Anda di halaman 1dari 21

LAPORAN PRAKTIKUM

PENGARUH pH DAN TEMPERATUR TERHADAP AKTIVITAS ENZIM AMILASE

NAMA NIM KELOMPOK

: SALMINAH SALEH : H311 08 005 : 1 (SATU)

HARI/TGL PERC. : SENIN/25 OKTOBER 2010 ASISTEN : YUSTIN

LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2010

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Enzim merupakan suatu senyawa yang termasuk dalam golongan protein. Enzim ini memiliki fungsi yang sangat penting dalam kelangsungan hidup manusia karena sebagian besar dari proses metabolisme tubuh kita mengikut sertakan kinerja dari enzim tersebut. Tetapi perlu kita ketahui bahwa kerja suatu enzim tentu saja tidak lepas dari syarat-syarat yang harus dipenuhi misalnya harus dalam suhu tertentu, pH tertentu dan masih banyak lagi faktor-faktor yang mempengaruhi kerja dari enzim tersebut. Enzim amilase tergolong dalam enzim hidrolase, yaitu katalis reaksi pemecahan ikatan. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya adalah pH dan suhu. Enzim dapat bekerja pada pH dan suhu yang optimum. Oleh karena itu melalui percobaan ini, akan diketahui pengaruh pH dan berbagai temperatur terhadap aktivitas enzim, dalam hal ini adalah enzim amilase, dengan menentukan pH dan suhu optimum dimana terjadi hidrolisis amilum menjadi glukosa paling cepat oleh kerja enzim. Amilum terdiri atas dua macam polisakarida yang kedua-duanya adalah polimer dari glukosa, yaitu amilosa (kira-kira 20-28%) dan amilopektin. Pada saat kita mengunyah nasi (amilum), maka dalam mulut terjadi suatu reaksi kimia, yaitu pemecahan ikatan-ikatan pada amilum dengan bantuan enzim, dalam hal ini adalah enzim amilase yang terdapat dalam saliva (air liur). Berdasarkan hal tersebut di atas, maka dilakukanlah percobaan ini untuk mengetahui pengaruh dari pH dan suhu terhadap kerja dari enzim tersebut.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan 1.2.1 Maksud Percobaan Maksud dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan mempelajari mengenai pengaruh pH dan temperatur terhadap aktivitas enzim amilase. 1.2.2 Tujuan Percobaan Tujuan dari percobaan ini antara lain : 1. Menentukan pH optimum untuk aktivitas enzim amilase. 2. Menentukan temperatur potimum untuk aktivitas enzim amilase.

1.3 Prinsip Percobaan 1.3.1 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase Menentukan aktivitas enzim amilase berdasarkan waktu penguraian pati menjadi glukosa pada berbagai pH tertentu dengan penambahan iodida sebagai indikator yang memberi warna biru dan akan berubah menjadi bening. 1.3.2 Pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim amilase Menentukan aktivitas enzim amilase berdasarkan waktu penguraian pati menjadi glukosa pada berbagai temperatur kemudian diuji dengan iodida pada interval waktu tertentu hingga warna biru yang terbentuk berubah menjadi bening.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis dalam sel hidup. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa adalah (1) dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi; (2) bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah; dan (3) bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu. Enzim telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi dan industri kimia lainnya. Dalam bidang pangan misalnya amilase, glukosa-isomerase, papain, dan bromelin, sedangkan dalam bidang kesehatan contohnya amilase, lipase, dan protease. Enzim dapat diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme (Azmi, 2006). Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi dan dengan demikian mempercepat proses reaksi. Percepatan terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap. Sebagai contoh, enzim -amilase hanya dapat digunakan pada proses perombakan pati menjadi glukosa (Taufik, 2007). Beberapa enzim membutuhkan baik koenzim maupun sat atau lebih ion logam bagi aktivitasnya. Pada beberapa enzim, koenzim atau ion logam hanya terikat secara lemah atau dalam waktu sementara pada protein, tetapi pada enzim lain senyawa ini terikat kuat, atua terikat secara permanen yang dalam hal ini

