Anda di halaman 1dari 89

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Kedelai telah menjadi makanan sehari-hari penduduk Asia. Pada sebagian besar negara Asia, konsumsi isoflavon diperkirakan antara 25 45 mg/hari. Jepang merupakan negara yang mengkonsumsi isoflavon terbesar, diperkirakan konsumsi harian orang Jepang adalah 200 mg/hari. Di negara-negara barat konsumsinya kurang dari 5 mg isoflavon per hari. Makanan yang terbuat dari kedelai mempunyai jumlah isoflavon yang bervariasi, tergantung bagaimana mereka diproses. Makanan dari kedelai seperti tahu, susu kedelai, tepung kedelai dan kedelai utuh mempunyai kandungan isoflavon berkisar antara 130 380 mg/100 gram. Kecap dan minyak kedelai tidak mengandung isoflavon. Produk kedelai yang digunakan sebagai bahan tambahan pangan, seperti isolat dan konsentrat protein kedelai mempunyai kandungan isoflavon yang bervariasi, tergantung bagaimana proses pengolahannya. Misalnya, hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan alkohol dalam proses ekstraksi menghasilkan kadar isoflavon yang rendah.

Hasil penelitian di berbagai bidang kesehatan telah membuktikan bahwa konsumsi produk-produk kedelai berperan penting dalam menurunkan resiko terkena berbagai penyakit degeneratif. Ternyata, salah satu penyebab dari hal tersebut adalah adanya zat isoflavon dalam kedelai. Isoflavon merupakan faktor kunci dalam kedelai sehingga memiliki potensi memerangi penyakit tertentu.Terdapat suatu realita bahwa di negara-negara ASEAN dan Jepang yang persentase konsumsi kedelainya relatif tinggi dibandingkan dengan negara lain, terjadi resiko penyakit kanker payudara, kanker prostat, dan uterus yang lebih rendah. Isoflavon kedelai dapat menurunkan resiko penyakit jantung dengan membantu menurunkan kadar kolesterol darah. Protein kedelai telah terbukti mempunyai efek menurunkan kolesterol, yang dipercaya karena adanya isoflavon di dalam protein tersebut. Studi epidemologi juga telah membuktikan bahwa masyarakat yang secara teratur mengkonsumsi makanan dari kedelai, memiliki kasus kanker payudara, kolon dan prostat yang lebih rendah. Isoflavon kedelai juga terbukti, melalui penelitian in vitro dapat menghambat enzim tirosin kinase, oleh karena itu dapat menghambat perkembangan sel-sel kanker dan angiogenesis. Hal ini berarti suatu tumor tidak dapat membuat pembuluh darah baru, sehingga tidak dapat tumbuh.

Peranan isoflavon dalam membantu menurunkan osteoporosis juga telah diteliti. Konsumsi protein kedelai dengan isoflavon telah terbukti dapat mencegah kerapuhan tulang pada tikus yang digunakan sebagai model untuk penelitian osteoporosis. Studi yang lain menunjukkan hasil yang sama pada saat menggunakan genistein saja. Ipriflavone, obat yang dimetabolisme menjadi daidzein telah terbukti dapat menghambat kehilangan kalsium melalui urine pada wanita post menopouse. Produk kedelai yang mengandung isoflavon dapat membantu pengobatan simptom menopouse. Pada wanita yang memproduksi sedikit estrogen, isoflavon (phytoestrogen) dapat menghasilkan cukup aktivitas estrogen untuk mengatasi simptom akibat menopouse, misalnya hot flashes. Suatu penelitian menunjukkan bahwa wanita yang mengkonsumsi 48 gram tepung kedelai per hari mengalami gejala hot flashes 40 % lebih rendah. Dari segi epidemologi, wanita Jepang yang konsumsi isoflavonnya tinggi jarang dijumpai simptom post menopousal. Isoflavon terdiri dari beberapa jenis senyawa diantaranya yaitu : genistein, glisitein, dan daidzein. Karena begitu pentingnya fungsi senyawa isoflavon yang terdapat dalam tanaman kedelai, khususnya biji kedelai, maka pada percobaan ini dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa golongan flavonoid dari biji kedelai (Glycine max). Metode ekstraksi yang digunakan untuk memisahkan isoflavon dari biji kedelai dalam hal ini adalah metode soxhletasi mengingat metode ini cukup sesuai digunakan untuk memisahkan isoflavon yang cukup stabil terhadap pemanasan. Serbuk biji kedelai yang diekstraksi memiliki struktur lunak sehingga dengan dengan aliran cairan penyari yang kontinu dapat diperoleh ekstrak dengan lebih cepat dan lebih murni. Selain itu, metode soxhletasi dipilih karena dengan metode ini dapat diperoleh ekstrak dengan lebih cepat, digunakan cairan penyari yang lebih sedikit, serta pelarut tidak cepat jenuh karena adanya sirkulasi pelarut yang berkesinambungan. Untuk identifikasi senyawa isoflavon dari biji kedelai, digunakan teknik KLT dan pergeseran spektrum. Alasan digunakannya teknik KLT adalah untuk mengefisiensikan waktu analisis mengingat KLT dapat memberikan waktu analisis yang cepat, yaitu antara 30 menit hingga beberapa jam. Selain itu, teknik KLT dapat dikombinasikan dengan suatu penampak bercak, sehingga penentuan senyawa dapat dilakukan dengan tepat. Identifikasi selanjutnya dapat dipastikan dengan menggunakan metode pergeseran

spektrum pada spektrofotometer UV-Vis, di mana senyawa isoflavon dapat memberikan absorbansi tertentu dengan penambahan pereaksi geser pada panjang gelombang UVVis.

1.2 Rumusan masalah 1. Bagaimana cara mengisolasi senyawa isoflavon pada biji kacang kedelai (Glycine max) ? 2. Bagaimana cara mengidentifikasi senyawa isoflavon yang ada pada biji kacang kedelai (Glycine max)? 3. Bagaimana prinsip pengidentifikasian senyawa isoflavon berdasarkan metode KLT-Spektrofotodensitometri ? 1.3 Tujuan Percobaan 1. Untuk mengetahui bagaimana cara mengisolasi senyawa isoflavon dari biji kacang kedelai (Glycine max). 2. Untuk mengetahui cara mengidentifikasi isolat yang diperoleh dari teknik isolasi yang dilakukan. 3. Untuk mengetahui prinsip pengidentifikasian senyawa isoflavon berdasarkan metode KLT-Spektrofotodensitometri

1.4 Manfaat Percobaan Penelitian ini dapat memberikan informasi kepada kalangan akademis mengenai cara yang tepat untuk melakukan isolasi dan identifikasi kandungan kimia (isoflavon) dalam ekstrak biji kacang kedelai (Glycine max).

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deskripsi Tanaman Dan Simplisia

Gambar 1. Kedelai (Glycine max Piper)

2.1.1 Deskripsi tanaman a. Sistematika Tanaman Divisi Sub divisi Kelas Ordo Famili Subfamili Genus Spesies : Spermatophyta : Angiospermae : Dicotyledonae : Rosales : Legiminosae : Papilionoidae : Soya : Soya max atau Glycine max Piper(Anonim a, 2001).

b. Nama Daerah Sumatera : Kacang bulu (Minangkabau) Retah Mejong (Lampung)

Kedele (Melayu) Jawa Bali : Kedele (Sunda) Kedele (Jawa Tengah) Khadele (Madura) : Kadele

Nusa Tenggara: Lebuwi Bawad (Sasak) (Anonim a, 2001). c. Deskripsi tanaman

Tanaman kedelai merupakan semak semusim dengan tinggi 20-60 cm. Batang bersegi, berkayu, berambut, bercabang, dan berwarna hijau keputih-putihan. Daun majemuk, menyirip ganjil, berbentuk bulat telur, ujung tumpul, tepi rata, pangkal membulat, panjang 2-5 cm, lebar 2-4 cm, petulangan menyirip, dan berwarna hijau. Bunga berupa bunga majemuk, berbentuk tandan, kelopak 5-7 mm, berambut, bertajuk sempit, runcing, mahkota memiliki panjang 6-7 mm, kelopak berwarna ungu, benang sari berbentuk jarum, serta bakal buah berambut lebat dan berwarna kuning keunguan. Buah kedelai merupakan buah polong, bertangkai pendek, pipih, masih muda hijau, dan setelah tua menjadi kuning kecoklatan.Biji kedelai berbentuk bulat telur, dan berwarna kuning keputih-putihan. Akar berupa akar tunggang, berwarna (Anonim a, 2001). putih kekuningan

2.1.2 Deskripsi Simplisia Polong kedelai pertama kali terbentuk sekitar 7-10 hari setelah munculnya bunga pertama. Panjang polong muda sekitar 1 cm. Jumlah polong yang terbentuk pada setiap ketiak tangkai daun sangat beragam,antara 1-10 buah dalam setiap kelompok. Pada setiap tanaman, jumlah polong dapat mencapai lebih dari 50, bahkan ratusan. Kecepatan pembentukan polong dan pembesaran biji akan semakin cepat setelah proses pembentukan bunga berhenti. Ukuran dan bentuk polong menjadi maksimal pada saat awal periode pemasakan biji. Hal ini kemudian diikuti oleh perubahan warna polong, dari hijau menjadi kuning kecoklatan pada saat masak (Wawan Irwan, 2006). Di dalam polong terdapat biji yang berjumlah 2-3 biji. Setiap biji kedelai mempunyai ukuran bervariasi, mulai dari kecil (sekitar 7-9 g/100 biji), sedang (10-13 g/100 biji), dan besar (>13 g/100 biji). Bentuk biji bervariasi,tergantung pada varietas tanaman, yaitu bulat, agak gepeng, dan bulat telur. Namun demikian, sebagian besar biji berbentuk bulat telur.Biji kedelai terbagi menjadi dua bagian utama, yaitu kulit biji dan janin (embrio). Pada kulit biji terdapat bagian yang disebut pusar (hilum) yang berwarna coklat, hitam, atau putih. Pada ujung hilum terdapat mikrofil, berupa lubang kecil yang terbentuk pada saat proses pembentukan biji.Warna kulit biji bervariasi, mulai dari kuning, hijau, coklat, hitam, atau kombinasi campuran dari warna-warna tersebut. Biji kedelai tidak mengalami masa dormansi sehingga setelah proses pembijian selesai, biji

kedelai dapat langsung ditanam. Namun demikian, biji tersebut harus mempunyai kadar air berkisar 12-13% (Wawan Irwan, 2006).

Gambar 2. Penampang Serbuk Biji Kedelai Keterangan. Biji berbentuk bulat telur dan memiliki ukuran sebagai berikut: panjangnya sekitar 6-11 mm, lebarnya 5-8 mm, tebalnya 4-7 mm. 100 biji kedelai beratnya antara 14,5 sampai 33 mg. Biji kedelai memiliki warna kuning pucat atau kekuning-kuningan. Di bagian tengah setiap kulit biji yang agak transparan terdapat hilus yang berukuran 3 sampai 4 mm dengan mikrofil di bagian ujung yang satu dan stropiol di bagian ujung lainnya. Embrio mengisi biji dan terdiri dari dua kotiledon plano-convex dengan hipokotil- radikula kecil dan plumula (T.E. Wallis, 2005).

Histologi Epidermis pagar dari beberapa kulit biji terdiri dari sel-sel prisma polygonal dengan tinggi 45 sampai 60 mikron dan lebar 7 sampai 20 mikron, dengan dinding antiklinal selulosa yang tebal, sedangkan bagian hipodermis berbentuk bearercells dengan tinggi 40 hingga 120 mikron dan lebar 30 hingga 40 mikron pada bagian atas dan dasar, dan 18 hingga 30 mikron di bagian tengah. Sisa kulit biji terdiri dari parenkim yang agak datar, hal ini diikuti oleh satu lapisan sel aleuron dan beberapa parenkim yang dihilangkan, membentuk lapisan hialin di bagian melintang. Kotiledon terdiri dari parenkim berdinding tipis dengan tiga baris palisade pada sisi datarnya. Sel ini terdiri dari minyak pemulih dan 3 biji yang memiliki diameter sekitar 3 sampai 11

mikron yang berbentuk

kristaloid dan globoid. Sel tersebar di sepanjang jaringan

kotiledon yang masing-masing berisi prisma ganda kalsium oksalat, dengan panjang sekitar 24,5 mikron dan dengan lebar 4 sampai 5 mikron. Pati tidak ditemukan dari biji matang, tetapi beberapa struktur butiran kecil kadang-kadang dapat ditemukan (T.E. Wallis, 2005).

2.2

Penyiapan Bahan Tahapan pembuatan simplisia meliputi tahap pengumpulan (panen), sortasi dan

pencucian, pengubahan bentuk, pengeringan, sortasi kering, pengepakan, dan penyimpanan. a. Pengumpulan Bahan Baku Selain dipengaruhi oleh organ tanaman yang digunakan untuk simplisia, kadar senyawa aktif dalam suatu simplisia juga bergantung dari umur tanaman serta waktu pengumpulan dalam setahun dan bahkan waktu pengumpulan dalam sehari (Harbone, 1987). b. Sortasi Basah Sortasi basah bertujuan untuk membersihkan benda- benda asing yang berasal dari luar seperti tanah, kerikil, rumput, bagian tanaman lain, bahan yang rusak, dan bagian lain tanaman (Tim Penyusun, 2008). c. Pencucian Pencucian terutama dilakukan terhadap simplisia organ tanaman bawah tanah untuk mencuci sisa-sisa tanah yang melekat. Untuk simplisia jumlah besar umumnya digunakan teknik dengan mengaliri air pada simplisia yang ditempatkan di atas alat seperti jaring-jaring. Air yang digunakan dapat dari berbagai sumber namun tetap harus memperhatikan kemungkinan adanya pencemaran (Tim Penyusun, 2008). d. Pengubahan Bentuk Pengubahan bentuk bertujuan untuk memperluas permukaan (Tim Penyusun, 2008). e. Pengeringan Tujuan pengeringan organ tanaman atau tanaman yang dipanen adalah untuk mendapatkan simplisia yang awet, tidak rusak dan dapat digunakan atau disimpam dalam jangka waktu relatif lama dengan cara mengurangi kandungan air dan mengehentikan reaksi enzimatik yang mungkin dapat menguraikan senyawa bioaktif

dan menurunkan mutu atau merusak simplisia itu. Air dalam sel dan jaringan tumbuhan yang ada setelah sel atau jaringan itu mati akan merupakan media pertumbuhan jamur. Demikian pula enzim-enzim tertentu dalam sel akan menguraikan senyawa bioaktif tertentu, sesaat setelah sel mati dan selama sel atau organ tersebut masih mengandung jumlah air tertentu yang memungkinkan reaksi enzimatik berlangsung (Tim Penyusun, 2008).

f. Sortasi kering Sortasi setelah pengeringan sebenarnya merupakan tahap akhir penyiapan simplisia. Tujuan sortasi disini adalah memisahkan benda-benda asing seperti bagianbagian tanaman yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering. Proses ini dilakukan sebelum simplisia dibungkus kemudian disimpan (Tim Penyusun, 2008).

g. Pengepakan dan penyimpanan Mutu simplisia akan menjadi turun kalau kondisi penyimpanan tidak diperhatikan. Tujuan penyimpanan yang baik dari suatu simplisia adalah untuk mencegah menurunnya mutu simplisia dalam masa penyimpanan. Pengaruh-pengaruh luar yang perlu dicegah antara lain masuknya serangga, sinar matahari langsung, dan kotoran udara lain. Berdasarkan Materia Medika Indonesia, sebaiknya disimpan pada wadah tertutup baik. Ruang penyimpanan simplisia yang telah diwadahi juga perlu diperhatikan. Suhu rendah, kelembaban relatif rendah, tekanan udara dalam ruang relatif tinggi dari tekanan uadar luar atau sistem sirkulasi udara yang baik, adalah kondisi ruang yang dianjurkan (Kristanti dkk, 2008).

2.3 A.

Skrining Fitokimia Cara Identifikasi Alkaloid I. Reaksi pengendapan Larutan percobaan untuk pengendapan alkaloid dibagi dalam 4 golongan sebagai berikut: a. Golongan I: Larutan percobaan dengan alkaloid membentuk garam yang tidak larut: Asam silikowolframat LP, Asam fosfomolibdat LP, dan asam fosfowolframat LP.

b. Golongan II: Larutan percobaan yang dengan alkaloid membentuk senyawa kompleks bebas, kemudian membentuk endapan: Bourchardat LP dan Wagner LP. c. Golongan III: Larutan percobaan yang dengan alkaloid membentuk senyawa adisi yang tidak larut: Mayer LP, Dragendroff LP, dan Marme LP. d. Golongan IV: Larutan percobaan yang dengan alkaloid membentuk ikatan asam organik dengan alkohol: Harger LP. (Anonim d, 1980) Cara percobaan: 1. Timbang 500 mg serbuk simplisia, tambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air, panaskan di atas penangas air selama 2 menit, dinginkan dan saring. 2. Pindahkan 3 tetes filtrat pada kaca arloji, tambahkan 2 tetes Bouchardat LP. Jika pada kedua percobaan tidak terjadi endapan, maka serbuk tidak mengandung alkaloid. 3. Jika dengan Mayer LP terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning yang larut dalam methanol P dan dengan Bouchardat LP terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam, maka kemungkinan terdapat alkaloid. 4. Lanjutkan percobaan dengan mengocok sisa filtrat dengan 3 ml amonia pekat P dan 10 ml campuran 3 bagian volume eter P dan 1 bagian volume kloroform P. 5. Ambil fase organik, tambahkan natrium sulfat anhidrat P, saring. 6. Uapkan filtrat diatas penangas air, larutkan sisa dalam sedikit asam klorida 2 N. 7. Lakukan percobaan dengan keempat golongan larutan percobaan, serbuk mengandung alkaloid jika sekurang-kurangnya terbentuk endapan dengan menggunakan dua golongan larutan percobaan yang digunakan. (Anonim d, 1980) II. Reaksi Warna 1. Lakukan penyarian dengan campuran eter-kloroform seperti pada cara reaksi pengendapan. Pindahkan beberapa ml filtrat pada cawan porselin, uapkan. 2. Pada sisa tambahkan 1 sampai 3 tetes larutan percobaan seperti yang tertera pada masing-masing monografi. Larutan percobaan, asam sulfat P, asam nitrat P, Frohde LP, dan Erdman LP. (Anonim d, 1980) 9

B. Cara Identifikasi Glikosida a. Larutan percobaan Sari 3 g serbuk simplisia dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol (95%) P dan 3 bagian volume air dalam alat pendingin alir balik selama 10 menit, dinginkan, saring. Pada 20 ml filtrat tambahkan 25 ml air dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, kocok, diamkan selama 5 menit, saring. Sari filtrat 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian volume kloroform P dan 2 bagian volume isopropanol P. Pada kumpulan sari tambahkan natrium sulfat anhidrat P, saring, dan uapkan pada suhu tidak lebih dari 50oC. Larutkan sisa dengan 2 ml methanol P (Depker RI, 1980). b. Percobaan umum terhadap glikosida Cara percobaan. a. Uapkan 0,1 ml larutan percobaan di atas penangas air, larutkan sisa dalam 5 ml asam asetat anhidrat P. Tambahkan 10 tetes asam sulfat P; terjadi warna biru atau hijau, menunjukkan adanya glikosida (reaksi Liebermann Burchard). b. Masukkan 0,1 ml larutan percobaan dalam tabung reaksi, uapkan diatas penangas air. Pada sisa tambahkan 2 ml air dan 5 tetes Molish LP. Tambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat P; terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan, menunjukkan adanya ikatan gula (reaksi Molish). (Anonim d, 1980) c. Kromatografi Lapis Tipis Sari 300 mg serbuk simpllisia dengan 5 ml methanol P, saring, pada 2 titik masing-masing 20 ml fitrat pada lempeng KLT setebal 0,25 mm. Elusi dengan campuran benzen P- etanol (95%) P (70+30) dengan jarak rambat 25 cm. Semprot kromatogram pertama dengan anisaldehida-asam sulfat LP, panaskan pada suhu 110oC selama 10 menit, amati dengan sinar biasa dan sinar ultraviolet 366 nm. Pada kromatogram tampak bercak berwarna biru. Semprot kromatogram kedua dengan asam perklorat P, panaskan pada suhu 110oC selama 10 menit, amati dengan sinar biasa dan sinar ultraviolet 366 nm, bercak tidak berflourosensi (Anonim d, 1980).

