Anda di halaman 1dari 5

Tugas Bioteknologi

Macam macam Seleksi


Oleh : Marvi Nurjanah (0906639335)

Dalam proses rekayasa genetika, ada beberapa tahapan yang harus dilalui. Salah satu produk dari rekaya genetika yaitu kloning gen, yang merupakan hasil dari teknologi DNA Rekombinan. Tahapan-tahapan yang harus dilalui dalam melakukan cloning gen, yaitu isolasi DNA, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan DNA, dan penyambungan DNA. Setelah itu, dilakukan transformasi, yaitu proses pengambilan DNA rekombinan oleh E.coli dengan cara mengintroduksi DNA murni ke dalam sel yang sudah kompeten. Tahap selanjutnya yaitu seleksi,dimana E.coli (plasmid DNA rekombinan) diseleksi terhadap E.coli yang tidak membawa rekombinan. Terdapat empat macam teknik seleksi yang umum dilakukan, yaitu teknik replica plating, seleksi warna koloni, komplementasi, dan analisa hibridisasi. Namun, hanya akan dibahas tiga teknik seleksi pada tugas ini. a. Teknik Replica Plating Replica plating adalah suatu teknik dengan menggunakan satu atau lebih cawan petri sekunder mengandung media pertumbuhan selektif yang berbeda (tanpa nutrisi atau berisi inhibitor pertumbuhan seperti antibiotik) diinokulasikan dengan koloni mikroorganisme yang sama dari suatu plat primer, menghasilkan pola koloni yang sama dengan induknya. Tujuan dari teknik cawan replika yaitu untuk dapat membandingkan plat master dan plat sekunder lain khususnya untuk skrining fenotip tertentu. Sebagai contoh, ketika sebuah koloni terdapat dalam plat primer, dan tidak muncul pada plat sekunder, menunjukkan bahwa koloni tersebut sensitif terhadap material tertentu yang terdapat di plat sekunder. Skrining fenotip yang biasa dilakukan meliputi auxotrophy dan resistensi antibiotik. Cawan replika sangat berguna untuk seleksi negatif. Sebagai contoh, jika seseorang ingin memilih koloni yang sensitif terhadap ampicillin, plat primer harus di replika ke dalam plat agar Amp+ sekunder. Koloni yang sensitif pada plat sekunder akan mati tapi koloni masih bisa disimpulkan dari plat primer karena keduanya memiliki pola yang sama dari koloni yang resisten ampicillin. Koloni yang sensitif kemudian dapat diambil dari plat.

Dengan meningkatkan variasi pada plat sekunder dengan media pertumbuhan selektif yang berbeda dapat menskrining secara cepat koloni yang diisolasi secara individu sebanyak fenotip yang terdapat di plat sekunder.

Gambar 1. Teknik Replica Plating

b. Seleksi Warna Koloni Seleksi warna koloni disebut juga dengan seleksi biru-putih, dimana nantinya koloni bakteri yang didapatkan akan terdiri dari dua warna, yaitu koloni biru dan putih. Koloni putih merupakan koloni yang diperkirakan mengandung fragmen gen sisipan (gen stilbena sintase) sedangkan koloni biru diperkirakan merupakan koloni yang tidak mengandung fragmen gen sisipan. Terbentuknya koloni putih biru ini disebabkan adanya marka seleksi pada vektor pGEMT Easy. Marka seleksi biasanya berupa gen yang membawa sifat resistensi terhadap antibiotik tertentu. Vektor pGEM-T Easy memiliki marka seleksi berupa gen resistensi ampisilin dan marka seleksi tambahan berupa gen Lac Z. Gen pembawa sifat resistensi terhadap ampisilin ini menyandi enzim -Laktamase. Enzim -Laktamase akan mendegradasi ampisilin sehingga ketika sel pembawa plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam media yang mengandung ampisilin, maka sel tersebut akan tumbuh sementara sel yang tidak membawa plasmid rekombinan akan mati. Gen Lac Z menyandi enzim Galaktosidase. Enzim ini akan menghidrolisis X-Gal yang ditambahkan pada media seleksi menjadi galaktosida dan senyawa turunannya yaitu 5-bromo-4kloro indoksil yang berwarna biru. Ketika terdapat fragmen gen sisipan pada plasmid maka sintesis peptida yang berperan sebagai aktivator terhadap kerja enzim galaktosidase akan terhambat sehingga warna biru tidak terbentuk. Seleksi transforman melalui pengamatan warna koloni yang terbentuk tidak selalu sesuai dengan teori. Artinya bahwa tidak semua koloni

