Review Journal

Flow cytometric analysis of CK19 expression in the peripheral blood of breast carcinoma patients: relevance for circulating tumor cell detection
Lili Wang, Yanyan Wang, Yajing Liu, Min Cheng, Xu Wu and Haiming Wei

Pendahuluan
Kanker payudara menduduki peringkat kedua penyebab kematian wanita yang paling sering, dimana hamper 10 % wanita di seluruh dunia memiliki risiko untuk

menderita kanker payudara. Telah banyak penelitian dan pengobatan yang telah dilakukan untuk mengatasi kanker ini, namun masih belum membuahkan hasil yang makasimal. Untuk itulah diperlukan suatu teknik terbaru untuk mendeteksi kanker payudara sedini mungkin dan harapannya para klinisi dapat melakukan terapi sedini mungkin sehingga komplikasi yang terjadi tidak akan bertambah parah dan akhirnya dapat meningkatkan usia haapan hidup dari penderita kanker payudara. Pada penelitian terdahulu telah ditemukan bahwa sel-sel epitel dari kanker payudara dapat bersirkulasi didalam pembuluh darah, atau dari aspirat sumsum tulang. Adanya Circulating Tumor Cells (CTCs) di darah perifer mengindikasikan rekurensi dan peningkatan kejadian metastasis pada kanker payudara. Semua sel epitel memiliki filament intermediet yang disebut Cytokeratinins (CKs), dan CK19 adalah bagian yang paling sering digunakan dalam mendeteksi tumor yang berasal dari jaringan epitel. Adanya CK19 dalam sirkulasi berkorelasi dengan tingkat keparahan kanker payudara Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi adanya CK19 yang bersirkulasi pada pembuluh darah 48 pasien dengan kanker payudara. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah flowcytometri dan imunohistokimia. Hasil yang diharapkan adalah adanya peningkatan CK19+ pada sirkulasi pasien penderita kanker payudara

Metode
Sampel sel kanker Sel A431 ( epitel kanker manusia) didapatkan dari American Type Culture Collection, dan dibiakkan pada Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), yang dinutrisi dengan 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, dan 100 g/ml streptomycin at 37C didalam incubator with 5% CO2.

Pasien Kanker payudara Pasien berasal dari rumah sakit jejaring Anhui Medical University. Penelitian dengan cohort memasukkan 7 pasien dengan benign tumor, 34 pasien dengan primary breast cancer dan 7 pasien dengan metastatic breast cancer sejak Oktober 2006 hingga April 2008. Pasien-pasien ini melakukan lumpectomy keciali pada pasien dengan metastasis yang jauh. Dan dideteksi ekspresi CK19 pada 15 pasien kanker payudara primer saat 3 bulan kemoterapi. Sampel darah diambil dengan persetujuan pasien dan dengan izin dari komisi etik University of Science and Technology of China. Darah kontrol didapatkan dari 25 pasien sehat secara sukarela.

Blood sample preparation 8ml darah pertama disisihkan untuk menghindari adanya kontaminasi epitel, sebelum 5ml sampel yang sebenarnya kita ambil. Sel darah putih diisolasi dari perifer menggunakan RBC lysisi buffer (RX-2-1-2 U-gene China). Kemudian 3ml darah dan 15 ml RBC lysis buffer dicampurkan dan di lakukan vortex lalu disimpan dalam es selama 15 menit sampai pellucid, dan disentrifugasi pada 450g selama 10 menit, Cuci menggunakan PBS.

Flowcytometri Fiksasi sampel dengan menggunakan 1% paraformaldehyde selama 1 jam dalm suhu kamar, lalu sel A431 atau leukosit di permeabilisasikan dengan 0.01% Triton X-100 elama 1 jam dalam suhu kamar, diikuti dengan pemberian serum blok tikus selama 30 menit dalam suhu kamar. Setelah itu dilakukan inkubasi dengan FITC-conjugated CK19 antibody atau FITC-mouse IgG1 isotype antibody Cuci dengan buffer dan dianalisa menggunakan Dickinson). flowcytometri FACSCalibur (Becton

Analisa statistik K Related Samples Test digunakan untuk analysis melihat ekspresi CK19 di pembuluh darah peifer pasien sebelum dan sesudah pengobatan.

Mann-Whitney U test digunakan untuk melihat ekspresi CK19 expression pada pasien stage III and stage IV. Statistical significance dipatok values of p < 0.05.

Hasil dan Pembahasan

Dari hasil flowcytometri didapatkan jumlah CK19 dari sel A431(tumor payudara) lebih tinggi daripada di sel darah perifer pasien normal. sel A431 (gambar 1), sebelumnya juga dicampur dengan sel darah putih pasien normal pada rasio-rasio yang berbeda antara 1:1, 1:10, 1:102, 1:103, and 1:104 (gambar 2) untuk membedakan sensitifitas dan spesifisitas dari flowcytometri, dan dari hasilnya didapatkan presentasi CK19+ yang terdeteksi sebanding/konsisten dengan rasio A431 banding sel darah putih. Sensitifitas yang dimaksud adalah seberapa baik metode ini dalam mendeteksi sel sel kanker.dan spesifisitas disini dimaksudkan agar metode ini bisa mendeteksi sel kanker payudara, dan tidak mendeteksi sel yang lain Terbukti bahwa flowcytometri dapat mendeteksi secara sensitif dan spesifik terhadap kadar CK19 dan menjadi kandidat untuk alat pemeriksaan standar dalam deteksi kanker payudara.