10

d. Percobaan terhadap glikosida antrakinon Cara percobaan. Campur 200 mg serbuk simplisia dengan 5 ml asam sulfat 2 N, panaskan sebentar, dinginkan. Tambahkan 10 ml benzen P, kocok, diamkan. Pisahkan lapisan benzen, saring; filtrat berwarna kuning, menunjukkan adanya antrakinon. Kocok lapisan benzen dengan 1 ml sampai 2 ml natrium hidroksida 2 N, diamkan; lapisan air berwarna merah intensif dan lapisan benzen tidak berwarna(Anonim d, 1980).

C. Cara Identifikasi Saponin Pembuihan Cara percobaan. Masukkan 0,5 g serbuk yang diperiksa ke dalam tabung reaksi, tambahkan 10 ml air panas, dinginkan dan kemudian kocok kuat-kuat selama 10 detik. (Jika zat yang diperiksa berupa sediaan cair, encerkan 1 ml sediaan yang diperiksa dengan 10 ml air dan kocok kuat-kuat selama 10 menit); terbentuk buih yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit, setinggi 1 cm sampai 10 cm. Pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N, buih tidak hilang (Anonim d, 1980).

Haemolisa Larutan dapar fosfat PH 7,4. Larutkan 16,0 g natrium fosfat P yang telah dikeringkan pada suhu 130oC hingga bobot tetap dan 4,4 g natrium dihidrogen fosfat P dalam 1.000 ml air. Untuk menambahkan stabilitas tambahkan 0,1 g natrium fluoride P (Anonim d, 1980). Suspensi darah. Masukkan 10 ml larutan natrium sitrat P 3,65 % b/v ke dalam labu takar bersumbat kaca 100 ml. Tambahkan darah sapi segar secukupnya hingga 100 ml, campur baik-baik hingga homogen. (larutan stabil selama 7 hari jika disimpan dalam lemari pendingin). Pipet 2 ml larutan diatas ke dalam labu takar bersumbat kaca 100 ml, tambahkan larutan dapar fosfat pH 7,4 secukupnya hingga 100 ml, campur baik-baik. Larutan dapat dipergunakan jika larutan jernih dan jika terjadi endapan, endapan tidak berwarna ungu (Anonim d, 1980).

11

Cara percobaan. Campur 0,5 g serbuk yang diperiksa atau sisa kering 5 ml sediaan berbentuk cair, dengan 50 ml larutan dapar fosfat pH 7,4, panaskan sebentar, dinginkan, saring. Ambil 1 ml filtrat, campur dengan 1 ml suspensi darah. Untuk serbuk yang mengandung tannin, encerkan 0,2 ml filtrat dengan 0,8 ml larutan dapat fosfat pH 7,4, campur dengan 1 ml suspensi darah. Diamkan selama 30 menit, terjadi haemolisa total, menunjukkan adanya saponin(Anonim d, 1980).

D. Cara Identifikasi Flavonoid Larutan percobaan Sari 0,5 g serbuk yang diperiksa atau sisa kering 10 ml sediaan berbentuk cairan, dengan 10 ml methanol P, menggunakan alat pendingin balik selama 10 menit. Saring panas melalui kertas saring kecil berlipat. Encerkan filtrat dengan 10 ml air. Setelah dingin tambahkan 5 ml eter minyak tanah P, kocok hati-hati, diamkan. Ambil lapisan metanol, uapkan pada suhu 40oC di bawah tekanan. Sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat P, saring (Anonim d, 1980).

Cara percobaan. 1. Uapkan hingga kering 1 ml larutan percobaan, sisa dilarutkan dalam 1 ml sampai 2 ml etanol (95%) P; tambahkan,5 g serbuk seng P dan 2 ml asam klorida 2 N, diamkan selama 1 menit. Tambahkan 10 tetes asam klorida pekat P, jika dalam waktu 2 sampai 5 menit terjadi warna merah intensif, menunjukkan adanya flavonoid (glikosida-3-flavonol). 2. Uapkan hingga kering 1 ml larutan percobaan, sisa dilarutkan dalam 1 ml etanol (95%) P, tambahkan 0,1 g serbuk magnesium P dan 10 tetes asam klorida pekat P, jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu, menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron. 3. Uapkan hingga kering 1 ml larutan percobaan, basahkan sisa dengan aseton P, tambahkan sedikit serbuk halus asam borat P dan serbuk halus asam oksalat P, panaskan hati hati di atas penangas air dan hindari pemanasan yang berlebihan. Campur sisa yang diperoleh dengan 10 ml

12

eter P. Amati dengan sinar ultraviolet 366 nm; larutan berflurorensensi kuning intensif, menunjukkan adanya flavonoid(Anonim d, 1980).

2.4 Metode Ekstraksi Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua pelarut diuapkan dan massa serbuk atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim c, 1995). Proses ekstraksi bahan nabati/bahan obat alami dapat dilakukan berdasarkan teori penyarian. Penyarian merupakan peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula berada didalam sel, ditarik oleh cairan penyari sehingga terjadi larutan aktif dalam cairan penyari tersebut. Terdapat 4 metode ekstraksi yaitu:

a. Maserasi Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (Anonim b, 1986). Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, stirak, dan lain-lain (Anonim b, 1986). Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain. Bila cairan penyari digunakan air maka untuk mencegah timbulnya kapang, dapat ditambahkan bahan pengawet, yang diberikan pada awal penyarian (Anonim b, 1986). Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Sedangkan kerugian cara maserasi adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna (Anonim b, 1986).

13

Gambar 3. Alat Maserasi (Anonim b, 1986)

Maserasi pada umumnya dilakukan dengan cara: 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok dimasukkan ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan 75 bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil berulang - ulang diaduk. Setelah 5 hari sari diserkai, ampas diperas. Ampas ditambah cairan penyari secukupnya diaduk dan diserkai, sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian. Benjana ditutup, dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari. Kemudian endapan dipisahkan(Anonim b, 1986). Pada penyarian dengan cara maserasi, perlu dilakukan pengadukan. Pengadukan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplisia, sehingga dengan pengadukan, dapat tetap terjaga derajat perbedaan konsentrasi yang sekecilkecilnya antara larutan di dalam sel dengan larutan di luar sel. Hasil penyarian dengan cara maserasi perlu dibiarkan selama waktu tertentu. Waktu tersebut diperlukan untuk mengendapkan zat-zat yang tidak diperlukan tetapi ikut terlarut dalam cairan penyari, seperti malam dan sebagainya (Anonim b, 1986).

b. Perkolasi Perkolasi adalah cara penyarian dengan mengalirkan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi (Anonim b, 1986).

14

Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut: Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang dibagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya, dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan (Anonim b, 1986). Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif yang keluar dari perkolator disebut sari atau perkolat, sedang sisa setelah dilakukannya penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim b, 1986).

Gambar 4. Alat Perkolasi

Jika tidak dinyatakan lain perkolasi dilakukan dengan membasahi 10 bagian simplisia atau campuran simplisia dengan derajat halus yang cocok dibasahi dengan 2,5 bagian sampai 5 bagian cairan penyari, lalu dimasukkan ke dalam bejana tertutup sekurang - kurangnya selama 3 jam. Kemudian massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati - hati. Selanjutnya dituangi dengan cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari. Kemudian perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Selanjutnya cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml/menit dan ditambahkan berulang - ulang cairan penyari berikutnya sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia, hingga jika 500 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa. Perkolat kemudian disuling atau diuapkan dengan tekanan rendah pada suhu tidak lebih dari 500C hingga konsistensi yang dikehendaki.

15

Pada pembuatan ekstrak cair 0,8 bagian perkolat pertama dipisahkan, perkolat selanjutnya diuapkan hingga diperoleh 0,2 bagian yang selanjutnya dicampurkan ke dalam perkolat pertama. Keuntungan metode ini adalah tidak memerlukan langkah tambahan yaitu sampel padat (marc) telah terpisah dari ekstrak. Sedangkan kerugiannya adalah kontak antara sampel padat tidak merata atau terbatas dibandingkan dengan metode refluks, dan pelarut menjadi dingin selama proses perkolasi sehingga tidak melarutkan komponen secara efisien(Anonim b, 1986). Kelebihan metode perkolasi: Aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang terjadi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi Ruangan di antara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran tempat mengalir cairan penyari. Karena kecilnya saluran kapiler tersebut, maka kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan batas, sehingga dapat meningkatkan perbedaan konsentrasi (Anonim b, 1986). -

Kekurangan metode perkolasi: Menggunakan pelarut dalam jumlah banyak Memakan waktu yang lama Kontak antara sampel padat tidak merata atau terbatas dibandingkan dengan metode refluks

Pelarut menjadi dingin selama proses perkolasi sehingga tidak melarutkan komponen secara efisien (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992)

c.Soxhletasi Soxhletasi merupakan penyarian simplisia secara berkesinambungan,cairan penyari dipanaskan sehingga menguap, uap cairan penyari terkondensasi menjadi molekul-molekul air oleh pendingin balik dan turun menyari simplisia dalam klongsong dan selanjutnya masuk kembali ke dalam labu alas bulat setelah melewati pipa sifon.

16

Prinsip Soxhletasi: Uap cairan penyari naik keatas melalui pipa samping, kemudian diembunkan kembali oleh pendingin tegak. Cairan turun kelabu melalui tabung yang berisi serbuk simplisia. Cairan penyari sambil turun melarutkan zat aktif serbuk simplisia. Karena adanya sifon maka setelah cairan mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan kembali kelabu (Anonim b, 1986).

Keterangan : 1. Refluks 2. Pipa uap 3. Larutan kembali ke labu

Gambar 5. Labu Soxhlet

Kelebihan metode ini soxhlet adalah sebagai berikut: Dapat digunakan untuk sampel dengan tekstur yang lunak Digunakan pelarut yang lebih sedikit Pemanasannya dapat diatur

Kekurangan metode soxhlet adalah sebagai berikut: Karena pelarut didaur ulang, ekstrak yang terkumpul pada wadah di sebelah bawah terus-menerus dipanaskan sehingga dapat menyebabkan reaksi peruraian oleh panas Jumlah total senyawa-senyawa yang diekstraksi akan melampaui kelarutannya dalam pelarut tertentu sehingga dapat mengendap dalam wadah dan membutuhkan volume pelarut yang lebih banyak untuk melarutkannya

17

Bila dilakukan dalam skala besar, mungkin tidak cocok untuk menggunakan pelarut dengan titik didih yang terlalu tinggi, seperti metanol atau air, karena seluruh alat yang berada di bawah kondensor perlu berada pada temperatur ini untuk pergerakan uap pelarut yang efektif. Metode ini terbatas pada ekstraksi dengan pelarut murni atau campuran azeotropik dan tidak dapat digunakan untuk ekstraksi dengan campuran pelarut, misalnya heksan:diklormetan = 1 : 1, atau pelarut yang diasamkan atau dibasakan, karena uapnya akan mempunyai komposisi yang berbeda dalam pelarut cair di dalam wadah(Anonim b, 1986).

d. Refluks Refluks adalah penyarian untuk mendapatkan ekstrak cair yaitu dengan proses penguapan dengan menggunakan alat refluks. Prinsip kerja refluks yaitu dengan cara cairan penyari diisikan pada labu, serbuk simplisia diisikan pada tabung dari kertas saring atau tabung yang berlubang-lubang dari gelas, baja tahan karat atau bahan lainya yang cocok. Cairan penyari dipanaskan hingga mendidih. Uap penyari akan naik keatas melalui serbuk simplisia. Uap penyari mengembun karena didinginkan oleh pendingin balik. Embun turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali ke labu. Cairan akan menguap kembali berulang seperti proses di atas. Keuntungan dari metode refluks ini yaitu menggunakan pelarut yang sedikit, hemat serta ekstrak yang didapat lebih sempurna. Sedangkan kerugian metode ini yaitu uap panas langsung melalui serbuk simplisia (Anonim b, 1986).

Gambar 6. Alat refluks

18

2.5 Metode Pemisahan Bahan Alam Pemisahan dan pemurnian kandungan kimia tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan teknik kromatografi. Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensiasi dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara

berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat tersebut menunjukkan perbedaaan mobilisasi disebabkan adanya perbedaan dalam absorpsi partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion (Anonim c, 1995). Teknik kromatografi umum membutuhkan zat-zat terdistribusi di antara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya, tereluasi lebih awal atau lebih akhir. Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cair atau gas yang disebut eluen. Fase diam dapat bertindak sebagai penjerap, atau dapat melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Dalam proses terakhir ini suatu lapisan cairan pada suatu penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam. Partisi merupakan mekanisme pemisahan yang utama dalam kromatografi gas-cair, kromatografi kertas, dan bentuk kromatografi kolom atau yang disebut dengan kromatografi cair-cair (Harbone, 1987). Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat dalam pemisahan dan pemurnian adalah kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas cair (KGC), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Harbone, 1987). Menurut Farmakope Indonesia IV (1995) selain keempat teknik yang telah disebutkan ada pula kromatografi kolom dan kromatografi vakum cair. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat dan keatsirian senyawa yang akan dipisahkan. KKt dapat digunakan terutama bagi kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air, yaitu karbohidrat, asam amino, basa asam nukleat, asam organik dan senyawa fenolat. KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut dalam lipid, yaitu lipid, steroid, karotenoid, kuinon sederhana dan klorofil. Sebaliknya, teknik ketiga, yaitu KCG, penggunaan utamanya ialah pada pemisahan senyawa atsiri, yaitu asam lemak, mono dan seskuiterpene, hidrokarbon, dan senyawa belerang. Tetapi, keatsirian kandungan tumbuhan yang bertitik didih tinggi dapat diperbesar dengan mengubahnya menjadi

19

ester dan atau eter trimetil silil sehingga hanya sedikit saja golongan yang sama sekali tidak cocok dipisahkan dengan KGC. Cara lain, yaitu KCKT, dapat memisahkan kandungan keatsiriannya kecil. KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan keefisiensian dari kromatigrafi kolom dan kecepatan analisis (Harbone, 1987). Semua teknik tersebut dapat digunakan pada skala mikro maupun makro. Untuk pekerjaan penyiapan, KLT dilakukan pada lapisan penjerap yang tebal, dan KKt pada lembaran kertas saring yang tebal. Untuk isolasi pada skala yang lebih besar dari itu, biasanya digunakan kromatografi kolom yang digabungkan dengan pengumpul fraksi otomatis. Prosedur ini akan menghasilkan senyawa murni dalam skala gram (Harbone, 1987). Pada prinsipnya kromatografi merupakan proses pemisahan yang melibatkan beberapa sifat fisika utama dari molekul yaitu : 1. Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan) 2. Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan) 3. Kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian) (Harbone, 1987) Dalam penggunaan analisis secara kualitatif metode ini bertujuan untuk mengungkapkan ada tidaknya senyawa tertentu dalam cuplikan. Keuntungan kromatografi sebagai metode kualitatif yaitu cuplikan senyawa yang diperlukan untuk analisis sangat sedikit dan waktu analisis pendek. Pemakaian kromatografi secara kuantitatif bertujuan untuk mengungkapkan banyaknya masing-masing komponen yang terdapat dalam suatu campuran. Keuntungan metode kuantitatif adalah dapat

menganalisis langsung suatu komponen campuran atau hasil suatu reaksi tanpa harus melakukan fraksinasi terlebih dahulu, sehingga dapat menjamin ketelitian hasil pemeriksaan (Harbone, 1987).

2.5.1 Kromatografi Kertas (KKt) Kromatografi kertas dapat digunakan terutama bagi kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air, yaitu karbohidrat, asam amino, basa asam nukleat, asam organik, dan fenolat. Untuk pekerjaan penyiapannya kromatografi kertas biasanya pada lembaran kertas saring yang tebal (Harbone, 1987).Satu keuntungan utama kromatografi kertas

20

adalah kemudahan dan kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan dan juga sebagai penyangga. Keuntungan lain adalah keterulangan bilangan Rf yang besar pada kertas sehingga pengukuran Rf merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru (Harbone, 1987). Kromatografi pada kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian atau penjerapan. Pada kromatografi pembagian, senyawa terbagi dalam pelarut alkohol yang sebagian besar tidak bercampur dengan air (misalnya n-butanol). Pengembang kromatografinya adalah air murni dan dapat digunakan untuk memisahkan purin dan pirimidin biasa, serta secara umum dapat dipakai juga untuk senyawa fenol dan glikosida tumbuhan. Pada kromatografi kertas senyawa biasanya dideteksi sebagai bercak berwarna atau bercak berfluoresensi-UV setelah direaksikan dengan pereaksi kromogenik yang digunakan sebagai pereaksi semprot atau pereaksi celup (Harbone, 1987). Pada kromatografi kertas sebagai penjerap digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan tebal yang sesuai. Pemisahan kromatografi dapat berlangsung menggunakan fase cair tunggal dengan proses yang sama dengan kromatografi adsorpsi kolom. Oleh karena kandungan air pada kertas atau imbisisi selektif dari komponen hidrofilik fase air oleh serat kertasnya, dapat dianggap sebagai fase diam, maka mekanisme partisi berperan penting dalam pemisahan. Pada teknik ini dapat dilakukan kromatografi menaik yaitu pelarut merambat naik pada kertas ditarik oleh gaya kapiler, atau kromatografi menurun, pelarutnya mengalir oleh gaya gravitasi (Anonim c, 1995). Untuk mencapai pemisahan dengan teknik kromatografi tertentu, dalam perdagangan tersedia berbagai jenis kertas saring yang sudah dimodifikasi. Misalnya, sifat polar selulosa dapat dikurangi sengan memasukan asam silikat atau aluminia ke dalam kertas sehingga lebih cocok untuk memisahkan lipid. Kertas dapat dimodifikasi juga di laboratorium, misalnya dengan merendamnya dalam parafin atau minyak silikon agar dapat digunakan untuk kromatografi fase-balik, juga untuk lipid. Untuk pemisahan skala besar dapat diberi lembaran kertas saring kromatografi yang tebal (Whiaman no. 3 atau 3 mm), dan kertas semacam ini dapat menampung beberapa mg senyawa perlembar. Pada KKt, senyawa biasanya dideteksi dengan bercak berwarna dan flurosensi-UV setelah direaksikan dengan pereaksi kromogenik yang digunakan sebagai

21

pereaksi semprot atau pereaksi celup. Untuk lembaran besar, pencelup biasanya lebih mudah tetapi susunan pereaksi sempot harus diubah agar mudah kering, dan dengan demikian mencegah difusi waku pencelupan. Selanjutnya kertas dapat dipanaskan untuk menimbulkan warna (Harbone, 1987). Bilangan RF adalah jarak yang ditempuh dengan senyawa kromatografi, nisbi terhadap garis depan. Bilangan RF diperoleh dengan mengukur jarak antara titik awal dan pusat bercak yang dihasilkan senyawa, dan jarak ini kemudian dibagi dengan jarak antara titik awal dan garis depan (yaitu jarak yang ditempuh cairan pengembang). Bilangan ini selalu berupa pecahan dan terletak antara 0,01 dan 0,99. Akan lebih mudah bila bilangan tersebut dikalikan 100, dan bilangan RF dalam buku dinyatakan sebagai RF (x 100). Kadang RF (x 100) dinyatakan sebagai hRF (Harbone, 1987). 2.5.2 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut dalam lipid, yaitu lipid, steroid, karotenoid, kuinon sederhana, dan klorofil. Untuk pekerjaan penyiapannya KLT biasanya dilakukan pada lapisan penjerap yang tebal. Bila KLT dibandingkan dengan KKt (Kromatografi Kertas), kelebihan KLT adalah keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya. Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa disamping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada pelat kaca atau penyangga lain yang digunakan untuk kromatografi. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat penjerap yang lebih bila disaputkan pada pelat dan merupakan keuntungan bila kita menelaah senyawa labil. Kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila diperlukan dapat dipisahkan dari bahan yang jumlahnya lebih sedikit dari ukuran g (Harbone, 1987). Satu kekurangan KLT yang asli adalah kerja penyaputan plat kaca dengan penjerap. Kerja ini kemudian agak diringankan dengan adanya penyaput otomatis. Tetapi sekarang menggunakan plat pralapis niaga dalam kebanyakan pemisahan sudah merupakan suatu hal yang biasa karena plat tersebut lebih seragam dan memberikan hasil yang lebih terulangkan. Tetapi beberapa penjerap yang berbeda, disaputkan pada kaca, lembaran aluminium, atau plastik. Plat dapat mengandung indikator flourosensi atau tidak. Penambahan indikator ini memungkin pendeteksian semua senyawa yang memadamkan flouresensi bila plat diamati dengan disinari sinar UV berpanjang

22

gelombang 254 nm. Jenis KLT yang paling baru adalah KLT yang menggunakan plat yang bersaputkan mikropartikel silika halus yang biasa digunakan untuk kolom KCKT. Kromatografi yang demikian disebut kromatografi lapis tipis kinerja tinggi (KLTKT) dan biasanya menghasilkan pemisahan yang lebih efisien dan lebih cepat daripada pemisahan pada lapisan silika biasa (Harbone, 1987). Pelarut yang digunakan pada KLT lebih banyak dibandingkan pada KKt, dan pada umumnya terdapat ruang gerak yang lebih leluasa dalam perbandingan pelarut yang digunakan dalam bidang pengembang. Untuk mengukur Rf pada KLT dengan seksama dapat dilakukan dengan membakukan kondisi, tetapi hal itu merupakan suatu proses yang memakan waktu. Biasanya dilakukan dengan cara pengembangan naik di dalam suatu bejana yang dindingnya dilapisi kertas saring sehingga atmosfer di dalam bejana jenuh dengan fase pelarut (Harbone, 1987). Deteksi senyawa pada pelat KLT biasanya dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1 mm) sebagai pengganti lapisan penjerap yang tipis (0,1 0,25 mm). Kandungan yang sudah dipisah dapat diperoleh kembali dengan cara mengerok, penjerap di tempat yang sesuai pada pelat yang telah dikembangkan lalu serbuk dielusi dengan pelarut seperti eter, dan akhirnya dipusingkan untuk menghilangkan penjerap. Kandungan tersebut dapat dianalisis lebih lanjut lagi dengan metode yang lebih sensitif lagi, contohnya spektofotometri (Anonim c, 1995).

2.5.3 Kromatografi Gas Cair (KGC) Penggunaan utama KGC adalah pada pemisahan senyawa atsiri, yaitu asam lemak, mono dan sesquiterpen, hidrokarbon, dan senyawa belerang. Tetapi keatsirian kandungan tumbuhan yang bertitik didih tinggi dapat diperbesar dengan mengubahnya menjadi ester atau eter trimetilsilil, sehingga hanya ada sedikit saja golongan yang sama sekali tidak cocok dipisahkan dengan cara KGC (Harbone, 1987). Komponen yang diperlukan untuk KCG sangat canggih dan mahal dibandingkan dengan komponen untuk KLT ataupun KKt. Tetapi pada prisipnya KGC tidaklah lebih rumit dari prosedur kromatografi yang lain. Komponen KGC memiliki empat bagian utama yaitu:

23

1. Kolom berupa pipa kecil yang panjang yang dikemas dengan fase diam yang melekat pada serbuk lembam. Disini fase diam disaputkan sebagai film pada permukaan kolom bagian dalam. 2. Pemanas digunakan untuk memanaskan kolom secara meningkat. Suhu di tempat masuk ke kolom dikendalikan terpisah sehingga cuplikan dapat diuapkan dengan cepat ketika diteruskan ke kolom. 3. Aliran gas, terdiri atas gas pembawa yang lembam seperti nitrogen dan argon. Pemisahan senyawa dalam kolom bergantung pada pengaliran gas ini melalui kolom dengan laju aliran yang terkendali. 4. Detektor diperlukan untuk mengukur senyawa ketika senyawa itu dialirkan melalui kolom. Pendeteksian didasarkan pengionan nyala atau penangkap elektron. Detektor dihubungkan dengan perekam potensiometri yang

memberikan hasil pemisahan berupa serangkaian puncak yang berbeda-beda kekuatannya. (Harbone, 1987) Hasil KGC dapat dinyatakan dengan Volume Retensi RV (volume gas pembawa yang diperlukan untuk mengelusi suatu komponen dari kolom) atau dengan waktu retensi Rt (waktu yang diperlukan untuk mengelusi komponen dari kolom) (Harbone, 1987). Perubah utama dalam KGC adalah sifat fase diam dalam kolom dan suhu kerja. Keduanya diubah-ubah menurut kepolaran dan keatsirian senyawa yang dipisahkan. KGC memberikan data kuantitatif maupun kualitatif senyawa tumbuhan karena luas daerah dibawah puncak yang ditunjukkan pada kromatogram berbanding lurus dengan konsentrasi masing-masing komponen yang berbeda yang terdapat dalam campuran asal (Harbone, 1987).

24

Gambar 7. Grafik Kromatografi Gas Cair

Keterangan gambar: Kromatogram gas cair pemisahan campuran sterol asetat yang terdapat dalam biji gandum ( Avena sativa ). Keterangan: (1) kolestrol, (2) brasikasterol, (3) kampesterol, (4) stigmasterol, (5) sitosterol, (6) 5 avenasterol, (7) 7 avenasterol. Fase diam sikloheksandimetanol suksinat 1% + polivinil pirolidon 2% pada gas krom P 255 yang telah dicuci dengan asam (Harbone, 1987).

2.5.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) KCKT dapat memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan keefisiennya kolom dan kecepatan analisis. KCKT dapat disamakan dengan KGC dalam hal kepekaan dan kemampuannya menghasilkan data kualitatif dan kuantitatif dengan sekali kerja saja. Perbedaannya adalah fase diam yang terikat pada polimer berpori terdapat pada kolom baja tahan karat yang bergaris tengah kecil, dan fase gerak cair mengalir akibat tekanan yang besar. Alat KCKT lebih mahal daripada KGC, terutama karena diperlukan sistem pompa yang cocok serta semua sambungan harus diskrup agar dapat menahan tekanan. Fase geraknya adalah campuran pelarut yang dapat bercampur. Campuran ini dapat tetap susunannya atau dapat diubah perbandingannya secara kesinambungan dengan menambahkan ruang pencampur kepada susunan alat (elusi landaian) (Harbone, 1987). Senyawa dipantau ketika keluar dari kolom dengan menggunakan pendeteksi, biasanya dengan mengukur spektrum serapan UV. Kolom yang biasanya dikemas dengan partikel bulat kecil yang terbuat dari silika yang berlapiskan atau berkaitan dengan fase diam, terutama peka terhadap cemaran. KCKT digunakan terutama untuk

25

senyawa tak atsiri, misalnya terpenoid tinggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid, dan gula. KCKT paling baik untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spektrum UV atau di daerah sinar tampak (Harbone, 1987).

2.5.5 Kromatografi kolom Alat yang diperlukan dalam kromatografi kolom sangat sederhana, terdiri dari tabung kromatografi, dan sebuah batang pemampat yang diperlukan untuk memadatkan wol kaca atau kapas pada dasar tabung jika diperlukan, serta untuk memadatkan zat penjerap dan air secara merata di dalam tabung. Kadang-kadang digunakan cakram kaca berpori yang melekat pada dasar tabung untuk menyangga isinya. Ukuran kolom bervariasi, kolom yang umum digunakan dalam analisis farmasi mempunyai diameter dalam antara 10 mm hingga 30 mm, dan panjangnya antara 150 mm hingga 400 mm, tidak termasuk tabung pengalir. Tabung pengalir pada umumnya berdiameter antara 3 hingga 6 mm, dapat dilengkapi dengan sebuah kran untuk mengatur laju pelarut yang melalui kolom. Batang pemampat merupakan suatu batang silinder, melekat kuat pada sebuah tangkai yang terbuat dari plastik kaca, baja tahan karat atau aluminium (Anonim c, 1995). Kromatografi kolom merupakan teknik pemisahan skala besar. Proses yang terjadi dalam pemisahan senyawa dari kromatografi ini dianalogikan sebagai pemisahan senyawa berwarna. Suatu campuran terdiri dari dua senyawa yang berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau. Maka dibuat larutan jenuh dari campuran dengan menggunakan pelarut yang lebih disukai dalam kolom. Seiring dengan berjalannya waktu dan penambahan larutan maka akan terjadi pemisahan komponen warna seperti gambar berikut ini. Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat diletakkan pada ujung atas kolom.Eluen atau pelarut dialirkan secara kontinu ke dalam kolom. Dengan adanya gravitasi atau karena bantuan tekanan, maka eluen atau pelarut akan melewati kolom dan proses pemisahan akan terjadi. Seperti pada umumnya, eluen/pelarut yang digunakan dimulai dari yang paling nonpolar dan dinaikkan secara gradien kepolarannya hingga pemisahan dapat terjadi. Sama halnya pada KLT,

26

pemisahan dapat terjadi karena adanya perbedaan afinitas senyawa pada absorben dan perbedaan kelarutan senyawa pada eluen/pelarut (Kristianti dkk., 2008). Ketika sampel diletakkan di ujung kolom, seketika itu juga terjadi peristiwa adsorpsi oleh permukaan adsorben yang berbatasan dengan sampel. Eluen yang dialirkan secara kontinu ke dalam kolom menyebabkan adanya peristiwa adsorpsi dan desorpsi senyawa-senyawa pada sampel. Molekul-molekul senyawa akan dibawa ke bagian bawah kolom dengan kecepatan yang bervariasi bergantung besarnya afinitas molekul tersebut pada adsorben dan juga pada besarnya kelarutan molekul tersebut dalam pelarut/eluen. Cairan yang keluar dari kolom ditampung dan dilakukan analisis menggunakan KLT untuk melihat hasil pemisahannya. Pada kromatografi kolom, hal yang paling berperan dalam kesuksesan pemisahan adalah pemilihan adsorben dan eluen/pelarut, dimensi kolom yang digunakan serta kecepatan elusi yang dilakukan (Kristianti dkk., 2008).

Gambar 8. Terjadi pemisahan senyawa di dalam kolom (Clarck, 2007).

27

Pemisahan tersebut terjadi karena senyawa biru lebih polar daripada senyawa kuning dan mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen yang lebih kuat. Hal tersebut dapat dilihat dari senyawa biru yang bergerak lebih lambat melalui kolom. Ini berarti bahwa senyawa biru dijerap kuat pada gel silika atau alumina. Karena kurang polar, senyawa kuning cenderung berada dalam pelarut, sehingga keluar dari kolom lebih cepat Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal sebagaielusi. Pelarut disebut sebagai eluen (Clarck, 2007). Adsorben yang umum digunakan selain SiO2 dan selulosa adalah alumina, yang tersedia dalam bentuk asam, basa, atau netral. Adsorben ini dianjurkan hanya dipakai untuk senyawa organik yang stabil. Pemilihan adsorben dan bentuknya (asam, basa, atau netral) sangat penting untuk menghindari reaksi yang dapat terjadi di dalam kolom yang tidak diinginkan selama proses elusi berlangsung, misalnya alumina asam dapat menimbulkan reaksi dehidrasi alkohol tersier dan bentuk basanya dapat mengakibatkan reaksi hidrolisis ester atau reaksi kondensasi aldol pada aldehida. Adsorben lain yang umum dipakai adalah silika gel, terutama digunakan untuk memisahkan senyawa organik yang tidak memiliki kestabilan yang memadai untuk dipisahkan menggunakan alumina (Kristianti dkk., 2008). Besarnya butir/granul adsorben yang digunakan pada kromatografi kolom harus lebih besar dibandingkan dengan yang digunakan pada KLT, yaitu antara 50-200m. Dengan ukuran tersebut, pengisian kolom secara homogen dapat terlaksana, kecepatan elusi juga berjalan sebagaimana seharusnya serta pergantian senyawa yang teradsorpsi pada adsorben dan kelarutannya pada eluen/pelarut terjadi cukup cepat (Kristianti dkk., 2008) Jumlah adsorben yang digunakan bergantung pada tingkat kesulitan pemisahan dan pada jumlah sampel yang akan dipisahkan. Secara umum diperlukan 30-50 gram adsorben untuk tiap gram sampel yang akan dipisahkan. Jumlah tersebut bisa mencapai 200 gram adsorben jika pemisahan yang dilakukan cukup sulit. Dibutuhkan jumlah adsorben yang lebih sedikit untuk memisahkan senyawa-senyawa yang perbedaan polaritasnya sangat besar (Kristianti dkk., 2008).

28

Tabel 2. Acuan Persiapan kolom Sampel (mg) 0,01 0,1 1 10 Adsorben (gram) 0,3 3 30 300 Diameter Kolom (mm) 3,5 7,5 16 35 Tinggi (mm) 30 60 130 280

Eluen atau pelarut yang digunakan, umumnya adalah campuran dua macam pelarut. Pada awal elusi dimulai dengan eluen yang paling nonpolar yang akan membawa senyawa-senyawa yang kurang terikat pada adsorben (yang paling nonpolar). Sepanjang proses elusi, komposisi eluen dapat divariasi dengan jalan menambahkan secara gradien pelarut yang lebih polar. Dengan demikian, senyawa-senyawa juga akan hanya terelusi ke arah bawah kolom secara berurutan berdasarkan kepolarannya. Adalah komposisi yang pertama dari eluen yang memiliki kemampuan elusi terkuat. Oleh karena itu, sepanjang elusi proporsi pelarut yang lebih polar dinaikkan dengan jalan menambahkan pelarut yang lebih polar ke dalam pelarut yang kurang polar secara eksponensial (Kristianti dkk., 2008). Tabel 3. Perbandingan Pelarut Petroleum Eter dan Diklorometana Petroleum Eter 100 96 90 80 50 20 0 Diklorometana 0 4 10 20 50 80 100

Hubungan antara kepolaran sebagian besar pelarut tampak pada bagan di bawah ini. Setiap garis tegak lurus menunjukkan campuran pelarut yang berlainan tapi mempunyai daya mengelusi yang setara, misalnya garis putus-putus menunjukkan bahwa daya elusi campiran hidrokarbon-etil asetat 50:50 sama dengan daya elusi

29

campuran hidrokarbon-aseton 33:67 dan campuran etil-etil asetat 8:92 (Kristianti dkk., 2008).

Gambar 9. Perbandingan Kepolaran Beberapa Pelarut (K.R Markham, 1988). Perubahan dari satu komposisi pelarut ke komposisi yang lain biasanya terjadi saat jumlah volume yang mengalir telah mencapai tiga kali volume adsorben dalam kolom. Misalnya adsorben menempati volume kolom sebanyak 25 cm3, maka perubahan komposisi pelarut dilakukan setelah komposisi yang terdahulu telah mengalir sebanyak 45 cm3 (Kristianti dkk., 2008). Penggunaan beberapa eluen harus dihindari ketika yang digunakan sebagai adsorben adalah alumina atau silika gel dalam bentuk asam dan basanya, misalnya: aseton akan terdimerisasi atau akan terjadi transesterifikasi jika eluen yang digunakan adalah etil asetat atau beberapa alkohol. Pelarut sangat polar seperti metanol, air, dan asam asetat juga harus dipergunakan secara hati-hati karena akan melarutkan adsorben dalam jumlah kecil (Kristianti dkk., 2008). Kolom yang digunakan untuk keperluan pemisahan ini, pada bagian bawahnya biasanya dilengkapi dengan pelat kaca masir (bisa saja digunakan glass wool atau kapas bebas lemak) baik dalam bentuk fix ataupun mobile yang berguna untuk melewatkan eluen secara bebas tetapi yang juga dapat menghambat keluarnya adsorben dari kolom. Buret dapat juga digunakan untuk keperluan ini, dengan menambahkan kaca masir atau glass wool di bagian bawah buret. Jumlah adsorben yang dimasukkan ke dalam kolom sedemikian rupa sehingga memenuhi tinggi kolom 10 kali diameter kolom, biasanya

30

juga disisakan ruang kosong di atas adsorben tersebut kira-kira 10cm untuk sampel dan pelarut (Kristianti dkk., 2008). Tahap yang paling sulit dalam kromatografi kolom adalah pengisian kolom dengan adsorben. Pengisisan tersebut harus sehomogen mungkin dan harus benar-benar bebas dari gelembung udara. Permukaan adsorben harus benar-benar horizontal untuk menghindari terjadinya cacat yang dapat terjadi selama proses elusi berjalan. Oleh karena itu, yang pertama harus diperhatikan adalah menempatkan kolom pada posisi yang benar-benar vertikal. Pengisian kolom dengan adsorben dapat dilakukan menurut dua cara yaitu: 1. Pengisian cara basah, Dalam sebuah gelas beker, disiapkan terlebih dahulu campuran homogen adsorben dengan pelarut atau campuran pelarut yang paling nonpolar yang nantinya akan digunakan untuk elusi. Campuran harus membentuk suspensi dengan kekentalan tertentu (cukup cair untuk bisa dituang). Pembuatan campuran harus dilakukan dengan jalan menambahkan sedikit demi sedikit adsorben ke dalam pelarut. Langkah ini tidak boleh dibalik dengan menambahkan pelarut ke dalam adsorben karena panas yang dibebaskan akan dapat mendidihkan pelarut dan akan menyebabkan terbentuknya gumpalan dalam campuran. Dengan bantuan sebuah corong, suspensi dimasukkan secukupnya ke dalam kolom agar adsorben dapat membentuk sebuah lapisan setebal 2cm secara progresif. Selama partikel-partikel adsorben dalam suspensi membentuk lapisan secara berlahan, dinding kolom diketuk-ketuk agar lapisan adsorben yang terbentuk benar-benar mampat (tidak ada gelembung udara). Kemudian keran di bagian bawah kolom dibuka agar pelarut dapat mengalir keluar secara perlahan. Pelarut yang keluar ini dapat dipakai kembali untuk membentuk suspensi adsorben-pelarut. Langkah ini terus diulang hingga semua adsorben yang telah disiapkan telah masuk ke dalam kolom. Setelah semua adsorben masuk, kolom dibiarkan beberapa saat agar cairan yang berada di atas adsorben menjadi jernih (semua partikel adsorben sudah membentuk lapisan). Selama proses elusi harus diperhatikan agar jumlah eluen atau pelarut tersebut di atas adsorben (Kristianti dkk., 2008). 2. Pengisian cara kering Kolom diisi terlebih dahulu 2/3 bagiannya dengan eluen atau campuran eluen yang paling nonpolar yang nantinya akan dipakai untuk elusi. Kemudian serbuk

31

adsorben dimasukkan ke dalam kolom dengan bantuan sebuah corong secara perlahanlahan. Selama penanbahan adsorben, dinding kolom diketuk-ketuk agar pengisian adsorben dapat benar-benar mampat. Pada saat sudah terbentuk adsorben setebal 2 cm, keran di bagian bawah kolom dibuka agar pelarut dapat keluar secara perlahan. Setelah semua adsorben masuk kolom dibiarkan berapa saat hingga adsorben menjadi jernih (semua partikel adsorben sudah membentuk lapisan). Selama proses elusi harus diperhatikan agar jumlah eluen atau pelarut dalam kolom selalu cukup yang ditandai dengan adanya eluen atau pelarut tersebut di atas adsorben (Kristianti dkk., 2008).

2.5.6 Kromatografi Vakum Cair Metode ini digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul pada pengerjaan kromatografi kolom. Meskipun kromatografi kolom merupakan salah satu metode yang paling efisien untuk memisahkan campuran kompleks dalam jumlah relatif banyak (tujuan preparatif), tetapi pengerjaannya menyita waktu dan sangat sulit untuk mempertahankan kondisi kolom tetap baik selama proses pemisahan. Sebagai alternatif dapat digunakan kromatografi cair vakum yang memiliki beberapa keuntungan seperti waktu pengerjaan yang lebih singkat, biaya lebih murah, cara pengerjaan lebih sederhana, dan dapat memisahkan ekstrak dalam jumlah lebih banyak. Tujuan dari kromatografi cair vakum ialah untuk memisahkan komponen senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak ke dalam beberapa fraksi berdasarkan kepolarannya(Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Prinsip pengerjaannya adalah sebagai berikut: kolom kromatografi dikemas secara kering dengan menggunakan vakum untuk memperoleh kekompakan maksimum. Setelah vakum dilepaskan, pelarut dengan polaritas tertentu dituangkan kemudian vakum dipasang kembali utnuk menghisap kolom hingga kering. Demikian dilakukan berulang menggunakan urutan sistem pengelusi dengan komposisi pelarut atau polaritas yang berbeda-beda sehingga semua komponen senyawa yang dikehendaki dapat tertampung sebagai fraksi yang akan dianalisis lebih lanjut(Kusmardiyani dan Nawawi, 1992).

32

2.6 KLT-Spektrofotodensitometri Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembang secara menaik atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun. Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas contohnya dengan menggunakan pereaksi H2SO4. H2SO4 bekerja dengan cara mengoksidasi solut-solut organik yang tampak sebagai bercak hitam kecoklatan. Adanya warna hitam kecoklatan itu menunjukkan adanya senyawa organik pada sampel. Asam sulfat bersifar membakar. Hal ini dimaksudkan untuk mendeteksi senyawa karbon. Hal ini dibuktikan dengan munculnya warna coklat kehitaman. H2SO4 memutuskan ikatan rangkap, sehingga yang terlihat adalah karbonnya. (Gandjar, 2007). Kromatografi lapis tipis merupakan bentuk kromatografi planar selain kromatografi kertas, dengan fase diam berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik. Fase gerak dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak disepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar, 2007). Metode KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang tidak volatil atau senyawa yang sifat volatilitasnya rendah, senyawa dengan polaritas rendah hingga tinggi, bahkan untuk memisahkan senyawa-senyawa ionik (Hahn-Deinstrop, 2007). Pemilihan fase gerak didasarkan pada keterpisahan senyawa-senyawa dalam

analit yang didasarkan pada nilai Rf atau hRf (100Rf). Nilai Rf diperoleh dari membagi jarak pusat kromatografik dari titik awal dengan jarak pergerakan pelarut dari titik awal. Perhitungan nilai hRf ditunjukkan dengan persamaan dibawah ini.

33

hR f

jarak elusi analit dari titik awal penotolan 100 jarak muka pelarut dari titik awal penotolan

Penggunaan KLT dapat berupa analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Pada analisis kualitatif, KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Untuk meyakinkan identifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan lebih dari 1 fase gerak dan jenis pereaksi semprot (Gandjar, 2007). Untuk analisis kuantitatif pada KLT dapat digunakan dua cara. Pertama, bercak pada plat KLT diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometri. Cara kedua adalah dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak tersebut dengan metode analisis yang lain, misalkan dengan metode spektrofotometri (Gandjar, 2007). Densitometer dapat bekerja secara serapan atau flouresensi. Densitometer mempunyai sumber cahaya yang diarahkan menuju monokromator (untuk memilih rentang panjang gelombang yang cocok antara 200-800 nm), sistem untuk memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton, dan rekorder (Gandjar, 2007). Output detektor dikonversikan menjadi signal dan diamplifikasi. Sebagai tambahan untuk scanning instrumen densitometer dilengkapi dengan digital konverter, dan data akan diproses secara digitalisasi oleh komputer. Analis dapat densitometri pada jangkauan panjang bekerja dengan

gelombang 190 s/d 800 nm. Terjadinya

penyimpangan baseline yang disebabkan oleh variasi ketebalan dan ketidakseragaman lapisan pada densitometer sangat kecil dan level signalnya relatif tinggi.

Gambar 10. Skema Instrumen Spektrofotodensitometer 34

Prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada plat. Radiasi elektromagnetik yang datang pada plat diabsorpsi oleh analit, ditransmisi atau diteruskan. Jika plat yang digunakan transparan, radiasi elektromagnetik yang diabsorpsi oleh analit atau indikator plat dapat diemisikan berupa flouresensi dan fosforesensi (Sherma and Fried 1994). Pemadaman flouresensi indikator F-254 dapat terjadi akibat adanya noda pada plat sehingga teramati di bawah lampu UV sebagai noda hitam (Mulja dan Sukarman, 1995). Analisis KLT dengan menggunakan spektrofotodensitometri dapat dilakukan dengan menggunakan mode absorbsi atau flouresensi. Pada umumnya yang paling sering digunakan adalah mode absorbsi dengan menggunakan sinar UV pada 190-300 nm. Oleh karena kebanyakan plat KLT menggunakan silika gel yang bersifat opaque (tidak tembus cahaya), maka pengukuran dengan mode transmitan tidak cocok digunakan. Penentuan absorpsi analit pada plat KLT opaque didasarkan pada rasio intensitas antara radiasi elektromagnetik yang datang dengan intensitas radiasi elektromagnetik yang dipantulkan/direfleksikan. Pengukuran flouresensi merupakan metode pengukuran langsung yang peka untuk senyawa dalam daerah ultraviolet dapat ditentukan melalui emisi penyinaran sekunder. Intensitas cahaya flouresensi setelah dipancarkan melalui suatu monokromator, diukur secara selektif dalam kondisi yang sesuai, berbanding lurus dengan berat senyawa yang ada dalam noda (Sherma and Fried, 1994). Fluorosensi molekuler adalah proses emisi dimana molekul dieksitasi dengan absorpsi dari radiasi elektromagentik. Selektivitas fluorosensi spektrometri memberikan sensitivitas yang tinggi dan spesifiksitas tinggi daripada metode absorpsi. Fluorosensi lebih selektif sebab emisi dan absorpsi spektra dapat diperoleh (Moffat, 2005). Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan KLT dapat dilakukan dengan densitometri langsung pada plat KLT untuk menentukan kadar suatu senyawa sampel (Schunack et al., 1990). Hal ini dapat dilakukan dengan cara nodanoda yang telah terpisah pada pelat TLC/HPTLC dimasukkan ke dalam alat ini, kemudian ditentukan kadarnya berdasarkan hubungan antara Area Under Curve (AUC) noda dengan konsentrasi senyawa dalam noda (Sherma and Fried, 2003).

35

Ssetelah komponen dari tablet dipisahkan dengan KLT, maka bercak hasil pemisahan diukur dengan sistem fluoresensi sinar UV dan respon sinyal yang dihasilkan akan sebanding dengan jumlah absorbansi dari analit yang ditotolkan. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer, yaitu: A=bc Di mana: A = Absorbansi = Absorptivitas molar (cm mg/mL) b = Tebal kuvet (cm) c = Konsentrasi (% b/v)

Dari rumus di atas maka kadar zat dapat ditentukan. Dengan mengetahui nilai absorbansi dari larutan sampel, melalui kurva kalibrasi dapat ditentukan konsentrasinya (Gandjar, 2007).

2.7 Sifat Fisiko Kimia Flavonoid Sifat Fisika Di alam flavonoid lebih sering berada sebagai senyawa campuran misalnya dengan gula dalam bentuk glikosida, dimana flavonoid berperan sebagai aglikon atau senyawa bukan gula dari glikosida tersebut. Oleh karena itu apabila kita ingin memperoleh flavonoid, yang harus dilihat aglikonnya. Flavonoid jarang sekali berada dalam bentuk tunggal. Flavonoid dalam bentuk glikosida atau aglikon polihidroksi bersifat polar, terdapat dalam cairan vakuola sebab terdapat gula sehingga larut dalam air. Flavonoid yang bersifat non polar seperti flavonoid dalam bentuk polimetoksi tidak larut dalam air, terdapat pada dinding sel (Tim Penyusun, 2008). Semua flavonoid mempunyai sistem aromatik yang mengalami konjugasi sehingga flavonoid menunjukkan pita serapan yang kuat pada spektrum ultraviolet (UV) dan spektrum tampak (Tim Penyusun, 2008). Sifat Kimia Pada prinsipnya, ikatan glikosida terbentuk apabila gugus hidroksil dari alkohol beradisi kepada gugus karbonil dari gula sama seperti adisi alkohol kepada aldehida yang dikatalisa oleh asam menghasilkan suatu asetal.Pada hidrolisa oleh asam, suatu

36

glikosida terurai kembali atas komponen-komponennya menghasilkan gula dan alkohol yang sebanding dan alkohol yang dihasilkan ini disebut aglokin. Residu gula dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa, ramnosa, galaktosa, dan gentiobiosa sehingga glikosida tersebut masing-masing disebut glukosida, ramnosida, galaktosida, dan gentiobiosida (Tim Penyusun, 2008). Dilihat dari strukturnya, Flavonoid merupakan senyawa fenolik. Oleh sebab itu senyawa flavonoid biasanya mengalami perubahan warna apabila direaksikan dengan basa seperti amonia. Substituen utama yang terdapat dalam flavonoid adalah OH atau gugus hidroksi sehingga umumnya flavonoid larut dalam air. Semakin banyak gugus OH yang dimiliki maka semakin mudah senyawa flavonoid tersebut larut dalam air (Tim Penyusun, 2008). Flavonoid dapat ditemukan sebagai mono-, di- atau triglikosida dimana satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan sedikit larut dalam pelarut organik seperti eter, benzen, kloroform, dan aseton (Tim Penyusun, 2008).

2.8 Isoflavon Isoflavon merupakan subkelas dari flavonoid yang merupakan flavonoid minor.Flavonoid minor penyebarannya terbatas pada beberapa jenis tumbuhan saja. Salah satunya terdapat pada tanaman kacang kedelai (Glycinemax). Isoflavon di alam sering dijumpai dialam dalam bentuk glikosidanya (terikat pada gugus gula). Senyawa isoflavone yang terdapat dikacang kedelai antara lain genistein dan daidzein.

Gambar 10. struktur isoflavon

37

Gambar 11. Struktur Genistein dan Daidzein(Harbone, 1987).

Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi dengan ammonia, tetapi kebanyakan yag lain (misalnya genistein) tampak sebagai bercak lembayung pudar yang dengan ammonia berubah menjadi coklat pudar. Untuk memisahkan isoflavon, manfaat kromatografi kertas terbatas walaupun gerakan isoflavon dalam pengembang air dapat dipakai untuk membedakannya dari aglikon flavonoid lain. Untuk mengidentifikasi isoflavon dari tumbuhan disarankan menggunakan KLT pada silica gel dengan pengembang methanol 11% dalam kloroform, dan mendeteksi memakai pereaksi folin-ciocalteu. Identifikasi isoflavon dapat dipastikan dengan pengukuran spectrum. Cara penentuan kuantitatif isoflavon dalam ektrak tumbuhan, menggunnakan kolom sephadex G-25. Unntuk penentuan kuantitatif dapat juga digunakan KCKT pada kolom Lichrosob RP-8 (Harbone, 1987).

38

2.9

Sifat fisiko kimia isoflavon Berada dalam bentuk glikosida : polar Berada dalam bentuk aglikon : non-polar

Kelarutan : aglikon larut dalam pelarut eter, kloroform dan n-Heksana. (Tim Penyusun, 2008).

2.10 Standarisasi Ekstrak a. Kadar abu Prosedur penetapan kadar abu yaitu lebih kurang 2 g sampai 3 g zat yang telah digerus dan ditimbang saksama, masukkan ke dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkn perlahan-lahan hingga arang habis, diinginkan, timbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas, sarig melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Anonim d, 1980).

b. Kadar abu yang tidak larut dalam asam Prosedur: Abu yang diperoleh pada Penetapan Kadar Abu, didihkan dengan 25 ml asam klorida encer P selama 5 menit, kumpulkan bagian yang tidak larut dalam asam. Saring melalui krus kaca masir atau kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu yang tidak larut dalam asam terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara(Anonim d, 1980).

c. Kadar sari yang larut dalam air Prosedur: Keringkan serbuk (4/18) di udara, maserasi selama 24 jam 5,0 g serbuk dengan 100 ml air kloroform P, menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selma 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring, uapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, panaskan sisa pada suhu 1050 hingga bobot tetap. Hitung

39

kadar dalam persen sari yang larut dalam air, dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Anonim d, 1980).

d. Kadar sari yang larut dalam etanol Keringkan serbuk (4/18) di udara, maserasi selama 24 jam 5,0 g serbuk dengan 100 ml etanol (95%), menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selma 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring cepat dengan menghindarkan penguapan etanol (95%), uapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, panaskan sisa pada suhu 1050 hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol (95%), dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Anonim d, 1980).

e. Bahan organik asing Bahan organik asing adalah bagian tanaman atau seluruh tanaman asal simplisia, tertera atau jumlahnya dibatasi dalam uraian pemerian dalam monografi yang bersangkutan. Cara penetapan. Timbang antara 25 g dan 500 g simplisia, ratakan. Pisahkan sesempurna mungkin bahan organik asing, timbang dan tetapkan jumlahnya dalam persen terhadap simplisia yang digunakan. Makin kasar simplisia yang diperiksa makin banyak jumlah simplisia yang ditiumbang (Anonim d, 1980).

f. Penetapan Susut Pengeringan Berdasarkan Materia Medika Indonesia, susut pengeringan adalah kadar bagian yang menguap suatu zat. Kecuali dinyatakan lain, suhu penetapan adalah 105o dan susut pengeringan ditetapkan sebagai berikut: Timbang saksama 1 g dan 2 g zat dalam bobot timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu penetapan selama 30 menit dan telah ditara. Jika zat berupa hablur besar, sebelum ditimbang digerus dengan cepat hingga ukuran butiran lebih kurang 2 mm. Ratakan zat dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol, hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm

40

sampai 10 mm, masukkan ke dalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu penetapan hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar. Jika suhu lebur zat lebih rendah dari suhu penetapan, pengeringan dilakkan pada suhu antara 5o dan 10o dibawah suhu leburnya selama 1 jam sampai 2 jam, kemudian pada suhu penetapan selama waktu yang ditentukan atau hingga bobot tetap (Anonim d, 1980).

g. Kadar Air A. Cara Titrasi Pereaksi dan larutan yang digunakan peka terhadap air, hingga harus dilindungi dari pengaruh kelembaban udara (Anonim d, 1980). Pereaksi Karl Fischer disimpan dalam botol yang diperlengkapi dengan buret otomatik. Untuk melindungi dari pengaruh kelembaban udara, buret dilengkapi dengan tabung pengering. Labu titrasi kapasitas lebih kurang 60 ml, dilengkapi dengan 2 elektroda platina, sebuah pipa pengalir nitrogen, sebuah sumbat berlubang untuk ujung buret dan sebuah tabung pengering. Zat yang diperiksa dimasukkan ke dalam labu melalui pipa pengalir nitrogen atau melalui pipa samping yang dapat disumbat. Pengadukan dilakukan dengan mengalirkan gas nitrogen yang telah dikeringkan atau dengan pengaduk magnit. Penunjuk titik akhir terdiri dari batere kering 1,5 volt atau 2 volt yang dihubungkan dengan tahanan variabel lebih kurang 2.000 ohm. Tahanan diatur sedemikian rupa sehingga arus utama yang cocok yang melalui elektroda platina berhubungan secara seri dengan mikroammeter (Anonim d, 1980). Setelah setiap kali penambahan pereaksi Karl Fischer, penunjuk mikroammeter menyimpang akan tetapi segera kembali ke kedudukan semula. Pada titik akhir, penyimpangan akan tetap selama waktu yang lebih lama (Anonim d, 1980). Untuk zat-zat yang melepaskan air secara perlahan-lahan, maka pada umumnya dilakukan titrasi tidak langsung. Kecuali dinyatakan lain dalam monografi maka penetapan kadar air dilakukan dengan titrasi langsung (Anonim d, 1980).

41

Cara Penetapan Titrasi langsung Kecuali dinyatakan lain, masukkan lebih kurang 20 ml methanol P ke dalam labu titrasi. Titrasi dengan pereaksi Karl Fischer hingga titik akhir tercapai. Masukkan dengan cepat sejumlah zat yang ditimbang saksama yang diperkirakan mengandung 10 mg sampai 50 mg air, ke dalam labu titrasi, aduk selama 1 menit. Titrasi dengan pereaksi Karl Fischer yang telah diketahui kesetaraan airnya. Hitung jumlah air dalam mg dengan rumus : VxF V adalah volume dalam ml pereaksi Karl Fischer pada titrasi kedua, F adalah faktor kesetaraan air (Depkes RI, 1980). Titrasi tidak langsung Masukkan lebih kurang 20 ml metanol P ke dalam labu titrasi. Titrasi dengan pereaksi Karl Fischer hingga titik akhir tercapai. Masukkan dengan cepat sejumlah zat yang ditimbang saksama yang diperkirakan mengandung 10 mg sampai 50 mg air, campur. Tambahkan pereaksi Karl Fischer berlebihan dan yang diukur saksama, biarkan selama beberapa waktu hingga reaksi sempurna. Titrasi kelebihan pereaksi dengan larutan baku air-metanol. Hitung jumlah dalam mg air dengan rumus : FV1-aV2 F adalah faktor kesetaraan air pereaksi Karl Fischer, V1 adalah volume dalam ml pereaksi Karl Fischer yang diukur saksama, a adalah kadar cair dalam mg tiap ml dari larutan baku air-metanol dan V2 adalah volume dalam ml larutan baku air-metanol (Anonim d, 1980). Pereaksi Pereaksi Karl Fischer Larutkan 60 g yodium P dalam 100 ml piridina mutlak P, dinginkan dalam es, alirkan belerang dioksida P hingga bobot bertambah 32,3 g sambil dilindungi dari pengaruh kelembaban udara. Tambahkan metanol mutlak P secukupnya hingga 500 ml, biarkan selama 24 jam. Lakukan pembakuan sebagai berikut:

42

Masukkan lebih kurang 20 ml metanol mutlak P ke dalam labu titrasi. Titrasi dengan pereaksi Karl Fischer tanpa mencatat volume yang digunakan. Masukkan air yang ditimbang saksama sejumlah yang cocok. Titrasi dengan pereaksi Karl Fischer. Hitung kesetaraan air dalam mg tiap ml pereaksi. Pereaksi Karl Fischer harus dibakukan segera sebelum digunakan. Peraksi Karl Fischer harus disimpan di lemari yang dingin pada suhu antara 20-80C, terlindung dari cahaya. 1 ml pereaksi Karl Fischer segar setara dengan lebih kurang 5 mg air (Anonim d, 1980). Larutan baku air metanol Encerkan 2 ml air dengan metanol P secukupnya hingga 1.000,0 ml. Titrasi 25,0 ml larutan dengan pereaksi Karl Fischer. Hitung kadar air dalam mg tiap ml dengan rumus (VF/25). V adalah volume dalam ml pereaksi Karl Fischer, F adalah faktor kesetaraan air (Depkes RI, 1980).