disebut gugus prostetik. Enzim yang strukturnya sempurna dan aktif mengkatalisis, bersama-sama dengan koenzim atau gugus logamnya disebut holoenzim. Koenzim dan ion logam bersifat stabil sewaktu pemanasan, sedangkan bagian protein enzim akan terdenaturasi oleh pemanasan (Lehninger, 1982). Enzim amilase dapat diperoleh dari sekresi air liur atau saliva. Saliva adalah suatu cairan oral yang kompleks dan tidak berwarna yang terdiri atas campuran sekresi dari kelenjar ludah besar dan kecil yang ada pada mukosa oral. Saliva dapat disebut juga kelenjar ludah atau kelenjar air liur. Semua kelenjar ludah mempunyai fungsi untuk membantu mencerna makanan dengan mengeluarkan suatu sekret yang disebut saliva (ludah atau air liur). Pembentukan kelenjar ludah dimulai pada awal kehidupan fetus (4 - 12 minggu) sebagai invaginasi epitel mulut yang akan berdiferensiasi ke dalam duktus dan jaringan asinar (Aldi, 2010). Saliva adalah cairan yang lebih kental daripada air biasa. Tiap hari sekitar 1 1,5 liter saliva dikeluarkan oleh kelenjar saliva. Saliva terdiri atas 99,24 % air dan 0,58 % terdiri atas ion-ion Ca2+, Mg2+, Na+, K+, PO43-, Cl-, HCO3-, SO42- dan zat-zat organik seperti musin dan enzim amilase atau ptialin. Musin suatu glikoprotein dikeluarkan oleh kelenjar sublingual dan kelenjar submandibular, sedangkan ptialin dikeluarkan oleh kelanjar parotid. Saliva mempunyai pH antara 5,75 sampai 7,05. Pada umumnya pH saliva adalah sedikit dibawah 7. Enzim ptialin dalam saliva adalah suatu enzim amilase. Enzim ptialin bekerja secara optimal pada pH 6,6 (Poedjiadi, 2005). Saliva terdapat sebagai lapisan setebal 0,1-0,01 mm yang melapisi seluruh jaringan rongga mulut. Pengeluaran air ludah pada orang dewasa berkisar antara

0,3-0,4 ml/menit sedangkan apabila distimulasi, banyaknya air ludah normal adalah 1-2 ml/menit. Menurunnya pH air ludah (kapasitas dapar / asam) dan jumlah air ludah yang kurang menunjukkan adanya resiko terjadinya karies yang tinggi. Meningkatnya pH air ludah (basa) akan mengakibatkan pembentukan karang gigi (Aldi, 2010). Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi dalam sel maupun luar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Jadi enzim dapat berfungsi sebagai katalis yang sangat efisien, di samping itu mempunyai derajat kekhasan yang tinggi. Seperti juga katalis lainnya, maka enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Reaksi kimia ada yang membutuhkan enenrgi (reaksi endergonik) dan ada pula yang menghasilkan energi atau mengeluarkan energi (eksergonik) (Poedjiadi, 2005). Menurut Poedjiadi (2005), faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim, antara lain : 1. Konsentrasi enzim, seperti pada katalis lain kecepatan suatu reaksi yang menggunakan enzim bergantung pada konsentrasi enzim tersebut. Pada suatu konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksi bertambah dengan

bertambahnya konsentrasi enzim. 2. Konsentrasi substrat, pada konsentrasi substrat rendah, bagian aktif enzim ini hanya menampung substrat sedikit. Bila konsentrasi substrat diperbesar, makin banyak substrat yang dapat berhubungan dengan enzim pada bagian aktif tersebut. 3. Suhu, enzim merupakan suatu protein sehingga kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Apabila terjadi denaturasi, maka

bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan reaksinya menurun. 4. Pengaruh pH, struktur ion enzim bergantung pada pH lingkungannya. Perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat. Di samping pengaruh terhadap struktur ion pada enzim, pH rendah atau tinggi dapat pula menyebabkan menurunnya aktivitas enzim. 5. Pengaruh inhibitor, molekul atau ion yang yang dapat menghambat reaksi dinamakan inhibitor. Hambatan merupakan mekanisme pengaturan reaksireaksi yang terjadi dalam tubuh kita. Inhibitor ini dapat menyebabkan menurunnya aktivitas enzim. Di dalam sel dan lingkungan sel sekelilingnya, pH dalam keadaan normal harus tetap sebab adanya perubahan akan menyebabkan pergeseran aktivitas enzim. Hal ini akan mempengaruhi dan mengacaukan sistem katabolik dan anabolik dalam sel jaringan (Girindra, 1993).

