Anda di halaman 1dari 13

Pontificia Universidad Javeriana Facultad de ciencias basicas Departamento de Microbiologia Informe curvas patron para la determinar azucares reductores

(DNS), cuantificacion de proteinas (Bradford) y cuantificacion de almidon (yodatoyoduro) Viernes Grupo 7 Nicolas Martinez Aldana, Luis miguel chaves

RESUMEN Objetivo: Realizar una serie de curvas patrn por los mtodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificacin de azcares reductores, protenas totales y almidn, respectivamente. Materiales y mtodos: Para la cuantificacin de azcares reductores se utilizaron soluciones de glucosa con concentraciones entre un rango de 0,5 a 1,7 g/L, y esto se realiz con la tcnica del cido 3,5 Dinitrosaliclico (DNS), para la cuantificacin de protenas se utilizo la tcnica de Bradford y solucin de albmina en un rango de concentracin de 100 a 700 g/mL, para cuantificar la cantidad de almidn se utiliz una solucin de este a concentraciones entre 300 y 1000 g/mL, para esto se utiliz espectrofotometra, con los datos que se obtuvieron en cada etapa del procedimiento se realizo una regresin lineal donde se obtuvo una ecuacin que describe la absorbancia en trminos de la concentracin. Resultados: La ecuacin que describe la relacin entre la absorbancia y la concentracin de azucares reductores fueY= 0,5105x0,0149 con un r2 = 0,9982, la ecuacin que describe esta relacin con protenas es Y=0,0953x+0,0439 con un r2 = 0,9952 yla que describe la concentracin de almidn es Y=0,0004x+0,1251 con un r2= 0,9845. Conclusin: Con el uso de las curvas patrn se pudo determinar ecuaciones que nos permiten identificar la concentracin de protenas extracelulares, azucares reductores y el almidn.

PALABRAS CLAVES: Curva Patrn, azucares reductores, cido 3,5 dinitrosaliclico, protenas, Bradford, almidn, yodato-yoduro, absorbancia

INTRODUCCION

Una curva patrn, o curva de calibracin es una herramienta de la qumica analtica que se emplea para medir la concentracin de una sustancia en una muestra, por asimilacin de los elementos de una concentracin conocida. Se basa principalmente en una relacin lineal entre un carcter medible, por ejemplo para el desarrollo de este laboratorio se utilizaron dos variables como lo son la absorcin que guiados por la teora cuntica que dice que si hay una colisin entre un fotn y un receptor (tomo, ion o molcula), hay una probabilidad finita de que su energa pueda ser transferida al receptor en un proceso discontinuo, en trminos simples el receptor puede absorber energa o no(1).La otra variable que se utilizo fue la concentracin de la sustancia o elemento que se quera determinar. Para realizar la curva de calibracin se realizo una serie de diluciones a partir de una muestra cuya concentracin se conoca previamente, el siguiente paso es establecer una relacin matemtica con los datos obtenidos. Se dice que la respuesta de la muestra puede ser cuantificada y, si se emplea la curva de calibracin, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentracin del analito. Estos mtodos suelen tener una respuesta lineal sobre la que se le realiza un anlisis estadstico de regresin para evaluar la confiabilidad de los datos (2). En la practica de laboratorio se llevaron a cabo tres curvas patrn, azcares reductores, protenas y almidn. Cada sustancia, por su composicin qumica, requiere de diferentes mtodos para su cuantificacin. Para cuantificar azcares reductores se utiliza el mtodo del cido 3,5 di-nitrosaliclico o llamado tambin DNS, el cual se basa en la reduccin del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azcar reductor al cido 3-amino-5-nitrosaliclico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la longitud de onda de 540nm (3), por otro lado, existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas como reacciones de biuret, mtodo de Lowry, del cido bicincnico, entre otros, pero sin duda, uno de los ms usuales es el mtodo de Bradford, que se basa en un equilibrio entre las tres formas del azul de Commassie (colorante), en condiciones fuertemente cidas el colorante suele ser ms estable, tornando a un color rojo, tras la unin a las protenas torna a color azul (4). Finalmente, para la cuantificacin del almidn se utiliz la tcnica yoduro yodato esta prueba se basa en la reaccin donde, en un medio dbilmente cido, ocurre rpidamente liberando yodo el cual se detecta fcilmente con almidn. El yodo por fuerzas de Van der vals se une a los enlace 1-4 del almidn formando un complejo de inclusin que forman un color violeta (5). El objetivo de esta introduccin es ilustrarnos para cumplir el objetivo de la practica el cual es realizar una serie de curvas patrn por los mtodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificacin de azcares reductores, protenas totales y almidn, respectivamente.

