protease banyak terdapat pada serealia, kacang-kacangan dan biji tanaman, seperti sorghum, gandum, barley, jagung, kentang, kacang hijau, kacang kedelai, biji bunga matahari, biji padi , biji moringa oleifera (Dahot, 1992). Sumber protease yang lain juga didapat dari pepaya, yang menghasilkan papain, nanas menghasilkan bromelin, famili fiscus menghasilkan fisin. Namun demikian untuk memproduksi enzim protease dari jaringan tanaman masih menghadapi banyak kendala sementara ketersediaan enzim protease belum

mencukupi kebutuhan, oleh karena itu perlu dicari sumber-sumber enzim protease yang lain (Witono, 2000). Rosella (Hibiscus sabdariffa) merupakan anggota family Malvaceae. Rosella dapat tumbuh baik di daerah beriklim tropis dan subtropis (Maryani dan Lusi, 2005). Penelitian terhadap kandungan antioksidan pada kelopak bunga rosella telah banyak dilakukan (Nurfarida, 2006 ; Ayerdi et al., 2007 disitasi dari (Maryani dan Lusi, 2005)). Sementara itu, hasil penelitian dari Abu-Tarboush and Hamza (1995) melaporkan kandungan komponen antinutritif seperti protease inhibitor, asam fitat dan gossypol pada ekstrak biji rosella (karkade) bebas lemak. Diduga biji rosella mengandung enzim protease, namun karakteristik dan jumlahnya belum diketahui. Sehingga perlu dilakukan penelitian mengenai isolasi dan karakterisasi enzim protease dari biji rosella. Penelitian ini bertujuan untuk mencari metode ekstraksi terbaik ditinjau dari rendemen dan aktivitas enzimnya, mengetahui kondisi optimal aktivitasnya, dan mengatahui termostabilitasnya. 1.2. Perumusan Masalah 1. Belum diketahui pengaruh metode ekstraksi terhadap rendemen dan aktivitas enzim protease biji rosella. 2. Belum diketahui pengaruh pH terhadap aktivitas enzim protease biji rosella. 3. Belum diketahui pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim protease biji rosella. 4. Belum diketahui termostabilitas enzim protease biji rosella. 1.3. Tujuan Penelitian 1. Mengetahui pengaruh metode ekstraksi terhadap rendemen dan aktivitas enzim protease biji rosella serta mencari metode ekstraksi enzim protease biji rosella yang terbaik ditinjau dari rendemen dan aktivitasnya. 2. Mengetahui pengaruh pH terhadap aktivitas enzim protease biji rosella dan menentukan pH optimal untuk aktivitasnya. 3. Mengetahui pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim protease biji rosella dan menentukan suhu optimal untuk aktivitasnya. 4. Mengetahui termostabilitas enzim protease biji rosella.

1.4.

Hipotesis 1. Metode ekstraksi berpengaruh terhadap rendemen dan aktivitas enzim protease biji rosella. Diduga ekstraksi dengan ammonium sulfat lebih baik dibandingkan dengan menggunakan etanol dan aseton 2. pH berpengaruh terhadap aktivitas enzim protease biji rosella dan terdapat pH optimal untuk aktivitas enzim protease biji rosella 3. Suhu berpengaruh terhadap aktivitas enzim protease biji rosella dan terdapat suhu optimal untuk aktivitas enzim protease biji rosella. 4. Terdapat suhu maksimal yang berpengaruh terhadap stabilitas enzim protease

II. METODOLOGI PENELITIAN

Penelitian dilakukan dalam 3 tahap. Tahap I dilakukan untuk mengetahui pengaruh metode ekstraksi dan menentukan metode ekstraksi enzim protease dari biji Rosella yang terbaik dilihat dari rendemen dan aktivitasnya. Tahap II dilakukan untuk mengetahui pengaruh pH dan suhu serta menentukan pH dan suhu optimal untuk aktivitas enzim protease dari biji Rosella. Tahap III dilakukan untuk menentukan termostabilitas enzim protease. Alur penelitiannya dapat dilihat berikut ini. Persiapan Sampel Biji Rosella Pembersihan dan Sortasi Dihaluskan dengan blender

Disaring dengan saringan 60 mesh

Bubuk Biji Rosella Diukur : Kadar air Kadar Protein

Penelitian Tahap I Estraksi enzim protease Etanol (1:1) ; Etanol (1:2) ; Aseton (1:1); Amonium sulfat kejenuhan 50%

Enzim Kering (Diukur rendemen dan aktivitas protease)