BAB III METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini antara lain larutan pati 1%, saliva (enzim amilase), larutan iodida 0,01 M, NaCl 0,1 M, asam asetat 0,1 M, buffer fosfat pH 8,0; 7,4; 6,8; 6,2; 5,8; 5,4, akuades, spiritus, korek api, es batu, sabun cair, kertas label, dan tissue roll. 3.2 Alat Percobaan Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini antara lain tabung reaksi, rak tabung, pipet tetes, inkubator, plat tetes, gegep, gelas kimia 1000 mL, kaki tiga, kawat kasa, labu semprot, erlenmeyer 250 mL, sikat tabung, waterbath, dan pembakar spiritus. 3.3 Prosedur Percobaan 3.3.1 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase Diambil 6 buah tabung reaksi yang bersih dan kering. Kemudian diisi masing-masing 5 mL larutan buffer fosfat berturut-turut pH 8,0; 7,4; 6,8; 6,2; 5,8 dan 5,4. Ke dalam larutan buffer ini dimasukkan 2,5 mL pati 1%, 1 mL NaCl, dan 1 mL saliva encer dan untuk tabung dengan pH 8 dan 7,4 diasamkan dengan ditambahkan 1 mL asam asetat. Kemudian masing-masing tabung ditambahkan dengan 2 tetes larutan iodium lalu diperhatikan perubahan yang terjadi. Selanjutnya dimasukkan ke dalam inkubator bersuhu 38oC selama 5 menit hingga menjadi bening. Dicatat perubahan dan waktu yang dibutuhkan pada berbagai pH

setiap interval 5 menit selama 30 menit. Selanjutnya dibuat grafik pH versus kebalikan waktu (1/T) dan dari grafik itu ditentukan pH optimumnya. 3.3.2 Pengaruh Temperatur terhadap aktivitas enzim amilase Diambil 4 buah tabung reaksi yang bersih dan kering lalu diisi masingmasing 2,5 mL larutan pati 1%. Ditambahkan 1 mL saliva encer. Kemudian tabung pertama dimasukkan ke dalam wadah yang berisi es batu, tabung kedua dibiarkan pada temperatur kamar, tabung ketiga dimasukkan dalam inkubator bersuhu 38 oC dan tabung keempat dimasukkan ke dalam gelas kimia yang berisi air mendidih (suhu 100oC). Setelah itu, dipipet ke dalam plat tetes yang berisi 1 tetes iodin pada menit ke nol. Setelah itu, simpan lagi ke dalam suhunya masingmasing, kemudian tiap interval lima menit, dipipet lagi pada plat tetes yang telah berisi iodin. Kemudian ditentukan kecepatan penguraian masing-masing contoh dengan melihat perubahan warna yang terjadi.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4. 1 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase Pada percobaan kali ini, dilakukan uji pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase. Keasaman atau pH merupakan salah satu faktor yang sangat mempengaruhi konformasi enzim sehingga akan mempengaruhi juga aktivitas dari enzim itu sendiri. Perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat. Enzim akan mempunyai aktivitas paling besar pada pH optimumnya. Berdasarkan percobaan ini diperoleh data sebagai berikut: Tabel 1. Hasil pengamatan pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase Warna Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 Ket : +++++ ++++ +++ = biru tua = agak biru tua = biru ++ + = biru muda = agak bening = bening pH 8,0 pH 7,4 pH 6,8 + pH 6,2 ++++ +++ ++ + pH 5,8 +++++ ++++ +++ ++ + pH 5,4 -

Tabel 2. Tabel pH versus kebalikan waktu ( 1/T) pH 8,0 7,4 6,8 6,2 5,8 5,4 Waktu 5 5 10 25 30 5 1/T 1/5 1/5 1/10 1/25 1/30 1/5

Grafik 1. pH versus kebalikan waktu (1/T)


0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 pH 7.5 8 8.5 9 9.5 10

1/T (waktu)

pH optimum

Pada percobaan ini akan ditentukan pH optimum dari enzim amilase. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan larutan buffer fosfat pada pH yang berbeda-beda yang telah ditentukan masing-masing. Digunakan beberapa macam pH yang berbeda-beda agar dapat ditentukan pada pH berapa enzim bekerja dengan baik. Pada larutan ini ditambahkan larutan pati 1%, larutan NaCl 0,1 M, saliva encer dan ditetesi dengan indikator iodin. Larutan pati yang digunakan