MATERIALES Y METODOS:

CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: Con la ecuacin de la volumetra se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de glucosa (0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 1.7) g/L. Para la determinacin de la concentracin de glucosa mediante la tcnica de DNS se preparo un blanco con 0,25ml de reactivo DNS y 0,25ml de agua, con las concentraciones de glucosa (0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 1.7) g/L se preparo una solucin que contena 0,25ml de la dilucin mas 0,25ml de DNS, al cabo de esto se llevaron estos tubos a una temperatura de ebullicin por 5 minutos, al terminar este tiempo se pasaron los tubos a un recipiente que contena hielo para frenar la reaccin, Una vez que se enfriaron los tubos se les agreg 2,5ml de agua destilada y luego se realiz una medicin en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540nm. CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS: Con la ecuacin de la volumetra se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de albumina 100, 200, 300,400, 600, 700 g/ml. Para la determinacin de la concentracin de protenas mediante la tcnica de Bradford se preparo un blanco con 0,1ml de NaCl y 5ml de reactivo de Bradford y se prepararon soluciones que contenan 0,1ml de cada dilucin con 5ml del reactivo de Bradford, se midi la absorbancia de estas soluciones a una longitud de onda de 595nm CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ALMIDON: Con la ecuacin de la volumetra se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de almidn 300,400,500,600,700,800 y1000 g/ml. Para la determinacin de la concentracin de almidn mediante la tcnica de yodo-yoduro se preparo un blanco con 1ml de solucin de sales, 1ml de solucin de yodo-yoduro y 2 ml de agua destilada y a partir de las diluciones preparadas se preparan soluciones con 1ml de estas mas 1ml de reactivo yodo-yoduro y 2ml de gua destilada, se homogenizan y se leen en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 650nm.

RESULTADOS

1. Curva patrn para la determinacin de azcares reductores.

La curva patrn para cuantificacin de azcares reductores se obtuvo producto de los resultados del experimento llevados a cabo por las monitoras y por los estudiantes del laboratorio. Los resultados se consignan a continuacin en la tabla nmero 1 y en la tabla nmero 2. Tabla 1. Resultados de la curva patrn de glucosa por DNS (monitora). Concentracin de azcar en g/L Vs. Abs a 540nm (monitora) Rplica Concentraciones g/L 0,5 0,7 1 1,5 1,7 2 1 0,280 0,300 0,655 0,817 0,962 2 0,241 0,352 0,490 0,785 0,808 1,077 3 0,233 0,316 0,418 0,811 0,856 0,947 Promedio 0,251 0,323 0,454 0,750 0,827 0,995 DS 0,025 0,027 0,051 0,084 0,026 0,071 CV (%) 10,005 8,254 11,214 11,139 3,085 7,146 La tabla 1 muestra los resultados obtenidos por las monitoras al efectuar el ensayo de DNS sobre las muestras de glucosa, en la que se observa un aumento de las absorbancias conforme aumentan las concentraciones de azcar, as como los coeficientes de variacin, los cuales se encuentran fuera del rango de un estudio qumico (mximo 5%). Tabla 2. Resultados de la curva patrn de glucosa por DNS (estudiantes) Concentracin de azcar en g/L Vs. Abs a 540nm GRUPOS Concentraciones (g/L) 0,5 0,7 1 1,5 1,7 2 1 0,362 0,498 0,699 1,060 1,130 1,166 2 0,207 0,318 0,697 0,712 0,727 0,871 3 0,240 0,328 0,488 0,693 0,758 1,068 4 0,139 0,212 0,240 0,290 0,304 0,933 5 0,293 0,424 0,419 0,755 0,949 1,130 6 0,211 0,304 0,480 0,837 0,879 0,932 7 0,261 0,379 0,532 0,792 0,876 1,006 8 0,374 0,470 0,632 0,896 1,028 0,984 Promedio 0,261 0,367 0,523 0,754 0,831 1,011 DS 0,079942 0,094927 0,154546 0,221332 0,250809 0,102896 CV 30,64373 25,89211 29,52879 29,33974 30,16797 10,17516 En la tabla nmero 2 se registran los datos de los 8 grupos de laboratorio tomados para cada una de las concentraciones de glucosa. Se puede observar que el coeficiente de variacin es alto.