B. Cara Destilasi Alat Sebuah labu 500-ml (A) dihubungkan dengan pendingin alir balik (C) dengan pertolongan alat penampung (B). Tabung penerima 5 ml (E), berskala 0,1 ml. Pemanas yang digunakan sebaiknya pemanas listrik yang suhunya dapat diatur atau tangas minyak. Bagian atas labu tabung penyambung (D) sebaiknya dibungkus dengan asbes (Anonim d, 1980).

Gambar 12. Alat Destilasi Pereaksi Toluen. Sejumlah toluen P, kocok dengan sedikit air, biarkan memisah, buang lapisan air suling (Anonim d, 1980).

43

Cara Penetapan Bersihkan tabung penerima dan pendingin dengan asam pencuci, bilasi dengan air, keringkan dalam lemari pengering. Ke dalam labu kering masukkan sejumlah zat yang ditimbang saksama yang diperkirakan mengandung 2 ml sampai 4 ml air. Jika zat berupa pasta, timbang dalam sehelai lembaran logam dengan ukuran yang sesuai dengan leher labu. Untuk zat yang dapat menyebabkan gejolak mendadak, tambahkan pasir kering yang telah dicuci secukupnya hingga mencukupi dasar labu atau sejumlah tabung kapiler, panjang lebih kurang 100 mm yang salah satu ujungnya tertutup. Masukkan lebih kurang 200 ml toluen ke dalam labu, hubungkan dengan alat. Tuang toluen ke dalam tabung penerima melalui alat pendingin. Panaskan labu hati-hati selama 15 menit (Anonim d, 1980). Setelah toluen mulai mendidih, suling dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian besar air tersuling, kemudian naikkan kecepatan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, cuci bagian dalam pendingin dengan toluen sambil dibersihkan dengan sikat tabung yang disambungkan pada sebuah kawat tembaga dan lebih dibasahi dengan toluen. Lanjutkan penyulingan selama 5 menit. Biarkan tabung penerima pendingin hingga suhu kamar. Jika ada tetes air yang melekat pada pendingin tabung penerima, hosok dengan karet yang diikatkan pada sebuah kawat tembaga dan basahi dengan toluen hingga tetesan air turun. Setelah air dan toluen memisah sempurna, baca volume air. Hitung kadar air dalam %. (Anonim d, 1980).

44

BAB III ALAT DAN BAHAN

3.1 Identifikasi Flavonoid Alat : - Beaker gelas - Kertas saring - Corong pisah - Batang pengaduk - Pipet tetes - Pemanas listrik - Neraca analitik - Aluminium foil Bahan: - Serbuk kedelai (Glycine max) - Metanol - Eter minyak tanah - Aquadest - Etil asetat - Etanol 95 % - H2SO4 pekat

3.2 Penetapan Susut Pengeringan Alat : - Botol timbang - Neraca analitik - Desikator - Oven Bahan: - Serbuk kedelai (Glycine max)

45

3.3 Ekstraksi Biji Kedelai (Metode Soxhletasi) Alat : - Neraca analitik - Kertas saring - Seperangkat alat soxhlet - Pemanas listrik Bahan: - Serbuk kedelai (Glycine max) - Etanol 80 %

3.4 Penguapan Ekstrak Etanol, Hidrolisis, dan Partisi Cair-Cair Alat : - Pemanas listrik - Cawan porselen - Batang pengaduk - Erlenmeyer - Corong pisah - Kertas saring - Aluminium foil - Neraca analitik Bahan : - Ekstrak etanol hasil soxhletasi - HCl 2 N - n-Heksana

3.5 Pemisahan Isoflavon Dengan Kromatografi Kolom Lambat Alat : - Beaker gelas - Kolom - Statif - Pipet tetes

46

- Botol vial bersih - Corong kaca - Erlenmeyer - Batang bambu - Batang pengaduk - Aluminium foil - Plastik ikan - Pipet ukur

Bahan : - Ekstrak kental n-Heksana - n-Heksana - Kloroform - Etil asetat - Silika gel mesh 60 - Glasswool

3.6 Analisis Kualitatif Isoflavon dengan KLT-Spektrofotodensitometri Alat : - Chamber KLT - Plat Silika GF254 10 x 10 cm - Kertas Saring - Oven - Lampu UV 254 nm dan 366 nm - Alat spektrofotodensitometer - Pipet tetes - Nampan aluminium - Pipet kapiler 5 L

Bahan : - Fraksi hasil kromatografi kolom - Metanol

47

- Kloroform - n-Heksana - Etil asetat

48

BAB IV CARA KERJA DAN EVALUASI HASIL

4.1

Skema Kerja

4.1.1Skema Kerja Umum Identifikasi Flavonoid

Penetapan Susut Pengeringan

Penguapan ekstrak etanol, hidrolisis, dan partisi caircair

Pemisahan Isoflavon dengan kromatografi kolom lambat

Analisis kualitatif dengan KLTSpektrofotodensitometer

4.1.2 Skema Kerja Khusus 4.1.2.1 Identifikasi Flavonoid A. Pembuatan Larutan Percobaan

0,5 gram serbuk kering ditambahkan 10 mL metanol

Dikocok selama 10 menit dan disaring

49

Filtrat diencerkan dengan air dan ditambah 5 mL eter minyak tanah (dikocok dalam corong pisah)

B. Pelaksanaan Identifikasi Flavonoid Larutan percobaan diuapkan dan ditambah etanol 95% sebanyak 2 mL

Ditambah 2-4 tetes H2SO4 pekat dan diamati warna yang terjadi 4.1.2.2 Penetapan Susut Pengeringan Serbuk

Ditimbang 1 gr serbuk kedelai, botol timbang ditara

Botol timbang dipanaskan dalam oven (1050C, 30 menit), didinginkan

Serbuk dimasukkan botol timbang

Dipanaskan (1050C, 30 menit), didinginkan, dan ditimbang

Dipanaskan (1050C, 30 menit), didinginkan, dan ditimbang

50

4.1.2.3 Ekstraksi Biji Kedelai Dengan Metode Soxhletasi Ditimbang sebanyak 10 gr serbuk biji kedelai

Serbuk biji kedelai dibungkus dalam kertas saring

Bahan serbuk dimasukkan dalam timbale alat soxhlet

Dimasukkan etanol 80% sebanyak dua kali sirkulasi (200 mL) serta batu didih ke dalam labu alas bulat

Alat soxhlet dipanaskan selama 2 sirkulasi menggunakan penangas air pada suhu 700 C

Hasil ekstraksi dituangkan ke dalam botol kemudian ditutup rapat

4.1.2.4 Penguapan Ekstrak Etanol Ekstrak yang diperoleh dari hasil soxhletasi diuapkan pada suhu 700 C

Diperoleh ekstrak kental, ekstrak kental yang diperoleh ditimbang 51

4.1.2.5 Hidrolisis Dengan HCl 2 N Endapan ditambahkan 10 mL HCL 2 N dalam Erlenmeyer 250 mL dan ditutup dengan aluminium foil

Dilakukan hidrolisis selama 1 jam, lalu disaring

4.1.2.6 Partisi Cair-Cair Dengan Menggunakan n-Heksana Hasil hidrolisis di ekstraksi dengan 25 mL n-Heksana dalam corong pisah

Diambil fase n-heksana ( lapisan atas)

Ekstrak n-Heksana diuapkan pada suhu 600 C

Diperoleh ekstrak kental n-Heksana

4.1.2.7 Pemisahan Dengan Kromatografi Kolom Lambat Dasar kolom diisi dengan glass wool dengan menggunakan lidi

52

Serbuk silica gel mesh 60 ditimbang sebanyak 20 gram, lalu dimasukkan ke dalam kolom, dan diukur tinggi kolom (diperoleh tinggi kolom 14,4 cm, diameter 2 cm) m)gi 5 cm ( diameter = 2cm) Dibuat fase gerak n-heksana : kloroform : etil asetat (9: 1 : 0,5 ) sebanyak 100 mL

Dibuat bubur (campuran homogen) silica gel + eluen dalam beaker glass

Eluen dimasukkan dalam kolom hingga hampir penuh, lalu keran kolom dibuka perlahan (diatur kecepatan alir kolom)

Bubur silica dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom melalui dinding kolom hingga mencapai tinggi 14,4 cm

Kolom didiamkan 4 hari agar diperoleh pemampatan yang sempurna

Ekstrak kental n-Heksana dilarutkan dalam fase gerak, tetapi karena ekstrak yang diperoleh tidak dapat larut dalam fase gerak, maka ekstrak dilarutkan dengam sedikit metanol, lalu dijerap dalam fase diam

53

Sampel dimasukkan dengan hati-hati melalui dinding kolom dan memutar secara perlahan-lahan sehingga tidak merusak kolom

Fase gerak ditambahkan secara kontinyu hingga terjadi pemisahan

Fraksi ditampung pada botol vial setiap 5 mL dan diuapkan pada suhu kamar

Masing-masing fraksi dan ekstrak pembanding diuapkan pada suhu kamar

4.1.2.8 Analisis Kualitatif Dengan Metode KLT-Spektrofotodensitometri Plat silica gel GF 254 disiapkan dengan ukuran 10 x 10 cm

Plat silica dicuci dengan 3 mL metanol, lalu diaktivasi pada suhu 1200 C selama 30 menit

Disiapkan eluen n-heksana : kloroform : etil asetat ( 9: 1: 0,5 ) sebanyak 10 mL 54

Fraksi dan ekstrak pembanding direkonstitusi dengan 0,5 mL metanol, chamber dijenuhkan dengan eluen

Masing-masing fraksi dan ekstrak pembanding dirtotolkan pada plat sebanyak 10 l pada titik yang berbeda dengan jarak penotolan 0,7 cm

Plat dielusi hingga mencapai jarak elusi 8 cm, lalu plat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan

Plat dilihat di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm

Discan pada spektrofotodensitometer pada panjang gelombang 200-800 nm

55

4.2

Evaluasi Hasil

Rf Genistein = 78 (Widiastuti, 2009) Ketika dilihat di bawah sinar UV 366 nm, bercak pada plat KLT berfluoresensi biru muda (Markham, 1988). Menurut literatur (Markham, 1988), genistein memiliki panjang gelombang maksimum 261 nm dan bahu 328 nm dengan pola spektrum sebagai berikut:

(Gambar 13. Evaluasi Hasil, pola spektrum genistein pada gelombang maksimum 261 nm dan bahu 328 nm)

56

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1

Hasil Percobaan

5.1.1 Skrining Fitokimia Untuk Identifikasi Flavonoid Berat serbuk kedelai yang diuji : 0,507 gram

Warna larutan yang terdiri dari serbuk kedelai dan 10 mL metanol : coklat muda keruh Warna larutan percobaan setelah ditambahkan 2 mL etanol 95 % dan 3 tetes H2SO4 pekat : merah tua (positif flavonoid)

5.1.2 Penetapan Susut Pengeringan Serbuk Simplisia Glycine max Tabel 4. Data Pengamatan Susut Pengeringan Serbuk Simplisia Glycine max Pemanasan keBerat simplisia awal (gram) 1 2 1,004 1,004 40,0500 40,0500 40,9232 40,7580 0,8732 0,7080 Berat botol (gram) Berat botol + simplisia (gram) Berat simplisia akhir (gram)

5.1.3 Soxhletasi Tabel 5. Ekstraksi Serbuk Glycine max Dengan Soxhletasi Simplisia yang digunakan 10,013 gram Pelarut etanol 80 % yang digunakan 200 ml 163,9 mL Kuning muda Hasil ekstraksi Warna Ekstrak

Sirkulasi terjadi sebanyak 2 kali, yaitu : Sirkulasi I Sirkulasi II : tercapai dalam waktu 57,19 menit : tercapai dalam waktu 21,42 menit

57

5.1.4 Penguapan Ekstrak Hasil Soxhletasi

Tabel 6. Penguapan Ekstrak Hasil Soxhletasi Berat cawan porselin kosong (gram) 64,888 Berat cawan porselen + ekstrak (gram) 65,756 0,868 Kuning tua Berat Ekstrak (gram) Warna Endapan Ekstrak

5.1.5

Hidrolisis Endapan Dengan HCl 2N

Tabel 7. Hidrolisis Endapan Dengan HCl 2N Volume HCl 2 N yang digunakan 10 mL 1 jam Terpisah antara glikon dan aglikon, terbentuk gumpalangumpalan glikon berwarna hijau Waktu hidrolisis Hasil hidrolisis

5.1.6

Partisi Dengan Ekstraksi Cair-Cair Menggunakan n-Heksana

Tabel 8. Partisi Dengan Ekstraksi Cair-Cair Menggunakan n-Heksana Volume n-Heksana yang digunakan 25 mL Lapisan atas yang bening Tidak berwarna (bening) Lapisan yang diambil Warna Ekstrak Hasil Partisi

5.1.7

Penguapan Ekstrak n-Heksana

Tabel 9. Penguapan Ekstrak n-Heksana Berat cawan porselin kosong (gram) 78,841 Berat cawan porselen + ekstrak (gram) 79,379 0,501 Hijau kehitaman Berat Ekstrak (gram) Warna Endapan Ekstrak

58

5.1.8

Pemisahan Isoflavon Dengan Kromatografi Kolom Basah

Tabel 9. Pemisahan Dengan Kromatografi Kolom Basah Tinggi kolom Berat silika yang digunakan 14,4 cm 20 gram n-Heksana : kloroform : etil asetat (9:1:0,5) 10 fraksi Semua fraksi yang diperoleh tidak berwarna (bening) Fase Gerak Hasil pemisahan Warna Fraksi

5.1.9 Identifikasi

atau

Uji

Kualitatif

Isoflavon

Dengan

KLT-

Spektrofotodensitometri

Terjadi perubahan metode identifikasi, di mana

fraksi hasil pemisahan

kromatografi kolom awalnya akan diidentifikasi dengan metode KLT dan pergeseran spektrum, namun karena metode pergeseran spektrum tidak dapat dilakukan, maka identifikasi dilakukan dengan metode KLT-spektrofotodensitometri.

5.1.9.1 Uji Kualitatif Isoflavon Dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Tabel 10. Uji Kualitatif dengan KLT Plat KLT Yang digunakan Plat KLT silica gel GF254 10 x 10 cm n-Heksana : kloroform : etil asetat( 9:1:0,5) 5 mL Ukuran Plat KLT Fase Gerak Volume Fase Gerak Jarak antar totolan 0,7 cm 8 cm Jarak Pengembangan

Di bawah sinar UV 254 nm, nampak spot berwarna gelap pada fraksi 2 dan fraksi 3 dengan jarak 6 cm.

Berikut ini adalah hasil KLT kelompok 4 pada pengamatan di bawah sinar UV 254 nm:

59

Hasil spot kelompok 4

Hasil spot kelompok 3

(Gambar 14. Kenampakkan plat KLT yang telah dielusi dibawah paparan sinar UV 254 nm)

60

5.1.9.2 Uji Kualitatif Isoflavon Dengan Spektrofotodensitometri

Tabel 11. Pengamatan Uji Kualitatif dengan Metode KLT-spektrofotodensitometri


Track 1 Spot 1 2 3 4 2 1 2 3 4 5 3 1 2 3 4 5 6 7 4 1 2 3 4 5 6 Rf 0,01 0,64 0,87 0.95 0,03 0,60 0,75* 0,85 0,95 0,02 0,60 0,71 0,74* 0,82 0,92 0,95 0,02 0,04 0,56 0,79 0,88 1,01 8 7 6 Track 5 Spot 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 Rf 0,04 0,56 0,79 0.81 0,88 1,02 1,05 0,00 0,02 0,55 0,83 0,90 0,96 0,02 0,03 0,42 0,56 0,80 0,94 1,02 0,41 0,55 0,83 0,89 0,91 11 10 Track 9 Spot 1 2 3 1 2 3 4 5 1 2 3 Rf 0,53 0,81 0,93 0,02 0,53 0,83 0,95 0,99 0,01 0,84 1,01

Keterangan : * = genistein Senyawa genistein diduga terdapat pada track 2, spot ke-3 dan pada track 3, spot ke-4 atas dasar literatur yang menyebutkan bahwa genistein memiliki nilai Rf 0.75. Namun hasil ini tidak dapat dinyatakan valid karena fase gerak yang digunakan untuk

61

mengelusi analit pada praktikum ini tidak memiliki perbandingan yang sama dengan fase gerak yang digunakan untuk mengelusi analit pada literatur. Selain itu, bentuk spektrum dari senyawa yang diduga tersebut tidak sama dengan bentuk spektrum genistein pada literatur.

(Gambar 15. Kromatogram dari tiap track pada panjang gelombang 260 nm)

5.2

Perhitungan

5.2.1 Penetapan Susut Pengeringan Serbuk Simplisia Glycine max Diketahui : Massa botol timbang kosong = 40,050 gr = 41,054 gr = 40,9232 gr = 40,7580 gr

Massa (botol timbang + serbuk) awal Massa botol timbang + serbuk pada pemanasan I Massa botol timbang + serbuk pada pemanasan II Ditanya : Perhitungan : Massa serbuk awal :

Susut pengeringan serbuk simplisia Glycine max ....?

= (massa botol timbang + serbuk)awal massa botol timbang kosong

62

= 41,054 gr 40,050 gr = 1,004 gr

Massa serbuk setelah pemanasan kedua = (massa botol timbang + serbuk)setelah pemanasan kedua massa botol timbang kosong = 40,7580 gr 40,050 gr = 0,7080 gr

Persentase massa serbuk yang hilang (susut pengeringan) :

Massa Serbuk Awal Massa SerbukSetelah Pemanasankedua 100% Massa Serbuk Awal 1,004 gr 0,7080 gr 0,2960 gr 100% 100% 29,48% 1,004 gr 1,004 gr

Massa serbuk sisa

= massa serbuk awal massa serbuk yang hilang = 1,004 gr 0,2906 gr = 0,7080 gr

Persentase massa serbuk sisa :

massa serbuk sisa 100 % massa serbuk awal 0,7080 gr 100% 70,51% 1,004gr

5.2.2 Penentuan Volume Etanol 80 % Untuk Proses Soxhletasi Volume larutan pengekstrak untuk soxhletasi idealnya 2 kali sirkulasi, di mana satu kali sirkulasi dalam praktikum ini membutuhkan larutan pengekstrak 100 mL, jadi untuk 1,5 kali sirkulasi dibutuhkan larutan pengekstrak (etanol 80 %) sebanyak : = = = 2 x volume 1kali sirkulasi 2 x 100 mL 200 mL

63

Pembuatan etanol 80 % : Diketahui : Etanol yang tersedia (C1) = etanol 95 % b/v = 200 mL = etanol 80 %

Volume etanol 80 % yang akan dibuat (V2) Etanol yang akan dibuat (C2) Ditanya :

Volume etanol 95 % yang diambil untuk membuat etanol 80% ....?