Purifikasi Enzim Penelitian Tahap II Uji Pengaruh pH dan penentuan pH optimal (pH 4.0 ; 5.0; 6.0 ; 7.0; 8.0 ; 9.0)

Uji Pengaruh suhu dan penentuan suhu optimal (suhu 30 ; 40 ; 50 ; 60 ; 70 ; 800C)

Enzim kering dengan pH dan suhu optimal Penelitian Tahap III Uji Termostabilitas
Kontrol ; 30; 40 ; 50 ; 60 ; 70 ; 800C

Tahap-tahap penelitian selengkapnya beserta rancangan percobaannya sebagai berikut : Penelitian Tahap I Penelitian tahap I dilakukan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) faktor tunggal dengan 4 perlakuan, yaitu macam-macam metode ekstraksi enzim protease dan dilakukan pengulangan sebanyak 5 kali. Keempat perlakuan masing-masing adalah : E1 E2 E3 E4 = ekstraksi dengan etanol (1:1) = ekstraksi dengan etanol (1:2) = ekstraksi dengan aseton (1:1) = ekstraksi dengan amonium sulfat kejenuhan 50%

Hasil penelitian tahap I dipilih satu cara ekstraksi yang paling sesuai untuk enzim protease biji Rosella (dilihat dari rendemen dan aktivitasnya) kemudian di-purifikasi untuk dipakai dalam penelitian tahap selanjutnya. Isolasi enzim protease biji Rosella (Suhartono, 1992 ; Thompson et al., 1973 disitasi dari Witono, 2000) 250 g Bubuk Biji Rosella

Dilarutkan dengan akuades (1:2)

Di-stirrer selama 5 menit

Didinginkan selama 30 menit

Di-sentrifuse 2000xg selama 20 menit

Supernatan

Endapan dibuang

Supernatan

Diekstrak menggunakan Etanol (1:1), etanol (1:2), aseton (1:1) Di-sentrifuse 10000xg selama 20 menit Endapan Dicuci dengan aseton (1:2) Dikeringkan dalam oven vakum suhu 400C selama 5 jam Enzim kering kasar Diukur : Rendemen Aktivitas protease

Diekstrak menggunakan Amonium sulfat kejenuhan 50% Di-sentrifuse 10000xg selama 20 menit Endapan Di-dialisis selama 48 jam Dicuci dengan aseton (1:2) Dikeringkan dalam oven vakum suhu 400C selama 5 jam Enzim kering kasar Diukur : Rendemen Aktivitas protease

Metode ekstraksi terbaik dilihat dari segi rendemen dan aktivitas protease kemudian dilakukan purifikasi enzim protease menggunakan kromatografi gel filtrasi sephadex G25 pada buffer phosphate 0.05M pH 7. Fraksi yang mempunyai aktivitas protease dilewatkan pada kromatografi kolom penukar ion positif CM sephadex C-50. kolom dielusi menggunakan gradien NaCl pada konsentrasi antara 0 sampai 1 M. Eluen ditampung setiap 5 ml pada tabung reaksi. Setiap fraksi dianalisa protein dan aktivitas enzimnya. Fraksi yang mengandung aktivitas dikumpulkan, kemudian dibekukan selama 24 jam. Enzim beku tersebut dikeringkan menggunakan pengering beku selama 3 hari (Noda et al., 1994).

Pemilihan metode ekstraksi terbaik dari segi rendemen dan aktivitas protease dilakukan menggunakan analisa sidik ragam dengan uji lanjut BNT pada =0,05 Sumber keragaman Ulangan Perlakuan Galat Umum Derajat Bebas 4 3 12 19 Variabel bebas : 4 Metode ekstraksi : Etanol (1:1) ; Etanol (1:2) ; Aseton (1:1) ; Amonium sulfat kejenuhan 50% Variabel terikat :

Rendemen dan Aktivitas protease

Re ndemen (%) = Berat Pr oduk x100 BeratSampe l

Penelitian Tahap II Penelitian tahap II dilakukan untuk mengetahui pengaruh pH dan suhu serta menentukan pH dan suhu optimal bagi aktivitas enzim protease biji Rosella. Penelitian tahap II dilakukan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) faktor tunggal dan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali. Pengujian pengaruh pH dan penentuan pH optimal aktivitas protease dilakukan pada range pH 4,0 9,0 dengan selang 1,0 sehingga didapatkan 6 level perlakuan pH sebagai berikut : H1 : perlakuan pH 4,0 H2 : perlakuan pH 5,0 H3 : perlakuan pH 6,0 H4 : perlakuan pH 7,0 H5 : perlakuan pH 8,0 H6 : perlakuan pH 9,0

Pengujian pengaruh suhu dan penentuan suhu optimal aktivitas protease dilakukan pada range suhu 30-800C dengan selang 100C sehingga didapatkan 6 level perlakuan suhu sebagai berikut : S1 : perlakuan suhu 300C S2 : perlakuan suhu 400C S3 : perlakuan suhu 500C S4 : perlakuan suhu 600C S5 : perlakuan suhu 700C S6 : perlakuan suhu 800C Pengaruh pH dan suhu terhadap aktivitas protease biji Rosella Faktor H : pH (6 level) Faktor S : suhu (6 level) Dengan demikian ada 36 kombinasi perlakuan yang diberi nomor/kode sebagai berikut :
1. H1S1 : pH 4,0 suhu 300C 19. H1S4 : pH 4,0 suhu 600C 0 2. H2S1 : pH 5,0 suhu 30 C 20. H2S4 : pH 5,0 suhu 600C 0 3. H3S1 : pH 6,0 suhu 30 C 21. H3S4 : pH 6,0 suhu 600C 0 4. H4S1 : pH 7,0 suhu 30 C 22. H4S4 : pH 7,0 suhu 600C 0 5. H5S1 : pH 8,0 suhu 30 C 23. H5S4 : pH 8,0 suhu 600C 0 6. H6S1 : pH 9,0 suhu 30 C 24. H6S4 : pH 9,0 suhu 600C 0 7. H1S2 : pH 4,0 suhu 40 C 25. H1S5 : pH 4,0 suhu 700C 0 8. H2S2 : pH 5,0 suhu 40 C 26. H2S5 : pH 5,0 suhu 700C 0 9. H3S2 : pH 6,0 suhu 40 C 27. H S : pH 6,0 suhu 700C 3400C substrat28. H3S5 :1,5% suhu 700C ml casein pH 7,0 10. H4S2 : pH 7,0 suhu 4 5 0 ; pH 4,0C 5,0 ; 6,0 ; 7,0 5; :8,0 8,0 suhu 700C 11. H5S2 : pH 8,0 suhu 40 29. H5S pH ; 9,0 suhu 30 0 40 60 ; 6S5 80 ; 90 0C 12. H6S2 : pH 9,0 suhu 40; C ; 50 ; 30. H70 :; pH 9,0 suhu 700C 0 13. H1S3 : pH 4,0 suhu 50 C 31. H1S6 : pH 4,0 suhu 800C 0 14. H2S3 : pH 5,0 suhu 50 C 32. H2S6 : pH 5,0 suhu 800C 0 15. H3S3 : pH 6,0 suhu 50 C 33. H3S6 : pH 6,0 suhu 800C 0 16. H4S3 : pH 7,0 suhu 50 C 34. H4S6 : pH 7,0 suhu 800C Ditambah 1 mg5S6 : pH 8,0 suhu 800C 0 17. H5S3 : pH 8,0 suhu 50 C 35. H enzim 0 18. H6S3 : pH 9,0 suhu 50 C 36. H6S6 : pH 9,0 suhu 800C

Diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang

Pengujian pengaruh pH, suhu dan penentuan pH, suhu optimal (Abe et al., 1997) Ditambah 1 ml TCA 5%

Di-sentrifuse 2000xg selama 20 menit

Supernatan

Endapan ditimbang 9

Uji Aktivitas Protease

10

Pemilihan pH dan suhu optimal terhadap aktivitas enzim protease biji Rosella dilakukan menggunakan analisa sidik ragam dengan uji lanjut BNT pada =0,05. Sumber keragaman Ulangan Perlakuan H 5 S 5 HxS 25 Galat Umum Derajat Bebas 2 35 Variabel bebas : 6 Level pH dan 6 level suhu Variabel terikat : 70 107 Aktivitas protease Penelitian tahap III

Pengujian Termostabilitas dilakukan dengan memanaskan enzim hasil ekstraksi selama 10 menit pada 7 perlakuan suhu, meliputi : T1 : Kontrol T2 : Pemanasan suhu 300C T3 : Pemanasan suhu 400C T4 : Pemanasan suhu 500C T5 : Pemanasan suhu 600C T6 : Pemanasan suhu 700C T7 : Pemanasan suhu 800C Penelitian tahap III menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) faktor tunggal dengan 3 kali ulangan

11

Pengujian Termostabilitas (Stoknes and Rustad, 1995 disitasi dari Witono, 2000)

1 mg enzim protease Biji Rosella

Pemanasan selama 10 menit (Kontrol, 30, 40, 50, 60, 70, 80 0C)

Ditambah 3 mg substrat casein 1,5% (pH optimal)

Diinkubasi 10 menit (suhu optimal)

Ditambah 1 ml TCA 5%

Di-sentrifuse 2000xg selama 20 menit

Supernatan

Endapan ditimbang

Uji Aktivitas Protease Pemilihan perlakuan suhu terhadap stabilitas enzim protease dilihat dari aktivitas protease dilakukan menggunakan analisa sidik ragam dengan uji lanjut BNT pada =0,05 Sumber keragaman Ulangan Perlakuan Galat Umum Derajat Bebas 2 6 12 20 Variabel bebas : 7 level perlakuan suhu

Variabel terikat : Aktivitas protease Pengujian aktivitas enzim protease (Darwis dan Sukara, 1990 ; Leewit and Pornsuksawang, 1988)

12

Pengujian aktivitas enzim protease dilakukan dengan menggunakan substrat casein 1,5%. Substrat casein sebanyak 3 ml dicampur dengan 1 mg enzim yang akan diuji, diinkubasikan sesuai dengan kondisi masing-masing. Setelah inkubasi selesai, reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 ml TCA 5 %. Endapan tersebut dipisahkan dengan sentrifugasi pada 2000xg selama 20 menit. Filtrat diambil 1 ml dan diencerkan menjadi 5 ml. Kemudian dianalisis menggunakan spektofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm. Tirosin, produk dari pemecahan substrat casein oleh enzim protease dengan berbagai konsentrasi yang telah diketahui diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm. Diperoleh hubungan antara konsentrasi tirosin standar (mol) dengan absorbansi. Dibuat persamaan regresi linear. Nilai absorbansi sampel dihitung berdasarkan persamaan regresi linier kurva tirosin standar, diperoleh konsentrasi tirosin sampel. Aktivitas enzim protease dihitung berdasarkan persamaan berikut : Aktivitas = Konsentrasi Tirosin (mol) / (p x q) p : jumlah enzim yang diuji (mg) q : waktu inkubasi (menit) Aktivitas enzim protease dinyatakan dengan molmg-1menit-1

13

DAFTAR PUSTAKA
Abe, K., Asakura, T., Watanabe, H., and Arai, S., 1997. Oryzain as an aspartic proteinase Occurring in rice seeds : purification, characterization and application to milk clotting. J. Agric Food Chem., 45 (4), 1070-1075 Abu-Tarboush and Hamza. Factors affecting protein Extractability of defatted karkade (Hibiscus sabdariffa) seed flour. J. King Saud. Univ. Vol 7 Agric. Sci (2) pp 179-186. Anonymous, 2008. Commercial production http://www.wipo.int. diakses tanggal 17 Oktober 2008. of proteases in plants.

Darwis, A.A dan Sukara, E., 1990. Isolasi, Purifikasi dan Karakterisasi Enzim. PAU Bioteknologi IPB. Bogor Dahot, M.U., 1992. Investigation of proteases in plant seeds. Journal of Islamic Academy of Science 5 : 4, 241-244 Leewit, S and Pornsuksawang, 1988. Protease from bacteria in soybean whey. Proc. Food Science and Technology in Industrial Development. Vol I, (Ed Manepoon), 751-754, Thailand Maryani, H dan Lusi, K., 2005. Khasiat dan Manfaat Rosella. PT Agro Media Pustaka. Jakarta Noda, K., Koyanagi, M. and Kamiya, C., 1994. Purification and Characterization of an Endoprotease from Melon fruit. J. Food Sci., 59 (3), 585-587 Suhartono, M.T., Lestariono, L.N, dan Tanoyo, T., 1995. Study on protease from Aspergillus oryzae isolated from soy sauce processing in Indonesia. J. Indonesian Trop. Agric., 6 (2), 21-25. Witono, Y., 2000. Isolasi dan Karakterisasi Enzim Protease dari Getah Tanaman Biduri. J. Teknologi Hasil Pertanian 1 (1), 1-14 Witono, Y., 2008. Eksplorasi enzim protease dari tanaman biduri (Calotropis gigantea) dan pemanfaatannya pada pengolahan pangan. Disertasi. Fakultas Teknologi Pertanian. Universitas Brawijaya. Malang.

14