Tabla 2a. Resultados de la curva patrn de glucosa por DNS RECORTADO (autores) Concentracin de azcar en g/L Vs. Abs a 540nm (recortado) GRUPOS Concentraciones (g/L) 0,5 0,7 1 1,5 1,7 2 1 2 3 0,240 0,328 0,488 0,693 0,758 1,068 4 5 6 0,211 0,304 0,480 0,837 0,879 0,932 7 0,261 0,379 0,532 0,792 0,876 1,006 8 Promedio 0,237 0,337 0,500 0,774 0,838 1,002 DS 0,025 0,038 0,028 0,074 0,069 0,068 CV (%) 10,579 11,365 5,600 9,518 8,238 6,795 La tabla 2a registra las rplicas que ms se acomodan a la tendencia de los datos de absorbancia, para cada una de las muestras, segn lo obtenido por las monitoras del laboratorio. Se eliminaron grupos de datos para obtener un menor coeficiente de variacin entre las absorbancias medidas, debido a que el mismo era demasiado alto y se encontraron rplicas que se encontraban demasiado desviadas de los datos experimentales de control interno. Figura 1. Grfico representativo de la curva patrn de glucosa (monitora).

En la figura 1 se puede apreciar la relacin casi lineal entre las concentraciones de glucosa y las absorbancias de cada una, y la regresin lineal de los datos con la ecuacin de dicha regresin y su r2 de 0,9962. Figura 2. Grfico representativo de la curva patrn de glucosa (autores).

En la figura 2 se observa la representacin grfica de los datos obtenidos por los estudiantes, de absorbancias Vs. Concentraciones, de las 3 rplicas que ms se ajustaron a los resultados del control.

2. Curva patrn para la cuantificacin de protenas. En las tablas 3 y 4 se registran los datos obtenidos de protenas totales (albmina de suero bovino) por el mtodo de Bradford, realizado por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes, respectivamente. Tabla 3. Resultados de la curva patrn de protenas por el mtodo de Bradford (monitora) Concentraciones de Albmina de suero bovino Vs. Abs a 595nm (monitora) 200 Rplica 100 g/mL g/mL 300 g/mL 400 g/mL 600 g/mL 700 g/mL 1 0,082 0,298 0,387 0,491 0,684 0,733 2 0,175 0,226 0,361 0,415 0,763 0,684 3 0,178 0,262 0,42 0,422 0,557 0,758 Promedi 0,3893333 0,4426666 o 0,145 0,262 3 7 0,668 0,725 DS 0,0545802 0,036 0,0295691 0,0420039 0,1039278 0,0376430

CV (%)

2 3 7 6 6 37,641528 13,74045 7,5948102 9,4888482 15,558062 5,1921462 4 8 9 1 8 7

En la tabla 3 se consignan los resultados obtenidos por las monitoras del laboratorio en la prueba. Se pudo observar que al ser el coeficiente de variacin tan alto, se encontraron problemas en el muestreo de uno o ms puntos. Tabla 4. Resultados de la curva patrn de protenas por el mtodo de Bradford (estudiantes). Concentraciones de Albmina de suero bovino Vs. Abs a 595nm 100 200 300 400 600 700 Grupo g/mL g/mL g/mL g/mL g/mL g/mL 1 0,035 0,082 0,147 0,207 0,374 0,467 2 0,045 0,124 0,266 0,399 0,558 3 0,041 0,115 0,221 0,265 0,426 0,523 4 0,112 0,216 0,318 0,399 0,532 0,555 5 0,141 0,237 0,282 0,401 0,514 0,585 6 0,112 0,208 0,342 0,410 0,609 0,530 7 0,165 0,239 0,377 0,485 0,579 0,658 8 0,082 0,170 0,280 0,339 0,528 0,609 Promedio 0,092 0,174 0,279 0,363 0,515 0,561 DS 0,049 0,060 0,072 0,089 0,078 0,063 CV (%) 53,289 34,763 25,714 24,553 15,226 11,171 En la tabla 4 se consignan los resultados obtenidos por cada uno de los grupos de laboratorio en la prueba. Se puede observar que el coeficiente de variacin es alto. Tabla 4a. Resultados de la curva patrn de protenas por el mtodo de Bradford (autores). Concentraciones de Albmina de suero bovino Vs. Abs a 595nm (recortado) 100 200 300 400 600 700 Grupo g/mL g/mL g/mL g/mL g/mL g/mL 1 2 3 4 0,112 0,216 0,318 0,399 0,532 0,555 5 0,141 0,237 0,282 0,401 0,514 0,585 6 7 0,165 0,239 0,377 0,485 0,579 0,658 8

