Zakiyah (0810910072) Anpros.. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.

1 Analisa Prosedur Tahapan pertama yang dilakukan adalah mengkondisikan diri dalam keadaan steril dengan memakai jas lab, masker dan sarung tangan yang sudah diberi alkohol. Selanjutnya masing-masing kelompok melaksanakan tugasnya masingmasing, yaitu kelompok 1 menyiapkan media, kelompok 2 melakukan pembedahan dan isolasi sel limfosit, kelompok 3 melakukan tahapannsentrifugasi hingga homogenasi dengan media, dan kelompok 4 mengkultur sel serta merekatkannya dengan parafin dan disimpan dalam inkubator. Selain itu sterilisasi alat yang akan digunakan dengan LAF yang terpapar oleh sinar UV. Peralatan dan larutan yang digunakan dalam kultur sel harus disterilisasi dahulu. Cara sterilisasi dipilih berdasarkan kestabilan peralatan dan bahan tehadap suhu yang tinggi. Sterilisasi peralatan dan bahan yang memiliki ketahanan tinggi terhadap panas seperti logam, gelas, dan plastik tahan panas) dapat sterilisasi dengan dry heat (Freshney, 2005). Terdapat 4 tahap dalam sterilisasi, yaitu perendaman, merupakan langkah di mana semua alat yang akan disterilisasi direndam dalam larutan deterjen. Perendaman tidak boleh dilakukan terlalu lama untuk mencegah terjadinya korosi dari alat non stainless. Pembersihan merupakan tahap dasar untuk menghilangkan kontaminasi. Semua pengotor dan cairan harus dibuang dulu sebelum dimasukkan ke dalam alat pembersih. Salah satu cara pembersihan adalah dengan pembersihan ultrasonik. Pengendalian korosi dan lubrikasi. Peralatan yang telah dibersihkan harus selalu dikeringkan untuk mengurangi kemungkinan korosi. Pengemasan dapat dilakukan sebelum proses sterilisasi selanjutnya, agar peralatan terlindungi dari kontaminasi setelah disterilisasi, dan pemantauan sterilisasi dapat dilakukan menggunakan indikator kimia seperti perubahan warna, tetapi lebih efektif menggunakan indikator biologi seperti pengujian terhadap kontaminan seperti spora, virus, bakteri (Gupta dan Verma, 2009). Persiapan media kultur terdiri dari beberapa bahan, antara lain RPMI DI, Penicilin FBS, Sterptomisin, dan HEPES. Komposisi pengambilan tiap bahan berdasarkan perhitungan adalah RPMI 0,312 gr, Penicilin 0,003 gr, Streptomisin 0,03 gr, dan HEPES 0,0174 gr. Dalam mengkultur sel, diperlukan medium kultur yang biasanya dikombinasikan dengan Fetal Bovine Serum (FBS), yaitu suatu serum (darah tanpa sel dan faktor penggumpal/pembeku). FBS berisi berbagai substansi yang dibutuhkan sel yang dikultur untuk tumbuh dan hidup dengan baik. FBS merupakan serum yang digunakan secara luas dalam kultur sel, jaringan, ataupun organ secara invitro, karena dapat digunakan hampir di semua jenis sel serta karena mengandung banyak faktor pendukung pertumbuhan dan metabolisme embrionik (Jochems, 2009). Setelah menyiapkan media, kelompok lain melakukan isolasi organ spleen pada mencit. Langkah awal mencit didislokasi pada leher, kemudian digunting kulitnya pada bagian perut untuk mengambil organ spleen. Organ spleen diletakkan ke dalam cawan petri yang telah berisi larutan PBS dan dicuci sebanyak 3x dengan larutan PBS. PBS merupakan sebuah larutan penyangga yang biasa digunakan dalam penelitian biologi. Buffer membantu untuk mempertahankan konstan pH. Osmolaritas dan konsentrasi ion solusi yang sesuai dengan tubuh manusia (isotonik) (Anonim 2, 2009). PBS sering digunakan dalam percobaan biologi sel untuk mempertahankan osmolaritas sel. Garam mengandung ion, yang menyeimbangkan jumlah ion garam di dalam sel. Jika sel yang tenggelam ke dalam solusi yang memiliki terlalu banyak garam ion, air akan bocor keluar dari sel, menyebabkan sel menyusut. Sebaliknya, jika sel terbenam ke dalam solusi yang memiliki ion terlalu sedikit garam, air akan masuk ke dalam sel, menyebabkan sel

pecah. Oleh karena itu, sangat penting saat melakukan percobaan biologi sel untuk menjaga sel-sel di osmolaritas tertentu. PBS adalah pada osmolaritas yang benar untuk menjaga sel-sel dalam negara isotonik. PBS sering digunakan sebagai larutan penyangga dalam berbagai eksperimen untuk mempertahankan pH protein. Protein memerlukan kisaran pH tertentu untuk menjaga netralitas pada asam amino tertentu, untuk mempertahankan struktur protein. Jika tidak, struktur protein akan terdenaturasi (Anonim 2, 2009).Selanjutnya cawan dibawa ke LAF, organ spleen dihancurkan dengan bagian ujung spuit yang tumpul searah jarum jam hingga hancur, kemudian sel tersebut dimasukkan ke dalam tabung propilen dengan menggunakan mikropipet. Kemudian tabung yang sudah berisi sel disimpan didalam kulkas untuk menjaga kondisi fisiologisnya.disentrifugasi sebanyak 2x dan diresuspensi dengan media 1 ml, lalu dihomogenasi dan dihitung sel. Setelah sel dihitung dilakukan kultur sel di ruang kultur dengan cara plate ditutup, kemudian direkatkan ke parafin serta disimpan di dalam inkubator CO2. Medium yang baru saja disterilisasi melalui filtrasi membran diinkubasi pada suhu 37C selama 1 minggu untuk mengetahui apakah terjadi kontaminasi. Kemudian medium disimpan pada suhu 4C dan dijaga agar pH tidak berubah. Serum yang belum digunakan harus disimpan pada suhu rendah (dibekukan) secepat mungkin setelah dibuat. Serum sebaiknya digunakan dalam jangka waktu 6-12 bulan dari persiapan jika disimpan pada suhu -20C, tetapi penyimpanan dapat lebih lama jika disimpan pada suhu -70C (Freshney, 2005). Medium kultur yang digunakan untuk kultur jaringan beragam. Terdapat medium kultur yang mengandung seluruh komponen secara lengkap dalam bentuk bubuk dan siap pakai. Macam medium diberi nama sesuai dengan pembuat medium dan larutan garam seimbang yang digunakan. Medium merupakan campuran nutrisi, serum, antibiotik, hormon, dan faktor tumbuh yang digunakan dalam kultur sel secara in vitro. Medium kultur sel sangat beragam dengan fungsi spesifik masingmasing. Beberapa contoh medium di antaranya Minimal Essential Medium (MEM), Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), Hams Nutrient Mitures F10 dan F12, Molecular Cellular Developmental Biology (MCDB), F12 CDME, dan Leibovitz L-15 (Marther dan Robert, 1998). Beberapa medium yang digunakan dalam kultur sel di antaranya, yaitu medium yang bekerja sangat kuat (1x konsentrasi), dengan atau tanpa glutamin, medium yang memiliki konsentrasi 10x, biasanya tanpa NaHCO3 dan glutamin yang tersedia dalam konsentrasi terpisah, dan medium berupa serbuk tanpa atau dengan NaHCO3 dan glutamin, merupakan medium yang paling murah (Freshney, 2005). Medium berperan sebagai mediator pertumbuhan bagi sel yang dikultur dan pemberian nutrisi bagi sel yang akan dikultur. Salah satu faktor yang penting dalam teknik kultur jaringan adalah medium. Teknik kultur jaringan akan berhasil bila pemilihan medium yang digunakan tepat karena dalam medium terdapat kebutuhan dari sel yang dikulturkan. Medium yang digunakan didasarkan pada sel yang akan digunakan dalam kultur sel tersebut (Wetter and Constabel,1991). Salah satu medium kultur yang biasa digunakan adalah DMEM. DMEM merupakan modifikasi dari Basal Medium Eagle (BME) yang berisi empat kali lipat lebih tinggi konsentrasi asam amino dan vitamin, serta tambahan komponen tambahan. DMEM asli formula berisi 1000 mg / L glukosa dan pertama kali dilaporkan untuk kultur sel embrio tikus (Anonim 3, 2011). DMEM yang digunakan dalam kultur sel kali ini adalah DMEM F-12, yang merupakan medium dengan nutrisi terkaya dibandingkan dengan medium lain yang ada. Kebanyakan media pertumbuhan yang digunakan merupakan media kimiawi, tetapi ditambahkan dengan serum 5-20% yang mengandung stimulan yang penting untuk pembelahan sel. Media yang bebas serum dengan tambahan stimulan tertentu digunakan untuk beberapa tujuan. Media mengandung larutan garam isotonis, asam amino, vitamin, dan glukosa, sontohnya Eagles Minimal Esential Medium (MEM) yang diformulasikan oleh Eagle th 50-an. Selain mengandung serum, MEM juga

diperkaya dengan antibiotik (biasanya penicillin dan streptomycin) untuk membantu mencegah kontaminasi bakteri. Umumnya pertumbuhan sel yang baik terjadi pada pH 7,0-7,4. Media juga ditambah fenol red sebagai indikator pH yang akan berwarna merah pada pH 7,4, orange pH 7,0, dan kuning pH 6,5, kebirubiruan pH 7,6 dan ungu pH 7,8. Kultur jaringan merupakan sutu tehnik reproduksi vegetativ, dimana sel atau jaringan diberi stimulan hormon sehingga bisa terbentuk organ yang utuh.. Pada hewan kemampuan toti potensi hanya ditemukan pada sel telur. Media tumbuh juga membutuhkan penyangga di antara dua kondisi, yaitu penggunaan flask terbuka menyebabkan masuknya O2 dan meningkatnya pH dan Konsentrasi sel yang tinggi menyebabkan diproduksinya CO2 dan asam laktat menyebabkan turunnya pH. Kedua kondisi ini dihadapi dengan dengan memberikan buffer ke dalam media dan ke dalam inkubator dialirkan CO2 dari luar. Buffer yang biasanya digunakan adalah sistem bikarbonat-CO2, sehingga ke dalam media pertumbuhan ditambahkan larutan bikarbonat. Reagent yang digunakan di dalam media dan kultur sel harus disterilisasi dengan autoclave (uap panas), hot-air oven (panas kering), membrane filtration, atau diirradiasi untuk peralatan plastik. Berdasarkan studi terdahulu menunjukkan bahwa ceplukan sebagai stimulan sistem imun yang efektif toksik pada beberapa tipe kanker dan sel leukemia dan memiliki efek antimikroba (Marther dan Robert, 1998).

Daftar pustaka Freshney, Ian. 2005. Culture of Animal Cells: A Manual of Basics Technique, Fifth edition. New York: John Willey & Sons Inc. Gupta, Mohit., dan Verma, Mohit. 2011. Sterilization and Disinfection. Diakses dari: http://www.scribd.com/doc/7658723/Sterilization-and-Disinfection. Diakses tanggal: 21 desember 2011. Jochems, Carlo. 2011. Fetal Bovine Serum: Are Cell Cultures Cruelty Free?. Diakses dari: http://www.all-creatures.org/clct/ar-fetal.html. Diakses tanggal: 21 desember 2011. Marther, Jennie P., dan Roberts, E. Penelope. 1998. Intoruction to Cell and Tissue Culture: Theory and Technique. New York: Plenum Press. Anonim 2, 2011. PBS. Diakses dari : http://www.biologicalworld.com. Diakses tanggal 21 desember 2011. Anonim 3, 2011. Diakses dari : www.sigmaaldrich.com. Diakses tanggal 21 desember 2011.