dalam percobaan ini bertindak sebagai substrat. NaCl ditambahkan sebagai bahan pengaktif kerja enzim, selain itu juga memberi kondisi yang sama dengan kondisi pada mulut. Saliva merupakan sumber penyedia enzim amilase. Sedangkan iodin sebagai indikator, membentuk kompleks biru ungu akibat adanya ikatan semu antara amilum dengan iodin. Selanjutnya tabung-tabung ini ditempatkan pada oven bersuhu 38 oC, hal ini dilakukan karena enzim amilase bekerja secara optimal pada suhu ini. Setelah itu ditambahkan iodin tetes per tetes sampai terjadi perubahan warna dari tidak berwarna menjadi biru. Amilum dengan iod akan membentuk kompleks yang berwarna biru keunguan dan dengan adanya enzim amilase, amilum akan terhidrolisis menjadi disakarida yang kemudian akan terhidrolisis membentuk 2 molekul glukosa secara enzimatis. Pada tabung reaksi yang berisi larutan buffer dengan pH 8,0 dan 7,4 ditambahkan asam asetat (CH3COOH) dengan tujuan untuk mengasamkan larutan tersebut karena enzim tidak dapat bekerja pada pH basa. Pada pH 5,8, perubahan warna sangat lambat. Ini membuktikan bahwa aktivitas enzim pada pH tersebut sangat lambat yang mengakibatkan enzim tidak mudah terhidrolisis menjadi glukosa sehingga perubahan warnanya juga lambat. Pada percobaan ini terjadi kesalahan dari data yang diperoleh baik tabel maupun grafik yaitu pada pH 8,0 dan pH 7,4 semestinya perubahan warna yang terjadi lambat tetapi pada data yang diperoleh cepat, ini disebabkan karena kurangnya kehati-hatian dalam mengerjakan prosedur. Jadi, dapat diketahui bahwa pH optimum untuk enzim amilase adalah 5,4 karena pada pH ini terjadi perubahan warna yang paling cepat.

4.2 Pengaruh Temperatur terhadap aktivitas enzim amilase Pada percobaan ini, diuji pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim amilase. Selain keasaman atau pH, temperatur juga merupakan salah satu faktor yang sangat mempengaruhi konformasi enzim sehingga akan mempengaruhi juga aktivitas dari enzim itu sendiri. Adapun temperatur yang digunakan ialah 0 C (dalam air es), 25 C (suhu kamar), 38 C, dan 100 C (air mendidih). Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, diperoleh data sebagai berikut: Tabel 1. Hasil pengamatan pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim Warna Waktu Tabung I (menit) (dalam air es) 5 10 15 20 25 30 35 Ket: ++++++ +++++ ++++ +++ = biru tua = agak biru tua = biru = biru muda ++ + = agak biru muda = agak bening = bening ++++++ +++++ ++++ +++ ++ + (25 oC) ++++++ +++++ ++++ +++ ++ + (38 oC) +++++ ++++ +++ ++ + (100 oC) ++++++ +++++ ++++ +++ + +++ Tabung II Tabung III Tabung IV

Tabel 2. Tabel temperatur versus kebalikan waktu ( 1/T) Temperatur 0 C 25 C 38 C 100 C Waktu 35 35 30 35 1/T 1/35 1/35 1/30 1/35

Grafik 1. temperatur versus kebalikan waktu (1/T)


0.034 0.033 1/T (menit) 0.032 0.031 0.03 0.029 0.028 0 10 20 30 40 50 60 (oC) 70 80 90 100 110 temperatur

temperatur optimum

Pada percobaan ini akan ditentukan suhu optimum dari enzim amilase. Masing-masing tabung diisi dengan larutan pati 1% dan tabung yang lain diisi dengan saliva encer. Tabung pertama yang berisi larutan pati dan tabung yang berisi saliva dicelupkan pada air es (0 oC). Tabung kedua yang berisi larutan pati dan tabung yang berisi saliva encer ditempatkan pada suhu kamar (25 oC). Tabung ketiga yang berisi larutan pati dan tabung yang berisi saliva encer dimasukkan dalam oven (38 oC). Tabung keempat yang berisi larutan pati dan tabung yang berisi saliva encer dimasukkan dalam penangas air (100 oC). Perlakuan ini dilakukan pada berbagai suhu yang telah ditentukan masing-masing agar dapat diketahui pada suhu berapa (suhu optimum) enzim amilase bekerja dengan baik.