Promedio DS CV (%)

0,139 0,027 19,047

0,231 0,013 5,524

0,326 0,048 14,727

0,428 0,049 11,460

0,542 0,034 6,196

0,599 0,053 8,839

En la tabla 4a se consignan los resultados de las rplicas que presentaron mayor igualdad a los datos obtenidos por las monitoras en la prueba. Se puede apreciar que los coeficientes de variacin son mucho ms bajos que tomando todo el grupo de gatos completo. Figura 3. Grfico representativo de la curva patrn de protenas (monitora)

En la figura 3 se puede apreciar la relacin de las absorbancias y las concentraciones de protena de las muestras analizadas. En la figura se puede apreciar la ecuacin de la linealizacin y el r2 de 0,9768. Figura 4. Grfico representativo de la curva patrn de protenas (autores).

En la figura 4 se puede apreciar la representacin de los datos obtenidos y su relacin casi lineal (Abs vs. Concentracin), as como la ecuacin de la linealizacin y el r2 de 0,9952.

3. Curva patrn para la cuantificacin de almidn. En las tablas 5 y 6 se consignan los datos obtenidos experimentalmente por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes durante la prctica. Tabla 5. Resultados de la curva patrn de almidn por el mtodo de Lugol (monitora). Rplica 1 2 3 Promedio DS CV (%) Concentracin de almidn en g/mL Vs. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0,246 0,310 0,357 0,420 0,452 0,492 0,245 0,284 0,336 0,398 0,429 0,467 0,248 0,309 0,354 0,390 0,436 0,465 0,246 0,301 0,349 0,403 0,439 0,475 0,002 0,015 0,011 0,016 0,012 0,015 0,620 4,894 3,254 3,858 2,686 3,169 1000 0,557 0,543 0,601 0,567 0,030 5,338

En la tabla 5 se consignan los datos experimentales obtenidos por las monitoras del laboratorio en la prctica. Se puede observar que el coeficiente de variacin de dichos datos es relativamente bajo. Tabla 6. Resultados de la curva patrn de almidn por el mtodo de Lugol (estudiantes).

Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 Promedio DS CV (%)

Concentracin de almidn en g/mL Vs. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0,236 0,287 0,359 0,385 0,417 0,472 0,227 0,271 0,331 0,397 0,415 0,457 0,237 0,303 0,365 0,401 0,442 0,505 0,238 0,284 0,348 0,386 0,430 0,478 0,237 0,285 0,326 0,373 0,411 0,420 0,222 0,287 0,358 0,393 0,446 0,467 0,229 0,310 0,364 0,386 0,425 0,475 0,242 0,310 0,360 0,419 0,430 0,465 0,234 0,292 0,351 0,393 0,427 0,467 0,007 0,014 0,015 0,014 0,013 0,024 2,887 4,794 4,292 3,493 2,946 5,093

1000 0,499 0,522 0,548 0,535 0,500 0,559 0,534 0,577 0,534 0,027 5,099

En la tabla 6 se consignan los resultados obtenidos por los 8 grupos de laboratorio. Se puede apreciar que el coeficiente de variacin no es muy alto.

Figura 5. Grfico representativo de la curva patrn de almidn (monitora).

En la figura 5 se pueda apreciar la representacin de los datos en una grfica, as como de la linealizacin de los mismos, incluyendo su ecuacin de la recta y el r 2 de 0,9957. Figura 6. Grfico representativo de la curva patrn de almidn (estudiantes).

En la figura 6 se puede apreciar la representacin de los datos en un grfico, as como de la linealizacin de los mismos, con la ecuacin de la recta y el r 2 de 0,9845.