Perhitungan pengenceran : V1 x C1 V1 x 95 % V1 = V2 x C2 = 200 mL x 80 % = 168,42 mL

Jadi, untuk membuat larutan pengekstrak (etanol 80 %), dipipet 168,42 mL etanol 95 %, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 200 mL dan diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas, kemudian digojog hingga homogen.

5.2.3 Pembuatan larutan HCl 2 N Diketahui : Konsentrasi larutan HCl yang tersedia BM HCl Volume larutan HCl 2 N yang dibuat (V2) Perhitungan : = 37 % b/v = 36,5 gram/mol = 50 mL

Ditanya : Volume HCl 37% yang diambil untuk membuat larutan HCl 2 N ....?

HCl 37 % b/v, artinya terdapat 37 gram HCl dalam 100 mL larutan HCl Mol HCl = =

MassaHCl BMHCl
37 gram 36 ,5 gram / mol

= 1,0137 mol Molaritas HCl =

MolHCl VolumeHCl
1,0137 gram / mol 0,1L

= 10,137 mol/L

64

HCl Ekivalen HCl Normalitas HCl

H + + Cl= 1 grek/mol = Molaritas HCl x ekivalen HCl = 10,137 mol/L x 1 grek/mol = 10,137 grek/L

Pengenceran : V1 x C1 V1 x 10,137 N V1 = V2 x C2 = 50 mL x 2 N = 9,86 mL

Jadi, untuk membuat larutan HCl 2 N, dipipet 9,86 mL larutan HCl 37 % b/v, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL dan diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas, kemudian digojog hingga homogen.

5.2.4 Pembuatan Fase Gerak Untuk Pemisahan Dengan Kromatografi Kolom Basah 5.2.4.1 Fase Gerak Untuk Penyiapan Kolom Diketahui : Volume fase gerak yang akan dibuat = 100 mL

Perbandingan n-Heksana : kloroform : etil asetan = 9 : 1 : 0,5 Ditanya Perhitungan : Volume masing-masing komponen fase gerak ....? : =
9 x100 mL 10 ,5

Volume n-Heksana

= 85,71 mL Volume kloroform =


1 x100 mL 10 ,5

= 9,52 mL Volume etil asetat =


0,5 x100 mL 10 ,5

= 4,76 mL

65

5.2.4.2 Fase Gerak Untuk Elusi Diketahui : Volume fase gerak yang akan dibuat = 50 mL

Perbandingan n-Heksana : kloroform : etil asetan = 9 : 1 : 0,5 Ditanya Perhitungan : Volume masing-masing komponen fase gerak ....? : =
9 x50 mL 10 ,5

Volume n-Heksana

= 42,86 mL Volume kloroform =


1 x50 mL 10 ,5

= 4,76 mL Volume etil asetat =


0,5 x50 mL 10 ,5

= 2,38 mL

5.2.5 Pembuatan Fase Gerak Untuk Uji Kualitatif Dengan Kromatografi Lapis Tipis Diketahui : Volume fase gerak yang akan dibuat = 10 mL

Perbandingan n-Heksana : kloroform : etil asetan = 9 : 1 : 0,5 Ditanya : Volume masing-masing komponen fase gerak ....? Perhitungan : =
9 x10 mL 10 ,5

Volume n-Heksana

= 4,28 mL Volume kloroform =


1 x10 mL 10 ,5

= 0,47 mL Volume etil asetat =


0,5 x10 mL 10 ,5

= 0,23 mL

66

5.2.6 Perhitungan Rendemen 5.2.6.1 Rendemen Hasil Penguapan Ekstrak Soxhletasi Diketahui : Berat cawan porselen kosong Berat cawan porselen + ekstrak Berat serbuk simplisia Glycine max awal Ditanya Perhitungan = 64,888 gram = 65,756 gram = 10,013 gram

: % rendemen hasil penguapan ekstrak soxhletasi ....? :

Berat ekstrak = (berat cawan porselen +ekstrak) - berat cawan porselen kosong = 65,756 gram - 64,888 gram = 0,868 gram % rendemen hasil penguapan = =

BeratEkstrakHasilPenguapan BeratSerbukAwal
0,868 gram 10 ,013 gram

= 8,67 %

5.2.6.2 Rendemen Hasil Partisi Cair-Cair Diketahui : Berat cawan porselen kosong Berat cawan porselen + ekstrak Berat serbuk simplisia Glycine max awal Ditanya Perhitungan = 78,841 gram = 79,379 gram = 10,013 gram

: % rendemen hasil penguapan ekstrak soxhletasi ....? :

Berat ekstrak = (berat cawan porselen +ekstrak) - berat cawan porselen kosong = 79,379 gram - 78,841 gram = 0,501 gram % rendemen hasil partisi cair-cair = =

BeratEkstrakHasilPartisiCair Cair BeratSerbukAwal


0,501 gram 10 ,013 gram

= 5%

67

5.3 Pembahasan Praktikum kali ini bertujuan untuk melakukan identifikasi dan pemisahan kandungan isoflavon dari ekstrak biji kedelai (Glycine max Piper), di mana praktikum yang dilakukan tergolong ke dalam pengujian kualitatif dengan menggunakan metode KLT-spektrofotodensitometer yang didahului oleh tahap soxhletasi, hidrolisis, dan partisi cair-cair. Flavonoid adalah salah satu kelompok senyawa fenol (metabolit sekunder) terbesar yang ditemukan di alam, merupakan senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, dan biru, dan sebagian zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai alifatik propane (C3) sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-C6 (Landyyun, 2008). Pada prinsipnya, ikatan glikosida terbentuk apabila gugus hidroksil dari alkohol beradisi kepada gugus karbonil dari gula sama seperti adisi alkohol kepada aldehida yang dikatalisa oleh asam menghasilkan suatu asetal.Pada hidrolisa oleh asam, suatu glikosida terurai kembali atas komponen-komponennya menghasilkan gula (glikon) dan alkohol yang sebanding dan alkohol yang dihasilkan ini disebut aglikon. Residu gula dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa, ramnosa, galaktosa, dan gentiobiosa sehingga glikosida tersebut masing-masing disebut glukosida, ramnosida, galaktosida, dan gentiobiosida (Tim Penyusun, 2008). Isoflavon merupakan subkelas dari flavonoid atau isomer flavon yang merupakan flavonoid minor, yang jumlahnya sangat sedikit dan sebagai bagi tumbuhan berfungsi sebagai fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan untuk pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon di alam sering dijumpai dialam dalam bentuk glikosidanya (terikat pada gugus gula). Bagian glikon larut dalam pelarut polar, sedangkan bagian aglikon larut dalam pelarut nonpolar. Flavonoid minor isoflavon penyebarannya terbatas pada beberapa jenis tumbuhan. Salah satunya terdapat pada tanaman kacang kedelai (Glycine max). Senyawa isoflavon yang terdapat di kacang kedelai antara lain genistein dan daidzein. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi dengan

68

ammonia, tetapi kebanyakan yang lain (misalnya genistein) tampak sebagai bercak lembayung pudar yang dengan ammonia berubah menjadi coklat pudar (Harbone, 1987). Pada praktikum identifikasi dan pemisahan kandungan kimia ekstrak biji kedelai ini diawali dengan proses isolasi senyawa aktif yang terdapat pada simplisia biji kedelai melalui proses ekstraksi padat cair dengan metode soxhletasi. Setelah itu, dilakukan metode pemisahan dengan kromatografi kolom basah. Terakhir, dilakukan analisis kualitatif dengan metode KLT-spektrofotodensitometer terhadap fraksi-fraksi yang dihasilkan dari pemisahan dengan kromatografi kolom lambat. Sebelum dilakukan isolasi falvonoid golongan isoflavon dari ekstrak biji kedelai, praktikum diawali dengan perlakuan skrinning fitokimia untuk identifikasi flavonoid terhadap serbuk biji kedelai untuk menentukan ada atau tidaknya senyawa flavonoid dalam serbuk biji kedelai. Skrinning fitokimia merupakan langkah awal yang dapat membantu untuk memberikan gambaran mengenai ada tidaknya senyawa target, yaitu flavonoid dalam serbuk biji kedelai yang akan dianalisis, di mana bila hasil skrinning fitokimia memberikan hasil positif terhadap adanya flavonoid, maka percobaan dengan prosedur analisis selanjutnya dapat diteruskan, namun apabila skrinning fitokimia menunjukkan hasil negatif terhadap adanya flavonoid, maka percobaan dengan prosedur analisis selanjutnya tidak dapat diteruskan. Metode skrinning fitokimia sebagian besar merupakan reaksi pengujian warna dengan suatu pereaksi warna. Dalam praktikum ini, dilakukan skrinning fitokimia terhadap golongan flavonoid, di mana terlebih dahulu disiapkan larutan percobaan dengan cara melarutkan serbuk biji kedelai dalam 10 mL metanol, lalu disaring dan filtrat yang dihasilkan diencerkan dengan air, kemudian dipartisi dengan 5 mL eter minyak tanah. Lapisan metanol (lapisan bawah) diambil, lalu diuapkan pada suhu 40C, endapan dilarutkan dengan 5 mL etol asetat, dan disaring (terbentuk larutan percobaan). Terhadap larutan percobaan ini selanjutnya dilakukan pengujian warna dengan penambahan 2 mL etanol 95 % dan 2-4 tetes larutan H2SO4 pekat dan diperoleh warna merah tua pada larutan percobaan. Hasil yang diperoleh menunjukkan hasil uji positif terhadap senyawa flavonoid, sehingga percobaan dengan prosedur selanjutnya dapat dilakukan. Seteleh dilakukan skrinning fitokimia untuk identifikasi flavonoid, dilakukan penentuan susut pengeringan simplisia Glycine max. Susut pengeringan adalah kadar

69

bagian yang menguap dari suatu zat, kecuali dinyatakan lain suhu penetapan adalah 105oC (Depkes RI, 1986). Penentuan susut pengeringan serbuk simplisia Glycine max bertujuan untuk menetapkan semua jenis bahan yang mudah menguap dan hilang pada kondisi tertentu dalam simplisia Glycine max (Tim Penyusun, 2009). Penentuan susut pengeringan dilakukan dengan cara menimbang 1 gram serbuk simplisia Glycine max dengan menggunakan kertas perkamen. Di samping itu, botol timbang kosong ditara kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC selama 30 menit. Pada saat dimasukkan ke dalam oven, tutup botol timbang dibuka dan tutupnya tersebut dibiarkan dalam oven. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan sisa-sisa air dalam botol timbang sehingga tidak mempengaruhi hasil. Setelah 30 menit, botol timbang diambil dari oven kemudian serbuk simplisia yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam botol timbang kemudian digoyang untuk meratakan serbuk dalam botol timbang. Botol timbang beserta isinya tersebut ditara kembali kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC selama 30 menit dalam keadaan tutup dibuka dan tutupnya juga diletakkan dalam oven. Hal ini bertujuan agar zat-zat yang mudah menguap seperti uap air, dapat menguap dan hilang dari simplisia dalam botol timbang tersebut. Setelah 30 menit, botol timbang dikeluarkan dari oven kemudian dimasukkan ke dalam desikator hingga mencapai suhu kamar. Setelah mencapai suhu kamar, botol timbang diambil kemudian ditentukan bobotnya dan bobot dicatat. Setelah itu, botol timbang dimasukkan dalam oven kembali selama 30 menit dan diberi perlakuan yang sama seperti di atas. Hal yang serupa dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh bobot yang konstan. Setelah diperoleh bobot yang konstan, kemudian dihitung susut pengeringan simplisia tersebut. Namun dalam pengerjaannya tidak sampai diperoleh bobot konstan karena keterbatasan waktu praktikum sehingga hanya dilakukan sebanyak 2 kali saja. Akibat keterbatasan waktu pula, pada percobaan hanya digunakan 1 botol untuk penentuan susut pengeringan simplisia, sehingga tidak dapat dilakukan uji validasi yang meliputi pengujian presisi melalui penentuan standar deviasi dan koefisien variasi terhadap hasil susut pengeringan yang diperoleh. Berdasarkan perhitungan diperoleh besarnya susut pengeringan sebesar 29,48 %, sedangkan persentase massa serbuk sisa sebesar 70,51 %. Dalam hal ini penentuan susut pengeringan juga dapat menunjukkan kandungan air yang terdapat dalam serbuk simplisia, di mana berkurangnya massa serbuk simplisia setelah dipanaskan atau dikeringkan diakibatkan oleh hilangnya kandungan air dalam

70

serbuk simplisia dan besarnya persentase susut pengeringan sebanding dengan persentase air yang terkandung dalam serbuk simplisia tersebut. Untuk serbuk simplisia Glycine max, diperoleh kadar air dalam simplisia sebesar 29,48 %. Menurut literatur (Tim Penyusun, 2008), kandungan air yang boleh ada dalam suatu simplisia adalah kurang dari 10 %. Tingginya kandungan air dalam serbuk simplisia Glycine max ini dimungkinkan tidak dilakukannya proses pengeringan pada pembuatan serbuk kedelai dari biji kedelai. Mengingat senyawa flavonoid yang terdapat dalam biji kedelai sangat mudah terdegradasi oleh adanya panas, maka setelah dibentuk menjadi serbuk, kami tidak melakukan proses pengeringan terhadap serbuk kedelai tersebut. Selanjutnya, dilakukan proses isolasi kandungan senyawa aktif dari serbuk simplisia Glycine max dengan menggunakan metode ekstraksi padat cair, khususnya metode soxhletasi. Ekstraksi padat cair merupakan proses penarikan suatu komponen padat dari suatu bahan alam padat dengan menggunakan media cair. Prinsipnya terjadi melalui tiga tahap, yaitu 1) penetrasi pelarut ke dalam sel tanaman dan pengembangan sel, 2) disolusi komponen yang tertarik (terekstraksi), dan 3) difusi bahan yang terekstraksi keluar sel. Tujuan dari proses ekstraksi padat cair ini adalah untuk memperoleh ekstrak biji kedelai yang di dalamnya terkandung senyawa isoflavon. Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 1995). Pada praktikum ini metode ekstraksi yang digunakan adalah metode soxhletasi dengan pelarut etanol 80%. Metode soxhletasi merupakan metode penyarian simplisia secara berkesinambungan, di mana cairan penyari dipanaskan hingga menguap, uap cairan penyari naik ke atas melalui pipa samping, kemudian diembunkan kembali oleh kondensor. Cairan turun ke labu melalui tabung yang berisi serbuk simplisia. Cairan penyari sambil turun melarutkan zat aktif serbuk simplisia. Karena adanya sifon maka setelah cairan mencapai permukaan sifon, seluruh cairan kembali ke labu (Depkes RI, 1986). Keuntungan menggunakan metode soxhletasi adalah cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit, dan secara langsung dapat diperoleh hasil yang lebih pekat; serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni, sehingga dapat menyari zat aktif yang lebih banyak; penyarian dapat diteruskan

71

sesuai dengan keperluan, tanpa harus menambah volume cairan penyari; serta senyawa dalam serbuk simplisia tidak terdegradasi karena uap panas tidak melalui serbuk

simplisia, tetapi melalui pipa samping (Depkes RI, 1986). Sementara itu, kerugian dari metode soxhletasi adalah harus menggunakan pelarut murni dalam penyarian, serta karena pelarut didaur ulang, maka ekstrak yang terkumpul pada wadah di sebelah bawah akan terus-menerus dipanaskan sehingga dapat menyebabkan reaksi peruraian oleh panas. Alkohol atau etanol secara umum merupakan pelarut yang baik untuk ekstraksi awal (Kusmardiani dan Nawawi, 1992). Soxhletasi dilakukan dengan pelarut etanol karena sifatnya yang mampu melarutkan hampir semua zat, baik yang bersifat polar, semi polar dan non polar serta kemampuannya untuk mengendapkan protein dan menghambat kerja enzim sehingga dapat terhindar dari proses hidrolisis dan oksidasi (Harbone, 1987). Proses soxhletasi diawali dengan pembuatan etanol 80 %, yaitu dilakukan pengenceran dari etanol 95 %. Sebanyak 168,42 mL etanol 95 % diambil, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 200 mL dan diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas, kemudian digojog hingga homogen. Selanjutnya, ditimbang serbuk biji kedelai sebanyak 10 gram, lalu dibungkus dengan kertas saring membentuk suatu klongsong. Kemudian, serbuk biji kedelai yang telah dibungkus dengan kertas saring dimasukkan ke dalam timbel alat soxhlet. Dimasukkan 200 mL etanol 80% ke dalam labu alas bulat. Selanjutnya, dimasukkan batu didih yang sebelumnya telah dicuci bersih ke dalam labu alas bulat. Penggunaan batu didih di sini bertujuan agar penguapan etanol terjadi secara merata di seluruh labu alas bulat, sehingga tidak akan mengakibatkan letupan dan pecahnya labu alas bulat. Selanjutnya alat soxhlet dirangkai dan pemanasan dilangsungkan dengan menggunakan kompor listrik. Awalnya suhu pemanasan yang digunakan adalah 400C untuk pemanasan awal, lalu suhu diturunkan menjadi 80C dan suhu tersebut dijaga agar tidak melebihi 800C hingga tercapai sirkulasi. Akibat keterbatasan waktu, pada proses soxhletasi kali ini hanya diperoleh 2 kali sirkulasi, di mana sirkulasi pertama membutuhkan waktu 57,19 menit dan sirkulasi kedua membutuhkan waktu 21,42 menit. Dari 2 kali sirkulasi pada proses soxhletasi diperoleh ekstrak berwarna kuning muda volume ekstrak sebesar 163,9 mL, namun ekstrak yang didapatkan ini belum merupakan ekstrak kental karena masih banyaknya kandungan pelarut dalam ekstrak

