Anda di halaman 1dari 4

Nama : Hardita Libriasanti NIM : 11798

FLUORESCEIN DIACETATE HYDROLYSIS ASSAY (FDA) Bahan : 60 mM buffer phospat 2000 m ml-1 FDA dalam bentuk aseton 5 mg ml-1 fluorescein garam sodium di dalam buffer Chloroform/methanol (campuran 2:1) Alat : 5 50 ml falcon tubes untuk sampel (steril) 5 50 ml falcon tubes sebagai tube-penangkap sampel (tidak steril tetapi bersih) 1 50 ml falcon tubes untuk masing-masing standar (n =5) 200 l pipet dengan tipnya Spatula logam Kertas filter bulat (diameter 10 cm) Water bath shaker Spectrophotometer Cara Kerja : Sampel Air Alat Tambahan : Unit filtrasi milipore Vacuum manifold Penjepit steril 47 mm (0,45 m ukuran pori) filter membran polikarbonat dengan alas penyerap

sterilkan penjepit dengan alkohol 70% dan api, pisahkan filter membran dan alas penyerap dari pembungkus, tempatkan pada dasar unit filtrasi milipore (perhatikan bahwa alas berada dibawah dan filter di atas), kunci cup filter pada bagian dasarnya siapkan 3 filter untuk masing-masing sampel

tempatkan unit filtrasi di vacuum manifold, buka katup yang mengatur aliran ke tempat dimana filter berada, tutup semua tempatkan sampel dalam filter dengan volume yang tepat (filter akan menampung 100 ml air), akan tetapi tetap terus tambah air secukup mungkin, volume dicatat

hubungkan pipa dari pompa vacuum ke manifold (pipa bermulut banyak) lewat aliran belakang preventor, nyalakan pompa, air akan terisap melewati filter membran (sel dalam air akan terperangkap pada membran) buka katup untuk melepaskan sisa pengisapan, pisahkan unit filtrasi dari vacuum manifold, pindahkan cup filtrasi dari dasar tanpa merusak membran dengan penjepit steril, pisahkan membran dari dasar, tempatkan pada 50 ml falcon tube, proses lagi dari langkah 2 inkubasi pada solid media (TSA atau R2A)

FDA Assay Isi 3 50 ml falcon tube dengan 2 gr material Isi 1 50 ml falcon tube dengan 2 gr material (berisi tanah, tetapi tidak berisi FDA) kontrol 1 Isi masing-masing tube 20 ml 60 buffer phospat Isi 1 50 ml falcon tube hanya dengan buffer kontrol 2 Vortex tambah masing-masing tube dengan 100 l FDA kecuali kontrol 1 Digojok sebentar dengan tangan water bath shaker (200 rpm) inkubasi 30 60 menit, suhu 30 C tambah dengan 20 ml 2 : 1 chloroform/methanol gojok sebentar dengan tangan Spin di 5000 x g selama 5 menit Ambil 5 ml cairan di dalam tube (bagian paling atas), letakkan dalam falcon tube baru yang bersih amati intensitas pewarnaan dari fluorescent termasuk menggunakan spectrophotometer (panjang gelombang 490 nm)

Menyiapkan Standar Fluorescein Gunakan kurva standar (digunakan untuk mengonversi perhitungan OD dalam satuan g produksi fluorescein per gram tanah)

Larutkan persediaan laruran standar (5 mg ml-1 aseton) fluorescein garam sodium sesuai tabel

Standar Fluorescein (mg ml-1) 5 2,5 1,0 0,5 0,1 0,05

Pelarutan Larutan Standar Fluorescein untuk Mencapai Masing-Masing Standar 1:2 1 : 5 (1 : 2,5 pelarautan sebelumnya) 1 : 10 (1 : 2) 1 : 50 (1 : 5) 1 : 100 (1 : 2)

Volume yang Ditambahkan pada Masing-Masing Sampel Standar (l) 100 100 100 100 100 100

Hasil Konsentrasi Fluorescein dalam Sampel Standar (g ml-1) 12,5 5,0 2,5 0,5 0,25 1,125

Ketika methanol larut dalan larutan encer, hasil dari volume fase encer mengikuti penambahan chloroform/methanol pada sampel nilainya akan lebih besar dari 20 ml. Oleh karena itu, untuk menghitung perbedaan konsentrasi yang tercipta dari daya larut methanol, larutan standar dihilangkan pada sampel aktual.

Misal, 100 ml dari latutan standar fluorescein ditambahkan ke falcon tube yang berisi 20 ml larutan penyangga (tanpa sampel), disebut sebagai sampel standar, dan diinkubasi. Dengan melakukan hal tersebut, hasil dari fase encer akan terdiri dari sedikit larutan, tetapi relatif konsentrasi yang akurat yang dapat dibandingkan dengan sampel.

Ketika tidak ada sampel di larutan standar, maka tidak butuh disaring. Larutan standar tersebut dapat dianalisis dengan spectophotometer secara langsung setelah disentrifugasi untuk menentukan kurva standar.

Penghitungan Aktivitas Enzim pada Sampel Penetapan sebelumnya standar perhitungan OD490 dari penetapan kurva standar. Setelah inkubasi, OD490 dari sampel standar dihitung untuk menghasilkan kurva standar. Untuk contoh, menentukan OD490 sampel standar dari tabel : Konsentrasi Fluorescein (g ml-1) 12,5 5,0 2,5

OD490 2,5 1,2 0,7

1,0 0,5 0,25 0,125

0,28 0,14 0,06 0,02

Buat grafik OD490 vs konsentrasi fluorescein untuk menghasilkan kurva standar (munculkan persamaan fungsinya, misal dihasilkan fungsi y = 9,3x 0,02)

Asumsikan hasil dari sampel dengan OD490 adalah 0,900. Untuk menghitung nilai dari produksi fluorescein dalam sampel tersebut

Kurangi nilai OD490 untuk perlakuan tanpa FDA (kontrol 1) dan perlakuan tanpa sampel (kontrol 2) (asumsikan meyumbang nilai sebesar 0,050). Perhitungan digunakan untuk perubahan warna apapun yang terjadi yang tidak berhubungan dengan sampel. OD490 = 0,850 dimasukkan dalam persamaan pada kurva standar y = 9,3x 0,02 Produk fluorescein = (9,3 x OD490) 0,02 Produk fluorescein = (9,3 x 0,850) 0,02 Produk fluorescein = 7,88 g ml-1 dari larutan