DISCUSIN

La elaboracin de una curva patrn es un paso muy importante para la determinacin de las concentraciones de una muestra a analizar, teniendo un parmetro con el que se relaciona dicha concentracin por medio de la curva patrn. En general, para la construccin de curvas patrn, se utilizan soluciones de concentracin conocida, a las que se les halla una determinada Absorbancia, por ejemplo u otro parmetro, como el dimetro, graficndose finalmente cada pareja de puntos en un sistema cartesiano y as lograr obtener una lnea recta que relacione dichas concentraciones con el parmetro medido. En la prctica se construyeron 3 curvas patrn para distintos propsitos, tomando en base las mediciones de absorbancia realizadas a muestras de concentracin conocida, empleando mtodos colorimtricos (DNS, Bradford, Lugol), para luego obtener, mediante la ayuda de un programa de hoja de clculo o CAS, una linealizacin de dichos puntos y poder as predecir qu concentracin tendr una muestra de determinada absorbancia. A la hora de trabajar con absorbancias, se debe tener en cuenta que, segn la ley de Lambert-Beer, el comportamiento lineal de los datos de concentracin, respecto a los datos de absorbancia solo se cumple desde 0,1 hasta 1 unidades

de absorbancia, ms all de ste rango, el comportamiento de los datos empieza a ser polinmico y por ende la relacin 1 a 1 se pierde. La primera curva realizada fue la curva patrn para la determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS, el cual es un mtodo bastante fiable y preciso para la determinacin de dichos azcares (6). Dicho proceso es un mtodo ampliamente utilizado en microbiologa para la deteccin de sustratos iniciales de un medio especfico, as como de sustratos residuales, que permiten hacer clculos cinticos para los microorganismos involucrados en un proceso fermentativo. La segunda curva realizada fue la curva patrn para la cuantificacin de protenas segn el mtodo de Bradford, el cual se basa en la interaccin de ciertos aminocidos como la Histidina y la arginina, con el colorante azul de Coomasie, para dar lugar a una reaccin colorimtrica (7). La tercera curva realizada fue la curva patrn para la cuantificacin de almidn segn el mtodo de Lugol, el cual se basa en la deteccin del almidn debido a la interaccin del yodo con las hlices del almidn, formando un complejo yodoalmidn y rindiendo un color violeta que indica la presencia de almidn positiva (8). En los datos obtenidos en las 2 primeras practicas correspondientes a las curvas patrn de azcares reductores y protenas, se pudo observar que los datos de las rplicas, cada una correspondiente a un grupo de trabajo del laboratorio, se encontraban bastante dispersos, presentando un coeficiente de variacin muy alto (mayor al 5%), por lo que se debi proceder a recortar el nmero de rplicas que se tomaron para efectuar dichas curvas patrn obteniendo al final, un mnimo de rplicas aceptable (3 rplicas), con las que se procedi a realizar cada una de las curvas. Estos resultados tan diferentes pueden deberse a la sensibilidad de los reactivos, a la calibracin incorrecta de los equipos o a fallas de manejo de los grupos de laboratorio. Dicha situacin no se present en los datos de la tercera curva, la de almidn, por lo que se emple todo el conjunto de datos (8 rplicas) para hacer las mediciones de la curva patrn.

CONCLUSIONES

De acuerdo al procedimiento de la prctica se pudo conocer los fundamentos qumicos, el correcto procedimiento y la importancia de las tcnicas de DNS, Bradford y yodo-yoduro.

Con el uso de las curvas patrn se pudo determinar y se hallaron ecuaciones que nos permiten saber o cuantificar las concentraciones de almidn, protenas y azucares reductores. Mediante una previa investigacin y en las practicas se identificaron los factores que pueden llegar a interrumpir o dar falsos positivos en las tcnicas utilizadas. Utilizando el conocimiento aprendido en estas practicas se pueden hallar diferentes ecuaciones para cuantificar diferentes compuestos que estn presentes en una gran cantidad de reacciones.

BIBLIOGRAFA 1- Alfonso Clavijo Diaz. Fundamentos de qumica analtica. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogota. Primera edicin (2002). pg 805 2- Gonzales C. Introduccin a los mtodos instrumentales de anlisis. Primera edicin. Ed. McGraw-Hill. Madrid (2003) 3- Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., 31, 426, 1959. 4- Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254. 5- Burns R. Fundamentos de qumica. Cuarta edicin. PEARSON. Mxico DF, Mxico. 2003 6- Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., 31, 426, 1959. 7- Ahmed H. Principles and reactions of protein extraction, purification and characterization. CRC Press, ao 2005, 410p. 8- Harisha S. An introduction to practical biotechnology. Laxmi Publications, ao 2006, 540p.

Anda mungkin juga menyukai