72

tersebut, sehingga ekstrak hasil soxhletasi tersebut perlu dipekatkan dengan cara penguapan. Penguapan dilakukan dengan cara memanaskan 163,9 mL ekstrak serbuk biji kedelai di dalam cawan porselen dengan menggunakan mantel listrik dan suhu pemanasan dijaga agar tidak lebih dari 700C agar tidak merusak zat aktif yang terdapat dalam ekstrak. Penguapan dilakukan hingga seluruh etanol dalam ekstrak menguap dan ekstrak menjadi pekat yang ditandai dengan warna yang semakin pekat, yaitu menjadi kuning tua. Selanjutnya, dilakukan perhitungan rendemen ekstrak kental hasil penguapan, di mana berat cawan porselen kosong yang digunakan untuk proses penguapan adalah 64,888 gram dan berat cawan porselen + ekstrak kental setelah penguapan adalah 65,756 gram. Dengan mengurangkan antara berat cawan + ekstrak kental dengan berat cawan kosong, diperoleh berat ekstrak kental 0,868 gram, dan dengan membagi berat ekstrak kental hasil penguapan dengan berat serbuk biji kedelai awal (10,013 gram) dan dikalikan dengan 100 %, maka diperoleh % rendemen ekstrak hasil penguapan sebesar 8,67 %. Dari kelompok 3 yang juga melakukan ekstraksi serbuk biji kedelai, namun dengan metode maserasi menggunakan dengan pelarut metanol, diperoleh hasil rendemen sebesar 7,8 %. Dari data tersebut dapat dilihat rendemen yang diperoleh oleh tiap kelompok sedikit berbeda. Hal tersebut mungkin dikarenakan penguapan ekstrak tidak dilakukan dengan evaporator melainkan dengan memanaskan ekstrak di atas penangas dan dikerjakan oleh praktikan yang berbeda yang memiliki persepsi tentang kekentalan ekstrak yang berbeda. Selanjutnya, dilakukan proses hidrolisis terhadap ekstrak kental ya ng diperoleh dengan menggunakan larutan HCl 2 N. Karena larutan HCl yang tersedia adalah larutan HCl 37 % b/v (37 gram HCl dalam 100 mL larutan HCl), maka dilakukan pengenceran untuk memperoleh larutan HCl 2 N. Untuk membuat larutan HCl 2 N sebanyak 50 mL, dipipet dipipet 9,86 mL larutan HCl 37 % b/v, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL dan diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas, kemudian digojog hingga homogen. Hidrolisis dilakukan di dalam erlenmeyer dengan cara menambahkan 10 mL larutan HCl 2 N ke dalam ekstrak kental isoflavon yang diperoleh, lalu proses hidrolisis dilangsungkan selama 1 jam. Adapun tujuan hidrolisis ini adalah untuk memutuskan ikatan antara gula dan aglikon. Mulanya senyawa target (isoflavon) berada dalam bentuk glikosida (masih terikat dengan gugus gulanya). Dengan hidrolisis, maka akan didapatkan bentuk aglikon saja yang merupakan bentuk yang diinginkan dari senyawa

73

target. Namun proses hidrolisis di sini tidak dapat berlangsung dengan baik, karena kemungkinan masih terdapatnya etanol dalam ekstrak kental yang dihidrolisis, di mana diketahui bahwa etanol dapat mengurangi potensi hidrolisis. Proses selanjutnya adalah partisi cair-cair dengan menggunakan n-Heksana. Partisi cair-cair ini bertujuan untuk membebaskan analit dari pengotor-pengotor lemak dan pengganggu lain yang bersifat polar maupun semipolar. Pemilihan n-Heksana dalam proses partisi ini didasarkan pada sifat kelarutan isoflavon dalam bentuk aglikon, yaitu larut dalam pelarut nonpolar saeperti n-Heksana. Proses partisi cair-cair dilakukan dengan cara memasukkan hasil hidrolisis yang telah disaring terlebih dahulu ke dalam corong pisah, lalu ke dalam corong pisah tersebut ditambahkan 25 mL n-Heksana, dan digojog hingga terbentuk emulsi. Pembentukan emulsi ini bertujuan untu memperluas kontak permukaan aglikon dengan n-Heksana (BJ n-Heksana < BJ HCl). Selanjutnya, diambil lapisan n-Heksana yang berada pada lapisan atas dan diperoleh ekstrak nHeksana yang bening. Namun pada proses partisi cair-cair ini, tidak terjadi pemisahan yang jelas antara fase n-Heksana dengan fase air, sehingga kemungkinan dalam pengambilan fase n-Heksana, fase air juga ada yang terambil. Ekstrak n-Heksana yang diperoleh diuapkan pada suhu tidak lebih dari 65C karena n-Heksana menguap pada suhu 69C. Digunakan suhu yang tidak terlalu tinggi untuk mencegah terdegradasinya zat aktif akibat suhu yang panas. Penguapan dilakukan hingga n-Heksana menguap seluruhnya. Selanjutnya dilakukan perhitungan rendemen ekstrak kental n-Heksana, di mana berat cawan porselen kosong yang digunakan untuk proses penguapan adalah 78,841 gram dan berat cawan porselen + ekstrak kental n- Heksana setelah penguapan adalah 79,379 gram. Dengan mengurangkan antara berat cawan + ekstrak kental nHeksana dengan berat cawan kosong, diperoleh berat ekstrak kental n-Heksana sebesar 0,501 gram, dan dengan membagi berat ekstrak kental hasil penguapan dengan berat serbuk biji kedelai awal (10,013 gram) dan dikalikan dengan 100 %, maka diperoleh % rendemen ekstrak hasil penguapan sebesar 5 %. Kecilnya % rendemen yang diperoleh disebabkan oleh adanya ekstrak n-Heksana yang tertinggal pada kertas saring ketika dilakukan penyaringan hasil hidrolisis sebelum dipartisi cair-cair dengan n-Heksana. Selain itu, ketika dilakukan proses hidrolisis, hanya sedikit ekstrak dalam bentuk aglikon yang diperoleh, sehingga ketika dipartisi cair-cair dengan n-Heksana, diperoleh rendemen hasil yang sedikit pula. Sedangkan untuk kelompok 3 yang juga melakukan

74

percobaan yang sama terhadap ekstrak biji kedelai, diperoleh rendemen ekstrak kental n-Heksana sebesar 1,08 %. Setelah dilakukan tahap isolasi isoflavon yang meliputi proses soxhletasi, penguapan hasil soxhletasi, hidrolisis, penguapan hasil hidrolisis, partisi cair-cair, dan penguapan hasil partisi cair-cair, dilakukan tahap pemisahan dengan kromatografi kolom lambat yang dipreparasi dengan cara basah. Proses pemisahan dapat diartikan sebagai suatu cara untuk mengisolasi sejumlah komponen kimia dalam keadaan murni dari suatu campuran (Kusmardiani dan Nawawi, 1992). Dari proses pemisahan ini, diharapkan memperoleh isoflavon daidzein dan genistein yang dipisahkan berdasarkan fraksi-fraksi tertentu. Kolom yang digunakan memiliki tinggi 14,4 cm dan diameter 2 cm. Sebelum dilakukan pemisahan, terlebih dahulu dilakukan penyiapan kolom dengan cara basah. Serbuk silica gel ditimbang sebanyak 20 gram, lalu dimasukkan ke dalam kolom dan diukur tinggi kolom. Diperoleh tinggi kolom 14,4 cm dan diameter 2 cm. Serbuk silica gel dituangkan lagi dari kolom untuk dibuat menjadi bubur silica. Kemudian, dilakukan pembuatan fase gerak yang terdiri dari n-Heksana, kloroform, dan etil asetat dengan perbandingan 9 : 1 : 0,5 sebanyak 100 mL. Dipipet sebanyak 85,71 mL n-Heksana, 9,52 mL kloroform, dan 4,76 mL etil asetat, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL, dan digojog hingga homogen. Pada bagian dasar kolom dimasukkan glass wol, namun glass wol yang dimasukkan tidak boleh menyumbat keran. Tujuan dari penambahan glass wol adalah agar serbuk silika tidak turun ke kran sehingga nantinya dapat menyumbat keran kolom. Kemudian, dilakukan pembuatan bubur silica yang akan digunakan sebagai fase diam dalam pemisahan dengan kromatografi kolom basah. Pembuatan bubur silica campuran dilakukan dengan cara menambahkan sedikit demi sedikit adsorben atau silica gel ke dalam fase gerak hingga semua silica (20 gram silica gel) dapat membentuk susupensi dengan fase gerak. Langkah pembuatan bubur silica ini tidak boleh dibalik, yaitu dengan menambahkan pelarut atau fase gerak ke dalam adsorben karena panas yang dibebaskan akan dapat mendidihkan pelarut dan akan menyebabkan terbentuknya gumpalan dalam campuran, yang akan menimbulkan kesulitan dalam pemasukan sistem fase diam ke dalam kolom dan dapat menimbulkan masalah pada proses elusi. Bubur silica yang telah terbentuk dimasukkan secara

perlahan ke dalam kolom dengan menggunakan pipet tetes melalui dinding kolom hingga semua bubur silica masuk ke dalam kolom dan membentuk lapisan yang

75

progresif. Setiap pemasukan bubur silica ke dalam kolom, dinding kolom diketukketukkan agar lapisan adsorben yang terbentuk benar-benar mampat (tidak ada gelembung udara). Adanya gelembung udara dapat mengganggu proses pemisahan karena adanya gelembung udara dalam kolom akan dapat menahan analit dalam kolom sehingga tidak akan terelusi. Kolom yang baik adalah kolom yang adsorbennya kompak dan tidak terdapat gelembung udara didalamnya karena gelembung udara dan celah pada adsorben akan mengakibatkan kolom akan pecah dan dapat mengganggu proses pemisahan. Setelah semua adsorben atau bubur silica masuk, kolom dibiarkan beberapa saat agar cairan yang berada di atas adsorben menjadi jernih (semua partikel adsorben sudah membentuk lapisan). Selanjutnya, keran di bagian bawah kolom dibuka agar pelarut dapat mengalir keluar secara perlahan dan dihitung kecepatan alir fase gerak, di mana dalam hal ini kecepatan fase gerak yang digunakan adalah 45 tetes per menit. Kolom yang telah dibuat didiamkan selama 4 hari sebelum proses elusi dilangsungkan, agar proses pemampatan fase diam menjadi lebih sempurna dan selama didiamkan, harus terdapat sejumlah tertentu fase gerak di bagian atas kolom untuk mencegah kering dan rusaknya kolom. Selain itu, kolom harus dalam keadaan tertutup rapat agar tidak memungkinkan udara untuk masuk (Kristianti dkk., 2008). Selanjutnya, dilakukan proses elusi dengan menggunakan fase diam silica gel dan fase gerak n-Heksana : kloroform : etil asetat (9 : 1 : 0,5). Dilakukan pembuatan fase gerak terlebih dahulu sebanyak 50 mL, yang terdiri dari 42,86 mL n-Heksana, 4,76 mL kloroform, dan 2,38 mL etil asetat. Digunakan kombinasi fase gerak ini karena dapat memberikan gradien kepolaran dari yang non polar sampai semipolar sehingga dapat memberikan pemisahan terbaik. Sedangkan untuk fase diam digunakan selica gel karena dalam hal ini proses pemisahan berlangsung melalui peristiwa sorpsi dan desorpsi, di mana silica gel merupakan adsorben yang baik untuk peristiwa tersebut. Selain itu, silica gel cocok digunakan sebagai fase diam dalam pemisahan senyawa organik yang relatif tidak stabil, seperti senyawa golongan flavonoid. Sebelum

dilakukan proses elusi, dilakukan pelarutan ekstrak kental n-Heksana dengan fase gerak secukupnya. Ekstrak yang akan dipisahkan melalui kromatografi kolom harus dapat larut dalam fase gerak yang digunakan karena jika ekstrak yang akan dipisahkan tidak dapat larut dalam fase gerak, maka ekstrak tersebut tidak akan dapat terelusi bersama dengan fase gerak melalui kolom dan proses pemisahan tidak akan terjadi. Namun, pada

76

praktikum ini ekstrak kental n-Heksana tidak dapat larut dalam fase gerak n-Heksana : kloroform : etil asetat. Hal ini dimungkinkan oleh kesalahan dalam penggunaan pelarut pengekstraksi, yaitu dalam praktikum ini digunakan etanol 80% sebagai pelarut pengekstraksi, sedangkan dalam literatur (Asih, 2009), pelarut pengekstraksi yang digunakan untuk mengekstraksi isoflavon dari biji kedelai adalah metanol. Etanol 80% merupakan pelarut yang sangat polar karena dalam etanol tersebut terdapat kandungan air sebesar 20 % yang semakin meningkatkan kepolaran etanol. Akibat sifat kepolaran yang sangat tinggi dari etanol 80 % tersebut, maka selama proses ekstraksi dengan soxhletasi, bukan hanya senyawa isoflavon dalam bentuk glikosida yang terekstraksi, tetapi juga senyawa lain dalam ekstrak biji kedelai yang juga bersifat polar. Setelah dilakukan studi pustaka mengenai penyebab tidak larutnya ekstrak n-Heksana yang dalam fase gerak yang digunakan, diketahui bahwa ternyata etanol dapat mengurangi potensi hidrolisis, dan hal ini berarti jika dalam ekstrak hasil soxhletasi masih terdapat etanol, maka sisa etanol tersebut akan dapat mengurangi hidrolisis atau pemutusan ikatan antara glikon dengan aglikon. Akibatnya, hanya sedikit isoflavon yang diperoleh dalam bentuk aglikon dan ketika dipartisi cair-cair menggunakan n-Heksana, hanya sedikit juga isoflavon dalam bentuk aglikon yang terpartisi ke fase n-Heksana. Setelah dilakukan penggojogan, tidak terbentuk pemisahan yang jelas antara fase n-Heksana dengan fase air, sehingga ketika dilakukan pengambilan fase n-Heksana, kemungkinan glikon dan senyawa polar lain yang terdapat pada fase air ikut terambil. Dengan demikian, ketika ekstrak kental n-Heksana ini dilarutkan dengan fase gerak yang sebagian besar terdiri dari komponen nonpolar (n-Heksana dan kloroform bersifat nonpolar, sedangkan etil asetat bersifat semipolar), hanya sedikit ekstrak yang dapat larut dalam fase gerak karena memang bagian aglikon yang diperoleh sangat sedikit, dan sebagian besar ekstrak tidak larut dalam fase gerak, mengingat kurangnya komponen pelarut yang bersifat polar dalam fase gerak yang digunakan. Untuk dapat melarutkan ektrak dalam fase gerak, ditambahkan sedikit metanol dalam ekstrak tersebut karena tidak mungkin jika dilakukan pengubahan komposisi fase gerak. Ketika ditambahkan dengan metanol, ekstrak yang semula hanya sebagian kecil larut dalam fase gerak, menjadi dapat larut secara keseluruhan. Karena fase gerak yang digunakan tidak mengandung metanol, maka tidak mungkin dilakukan penambahan ekstrak yang dilarutkan dalam metanol ke dalam kolom, karena akan menyebabkan

77

kerusakan pada kolom. Untuk mengatasi hal tersebut, ekstrak yang telah dilarutkan dengan sedikit metanol, dicampurkan dengan silica gel dalam jumlah yang sama dengan berat ekstrak kental n-Heksana, yaitu 0,501 gram. Pencampuran dilakukan hingga metanol menguap, sehingga ekstrak akhirnya dijerap dalam silica gel. Selanjutnya, ekstrak yang dijerap dalam silica gel tersebut ditambahkan dengan cara kering ke dalam kolom. Setelah didiamkan dalam waktu yang cukup lama, tidak terbentuk pita-pita pemisahan dalam kolom karena sebagian besar ekstrak yang diperoleh tidak larut dalam fase gerak dan walaupun ada ekstrak yang larut, namun jumlahnya sangat sedikit sehingga jika terjadi pemisahan, pemisahan tersebut tidak nampak sebagai pita-pita pemisahan. Elusi dilangsungkan dengan kecepatan elusi 45 tetes/menit, dan hasil elusi ditampung tiap 5 mL dalam botol vial bersih. Elusi dilangsungkan hingga diperoleh 10 fraksi, dan dalam hal ini semua fraksi yang ditampung tidak berwarna (bening). Hasil yang kelompok kami peroleh tidak dapat dibandingkan dengan kelompok lain yang juga melakukan pemisahan ekstrak n-Heksana biji kedelai dengan kromatografi kolom lambat. Hal ini dikarenakan kolom yang dibuat oleh kelompok lain tersebut telah kering atau rusak sebelum proses elusi dilakukan, sehingga kelompok tersebut tidak dapat melalui prosedur pemisahan dengan kromatografi kolom lambat. Selanjutnya, semua fraksi yang diperoleh diuapkan pada suhu kamar. Tujuan penguapan di sini adalah untuk menghilangkan fase gerak yang terdapat pada fraksi-fraksi. Dalam hal ini juga digunakan ekstrak yang tidak dipisahkan melalui kromatografi kolom lambat sebagai pembanding untuk mengetahui ada atau tidaknya zat yang dituju pada ekstrak, mengingat tidak berhasilnya proses pemisahan yang dilakukan dengan kromatografi kolom lambat karena dalam kolom tidak terbentuk pita-pita pemisahan. Ekstrak pembanding ini masih mengandung metanol, sehingga juga harus diuapkan pada suhu kamar hingga diperoleh ekstrak kental. Fraksi yang diperoleh dari pemisahan dengan kromatografi kolom lambat kemudian dianalisis secara kualitatif dengan metode KLT-spektrofotodensitometri. Plat yang digunakan adalah plat aluminium sheets silica gel GF
254

dengan ukuran10 x 10

cm. Adapun fase diam yang digunakan adalah silica gel, dan fase gerak yang terdiri dari kombinasi n-Heksana : kloroform : etil asetat (9 : 1 : 0,5). Silika gel GF 254 nm adalah silika gel yang telah ditambahkan indikator yang memungkinkan pendeteksian semua senyawa yang memadamkan flouresensi bila plat diamati dengan disinari UV

78

berpanjang gelombang 254 nm, sehingga analit yang tidak berfluoresensi dapat diamati sebagai bercak hitam di antara pendaran fase diam (Harbone, 1987). Sementara itu, fase gerak yang digunakan adalah sistem pelarut yang terdiri dari kombinasi. Dengan

menggunakan fase gerak yang terdiri dari n-Heksana : kloroform : etil asetat (9 : 1 : 0,5), diharapkan dapat dihasilkan resolusi pemisahan yang baik, sehingga analisis kualitatif terhadap senyawa daidzein dan genistein dapat dilakukan dengan baik pula. Plat KLT yang telah dipotong dengan ukuran 10 x 10 cm, ditandai untuk mengetahui arah elusi dan batas akhir elusi, di mana penandaan pada plat ini harus dilakukan seminimal mungkin untuk mencegah terganggunya pemisahan oleh noda pensil yang digunakan untuk menandai plat. Setelah itu plat KLT dicuci secara elusi dengan menggunakan 5 mL metanol. Tujuan pencucian plat KLT ini adalah untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang mungkin terdapat pada plat KLT. Pada ujung plat KLT diletakkan kertas tissue yang berfungsi untuk menyerap fase gerak apabila telah terelusi melewati plat, sehingga pengotor yang telah larut dalam metanol langsung dapat diserap dan tidak terjadi elusi balik. Selanjutnya, dilakukan aktivasi plat KLT dengan cara dikeringkan pada oven pada suhu 1200C selama 30 menit. Aktivasi ini bertujuan untuk mengaktifkan plat KLT, untuk menghilangkan sisa air yang terdapat fase diam, serta untuk memindahkan pengotor agar berada pada ujung plat KLT sehingga tidak mengganggu proses pemisahan (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Setelah proses aktivasi selesai, dilakukan penjenuhan chamber untuk mengoptimalkan proses pengembangan fase gerak. Penjenuhan chamber dilakukan dengan

menambahkan 5 mL fase gerak ke dalam chamber dan meletakkan kertas saring pada chamber. Penambahan kertas saring berfungsi agar penguapan yang terjadi dalam chamber merata sehingga udara di dalam chamber tetap jenuh pelarut (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Selama proses penjenuhan, chamber ditutup dengan baik, didiamkan selama 30 menit dan dijaga agar tidak mengalami pergeseran untuk mencegah terjadinya ketidakjenuhan pelarut. Kondisi jenuh dalam chamber dengan uap pelarut dapat mencegah penguapan pelarut (Clark, 2007). Selanjutnya, dilakukan penotolan fraksi-fraksi yang diperoleh dari proses pemisahan dengan kromatografi kolom. Sebelum dilakukan penotolan pada plat KLT silica gel GF254, semua fraksi, termasuk ekstrak yang telah diuapkan, direkonstitusi dengan 0,5 mL metanol. Tujuan rekonstitusi ini adalah agar fraksi serta ekstrak