Setelah 5 menit larutan pati ditambahkan beberapa tetes saliva dan kemudian diuji pada plat tetes yang telah diisi dengan larutan Iodin 0,01 M. Pengujian ini dilakukan pada interval 5 menit. Pada 5 menit pertama semua larutan pada plat berwarna biru tua terutama pada tabung I, II, dan IV sangat pekat warnanya. Perubahan warna akan terlihat dengan jelas pada plat tetes setelah 5 menit kelima. Tabung II yang diletakkan pada suhu kamar berubah warnanya menjadi bening setelah 35 menit begitupun pada larutan yang ditempatkan di dalam air es (0 oC) juga menunjukkan perubahan warnanya menjadi bening setelah 35 menit. Pada larutan yang ditempatkan pada suhu 100 oC juga menunjukkan perubahan warna menjadi bening pada waktu yang sama yaitu setelah 35 menit, setelah terjadi denaturasi pada menit 25. Dimana denaturasi adalah rusaknya struktur konformasi dari enzim yang disebabkan karena pemanasan suhu yang cukup tinggi. Larutan yang ditempatkan pada oven (38 oC) akan menjadi bening setelah 30 menit, ini menunjukkan aktivitas enzim lebih cepat dibandingkan pada suhu 0 oC, 25 oC, dan 100 oC. Berdasarkan data yang diperoleh baik dari tabel maupun grafik terlihat bahwa suhu optimum dari enzim amilase adalah 38 oC. 4.3 Reaksi Adapun reaksi yang terjadi yaitu:
CH2O H O H OH O H OH H H O H CH2O O H OH H H O OH n H + nI2

CH2O H O H OH O H OH H H
I

CH2O H O H OH H H O OH n H amilase

O I biru

CH2O H OH H bening OH O H OH H OH H + nI2

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa : 1. pH optimum untuk aktivitas enzim amilase adalah pada pH 5,4. 2. Temperatur optimum untuk aktivitas enzim amilase adalah pada suhu 38C. 5.2 Saran Untuk percobaan sebaiknya untuk uji aktivitas enzim berikutnya digunakan juga enzim yang lain seperti enzim lipase sehingga dapat dibandingkan hasilnya dan wawasan praktikan juga bertambah. Untuk asisten kinerjanya sudah sangat baik, saya harap dapat dipertahankan.

DAFTAR PUSTAKA

Aldi, 2010, Enzim II Pengaruh Suhu Pada Amilase Air Liur, Pengaruh pH Pada Aktivitas Amilase Air Liur, Hidrolisis Pati Oleh Amilase Air Liur, Dan Hidrolisis Pati Mentah Oleh Amilase Air Liur (online), (http://agitoaldi.blogspot.com/), diakses 25 Oktober 2010, pukul 16.43 WITA. Azmi, J., 2006, Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus oryzae Untuk Isolasi Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka (Arthocarphus heterophilus Lmk), Jurnal Biogenesis, 2(2), 55-58, (online), (http://www.kimiawan.org/journal, diakses tanggal 25 Oktober 2010, pukul 17.03 WITA). Girindra, A., 1993, Biokimia 1, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Lehninger, A. L., 1995, Dasar-Dasar Biokimia jiid 1, diterjemahkan oleh Maggy Thenawidjaja, Erlangga, Jakarta. Poedjiadi, A., 2005, Dasar-Dasar Biokimia, UI Press, Jakarta. Taufik, H., 2007, Laporan Aktivitas Enzim (online), (http://www.x3prima.com/2009/09/laporan-aktivitas-enzim.html), diakses 25 Oktober 2010, pukul 16.08 WITA.

LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 25 Oktober 2010

ASISTEN

PRAKTIKAN

(Y U S T I N)

(SALMINAH SALEH)

Bagan Kerja 1. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase Larutan Buffer Dipipet 5 mL ke dalam masing-masing 6 buah tabung reaksi dengan pH 8,0; 7,4; 6,8; 6,2; 5,8 dan 5,4. Ditambahkan 2,5 mL larutan pati 1% Ditambah NaCl 0,1 M 1 mL Ditambahkan dengan saliva encer 1 mL Ditambahkan dengan asam asetat 0,1 M sebanyak 1 mL untuk tabung dengan pH 8,0 dan 7,4 Ditambahkan 2 tetes larutan iod Dimasukkan ke dalam inkubator Dicatat perubahan warna dari biru ke bening setiap 5 menit selama 30 menit Data

2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim amilase Larutan pati 1% Ditempatkan ke dalam 4 tabung reaksi sebanyak 1 mL, ditambah saliva encer sebanyak 5 tetes. tabung pertama dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi LEMBAR PENGESAHAN es batu tabung kedua dibiarkan pada temperatur kamar tabung ketiga dimasukkan dalam penangas air bersuhu 38o C tabung keempat pada suhu 100 oC (air mendidih) dipipet masing-masing tabung pada interval waktu 5 menit selama 30 menit pada plat tetes yang berisi larutan iodin

Data