berwarna putih pasti membawa fragmen gen sisipan dan sebaliknya belum tentu semua koloni berwarna biru merupakan koloni yang tidak membawa fragmen gen sisipan. Hal tersebut dapat disebabkan oleh karakteristik dari fragmen gen hasil PCR yang diklon ke dalam pGEM-T Easy. Sebagai contoh, koloni biru dapat dihasilkan dari produk PCR yang diklon pada frame yang sama dengan gen LacZ. Produk PCR tersebut biasanya memiliki tiga basa sama yang berulang pada beberapa bagian fragmen, termasuk memiliki basa adenin yang berulang pada bagian ujungnya. Produk PCR yang demikian tidak memiliki kodon stop pada bagian fragmennya sehingga akan ditranslasi bersamaan dengan gen LacZ dan menghasilkan koloni berwarna biru. Koloni sel yang terbentuk pada media seleksi selanjutnya diambil beberapa untuk diamplifikasi dengan teknik PCR koloni dan dikonfirmasi dengan elektroforesis gel agarosa. Tujuan utama dari PCR koloni adalah untuk mengkonfirmasi koloni transforman yang membawa fragmen gen sisipan dan menghindari kesalahan dari pengamatan warna koloni.

Gambar 2. Seleksi Warna Koloni ( Biru-putih )

c. Komplementasi Galur E. coli DH5 merupakan salah satu galur E. coli yang banyak digunakan dalam teknologi rekombinasi DNA. Beberapa gen pada galur E. coli ini sudah mengalami mutasi dari galur aslinya sehingga menguntungkan bila dipakai sebagai inang pada rekombinasi DNA. Gen yang dimanfaatkan untuk menseleksi klon rekombinan yang diintroduksikan ke dalam sel inang

E. coli DH5 adalah gen lacZM15. Gen ini merupakan produk mutasi dari gen lacZ. Protein -galaktosidase merupakan produk dari gen lacZ yang terdiri atas subunit dan subunit . Gen lacZM15 hanya menghasilkan subunit . Jika plasmid yang membawa gen yang dapat menghasilkan subunit dari protein -galaktosidase dimasukkan ke dalam galur E. coli ini, maka akan terbentuk protein -galaktosidase yang memiliki aktivitas menguraikan senyawa X-gal (5bromo-4-kloro-3-indolil--D-galaktosida) menjadi senyawa 5-bromo-4-kloro-3 indolil yang berwarna biru dan D-galaktosa. Keberadaan gen lacZM15 pada E. coli galur ini dapat dimanfaatkan untuk menyeleksi koloni yang membawa dan yang tidak membawa plasmid rekombinan. DNA akan disisipkan di Multiple Cloning Site (MCS) yang merupakan bagian dari gen lacZ pada plasmid. Jika plasmid tidak tersisipi maka subunit dapat dihasilkan sehingga dapat bergabung dengan subunit yang dihasilkan inang. Gabungan kedua subunit protein tersebut akan menghasilkan protein galaktosidase aktif yang dapat menghasilkan koloni berwarna biru jika terdapat senyawa X-gal pada media, tetapi jika plasmid tersisipi maka subunit tidak akan dihasilkan sehingga walaupun terdapat senyawa X-gal pada media tumbuhnya koloni tetap akan berwarna putih.

Gambar 3. Komplementasi

Referensi

Lilis, Embi. 2009. Konstruksi DNA Rekombinan Pcambia 1303-Stilbena Sintase Pencegah Busuk Akar Kelapa Sawit. Bogor : Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor. Millar,Neil. 2000. Module 2 : Gene and Genetic Engineering. http://www.mrothery.co.uk/module2/mod2trimmednotes.htm, diunduh pada 26 Februari 2012, pukul 20.05 WIB Satria, Heri. 2009. Studi Penggunaan Indikator X-Gal Dalam Kloning Gen Pada Escherichia Coli DH5 (Study Of X-Gal Indicator Uses On Gene Cloning In Escherichia Coli DH5). Lampung : FMIPA Universitas Lampung.