79

pembanding dapat ditotolkan pada plat KLT. Rekonstitusi dilakukan dengan menggunakan metanol karena metanol memiliki titik didih yang rendah, yaitu 64,565C, sehingga ketika dilakukan penotolan fraksi maupun ekstrak pembanding, metanol akan cepat menguap dan pada plat hanya akan terdapat fraksi dan ekstrak pembanding yang diinginkan. Pada praktikum ini, fase diam yang digunakan yaitu silika gel yang bersifat polar. Hal ini mengakibatkan senyawa-senyawa yang bersifat polar akan cepat tertambat sehingga harga Rf yang diperoleh kecil. Sebaliknya senyawa yang bersifat non polar akan tertambat jauh dari tempat penotolan dan mempunyai harga Rf besar. Dalam hal ini senyawa yang dikehendaki untuk terdeteksi pada plat KLT adalah daidzein dan genistein yang cenderung bersifat nonpolar, sehingga senyawa tersebut akan mudah terelusi oleh fase gerak yang terdiri dari campuran komponen nonpolar dan semipolar, dan setelah diamati di bawah sinar UV dan dianalisis dengan spektrofotodensitometer, diharapkan akan diperoleh harga hRf yang besar, yaitu harga hRf 68 untuk daidzein dan 75 untuk genistein (Widiastuti, 2009). Untuk memperoleh hasil yang baik, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 L. Hal ini dilakukan agar setelah elusi, spot yang satunya tidak mengganggu spot yang lainnya sehingga spot yang dihasilkan tidak bertumpuk satu sama lainnya. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 l maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan (Sudjadi, 2007). Pada praktikum ini, penotolan dilakukan dengan volume totolan 10 L dan jarak antar totolan 0,7 cm atau 7 mm, dimana penotolan dilakukan dengan teknik manual menggunakan pipa kapiler ukuran 5 L. Dengan demikian, penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Semua fraksi yang diperoleh ditotolkan pada plat KLT, termasuk 1 ekstrak pembanding yang tidak dipisahkan melalui kromatografi kolom lambat. Penotolan fraksi maupun ekstrak pembanding harus dilakukan dengan konsentrasi yang tidak terlalu pekat dan totolan bercak sesempit mungkin, karena penotolan bercak yang terlalu lebar yang tidak tepat akan menyebabkan terjadinya tailing serta bercak dapat menyebar ke puncak ganda. Pelebaran bercak dapat mengganggu proses scanning dengan spektrodensitometri karena memungkinkan terjadinya himpitan puncak (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Pada praktikum ini, kelompok kami (kelompok 4) dan kelompok 3 melakukan penotolan pada plat KLT yang sama, di mana jumlah total totolan adalah 13 totolan,

80

yang terdiri dari 10 totolan fraksi dari kelompok 4; 1 totolan ekstrak pembanding dari kelompok 4; dan 2 totolan ekstrak dari kelompok 3. Setelah dilakukan penotolan, plat KLT dielusi dalam chamber yang telah mengalami penjenuhan, dengan menggunakan fase gerak yang sama dengan fase gerak yang digunakan dalam kromatografi kolom lambat, yaitu n-Heksana : kloroform : etil asetat (9 : 1 : 0,5) sebanyak 5 mL untuk tiap sisi chamber. Elusi yang dilakukan adalah elusi menaik (ascending) dan diharapkan pelarut atau fase gerak dapat bergerak naik secara bersamaan hingga jarak pengembangan 8 cm. Setelah fase gerak mencapai batas pengembangan 8 cm, plat KLT dikeluarkan dari chamber untuk dikeringkan pada suhu kamar. Plat yang telah kering selanjutnya dianalisis dengan metode

spektrofotodensitometri. Sebelum dianalisis dengan spektrofotodensitometer, plat diamati di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm untuk mengetahui ada tidaknya spot yang terpisah. Pada pengamatan di bawah sinar UV 254 nm, terlihat dua spot yang cukup jelas, berupa bercak berwarna gelap dengan jarak 6 cm dari titik awal penotolan. Spot tersebut terdapat pada fraksi 2 dan fraksi 3. Sedangkan ketika diamati di bawah sinar UV 366 nm, spot yang teramati tidak jelas. Analisis kualitatif dilanjutnya dengan metode spektrofotodensitometri pada panjang gelombang 200-800 nm. Analisis dilakukan dengan metode KLTspektrofotodensitometri karena ekstrak maupun fraksi yang diperoleh tidak murni, sehingga metode analisis semula, yaitu pergeseran spektrum tidak dapat dilakukan. Karena tidak terdapatnya data spesifik dari daidzein dan genistein pada library spektrofotodensitometer, dan akibat keterbatasan literatur, di mana hanya diperoleh literatur yang menunjukkan pola spektrum dari senyawa genistein, maka pada metode spektrofotodensitometri ini, senyawa yang dianalisis secara kualitatif adalah senyawa genistein. Prinsip dasar pengukuran kadar suatu senyawa dengan sistem

spektrofotodensitometri adalah mengukur serapan atau fluorosensi dari analit yang menyerap sinar UV. Pada praktikum ini, digunakan sistem serapan (absorbsi) karena zat yang di ukur tidak berfluoresensi, di mana pengukuran oleh densitometer dilakukan terhadap banyaknya REM yang diabsorsi atau diserap oleh kromofor suatu senyawa. Pada metode ini, digunakan rentang panjang gelombang 200-800 nm karena mode absorbsi dengan spektrofotodensitometri terjadi pada daerah dengan rentang panjang gelombang tersebut. Pendeteksian dengan metode spektrofotodensitometer ini dilakukan

81

dengan teknik semiautotomatis karena alat spektrofotodensitometer hanya bisa mendeteksi analit dengan jarak penotolan kelipatan 0,5 cm. Dalam praktikum ini, jarak penotolan yang digunakan adalah 0,7 cm (bukan kelipatan 0,5 cm) sehingga terjadi kekacauan dalam penentuan jumlah track. Pada alat spektrofotodensitometer, jumlah track yang dideteksi berjumlah 19 track, sedangkan jumlah track sebenarnya adalah 13 track, yang terdiri dari 10 fraksi dan 1 ekstrak pembanding. Akibatnya, harus dilakukan penyesuaian secara manual antara track yang dideteksi oleh alat pada jarak penotolan 0,5 cm dengan track sebenarnya pada jarak penotolan 0,7 cm. Hasil penyesuaian antara track pada keadaan sebenarnya dengan track yang dibaca oleh alat adalah sebagai berikut : track 1 menjadi track 2; track 2 menjadi track 3; track 3 menjadi track 4; track 4 menjadi track 6; track 5 menjadi track 7; track 6 menjadi track 9; track 7 menjadi track 10; track 8 menjadi track 11; track 9 menjadi track 13; track 10 menjadi track 14; track 11 menjadi track 16; track 12 menjadi track 17; dan track 13 menjadi track 18. Dari hasil analisis oleh alat spektrofotodensitometer, tidak ada spot dari setiap track yang memberikan bentuk spektrum yang sama dengan bentuk spektrum genistein pada literatur, sehingga analisis hanya dapat dilakukan melalui perbandingan harga Rf yang diperoleh untuk setiap spot dengan harga Rf genistein menurut literatur, yaitu 75. Dari hasil analisis terhadap harga Rf, diperoleh bahwa kemungkinan genistein berada pada pada fraksi 2 (track 2, spot ke-3) dan pada fraksi 3 (track 3, spot ke-4) dengan nilai Rf masing-masing adalah 0,75 dan 0,74. Namun hasil ini tidak dapat dikatakan valid karena bentuk spektrum yang dihasilkan tidak sesuai dengan pola spektrum genistein pada literatur. Menurut literatur (Markham, 1988), genistein memiliki panjang gelombang maksimum 261 nm dan bahu 328 nm dengan pola spektrum sebagai berikut:

(Markham,1988).

82

Dari hasil analisis, diperoleh pula harga Rf yang sangat kecil, yaitu di bawah 0,40 pada beberapa track penotolan. Hal ini menunjukkan bahwa pada plat yang dianalisis terdapat senyawa yang bersifat polar, sehingga senyawa tersebut lebih tertahan oleh fase diam dan tidak terelusi oleh fase gerak. Terdapatnya senyawa polar dalam hasil analisis dan ketidaksesuaian spektrum genistein yang diperoleh pada analisis KLTspektrofotodensitometri ini dengan literatur disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain: 1. Senyawa target genistein (salah satu isoflavon yang terdapat pada biji kedelai) yang terdapat dalam biji kedelai kemungkinan mengalami kerusakan akibat pemanasan dengan suhu tinggi saat proses ekstraksi dengan metode soxhletasi, di mana suhu yang digunakan praktikan pada saat soxhletasi adalah 4000C, padahal menurut literatur genistein memiliki titik didih pada suhu 200 C (Ketaren, 1985) sehingga menyebabkan rusaknya genistein dalam ekstrak biji kedelai, dan dengan demikian ketika dianalisis dengan KLT-

spektrofotodensitometri, dihasilkan pola spektrum yang berbeda dengan pola spektrum genistein pada literatur, walaupun dihasilkan nilai Rf yang sesuai dengan nilai Rf genistein pada pustaka. 2. Sangat sedikitnya ekstrak yang larut dalam fase gerak ketika akan dipisahkan melalui kromatografi kolom lambat akibat sedikitnya komponen nonpolar (isoflavon dalam bentuk aglikon) yang terdapat dalam ekstrak yang ingin dipisahkan, sedangkan fase gerak yang digunakan terdiri dari komponen nonpolar dan semipolar. Akibatnya, aglikon khususnya genistein, hanya sedikit yang terelusi melalui kolom, dan ketika dianalisis secara kualitatif dengan metode KLT-spektrofotodensitometri, hanya sedikit genistein pula yang terdeteksi, yaitu pada fraksi 2 dan fraksi 3, namun kebenaran senyawa tersebut sebagai genisteinpun tidak bisa dipastikan karena spektrum yang dihasilkan tidak menunjukkan kemiripan dengan spektrum genistein pada pustaka. 3. Penggunaan pelarut yang kurang sesuai yaitu etanol 80% yang mengandung air sebanyak 20%, sehingga pelarut ini menjadi sangat polar. Pelarut polar ini dapat melarutkan berbagai komponen yang bersifat polar maupun semipolar dalam ekstrak biji kedelai, dan karena proses hidrolisis serta partisi cair-cair

83

dengan n-Heksana tidak dapat berlangsung sempurna, maka ada kemungkinan senyawa-senyawa polar maupun semipolar tersebut ikut terpisahkan pada kromatografi kolom lambat akibat adanya komponen fase gerak yang bersifat semipolar, yaitu etil asetat. Ketika dianalisis dengan KLT-

spektrofotodensitometri, maka senyawa polar maupun semipolar tersebut juga akan terdeteksi sebagai puncak-puncak yang tidak diketahui. 4. Penyimpanan plat KLT yang terlalu lama, di mana seharusnya plat yang telah dielusi tidak boleh disimpan terlalu lama atau harus segera dianalisis dengan spektrofotodensitometri karena penyimpanan plat akan menyebabkan rusaknya palt dan senyawa dalam plat dapat terdegradasi, sehingga akan mengganggu proses scanning dengan spektrofotodensitometri.

Perbandingan Hasil Maserasi dan Soxhletasi Percobaan dengan biji kedelai ini, dilakukan dengan menggunakan 2 metode ekstraksi yaitu metode maserasi (metode ekstraksi dingin) yang dilakukan oleh kelompok 3 dan metode soxhletasi (metode ekstraksi panas) yang dilakukan oleh kelompok 4. Jadi, metode ekstraksi dipandang sebagai variabel bebas yang menyebabkan adanya perbedaan hasil baik hasil ekstraksi maupun hasil KLT. Berikut adalah tabel perbedaan hasil kedua metode ekstraksi tersebut :

84

Tabel 12. Perbandingan Hasil dari Beberapa Metode Ekstraksi Pembanding Randemen ekstrak kental hasil ekstraksi Susut pengeringan ekstrak Warna Ekstrak Hasil Soxhletasi Jumlah Bercak KLT di bawah sinar UV 366 nm Warna bercak di bawah UV 366 nm Nilai Rf pada spektrofotodensitometer Antara 0,30 0,95 (tidak ditemukan senyawa genistein) Senyawa yang akan dianalisis Genistein Genistein 0,75 pada fraksi 2 dan 0,74 pada fraksi 3 Gelap 1 spot cukup jelas 2 spot yang cukup jelas, yaitu spot 2 dan spot 3 Gelap 21,32 % Kuning kecoklatan 29,48 % Kuning muda Maserasi (Kelompok 3) 7,8 % Soxhletasi (Kelompok 4) 8,67 %

Berdasarkan tabel di atas dapat dilihat adanya perbedaan hasil antara kedua metode ekstraksi. Dilihat dari randemen ekstrak yang diperoleh, ekstraksi dengan metode maserasi menghasilkan rendemen yang lebih sedikit daripada ekstraksi dengan metode soxhletasi. Seharusnya, rendemen yang diperoleh dari metode maserasi lebih banyak daripada rendemen dari metode soxhletasi, karena pada metode maserasi, kontak antara serbuk biji kedelai dengan cairan penyari dapat berlangsung dalam waktu yang lebih lama, sehingga cairan penyari dapat menyari zat aktif yang terdapat dalam serbuk biji kedelai dalam jumlah yang lebih banyak pula, dan dengan demikian ekstrak yang diperoleh dengan cara maserasi tersebut seharusnya mengandung senyawa target dalam jumlah yang lebih banyak. Namun, dalam hal ini rendemen yang lebih sedikit justru dihasilkan dari ekstraksi dengan menggunakan metode maserasi. Hal ini dimungkinkan oleh waktu maserasi yang tidak mencapai 1 minggu perendaman dan kemungkinan ekstrak ada yang tertinggal pada kertas saring saat dilakukan penyaringan ekstrak. Kecepatan dan jumlah sirkulasi pada proses soxhletasi berpengaruh pada jumlah zat aktif yang diekstrak. Pada praktikum yang dilakukan oleh kelompok 4,

85

sirkulasi pada soxhletasi hanya dilakukan sebanyak 2 kali sirkulasi, namun karena waktu untuk 1 kali sirkulasi tergolong cukup lama, maka dapat diperoleh ekstrak dengan warna yang cukup pekat. Dilihat dari warna ekstrak yang dihasilkan, ekstrak hasil maserasi memiliki warna yang lebih pekat dibandingkan dengan warna ekstrak hasil soxhletasi. Hasil susut pengeringan serbuk biji kedelai yang diperoleh oleh kelompok 3 dan kelompok 4 berbeda. Perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan berat serbuk yang ditimbang ditimbang dan botol timbang yang digunakan. Pada hasil KLTspektrofotodensitometri kelompok 3 tidak ditemukan senyawa genistein dalam kedua ekstrak yang ditotolkan, di mana hal ini dimungkinkan oleh kurang optimalnya proses hidrolisis dan partisi cair-cair yang dilakukan.

86

BAB VI KESIMPULAN

6.1

Kesimpulan 1. Senyawa isoflavon dari serbuk biji kedelai ini diisolasi melalui serangkaian proses ekstraksi panas (soxhletasi), hidrolisis, partisi caircair, dan kromatografi kolom. 2. Untuk mengidentifikasi jenis senyawa isoflavon (senyawa target analisis adalah genistein) digunakan metode KLT-Spektrofotodensitometri dengan mode absorpsi. 3. Prinsip KLT-Spektrofotodensitometri dengan mode absorpsi adalah berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada plat, kemudian diukur besarnya serapan cahaya oleh analit pada panjang gelombang tertentu. 4. Dari hasil percobaan diperoleh persentase susut pengeringan serbuk biji kedelai adalah 29,48 %; dari pemisahan dengan kromatografi kolom lambat, diperoleh 10 fraksi yang tidak berwarna; dan dari hasil analisis dengan KLT-spektrofotodensitometri, tidak ditemukan spot yang memberikan gambaran spektrum yang sama dengan spektrum genistein pada literatur. Rendemen ekstrak kental hasil soxhletasi yang diperoleh adalah 8,67 % dan rendemen ekstrak kental hasil partisi cair-cair nHeksana adalah 5 %.

6.2

Kritik dan Saran 1. Peralatan dan bahan praktikum agar lebih dilengkapi guna

meningkatkan ketrampilan dan kompetensi mahasiswa. 2. Adanya banyak perubahan yang dilakukan terhadap cara kerja dari literatur menyebabkan hasil yang diperoleh tidak sesuai dengan yang diharapkan. 3. Diskusi sebelum dan sesudah praktikum perlu diadakan guna mencegah kesalahan prosedur dan memantau hasil yang diperoleh praktikan

87

DAFTAR PUSTAKA

Agustina, Widiastuti, tt, Profil Kandungan Daidzein dan Genistein Pada Tempe Gembus Selama Proses Fermentasi, Available at : http//www.digilib.uns.ac.id/abstrak.pdf Opened at : 20 Desember 2010.

Anonim a, 2001, Inventaris Tanaman Obat Indonesia Jilid II, Jakarta: Depkes RI Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. Anonim b, 1986, Sediaan Galenik, Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Anonim c, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Anonim d, 1980, Materia Medika Indonesia V, Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Asih, I. A. R. Astiti, 2009, Isolasi dan identifikasi senyawa isoflavon dari kacang kedelai (Glycine max), Jurnal Kimia 3 (1). Clark, J, 2007, Kromatografi Lapis Tipis, (cited 2009 Oct, 9) Available from: http://www.chem-is-try.org/kromatografi/pdf. Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rochman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Yogyakarta: Pustaka pelajar. Harbone, J.B, 1987, Metode Fitokimia. Bandung: ITB. Irwan, Wawan, 2006, Budidaya Tanaman Kedelai (Glycine max (L.) Merill), Jatinangor : Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas Padjadjaran. Koswara, Sutrisno, 2006, Isoflavon, Senyawa Multi- Manfaat Dalam Kedelai, Bogor : Institute Pertanian Bogor. Kristianti, A.N, N.S. Aminah, M. Tanjung, B.Kurniadi, 2008, Buku Ajar Fitokimia. Surabaya: Jurusan Kimia Laboratorium Kimia Organik FMIPA Universitas Airlangga. Kusmardiyani, S., dan A, Nawawi, 1992, Kimia Bahan Alam, Jakarta: Universitas Bidang Ilmu Hayati.

86

Markham, K.R, 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, Bandung : ITB. Moffat, C.A., M. D. Osselton, and B. Widdop, 2005, Clarkes Analysis of Drugs and Poisons, In Pharmaceuticals, Body Fluids, and Postmortem Material, 3rd Edition. London: Pharmaceutical Press Mulja, M. dan Sukarman. 1995, Analisis Instrumental, Surabaya: Airlangga University Press. Priyatni, Sri dan Iskandar, Yetti Multyati, 2006, Isoflavone Aglicone Produce From Fermented Soybean, Yogyakarta : Prosiding Seminar Nasional Iptek Solusi Kemandirian Bangsa. Sherma, J. and B. Fried. 1996, Handbook of Thin-Layer Chromatography Third Edition, New York : Marcel Dekker Inc. P.147-149. Tim Penyusun. 2008. Buku Ajar Farmakognosi. Jurusan Farmasi FMIPA Universitas Udayana. Bukit Jimbaran. Wallis, TE, 2005, Texbook of Pharmacognosy Fifth Edition, New Delhi : Darya Ganj. Widjaja, I.N.K., K.W. Astuti, N.M.P. Susanti, dan I M. A. G. Wirasuta. 2008. Buku Ajar Farmasi Fisiko Kimia. Jimbaran: Jurusan Farmasi FMIPA UNUD.

86