Gambar 1. Menunjukkan jumlah CK19 yang banyak pada sel kanker payudara dibandingkan dengan jumlah CK19 pada sel darah putih manusia normal

Gambar 2. Menunjukkan pencampuran sel kanker payudara dan sel darah putih manusia normal dengan raio yang berbeda menunjukkan bahwa memang jumlah sel CK19 sebanding dengan jumlah sel tumor yang ada

Gambar 3. Hasil flowcytometri menunjukkan bahwa tedapat sebaran CK19+ pada pasien dengan kanker payudara dilihat pada pola persebaran sel-nya

Pada gambar 3 didapatkan hasil sensitifitas yang masih kurang baik, karena hanya sedikit sel kanker yang terdeteksi, namun memiliki spesifisitas yang sangat baik. Untuk menjadi alat deteksi yang baik, diperlukan spesifisitas yang tinggi, agar tidak terjadi kesalahan diagnosis ( false positive/negative) Dengan analisis flowcytometri , tidak ditemukan kadar CK19 pada manusia sehat, tumor jinak dan pasien kanker payudara stage I, sedangkan pada pasien kanker payudara stage II-IV ditemukan CK19+. Hal ini bisa menjadi salah satu indikator dasar potensi deteksi dini kanker payudara.

Gambar 4 . menunjukkan bahwa terjadi penurunan jumlah sel CK19 pada pasien kanker payudara setelah dilakukan operasi dan kemoterapi. Hal ini menunjukkan bahwa ada hubungannya antara keberadaan sel CK19 dengan manifestasi kanker payudara

Flowcytometri bisa digunakan sebagai alat diagnostik yang cukup presisi apabila digunakan sesuai dengan indikasinya, akan tetapi jurnal ini sangat percaya bahwa deteksi dini kanker payudara dapat dilakukan dengan metode ini. Namun, untuk menjadi sebuah alat deteksi/ screening berbeda sekali dengan alat diagnostic. Alat screening/ deteksi dini biasanya tidak memerlukan spesifitas tinggi, namun memerlukan sensitifitas yang tinggi, sedangkan penelitian ini menunjukkan spesifisitas yang tinggi, jadi akan lebih baik kalau disebut sebagai alat diagnostic, bukan alat deteksi dini. Penelitian ini membuktikan bahwa penggunaakn flowcytometri saja dapat mendeteksi adanya kanker payudara mulai stage II, hingga stage IV. Namun pada penelitian ini didapatkan bahwa jumlah sel CK19+ pada pasien stage II masih cukup sedikit dan bisa berisiko menimbulkan hasil negatif palsu. Kita ketahui bahwa kanker stage II adalah kondisi dimana kanker sudah mulai menyerang ke limfonodi aksiler, namun ukurannya tidak lebih besar dari 5 cm (antara 2-5cm) sehingga apabila kanker tersebut tidak teraba dan dilakukan pemeriksaan ini, akan bisa segera dideteksi dan tentunya terapi akan lebih cepat dimulai. Harapannya komplikasi dari kanker ini dapat dicegah dengan segera. Penggunaan flowcytometri ini memiliki spesifisitas yang tinggi, namun masih sedikit kurang pada sensitifitasnya. Metode flowcytometri yang digunakan di penelitian ini tidak mencantumkan detail langkah-langkah flowcytometrinya, namun bisa memberikan keterangan secara umum bagaimana gambaran pelaksanaan flowcytometrinya. Pada prinsipnya flowcytometri adalah menghitung jumlah sel berdasarkan adanya ikatan dari marker antibodi yang sudah disediakan. Dalam penelitian ini, marker dari CK19 adalah FITC-mouse IgG1 isotype antibody. Dengan menggunakan marker ini dapat diketahui sebaran sel-sel yang mengandung CK19, yaitu sel kanker payudara.

KESIMPULAN
Metode deteksi dengan menggunakan flowcytometri ini merupakan metode yang cukup menjanjikan dalam mendeteksi kanker payudara mulai dari stage II-IV secara spesifik, akan tetapi tetap saja ada kekurangannya yaitu sensitifitasnya yang belum terlalu tinggi sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut agar didapatkan metode deteksi kanker yang spesifik dan sensitif, sehingga dari stage I saja bisa dideteksi, lalu segera diterapi dan pada akhirnya diharapkan akan didapatkan peningkatan kualitas hidup dari pasien kanker payudara.

Review Journal

Flow cytometric analysis of CK19 expression

in the peripheral blood of breast carcinoma patients: relevance for circulating tumor cell detection
Lili Wang, Yanyan Wang, Yajing Liu, Min Cheng, Xu Wu and Haiming Wei*

Review oleh : Aditya Satriya Nugraha Fastrack- Magister biomedik 2012

FAKULTAS KEDOKTERAN PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG