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UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE AGRONOMA

MANUAL DE PRACTICA PARA BIOQUMICA.


REA DE CIENCIAS SUB REA DE CIENCIAS QUMICAS

GUATEMALA ENERO 2010

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LABORATORIO DE BIOQUMICA

NDICE
CONTENIDO PAGINAS NDICE ..................................................................................................................................................................... 2 REUNIN DE INFORMACIN GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA ............................... 5 1. INTRODUCCIN ...................................................................................................................................................... 5 2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................................ 5 3. MATERIALES ........................................................................................................................................................... 6 4. METODOLOGA ....................................................................................................................................................... 6 PRACTICA No. 1 SELECCIN DE LA MUESTRA VEGETAL A TRABAJAR EN EL LABORATORIO .. 7 1. INTRODUCCIN ...................................................................................................................................................... 7 2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................................ 7 3. MATERIAL DE APOYO LAS BIOMOLCULA ................................................................................................. 8 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO .......................................................................................................... 13 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 15 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 15 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 16 PRCTICA 2. PREPARACIN DE MUESTRAS VEGETALES PARA ANLISIS QUMICO SECADO, MOLIDO Y TAMIZADO DE MUESTRAS VEGETALES ............................................................................... 17 1. INTRODUCCIN .................................................................................................................................................. 17 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 17 3. MARCO TERICO ................................................................................................................................................ 18 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 2 .................................................................................. 21 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 22 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 23 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 24 8. PARA INCLUIR EN EL REPORTE DE PRCTICA: ..................................................................................... 24 9. INVESTIGAR .......................................................................................................................................................... 24 PRCTICA No. 3 EXTRACCIN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTENAS EN MUESTRAS VEGETALES......................................................................................................................................................... 25 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 25 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 25

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3. MARCO TERICO. ............................................................................................................................................... 26 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 3 ................................................................................ 31 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 32 6. METODOLOGA ................................................................................................................................................... 33 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 37 8. PARA INCLUIR EN EL INFORME EN LA DISCUSIN.............................................................................. 38 PRCTICA 4 ESTUDIO DE AMINOCIDOS DE MUESTRA VEGETALES............................................. 39 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 39 2. OBJETIVOS: ............................................................................................................................................................ 39 3. MARCO TERICO. ............................................................................................................................................... 40 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 4 ................................................................................ 46 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 48 6. METODOLOGA. ................................................................................................................................................... 49 7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA: ..................................................................................... 54 8. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 55 9. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS PARA EL REPORTE ................................................... 55 PRCTICA No. 5 ESTUDIO DE AMINOCIDOS, CROMATOGRAFA DE AMINOCIDOS Y ESPECTROFOTOMETRA. .............................................................................................................................. 57 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 57 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 57 3. MATERIAL DE APOYO CROMATOGRAFA (11)....................................................................................... 58 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 5 ................................................................................ 64 5. MATERIALES DE LA PRCTICA V ................................................................................................................. 66 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 67 7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA: ..................................................................................... 73 Prctica No. 6 EXTRACCIN DE GLCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES ........................................ 76 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 76 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 76 3. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 77 4. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 78 5. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 79

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PRCTICA 7 ESTUDIO DE GLCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES ................................................... 81 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 81 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 81 3. MATERIAL DE APOYO GLCIDOS (CARBOHIDRATOS) (3,7,15,20) ................................................ 82 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 7 ................................................................................ 89 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 90 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 91 7. PREPARACIN DE REACTIVOS ..................................................................................................................... 93 8. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA: ..................................................................................... 94 9. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 94 Prctica No. 8 EXTRACCIN DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES .......................................... 101 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................. 101 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 101 3. MATERIALES ...................................................................................................................................................... 102 4. METODOLOGA .................................................................................................................................................. 103 5. EVALUACIN DE LA PRCTICA: ................................................................................................................. 104 Prctica No. 9 ESTUDIO DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES .................................................. 105 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................. 105 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 105 3. MATERIAL DE APOYO ESTUDIO DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES ............................... 106 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 9 .............................................................................. 112 5. MATERIALES ...................................................................................................................................................... 113 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................. 114 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................. 117 8. PARA EL REPORTE DE PRCTICA .............................................................................................................. 117 BIBLIOGRAFA................................................................................................................................................. 119

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REUNIN DE INFORMACIN GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA

1. INTRODUCCIN Para iniciar el Laboratorio de Bioqumica, se plantea esta primera reunin, de carcter obligatorio, para enterar a los estudiantes de las disposiciones generales que aqu debern cumplirse. Esta es una parte del laboratorio que el estudiante suele obviar, pero que, por la trascendencia de la misma, se plantea como parle de la asistencia. Adems de lo antes dicho, puede aprovecharse la reunin para que el estudiante conozca a su instructor d laboratorio y viceversa, con la finalidad de que se cimienten las bases de una buena comunicacin sobre la cual pueda edificarse el conocimiento. A su vez, el instructor de laboratorio formar grupos de trabajo a quienes har responsables de un locker, con la finalidad de qu las actividades prcticas s realicen con el mayor orden posible.

2. OBJETIVOS 2.1. GENERAL Informar a los estudiantes de las disposiciones generales del laboratorio de Bioqumica. 2.2. ESPECFICOS: Revisar el contenido del programa de Laboratorio de Bioqumica. Revisar el reglamento de Laboratorio de Bioqumica. Revisar las normas de cuidado de materiales dentro del laboratorio. Dar lectura a los "aspectos a considerar para el buen uso del Manual de prcticas de bioqumica. Ampliar la informacin antes revisada, o bien aclarar aquellas dudas que el estudiante pudiese tener sobre algn tpico de la informacin general del Laboratorio. Formar los grupos de trabajo para el desarrollo ordenado del Laboratorio de Bioqumica.

[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MATERIALES Programa de Laboratorio do Bioqumica.

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Reglamento de Laboratorio de Bioqumica. Reglamento para Uso de Materiales de Laboratorio.

4. METODOLOGA El instructor de laboratorio habr d presentarse a los estudiantes y tomar asistencia a esta reunin. El instructor de laboratorio repartir los tres reglamentos mencionados en los listados de materiales" de esta sesin de laboratorio. Se proceder a dar lectura al Programa de laboratorio de Bioqumica. Se proceder a dar lectura al Reglamento d laboratorio de Bioqumica. Se proceder, a dar lectura al Reglament para uso de materiales de laboratorio. El instructor de laboratorio ampliar aquella informacin que fuese requerida por los estudiantes. Se formarn grupos de trabajo con un mximo de 4 integrantes, para favorecer la realizacin de las prcticas y el aprendizaje de los estudiantes.

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PRACTICA No. 1 SELECCIN DE LA MUESTRA VEGETAL A TRABAJAR EN EL LABORATORIO


1. INTRODUCCIN Algunas veces se ha escuchado en la Subrea de Ciencias Qumicas, la inquietud de los estudiantes por encontrar, desde el inicio, un "sentido" a los laboratorios de la Subrea. No han quedado de lado aquellos estudiantes que ven al laboratorio simplemente como un requisito para la aprobacin del curso, y es qu mucho de lo que un estudiante puede aprovechar de un laboratorio, est ligado con la manera en cmo se lo presenten. Es por ello que ahora se inicia el Laboratorio de Bioqumica con los fundamentos que puedan crear un espritu de inters en el estudiante, esto es, algunas bases sobre las que pueda descansar el proceso de aprendizaje en el laboratorio, con la pretensin de que el estudiante se site en el contenido del Laboratorio de Bioqumica y logre contextualizar l mismo en el campo de la Agronoma. Procurando no caer en la profundizacin terica -lo cual corresponde a la teora de curso- se har una breve descripcin de lo que es una "Biomolcula", y junto a ello la identificacin de las molculas que se estudiarn posteriormente en el Laboratorio. As mismo, se aprovechar la reunin de esta semana para adelantar un poco de la Prctica 2 a fin de que no se sobrecargue de trabajo la semana asignada a dicha prctica.

2. OBJETIVOS Explicar la importancia del laboratorio de Bioqumica dentro de la Carrera de Ingeniero Agrnomo. Ubicar el trmino "Biomolcula" en la Jerarqua Organizativa de la Vida. Identificar las Biomolculas y Macromolculas que se van a trabajar en el laboratorio. Seleccionar el material vegetal que se trabajar en el laboratorio. Iniciar el proceso de preparacin del material vegetal seleccionado.

[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MATERIAL DE APOYO LAS BIOMOLCULA

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c) 3.1. La materia viva posee diversas caractersticas (15) Alguna vez estudiaste en Biologa General lo que distingue a los organismos vivos de los objetos inanimados; ahora mencionaremos uno de" estos atributos: "Un organismo vivo es estructuralmente complicado y altamente organizado. Poseen intrincadas estructuras internas (Fig. 1) y contienen muchos tipos de molculas. Ello contrasta con la materia inanimada del entorno -arcilla, arena, rocas, agua del mar que suele consistir en mezclas de compuestos qumicos relativamente simples. C4 C3

Fig. 1 corte transe versal de hoja. Observe como se aprecia la organizacin y complejidad microscpica

"Cada uno de los componentes de un organismo vivo tiene una funcin especfica. Esta afirmacin no es solamente cierta para estructuras macroscpicas como las hojas y los tallos, el corazn y los pulmones, sino tambin para estructuras intracelulares microscpicas como el ncleo y los cloroplastos". La bioqumica trata de explicar la vida en trminos qumicos (5) "Las molculas que componen los organismos vivos cumplen todas las leyes familiares de la qumica, pero tambin la interaccin entre ellas, de acuerdo con otra serie de principios a los que nos referiremos colectivamente como la lgica molecular de la vida. Estos principios son un conjunto de relaciones que caracterizan la naturaleza, la funcin, as como las interacciones de las Biomolcula. "Si los organismos vivos se componen de molculas intrnsecamente inanimadas, cmo pueden estas molculas dar lugar a la remarcable combinacin de caractersticas que llamamos vida? Cuales la razn de que un organismo vivo parece ser ms que la suma de sus partes inanimadas?

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El objetivo fundamental de la ciencia 'bioqumica es el de determinar de qu modo interactan los organismos vivos con otros los conjuntos de molculas inanimadas que constituyen los organismos vivos para mantener y perpetuar la vida. En otras palabras, la bioqumica tiene como objetivo explicar las estructuras y funciones biolgicas en trminos qumicos. Aunque la bioqumica proporciona conocimientos y aplicaciones prcticas que son importantes en medicina, agricultura, nutricin e industria, su preocupacin ltima es el prodigio de la vida misma. 3.2. Debajo de la diversidad biolgica subyace una informacin qumica (15) Por favor piense un poco en la diversidad de seres vivos que conoce. Piense en un conejo, en un caballo, en un insecto -de los que se miran en Entomologa General-, en un roble (Quercus sp), en el frijol (Phaseolus vulgaris), piense en una bacteria o un hongo (de los que se pueden apreciar al cursar Microbiologa General). Si compara cada una de las cosas en las que pens, en un principio, parece haber muy pocas cosas en comn. Sin embarg, despus de cien aos de investigacin bioqumica, resulta evidente que los organismos vivos son notablemente similares en los niveles qumico y microscpico. 3.3. Biomolculas Lehninger, Nelson y Cox (15) dicen que al comenzar el estudio de las biomolculas y sus interacciones, algunas cuestiones bsicas requieren atencin. Qu elementos, qumicos pueden encontrarse en las clulas? Qu tipos de molculas conforman la materia viva? En qu proporciones se hallan? Cmo llegaron a formar parteado ella? De qu manera las molculas presentes en las clulas vivas son especialmente adecuadas para cumplir su cometido? "Prcticamente todos los compuestos orgnicos a partir de los que se construyen los organismos vivos son productos de la actividad biolgica. Estas biomolculas fueron seleccionadas a lo largo del proceso de evolucin biolgica en razn de su idoneidad para llevar a cabo funciones bioqumicas y celulares especficas". 3.4. Composicin qumica (15) "A principios del siglo diecinueve resultaba claro para los qumicos que la composicin de la materia viva era sorprendentemente diferente de la del mundo inanimado. 3.5. La materia viva se compone principalmente en los elementos ms ligeros "Los cuatro elementos ms abundantes en loa organismos vivos, en trminos de porcentaje sobre el nmero total de tomos, son el hidrgeno, el oxgeno, el nitrgeno y el carbono, que en conjunto representan ms del 99% de la masa de la mayor parte de los clulas.

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3.6. Las biomolculas son compuestos de Carbono "La qumica de los organismos vivos se organiza alrededor del elemento carbono, que representa ms de la mitad del peso seco de las clulas. Recuerde un poco el contenido de curso de "Qumica Orgnica": "los tomos de carbono unidos covalentemente pueden formar cadenas lineales, cadenas ramificadas y estructuras cclicas y en forma de celda. A estos esqueletos carbonados se les unen otros grupos de tomos, denominados grupos funcionales, que confieren propiedades qumicas especficas a la molcula. Las molculas que contienen esqueletos carbonados unidos covalentemente se denominan compuestos orgnicos; el nmero de ellos y su variedad son casi ilimitados. La mayor parte de biomolculas son compuestos orgnicos; podemos por tanto deducir que la versatilidad de enlace del carbono constituy un factor decisivo en la seleccin de los compuestos de carbono para la maquinaria molecular de las clulas durante el origen y la evolucin de los organismos vivos"(15) 3.7. Los grupos funcionales determinan las propiedades qumicas: "Puede considerarse que la mayor parte de biomolculas son derivados de los hidrocarburos, compuestos que tienen un esqueleto de tomos de carbono unidos covalentemente a los que slo se unen tomos de hidrgeno. Los esqueletos de hidrocarburo son muy estables. Los tomos de hidrgeno pueden ser reemplazados por una amplia gama de grupos funcionales para dar lugar a las diferentes familias de compuestos orgnicos. "Muchas biomolculas son poli funcionales y contienen dos o ms tipos diferentes de grupos funcionales, cada uno de ellos con sus propias caractersticas qumicas y su reactividad propia: Los aminocidos, una importante familia de biomolculas que actan principalmente como subunidades monomricas de las protenas, contienen como mnimo dos tipos diferentes de grupos funcionales: un grupo amino y un grupo carboxlico. La capacidad de un aminocido para condensarse con otros aminocidos para formar las protenas depende de los propiedades qumicas de estos dos grupos funcionales''. 3.8. Reactividad qumica (15) . "Los hidrocarburos saturados -molculas con enlaces simples carbono-carbono y sin enlaces dobles o grupos sustituyentes- no son fcilmente atacados por la mayora de los reactivos qumicos; las biomolculas, quo pueden, poseer diversos tipos de grupos funcionales, son mucho ms reactivas qumicamente. Es posible analizar y predecir el comportamiento qumico y las reacciones de las biomolculas a partir de los grupos funcionales que contienen".

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3.9. Las macromolculas y sus subunidades monomricas (15) "Muchas de las molculas que se encuentran dentro de las clulas son macromolculas, polmeros de alta masa molecular construidos a partir de precursores relativamente simples. Las macromolculas pueden formar posteriormente estructuras supra macromoleculares, dando lugar a las unidades funcionales del tipo de los ribosomas, las membranas y los orgnulos (Ver Fig. 2) : "Las macromolculas son los constituyentes principales de los organismos. Prcticamente toda la materia slida de cualquier tipo de clulas es orgnica y se halla presente en cuatro formas: protenas, cidos nucleicos, polisacridos y lpidos. "Las protenas, largos polmeros de aminocidos, constituyen, el agua aparte, la fraccin celular mes importante; las protenas son quizs las ms verstiles de los biomolculas, en cuanto a sus mltiples funciones y propiedades. Los cidos nucleicos, DNA y RNA, son polmeros de nucletidos. Participan en el almacenaje, transmisin y traduccin de la informacin gentica. Los polisacridos, polmeros de azcares simples como la glucosa, tienen dos funciones principales: como almacn de combustibles energticos y cmo elementos estructurales extracelulares. Los lpidos, derivados hidrocarbonados grasos o aceitosos, sirven de componentes estructurales do las membranas y de reserva de combustible rico en energa, adems de cumplir otras funciones. "Las macromolculas se construyen a partir de subunidades monomricas. En las macromolculas protenas, cidos nucleicos y polisacridos el nmero de subunidades monomricas es muy grande. NOTA: Si esto ltimo le confunde un poco, no se preocupe, pues esto es lo que se ir estudiando en el laboratorio de Bioqumica. Antes de continuar, se recordar un poco de lo visto en el Curso de Biologa General, respecta a la jerarqua de organizacin de un organismo vivo. Esto servir para poder ubicar el contenido del laboratorio de Bioqumica en un contexto Agronmico, pues con esta Figura 2, es posible concatenar ideas, para ubicar el sitio de las "Biomolculas" en una planta (pilar fundamental de la Agronoma). 3.10. Existe una jerarqua en la estructura celular "Las subunidades monomricas (aminocidos, azcares simples como la glucosa, etc.), que se unen para formar las macromolculas, Son muy pequeas comparadas con las macromolculas biolgicas. Una molcula d un aminocido como la alanina tiene una longitud menor de 0.5 nm. Lo hemoglobina, la protena transportadora de oxgeno de los eritrocitos, est formada por aproximadamente 600 aminocidos unidos covalentemente en cuatro largas cadenas, que se

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pegan en forma globular y se asocian en una estructura tetramrica con un dimetro de 5,5 nm. Por su parte, las molculas de protena son pequeas en comparacin con los ribosomas (de aproximadamente 20 nm de dimetro), que contienen aproximadamente 70 protenas diferentes y diversas molculas de DNA. Los ribosomas, son a su vez, mucho ms pequeos que orgnulos cmo las mitocondrias, de dimetro aproximadamente igual a 1000 nm. Existe pues, un gran salto desde las biomolculas sencillas hasta las estructuras celulares que pueden observarse con el microscopio ptico. (Ver Fig. 2)

Fig. 2 Organizacin jerrquica en la estructura celular

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO

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1. A qu se le llama la Lgica Molecular de la Vida?

2. Cul es el objetivo fundamental de la Ciencia Bioqumica?

3. Cules son los dos niveles en los cuales los organismos vivos (por ejemplo, un roble, un insecto o un hongo) son notablemente similares?

4. En razn de qu surgieron las biomolculas a lo largo del proceso de evolucin biolgica?

5. Cules son los 4 elementos ms abundantes en los seres vivos?

6. A su juicio personal y fundamentado en lo que ha ledo, qu es lo que determina las propiedades qumicas y el comportamiento de las biomolculas?

7. Elabore una definicin propia de Biomolcula, indique qu es una macromolcula. Adems explique si a su juicio hay alguna diferencia entre ambos trminos.

8. Enumere las 4 macromolculas que se presentan en el material de apoyo a esta prctica. Adems indique cul de esas 4 es la que tiene mayor versatilidad de funciones y propiedades.

9. Seales las funciones generales de los cidos nucleicos, los polisacridos y los lpidos.

10. Esquematice lo que para usted significa la frase siguiente: las macromolculas se construyen a partir de subunidades monomricas.

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11. Para resolver este tpico piense, por ejemplo, en un conjunto formado por varios subconjuntos. Luego piense cmo la unin de estos lo hace a aqul. 12. Esquematice grficamente, de manera clara y sencilla, cada uno de los trminos sealados en la Fig. 2 del Material de apoyo de esta prctica, procurando que su esquema guarde una secuencia lgica. Por ejemplo: se le pudiera ocurrir esquematizar una hoja de Frijol como ejemplo de rgano.

13. Ordene ascendentemente (en funcin de su tamao), los trminos siguientes: rgano, subunidad monomrica, organismo vivo, complejos supra moleculares, orgnulos, tejido, macromolcula, sistema, clula.

14. Conteste con sinceridad si usted cree que ha podido ubicar el tema central de estudio de este laboratorio (biomolcula) como parte integradora de una Planta. Cree usted que al lograr esta ubicacin es posible enmarcar el Laboratorio de Bioqumica en un Contexto Agronmico? Explique. Recuerde que su Instructor de Laboratorio est para asesorarle y ayudarle a resolver sus dudas.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES A cargo de cada estudiante

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Manual de prcticas de Laboratorio de Bioqumica Cuaderno de prcticas de laboratorio.

6. METODOLOGA Revisin del fundamento terico y explicacin del instructor de laboratorio: Resolver un examen corto del fundamento terico contenido en el "Material de Apoyo". Revisin del cuestionario pre-laboratorio y solucin a interrogantes de los estudiantes. Entrega del cuestionario pre-laboratorio. Identificacin de las biomolculas y macromolculas que se estudiarn en el Laboratorio de Bioqumica Revisar de forma general el documento de laboratorio de Bioqumica, procurando identificar las biomolculas y macromolculas que se tratarn en las prcticas respectivas. Realizar un listado de las biomolculas y macromolculas que se van a trabajar en las prcticas de laboratorio. En el listado anterior, procure colocar al menos, dos ejemplos de cada biomolcula macromolcula. Seleccin del material vegetal a trabajar en el laboratorio: Al observar los objetivos de su instructivo, se ve que durante el laboratorio de Bioqumica, se va a estudiar las macromolculas. En funcin de ello, la seleccin del material vegetal estar muy ligada al contenido (en porcentaje peso/peso) de dichas molculas. El material a trabajar debe, cumplir con las caractersticas siguientes: Que lo seleccionado sea un rgano vegetal (semilla, tallo, hoja, fruto, etc.) que no posea demasiados pigmentos (como podra ser el caso del caf o el laurel). Que sea factible preparar harina de ese rgano vegetal Para la seleccin de un material vegetal especfico seguir las recomendaciones siguientes: Que se tenga un porcentaje no menor que 10%, de al menos dos biomolculas y/o macromolculas (protenas, carbohidratos, lpidos). Conocer la planta seleccionada. Tener la facilidad de conseguir la planta. Toda vez seleccionada la planta que se va a trabajar, cada sub-grupo de laboratorio, se dirigir o. su instructor para pedir por la aprobacin de la planta a trabajar. 15

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Para ello debe tener al menos dos opciones de plantas (que cumplan con lo sealado anteriormente) y presentar al instructor una pequea tabla con los datos siguientes: Nombre comn y nombre cientfico de la planta. Lugar (es) donde se le puede conseguir (nombre del almacn u otro lugar de suministro del material vegetal) Contenido, en porcentaje, de biomolculas y/o macromolculas Contenido de humedad Porcin no comestible de la planta. Inicio del proceso de preparacin de la muestra vegetal aprobada; Cuando el instructor apruebe la planta a trabajar, los estudiantes procedern a comprar el material suficiente para poder preparar una buena cantidad de harina de la muestra vegetal. De 700 gramos en adelante, de material vegetal. Cuando tengan la muestra vegetal, refirase al numeral 2.1 de la prctica 2 (en caso de semillas) y/o al numeral 2.4 de la prctica 2 (para el secado de la muestra vegetal). Luego los alumnos averiguarn el porcentaje de humedad de la muestra vegetal, utilizando el horno de conveccin (a una temperatura no mayor a 60oC). Refirase a la metodologa que se emplea en el laboratorio de la Subrea de Ciencias Biolgicas de la FAUSAC, para averiguar el contenido de humedad de la muestra vegetal. Para hacer esto puede serle de utilidad los numerales 2.1 y 2.2 del Instructivo de la Prctica 2 de este laboratorio. Anote los resultados de sus clculos en su cuaderno de laboratorio y entrguelos como parte de la Tarea No. 1. Recuerde que el material vegetal que se va a utilizar en la siguiente prctica debe llevarlo seco, para que su instructor autorice la realizacin de dicha prctica. 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO. Tarea No. 1: Usted deber entregar individualmente un trabajo corto, escrito. Para ello debe resolver y realizar aquello que est planteado, que aparecen en el Instructivo de Prctica 1. La parte prctica indicada en esos mismos ser evaluada al momento de que los estudiantes lleven su material debidamente seco, para la preparacin de la harina, en la Prctica 2.

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PRCTICA 2. PREPARACIN DE MUESTRAS VEGETALES PARA ANLISIS QUMICO SECADO, MOLIDO Y TAMIZADO DE MUESTRAS VEGETALES
1. INTRODUCCIN En el laboratorio de Bioqumica, se plantea un estudio de protenas, carbohidratos y lpidos dentro de un contexto agronmico, y es por ello que el anlisis de estas biomolculas se har en muestras de vegetales. No obstante el aplicar pruebas analticas a muestras de vegetales a alguien le pudiese parecer insuficiente para crear un contexto agronmico en cada prctica. En funcin de esto, se realiz una planificacin de actividades, la semana anterior (Prctica 1), y en esa oportunidad se pudo seleccionar aquel vegetal, que por su contenido, de al menos dos de las tres molculas biolgicas en cuestin, es adecuada para el trabajo a lo largo de todo el laboratorio. Luego cada grupo de trabajo ha conseguido una muestra suficiente de la planta escogida. As se llega a la presente reunin de laboratorio, en donde la atencin se centrar en preparar dicho material vegetal, con lo, cual se pretende proveer al estudiante de herramientas de trabajo del campo agronmico.

2. OBJETIVOS Al finalizar la prctica, el alumno deber estar en capacidad de: Preparar muestras vegetales para el anlisis a realizar en el laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC. Utilizar de manera correcta, el equipo de laboratorio utilizado en la presente prctica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MARCO TERICO

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Cuando se hace referencia a "preparar" muestras vegetales para anlisis qumico, en el contexto del laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC, se est hablando del proceso de colecta, secado, molido y tamizado de dichas muestras. Este proceso incluye la "extraccin" de los compuestos a analizar, sin embargo, esto se deja como un apartado puesto que se estar trabajando ms adelante (16) 3.1. Recopilacin botnica Es el estudio botnico de la familia o gnero de plantas a investigar con el objeto de no cometer errores en el momento de la recoleccin, pues en ocasiones hay varias plantas, miembros de familias o gneros, que por lo comn contienen las mismas sustancias de inters y debe decidirse cul planta escoger en el momento. (6) 3.2. Investigacin bibliogrfica de la planta de inters (6) Consiste en hacer un estudio exhaustivo sobre todo lo que se encuentra escrito sobre determinado gnero o familia del vegetal a investigar con el objeto de tener la mayor cantidad posible de informacin y conocer, por ejemplo, que parte de la planta es rica en ciertos constituyentes, qu tipo de constituyentes se conoce que contiene, qu parte de la planta recolectar, qu mtodo de extraccin utilizar, etc. La mayor cantidad de informacin sobre estudios qumicos en plantas y sustancias aisladas de ellas, son publicadas en revistas cientficas de muy diversa ndole, pertenecientes a las reas de Farmacia, Medicina, Agronoma, Botnica, Qumica, Zootecnia, etc.. Por lo tanto la localizacin de datos sobre un vegetal puede ser muy dificultosa. Sin embargo utilizando publicaciones de Chemical Abstrais u otros abstractos de la rama de vegetales, puede facilitarse esta bsqueda bibliogrfica. Adems, actualmente, el recurso Internet es de mucha ayuda. 3.3. Recoleccin de las muestras vegetales Segn Medinilla (lT), idealmente el anlisis qumico de muestras vegetales debera realizarse sobre tejidos vegetales frescos. Sin embargo, muchas veces la planta a estudiar proviene de lugares distantes, o quizs fue colectada en otro continente. En tales casos la planta debe ser secada antes de la extraccin de compuestos. Debe cuidarse que el material vegetal bajo estudio se encuentre libre de contaminacin con otra planta. Asimismo, es esencial emplear plantas sanas, que no estn infectadas por virus, bacterias u hongos. La razn de esto es que no solo podran detectarse productos de sntesis microbiana, sino que adems estas infecciones podran alterar seriamente el metabolismo de la planta y formarse productos inesperados, quizs en grandes cantidades (lT).

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Es necesario reconocer de antemano al vegetal a recolectar entre grupos similares de plantas, as como saber que parte o partes se van n colectar de acuerdo al inters del investigador. Es imperativo llevar a cabo una recoleccin de acuerdo a las normas establecidas para ello. (6) De la tcnica do colecta de plantas en el campo, puede obtenerse una buena referencia consultando el documento "Algunas indicaciones para la preservacin de plantas", del Herbario de la FAUSAC (13), razn por la cual no se detalla aqu. 3.4. Secado de las muestras vegetales Medinilla (17), dice: "es esencial que la operacin de secado se efecte bajo condiciones controladas para evitar que ocurran cambios qumicos en los constituyentes. Toda muestra vegetal debe secarse lo ms pronto posible, evitando usar altas temperaturas, y preferiblemente con una adecuada circulacin de aire". Segn el documento "Mtodos de Investigacin Fitoqumica" (6), el secado de muestras vegetales puede realizarse de 2 maneras: 3.4.1. Tcnica de secado al sol: Esta tcnica es la ms utilizada, debido a que no hay descomposicin de constituyentes, por lo cual es la tcnica ms recomendable. Secando sobre papel peridico cambiable cada 24 horas hasta unas 4 a 5 veces hasta la eliminacin total del agua 3.4.2. Tcnica de secado artificial: Utilizando mtodos elctricos o de cualquier otro tipo. Es necesario no calentar a temperaturas mayores de 60C que podran descomponer ciertos compuestos. En el documento del Herbario de la FAUSAC (13), dice que en el proceso de colecta de muestras vegetales, muchos buenos especmenes se pierden por pudricin. Por ello el secado de esas muestras es imperativo. En ese documento se citan tcnicas de colocacin de muestras vegetales en una "prensa", con el objeto de preservar de mejor forma la morfologa de la planta, y proveer una tcnica fcil de secado -que es lo particularmente nos interesa -. Una vez hecho el paquete en la "prensa", puede dejarse secando lejos de la intemperie y haciendo cambios constantes de papel peridico, o bien utilizando una cmara desecadora, comnmente utilizada en el herbario. 3.5. Molienda y tamizado del material vegetal Moler es reducir un cuerpo a partes menudas, o aplastarlo mucho (de aqu en adelante procuraremos no confundir este trmino con "macerar", por las razones que habrn de explicarse posteriormente). Para el caso del anlisis de las plantas en el laboratorio de Bioqumica, se realiza la molienda con el fin de homogeneizar el material a analizar, pues muchas veces, los compuestos qumicos de inters se encuentran distribuidos heterogneamente en un rgano vegetal 19

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"La molienda debe efectuarse con el material ya seco; con el objeto de reducir a lo mnimo posible el tamao de la partcula del material a utilizar. Con races o material leoso debe usarse un molino, teniendo cuidado de que la friccin producida no eleve la temperatura del sistema para evitar descomposiciones de principios activos o compuestos qumicos de inters. Cuando el material es ligero (hojas, tallos, flores, etc.) puede utilizarse un mortero manual" (1). Para el tamizado se utiliza un tamiz de 20 mallas, con el objeto de dejar pasar nicamente aquellas partculas ms pequeas y separarla de grumos que no suelen ser de inters. 3.6. Procesamiento de las semillas En el laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC suelen utilizarse semillas para el anlisis de las biomolculas de inters. Por ello debe hacerse una breve referencia de aquellas razones en las que se fundamentan algunos hechos de la metodologa del instructivo de prctica. Para principiar, se recomienda eliminar la testa de las semillas a usar, para evitar que exista una interferencia de pigmentos (13). Sin embargo, esto se hace en funcin de que con el anlisis a realizar en este laboratorio, se pretende acercar al estudiante al estudio cuali-cuantitativo de biomolculas, y no se pretende hacer un anlisis detallado de todas las molculas para cada parte de la planta a utilizar. Es bueno hacer referencia a la definicin de testa. Testa es la capa exterior de la semilla, y suele conocerse vulgarmente como la "cascara" de la semilla. Algunas veces es difcil de eliminar (por ejemplo en el frijol negro, Phaseolus vulgaris) y por ello se recomienda hacer un remojo de no ms de 25 minutos para esa eliminacin. Lo que sucede es que la testa no es impermeable y permite el paso de agua hacia su interior, provocando que los tejidos internos de la semilla (endospermo y embrin) absorban agua y se hinchen, facilitando de tal manera la eliminacin de la testa.

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 2 1. A qu se refiere la "preparacin de muestras vegetales" para anlisis qumico, dentro del contexto de laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC?

2. Cul es la importancia de hacer un recopilado botnico y una investigacin bibliogrfica de la planta de inters?

3. Por qu debe cuidarse que el material vegetal bajo estudio debe estar sano?

4. Qu documento se le recomienda aqu para la colecta y secado de material vegetal?

5. Por qu razn la operacin de secado debe hacerse bajo condiciones controladas?

6. En qu consiste la tcnica de secado artificial de muestras vegetales

7. Explique por qu cree que se hace la molienda del material vegetal.

8. Qu es la testa de una semilla?

NOTA Cada grupo de trabajo debe traer, para la realizacin de esta prctica, lo siguiente: La muestra vegetal que se puso a secar das antes de la presente prctica, segn lo estipulado por el Instructivo de\ Prctica I. Esta muestra debe estar debidamente seca para no: daar el equipo de laboratorio, por ello su instructor revisar esto al inicio de la prctica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES Preparar el rea de trabajo del rea de trabajo: 01 Mortero y 01 pistilo (1 marceador) 02 esptulas 01 Becker de 600 ml 01 balanza mono plato Papel peridico 01 tamiz de 20 mallas A cargo del da de laboratorio: 01 horno de conveccin Papel encerado Etiquetas auto adhesivo Tijeras Masking tape

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 6. METODOLOGA

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6.1. Preparado de la semilla a secar (si tuviera testa) Remojar las semillas en agua durante un perodo mximo de 30 minutos. Iniciar la eliminacin de la cscara de forma manual o con el auxilio de alguna otra tcnica. Investigue las tcnicas utilizadas en el secado de semillas.

6.2. Secado de la semilla. Pesar aproximadamente 900 gramos de semilla ejemplo garvanzo. Colocar las semillas en las bolsas de papel y colocarlos en hornos de conveccion a una To menor a 60 OC durante 48 h Elaborar bolsal de papel periodico y perforarlos para que tenga ventilacion. Pregunte a su instructor de laboratorio sobre la manera adecuada de manejar el horno de conveccin.

6.3. Molienda de la muestra vegetal. Con la ayuda de un mortero y un pistilo se procede a moler aproximadamente 600gramos. de la muestra vegetal. Debe de tener especial cuidado en daar el mortero, por lo que debe de hacerse sin despegar demasiado el pistilo. Anote en su cuaderno de laboratorio la cantidad exacta que peso con su grupo de trabajo.

Auxiliandose del molino tipo Wiley, muele el material previamente macerado, para obtener una muestra fina. NOTA: si el material utilizado para obtener la harina, es demasiado dura, como la semilla de soya, inicie de una sola vez con molturacin del material en los molinos disponibles, sin una previa molturacin en el mortero y pistilo.

6.4. Tamizado de la muestra vegetal molida Tamizar la muestra vegetal, molida previamente, con un tamiz de 20 mallas, Coloque el tamiz sobre el recipiente donde colectara la muestra tamizada Agregue pequeas muestras de material vegetal molido y mueva constatemente el tamiz, evite utilizar la mano o algun material para forzar el paso de la muestra vegetal por el tamiz

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6.5. Almacenamiento de la muestra vegetal preparada para analisis quimico.

Determinar la cantidad de harina obtenida. Fabrique uno o varios paquetes de papel encerado, utilizando tijeras y masking tape. Guardar la harina obtenida, en el(los) paquete(s) de papel encerado. Identificar claramente la harina preparada por su grupo de trabajo. Almacene esta harina en un lugar limpio y seco. Nota: Debido a que la mayora de grupos de trabajo utilizarn "semillas" de la planta de inters, la metodologa que se describirn ser para ese rgano vegetal. En caso de utilizar otra parte de la planta, consultar con su instructor de laboratorio. 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO. Tarea No. 2: Usted deber entregar individualmente un trabajo corto, escrito. Para ello debe resolver y realizar aquello que est planteado para el reporte. 8. PARA INCLUIR EN EL REPORTE DE PRCTICA: Reporte la cantidad de semilla utilizada para preparar harina. Reporte la cantidad de harina obtenida Reporte el porcentaje de prdida en el proceso de preparacin de harina. Trate de indicar las razones de prdida de harina. Indique qu cuidados especiales debern aplicarse a la harina en su almacenamiento. 9. INVESTIGAR Por qu debe eliminarse la testa de las semillas que se utilizaren como muestras vegetales para el anlisis en este laboratorio? Refirase a documentos de Tecnologa de Semillas" o dirjase al rea Tecnolgica (Subrea de Manejo y Mejoramiento de Plantas) y pregunto sobre quien puede asesorarle en este tpico. Por qu se utiliza ms la "tcnica de secado al sol" que la de "secado artificial", en la preparacin de muestras vegetales para anlisis qumico? Por qu es necesario calentar las muestras vegetales a temperaturas menores de 60 0C en la tcnica de secado artificial? Cul es la razn de efectuar la "molienda" con material vegetal seco?

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PRCTICA No. 3 EXTRACCIN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTENAS EN MUESTRAS VEGETALES


1. INTRODUCCIN El contenido proteico es un componente de los anlisis bromatolgicos que se realizan en cultivos para evaluar su calidad nutricional o para evaluar el efecto, en este aspecto, de algn tratamiento practicado (16). Para el estudio de las macromolculas, en este laboratorio, han de realizarse pruebas analticas (cuantitativas y cualitativas). Dichas pruebas estn diseadas para llevarse a cabo en medio acuoso. Es por ello que en esta prctica de laboratorio se prepararn soluciones salinas y acuosas de protenas a travs del proceso de "Extraccin de Protenas" indicado ms adelante. Con la finalidad de no confundir al estudiante en su proceso de aprendizaje, en esta prctica se pretende dar a conocer cmo caracterizar a la macromolcula "Protena", sin profundizar, todava, en las subunidades monomricas que le componen. As que se detendr, por el momento, en el estudio a travs de dos pruebas de caracterizacin de protenas, que son: La Prueba de Biuret y la Prueba de Metales Pesados. Es necesario mencionar, que el estudio cuantitativo de protenas se realizar en una prctica posterior, a fin de evitar que se sobresature el contenido de prcticas de laboratorio siguientes.

2. OBJETIVOS Al finalizar la prctica el estudiante deber estar en capacidad de: Efectuar extraccin salina y extraccin acuosa de las protenas de una muestra Vegetal. Efectuar la prueba de Biuret para la deteccin de protenas y/o pptidos (de al menos dos enlaces peptdicos), en los extractos. Efectuar la prueba de "Precipitacin Proteica por Metales Pesados" para la deteccin de protenas en los extractos. Utilizar adecuadamente el equipo y cristalera de laboratorio empleado en la presente prctica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MARCO TERICO.

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3.1. Protenas La importancia de las protenas fue reconocida a comienzos del S. XIX por Mulder (1838): En las plantas y animales hay presente una sustancia que sin duda es la ms importante entre las sustancias conocidas de los seres vivos, y sin ella, la vida sera imposible en el planeta. Esta sustancia se llama protena. El nombre protena atestigua la importancia que sematribuye a esta clase de biomolculas". (19) Bohinski (2) dice lo siguiente: "Cada protena es nica en trminos de estructura y funcin. No obstante, tambin existen numerosas semejanzas entre las protenas. Su caracterstica ms comn es que todas son polmeros formados por aminocidos, que son loa monmeros que se unen en forma covalente unos a otros en secuencia mediante lo que se llama un enlace peptdico. La estructura resultante, que tiene forma de cadena, recibe el nombre de polipptido, o simplemente pptido. Cuando un polipptido consta de 50 o ms residuos (unidades) de aminocidos (un mnimo arbitrario) ya se considera una protena". Como dicen Lehninger, Nelson y Cox (15), casi todo lo que sucede en la clula requiere la intervencin de una o ms protenas. Las protenas proporcionan estructura, catalizan reacciones celulares y llevan a cabo una multitud de tareas. Su papel central en la clula queda reflejado en el hecho que la informacin gentica se expresa en ltimo trmino en forma de protenas. En una clula tpica existen miles de protenas diferentes, cada una codificada por un gen y encargada de realizar una tarea especfica. Las protenas se encuentran entre las macromolculas biolgicas ms abundantes y son tambin extremadamente verstiles en sus funciones. Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en el interior de las clulas, pues constituyen el 50% o ms de su peso seco. Las protenas ocupan una posicin central en la composicin y en funcionalismo de la materia viva. Las actividades fsicas y qumicas que constituyen la vida de la clula estn catalizadas por enzimas, las cuales son todas de naturaleza proteica (19). 3.2. Extraccin proteica La visin bioqumica general sobre la estructura y funcin de las protenas proviene del estudio de muchas protenas individuales. Los mtodos de separacin de protenas aprovechan las propiedades tales como la carga, tamao y solubilidad, que varan en una y otra protena (15). La Extraccin de Protenas tiene que ver mucho con su solubilidad en diversos compuestos. Dado que muchas protenas se unen a otras biomolculas, las protenas tambin se pueden separar en base a sus propiedades ligantes. La fuente de una protena es

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generalmente un tejido o clulas microbianas. Las clulas deben romperse liberando la protena en una solucin denominada extracto crudo. Protena: del griego protos, primero. Mulder en 1838 introdujo esta palabra con el sentido de "de primer orden, o sea, la sustancia ms importante de la materia viva, Para el caso particular de los laboratorios de Bioqumica de la FAUSAC, interesa la extraccin acuosa y la extraccin salina. Se suelen preparar soluciones de protena a razn de 5 g. de protena por litro de solvente. La casena se disuelve en un poco de NaOH (6N), la albmina, gelatina y peptona se disuelven en solucin salina (NaCl 0.2N) (19) 3.3. Composicin de las protenas En la prctica siguiente, se ver cmo las protenas se conforman a partir de aminocidos. El objeto de colocar aqu, un poco sobre "composicin de Protenas", es para tocar un poco lo de la solubilidad de las protenas y con ello comprender un poco mejor el tema de la "Extraccin de Protenas". Segn Lelninger (15), del aislamiento de muchas protenas en forma pura y cristalina, se ha aprendido que todas contienen carbono, hidrgeno, nitrgeno y oxgeno, y casi todas tambin azufre. Asimismo, hay protenas que contiene elementos adicionales, como fsforo, hierro, zinc y cobre. Lehninger(15) y Bohin.ski(2) coinciden en que las protenas se dividen en dos clases principales basndose en su composicin: Protenas simples y Protenas conjugadas. 1. LAS PROTENAS SIMPLES: son aquellas que por hidrlisis producen solamente aminocidos, sin ningn otro producto principal, orgnico o inorgnico. Comprenden los siguientes grupos: Albminas: Solubles en agua, coagulan por el calor y precipitan con las soluciones salinas saturadas. Globulinas: Solubles en soluciones diluidas de sales de cidos y bases fuertes (NaCl por ejemplo); insolubles en agua pura o en soluciones salinas de mediana concentracin; coagulan por el calor. Glutelinas: Solubles en cidos y lcalis diluidos; insolubles en los solventes neutros; coagulan por el calor. Ejemplo: glutelina del trigo. Prolaminas: Solubles en alcohol de 70 a 80%; insoluble en alcohol absoluto, en agua y en otros solventes neutros. Ejemplos: la zena del maz y la gliadina del trigo. Albuminoides: Solubles en todo solvente neutro y en cidos y lcalis diluidos. En este grupo entran las protenas de sostn. Ejemplo: queratina, colgeno. Histidias: Solubles en agua y en cidos muy diluidos; coagulables por el calor. Predominan los aminocidos bsicos.

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Protaminas: Poli pptidos bsicos, solubles en agua predominan aminocidos bsicos en su estructura; precipitan a otras protenas. Se encuentran principalmente en las clulas huevo.

2. Las PROTENAS CONJUGADAS son aquellas que por hidrlisis producen no solamente aminocidos, sino tambin otros componentes orgnicos o inorgnicos (esta porcin no aminocido, de una protena conjugada se denomina grupo prosttico). Las protenas conjugadas pueden subdividirse de acuerdo con la naturaleza qumica de sus grupos prostticos, y pueden identificarse as: Nucleoprotenas: Compuestos formados por una o varias molculas de protena unidas al cido nucleico. Glucoproteas: Compuestos que tienen carbohidratos como grupos prostticos. Ejemplo: la mucina. Fofoprotenas: Compuestos con un radical que contiene fsforo que no sea ni un fosfolpidos ni cido nucleicos. Ejemplo: la casena. Cromoprotenas: Compuestos conjugados con un grupo cromforo. Ejemplos: hemoglobina, citocroruo y flavoproienas. Lipoprotenas: Poseen grasas neutras (triglicridos) u otros lpidos tales como fosfolpidos y colesterol. Metaloprotenas: Resultan de la unin con un metal. Flavoprotenas: Tienen una flavina como grupo prosttico. De vez en cuando pueden estar presentes dos o ms grupos prostticos idnticos o diferentes. 3.4. Configuracin (forma) de las protenas Segn la forma o estructura tridimensional de las protenas, estas pueden ser: fibrosas y globulares. Las protenas fibrosas tienen formas moleculares muy alargadas. Como dicen Sniith y Woocl(19), son insolubles en medio acuoso. Dentro de ellas encontramos: Cartlagos, tendones, cabello, seda, exoesqueleto de los insectos, etc... Las protenas globulares son ms compactas que las fibrosas; en general son ms solubles que las protenas fibrosas. Incluyen la mayora de enzimas, muchas hormonas y otros como los anticuerpos (2,19). 3.5. Extraccin salina de las protenas Segn White, et.aL (20), las sales pueden disminuir o aumentar la solubilidad de una protena. El efecto salino haciendo mayor la cantidad de protena disuelta se conoce como salling-in, o solubilidad por salado.

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Como usted recordar, del contenido terico de la Qumica General II, la solubilidad de cualquier sustancia depende de la afinidad relativa entre la correspondiente a las molculas del soluto entre s y la existente con las molculas del solvente. Como dicen White et.al. (20): "Cualquier factor que disminuya las interacciones entre las molculas del soluto tender a aumentar la solubilidad. En el efecto salling-in, los pequeos iones de las sales neutras interaccionarn con los grupos inicos de las molculas proteicas, disminuyendo la interaccin proteica y, por tanto, favoreciendo la solubilidad". 3.6. Reacciones de color de protenas (20) An cuando todas las protenas son. Compuestos formados por aminocidos unidos por enlaces peptdicos, estas sustancias presentan variaciones considerables en sus propiedades qumicas y biolgicas. Las protenas reflejan las propiedades qumicas do los aminocidos que estas contienen en su estructura. Muchas de las reacciones de color de las protenas dependen de la presencia de un aminocido en su molcula. 3.7. Prueba de precipitacin proteica con metales pesados

Esta prueba permite detectar la presencia de protenas. La precipitacin de las protenas se llama "desnaturalizacin". En ella hay prdida de la actividad biolgica de la molcula. La desnaturalizacin puede ser causada por: a) agentes fsicos o b) por agentes qumicos. La prueba se basa en que no todas las protenas son igualmente sensibles a los agentes desnaturalizantes y esta propiedad puede usarse para remover ciertas protenas de una mezcla. A pH 7 o por encima de l, las protenas estn usualmente cargadas negativamente, as que la adicin de metales cargados positivamente neutraliza la carga y la protena precipita. La precipitacin por metales pesados es, por lo tanto, ms efectiva a valores de pH neutros o ligeramente alcalinos, pero la solucin no puede ser muy alcalina porque se corre el riesgo de que se precipiten hidrxidos de los metales. El precipitado es frecuentemente soluble en exceso de iones de metal pesado, ya que tal exceso confiere a las partculas, cargas positivas estables.

Figura 3: Resultados de prueba de nitrato de plata, as como la reaccin.

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Figura 4: Resultados de la prueba de (CH3COO)2Pb Fuente: Marvin Pec.

3.8. Biuret El ion cobre formar un complejo con las protenas de una manera similar al que forma con el amonio. El complejo en el caso de las protenas es rojo o violeta, y azul en el caso del amonio. La prueba es positiva cuando la muestra analizada posee, al menos, dos enlaces peptdicos (tripptidos, polipptidos y protenas); esto quiere decir que los aminocidos y los dipptidos dan una prueba negativa de Biuret. La sustancia ms simple que tiene dos uniones peptdicos es el Biuret (NH2CONHCONH2) y esta es la razn por la cual esta reaccin lleve el nombre de Biuret.

C HN

C NH HC Cu2+ C

R O

CH C

R O

HN R CH

NH HC R

Figura 5: Resultados de prueba de Biuret y figura que muestra la interaccin entre cobre y aminocidos

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 3 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Elabore una definicin propia de: protena. Cules son los cinco elementos que se encuentran ms comnmente en las protenas? Cmo pueden clasificarse las protenas segn su "composicin"? Cul es la diferencia entre una protena simple y una protena conjugada? Mencione tres protenas simples que sean solubles en agua. De una definicin de grupo prosttico. Mencione al menos tres compuestos que pueden, existir corno grupos prostticos, en las protenas. Qu tipo de protena -segn su configuracin- es ms "soluble"? Las fibrosas o las globulares? A qu se refiere la "solubilidad por salado" o salting-in? A qu se le llama "desnaturalizacin" de protenas? A pH 7 o por encima de l, las protenas precipitan cuando se les adicionan metales pesados. Por qu? Adems, por qu en esta reaccin la solucin no debe estar demasiado alcalina?

11. Qu caracterstica debe tener un compuesto para dar positiva la prueba de Biuret? 12. Indique el cambio que evidencia un resultado positivo para la prueba de "Metales Pesados" y para la prueba de "Biuret".

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES A cada del grupo de trabajo: Balanza mono plat 2 Becker de 150 ml. 2 erlenmeyer de 50 ml. 1 anillo de hierro 1 esptula 12 tubos de ensayo

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A cargo del da de laboratorio: Centrfuga manual 2 varillas de agitacin Probeta de 25 ml 1 plancha agitadora 1 embudo plstico 1 soporte universal Agua destilada Solucin de Biuret [0.2M 1 estufa elctrica Papel parafilm No. 42 Papel encerado 2 probetas de 10 ml. 1 piceta 4 tubos de ensayo c/tapn de rosca-1 pinza p/tubo de Solucin NaCl 10.2N] Solucin Acetato de Pb Refrigeradora Papel filtro Whatman Centrifugadora Solucin de HCl (6N) 1 beacker de 500 mL Solucin de Sulfato Cu [0.2M] 1 gradilla de metal 2 tubos p/centrfuga Etiquetas autoadhesivas Solucin Nitrato de Hg 10.2M Centrifugadora

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6.1. EXTRACCION ACUOSA DE PROTEINAS a. Mida dos (2) gramos de harina de la muestra a estudiar, en el beacker de 150 mL b. Aada 25 mL de agua destilada. c. Mezcle, durante 5 minutos, utilizando un agitador magntico, o bien agitando manualmente. d. Reposar la mezcla por tres minutos y Agite, nuevamente, durante cinco minutos.
Centrifugacion. e. Centrifuge la suspensin durante diez minutos, utilizando una centrifugadora manual, que encontrar en un locker de grupo, o bien la centrifugadora elctrica de la Subrea de Ciencias Qumicas.

f. Decante y filtre el sobrenadante, utilizando papel Whatman No. 42. Colecte el lquido filtrado en un erlenmeyer de 50 ml Identifique el erlenmeyer de 50 mL con su nmero de grupo, da y jornada de laboratorio g. Devuelva al beacker de 150 ml el sedimento resultante del proceso de centrifugacin. h.Repita una vez mas la metodologia descrita del 6.1. a al 6.1. f para obtener una mayor cantidad del extracto. y lo obtenido colocarlo en el erlenmeyer anterior, y este constituira el Extracto acuoso

Mida en con una probeta de 25 ml la cantidad de Extracto obtenida.


i. Selle el erlenmeyer que contiene el extracto, utilizando papel parafinado y/o papel parafilm. j. Almacene este extracto en una refrigeradora de la Subrea de Ciencias Qumicas. k. Indique la cantidad obtenida de Extracto Acuoso

6.2. EXTRACCION SALINA DE PROTEINAS


a. Coloque el residuo de la extraccin acuosa en un beacker de 100 ml. b. Agregue 25 mL de solucin de NaC1 0.2N, al residuo de la extraccin acuosa c. Repita la metodologia del 6.1 b al 6.1 g

d. Agregue otros 25 mL de la solucin de NaCl 0.2 N al residuo anteriormente tratado y repita la metodologia del 6.1. b al 6.1 f Repita los pasos de los incisosos 6.1 i al 6.1. k Indique la cantidad de obtenda de extracto salino

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA PRUEBAS DE CARACTERIZACIN DE PROTENAS

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El siguiente cuadro, es una gua para el estudiante para que sepa qu muestras se van a analizar con cada prueba, en esta prctica. CUADRO 1. Resumen de pruebas cualitativas, protenas.
PRUEBA

a realizar a soluciones patrones y extractos de

METALES PESADOS
MUESTRA A ANALIZAR

BIURET

Extracto Acuoso Extracto Salino Peptona Albumina Casena Gelatina NOTA: Las soluciones patrn (peptona, albmina, casena y gelatina) son protenas. Estas soluciones se utilizan para que el estudiante tenga cuatro "testigos" de resultados positivos en cada prueba. En otras palabras, estas soluciones sirven para poder observar como es el resultado positivo para cada una de estas pruebas.

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6.3. PRUEBA DE PRECIPITACION PROTEICA.


a. Tome 6 tubos de ensayo limpios y secos. b. En cada tubo de ensayo, por separado, coloque 2 mL de muestra a analizar. Ver el Cuadro 1, presentado anteriormente, para ver cules son las 6 muestras a utilizar. c. dentifique los tubos de ensayo para evitar confusiones en el manejo de los mismos.

d. A cada muestra aada 6 gotas del metal pesado que se le ha indicado. e. Agite cada uno de los tubos de ensayo. (como metal pesado puede
utilizarse "sulfato de cobre", "acetato .de plomo" o "nitrato de plata" con una concentracin 0.2M c/u)

f. observe los resultados y anote en su cuadernode laboratorio

6.4. PRUEBA DE BIURET. a. Tome 6 tubos de ensayo limpios y secos. b. En cada tubo de ensayo, por separado, coloque 1 mL de muestra a analizar. (Vea el Cuadro 1, presentado anteriormente, para ver cules son las 6 muestras a utilizar.) c. Identifique loa tubos de ensayo para evitar confusiones en el manejo de los mismos. d. A cada muestra aada de 20 a 35 gotas del reactivo de Biuret.

Si usted quisiera saber preparar el reactivo de Biuret, dirjase a su instructor de laboratorio, a la Coordinacin de la Subrea o a la "Bodega de Cristalera y Reactivos". As puede obtener una copia dla metodologa necesaria para dicha preparacin.

e. Agite cada uno de los tubos de ensayo. f. Si no se observa un color violeta o rojo, djelos reposar durante 10 o 15 minutos. La coloracion es positiva si es como la del tubo de ensayo No. 1 Al terminar de utilizar los extractos gardarlos en refrigeradora.

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7. EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO. La metodologa de evaluacin tambin incluye un Informe de prctica. Este informe puede hacerse en parejos o individualmente, y debe incluir: Cartula RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS Resultados de prctica. Estos se presentan segn las siguientes indicaciones: Para los resultados de los numerales 6.1 y 6.2 de la metodologa, solamente resuelva lo que se le indica en los "cuadritos negros" que all aparecen. Para los numerales 6.3 y 6.4, primeramente debe presentar un cuadro de resultados pura cada prueba: Siga el modelo indicado en el Cuadro 2. CUADRO 2. Resultados de la prueba de BIURET con las cuatro soluciones patrn y los dos extractos de protenas. MUESTRA ANALIZADA Extracto Acuoso Extracto Salino Peptona Albmina Casena Gelatina REFERENCIA: Coloracin = color observado como resultado de la prueba Dictamen = prueba positiva (+) o negativa (-). Adems del cuadro anterior, para los numerales 6.3 y 6.4, debe incluir el anlisis y explicacin de los dos cuadros de resultados, a fin de establecer la presencia o ausencia de protenas en cada muestra problema. (Para el caso de la explicacin que se le pide, haga nfasis sobre si hay concordancia de los resultados prcticos con el fundamento terico. Si no hubiese tal concordancia, plantee una justificacin valida). COLORACIN OBTENIDA DICTAMEN

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Resuelva los "cuadros" que aparezcan en su metodologa (6.3 y 6.4); debe presentarlos tambin, intercalados con los resultados, y anlisis de resultados. Esto puede servirle tambin como una gua para ou anlisis de resultados. 8. PARA INCLUIR EN EL INFORME EN LA DISCUSIN Qu es una solucin patrn? Qu utilidad encontrada con el uso de este tipo de soluciones en la presente prctica? De la extraccin de protenas: Cul cree que es (son) la(s) razn(es) para realizar dos tipos de extraccin de protenas? Cuntos tipos de "extraccin de protenas" existen y cules son? En qu se diferencian estos tipos de extraccin? Qu tipo de protena -segn su configuracin- es ms "soluble"? Las fibrosas o los globulares? En funcin de ello qu tipo de protena -segn su configuracin- habr en mayor cantidad en sus "Extractos de protenas"? Esquematice (utilice dibujos sencillos: No se complique) el procedimiento general para extraer protenas de una muestra vegetal. Sugiera usted el solvente para extraccin (agua o solucin salina) En qu se basa la prueba de Precipitacin proteica por metales pesados? Qu resultado indica una prueba positiva en esta prueba? Qu se logra identificar con esta prueba? En qu se basa la prueba de Biuret? Qu resultado indica una prueba positiva en esta prueba? Qu se logra identificar con esta prueba? Haga un listado de los tipos de protenas que se pueden extraer con Agua. (Vea la parte Composicin de las Protenas" de su material de Apoyo a la prctica) Haga un listado de los tipos de protenas que se pueden extraer con Solucin salina. (Vea la parte "Composicin de las Protenas" de su material de Apoyo a la prctica) A qu se refiere la solubilidad por salado o "salting in"? Qu tiene que ver con esta prueba de la prctica?

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PRCTICA 4 ESTUDIO DE AMINOCIDOS DE MUESTRA VEGETALES


1. INTRODUCCIN En la prctica anterior se ha efectuado el estudio cualitativo de protenas de una muestra vegetal. Esta vez el estudio recae en las unidades que componen a las protenas; usted recordar que en la prctica 1 se mencion que las protenas se construyen a partir de aminocidos, los cuales son las subunidades monomricas que se unen para formar esas macromolculas. Tal como se ver ms adelante, pueden obtenerse aminocidos libres a partir de la hidrlisis de protenas. Esto es, entonces, la primera parte de esta prctica, la hidrlisis de protenas; luego, mediante el anlisis de los hidrolizados, se habr de comprobar si la hidrlisis de las protenas fue o no fue completa. El desarrollo de esta prctica contina con un estudio cualitativo de los hidrolizados obtenidos; es este el momento en que el estudiante de laboratorio centrar su atencin en los aminocidos y podr detectar su presencia/ausencia. Esta prctica es una de las ms que necesita ms tiempo para su realizacin. A s que deben emplearse al mximo las dos horas de laboratorio y en caso de no poder terminar con la metodologa de prctica, se tendr que trabajar en otro momento, acordado por el instructor y los estudiantes, dentro de la semana asignada para esta prctica. 2. OBJETIVOS: Al finalizar la prctica, el estudiante deber estar en la capacidad de: Efectuar la hidrlisis cida e hidrlisis alcalina de protenas extradas de la muestra vegetal. Determinar la presencia o ausencia de aminocidos en hidrolizados de protenas. Determinar la presencia o ausencia de aminocidos con ncleo aromtico, en hidrolizados de protenas. Determinar la presencio o ausencia de aminocidos fenlicos, en hidrolizados de protena. Determinar la presencia o ausencia de thioaminocidos, en hidrolizados de protena. Determinar la presencia o ausencia de aminocidos con grupo imidazol, en hidrolizados de protenas. Utilizar soluciones patrn, para obtener resultados positivos que acten como testigos en cada prueba de esta prctica. Utilizar adecuadamente el equipo y cristalera de laboratorio empleado en la presente prctica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MARCO TERICO.

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La hidrlisis proteica es el proceso de rompimiento del enlace peptdico con lo que se producen ppticos y/o aminocidos libres. La hidrlisis proteica puede ser de tres tipos: cida, alcalina o por enzimas (10,15) La hidrlisis con cido o base no es especfica y existen algunos aminocidos que sufren modificaciones o pueden ser destruidos. Mediante la hidrlisis enzimtica es posible romper los enlaces peptdico entre residuos de aminocidos especficos. La hidrlisis es un proceso fundamental para llegar a determinar la secuencia de aminocidos que conforman la estructura primaria de la protena. (15). Hidrlisis de las protenas mediante cido: (De Harper (10) y Lehninger (15)): la mayora de las protenas son completamente hidrolizadas hasta sus aminocidos constituyentes calentando a 110oC durante 20 a 70 horas en HCL 6N. La hidrlisis se realiza en un tubo cerrado. El hidrolizado resultante contiene los aminocidos en forma de clorhidratos. Sin embargo, no todos los aminocidos de un pptido o de una protena determinada se recuperarn cuantitativamente. Esto quiere decir lo siguiente: Todo el triptfano y cantidades variables se serina y treonina son destruidos. Los grupos amida de la glutamina y la asparagina resultan hidrolizados, con produccin de los cidos glutmico y asprtico y de iones amonio. Hidrlisis de las protenas por lcali: esta se usa para recuperar el triptfano y la tirosina, los cuales no se destruyen por hidrlisis alcalina. Sin embargo, la hidrlisis alcalina provoca la destruccin de la arginina, la cistina, la serina y la treonina; todos los aminocidos son racemizados. Por ello el mtodo se emplea para la determinacin por separado del triptfano, que es estable a la calefaccin con bases. (10,15) 3.1. Aminocidos Anteriormente se cit a Bohinski (2) para conocer que la caracterstica ms comn de las protenas es que todas son polmeros formados por aminocidos. Este autor dice que los aminocidos son monmeros que se unen en forma covalente unos a otros en secuencia mediante lo que se llama un enlace peptdico, y dan por resultado una estructura que tiene forma de cadena; esa estructura recibe el nombre de polipptido, o simplemente pptido. Cuando un polipptido consta de 50 o ms residuos (unidades) de aminocidos (un mnimo arbitrario) ya se consideran una protena. El primer aminocidos que se aisl de una protena fue la glicina (del griego glykis, dulce, pues la sustancia tiene cierto sabor dulce); la obtuvo Braconnot, en 1820, al hidrolizar la gelatina con

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cido sulfrico diluido, en un intento de averiguar si la gelatina, como la celulosa, producira un azcar por hidrlisis. Durante un perodo de 50 aos, el aislamiento de aminocidos a partir de hidrolizados de protena era una cuestin de azar, ms que un problema de investigacin sistemtica (10). A partir de estos bloques unitarios, los aminocidos, los diferentes organismos pueden fabricar productos tan diversos como enzimas, hormonas, anticuerpos, la protena del cristalino del ojo, antibiticos, venenos de hongos y muchas sustancias con actividades biolgicas distintas (15) 3.2. Estructura de los aminocidos caractersticas generales Se sabe que existe alrededor de 300 aminocidos diferentes de origen natural. Muchos de ellos solo se observan en determinadas formas de vida, y algunos solo aparecen en una especie. Sin embargo, todos los organismos usan solo 20 de ellos para la biosntesis de protenas, lo que constituye un notable ejemplo de la unidad bioqumica en la biosfera (2). Como seala Lehinger, Nelson y Cox (15), debido a que cada uno de esos aminocidos tiene una cadena lateral propia que determina sus propiedades qumicas, se puede considerar a este grupo de 20 molculas precursoras como el alfabeto en el que est escrito el lenguaje de la estructura proteica . Las clulas pueden producir protenas con propiedades y actividades claramente diferentes uniendo los mismos 20 aminocidos en multitud de combinaciones y secuencias distintas. Como dice Bohinski (2) y White & Handler (18), casi todos los aminocidos (salvo la Prolina y la hidroxiprolina) son alfa-aminocidos pues tienen un grupo amino (-NH2) y Un grupo carboxilo (COOH) unidos al mismo tomo de carbono, llamado alfa.

Cada aminocido posee propiedades nicas debido a la variacin en la estructura de los Grupos R (el grupo R se refiere a la cadena lateral del aminocido). Lehninger, Nelson y Cox (15) dicen que algunos aminocidos son mucho menos frecuentes q otros. Por ejemplo, muchas protenas poseen relativamente pocos restos de Histidina y de triptfano. 3.3. Reacciones qumicas de los aminocidos Alfa-amino ms caracterstica y ms ampliamente utilizada es la reaccin de la Las reacciones qumicas de los aminocidos son las de sus grupos funcionales, es decir, las de los grupos alfacarboxilo y alfa-amino, as como las de los grupos funcionales presentes de las cadenas laterales.

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Una de las reacciones del grupo ninhidrina, que puede utilizarse para valorar los aminocidos cuantitativamente en cantidades muy pequeas (15) 3.4. Solubilidad de los aminocidos La naturaleza del radical R de los aminocidos, puede ser, por un lado, hidroflico o Hidrofbico y, por otro, acida, bsica o neutra. Fieser y Fieser (10) sealan que como los aminocidos contienen simultneamente grupos carboxilo y amino, se comportan como sustancias anfteras que se ionizan como cidos y como bases. En el laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC, se acostumbra preparar soluciones patrn de aminocidos a razn de 1g de aminocidos por litro de agua destilada. Para disolver los aminocidos hay que considerar si estos son cidos, bsicos o neutros. As: los aminocidos se disuelven en agua y agregando unas gotas de HCl 1N; por otro lado los aminocidos bsicos se disuelven agregando, al agua, unas gotas de NaOH6N. Los aminocidos neutros se disuelven simplemente en agua (5, 16). Esto de aminocidos cidos, neutros o bsicos depende del grupo R de los aminocidos. Para profundizar en ello se recomienda referirse al captulo 5 de Lehninger, Nelson y Cox (15) 3.5. Protenas vegetales y nutricin humana (18) Salisbury y Ross (18) sealan lo siguiente: seres humanos y otros animales dependen de los vegetales para obtener muchos de sus aminocidos, por lo que la composicin protenica de semilla, hoja y tallo es importante para la dieta. Nosotros y otros animales, utilizamos estos aminocidos para formar nuestras propias protenas y como fuente alimenticia ( de energa ). Aunque los humanos adultos podemos sintetizar la mayor parte de los aminocidos que necesitamos, a partir de carbohidratos y diversos compuestos orgnicos nitrogenados, hay ocho aminocidos que debemos obtener del alimento. Estos son: leucina, isoleucina, valina, lisina, metionina, triptfano, fenilalanina y treonina. Adems parece que slo se pueden formar cantidades adecuadas del aminocido azufrado Cistenas cuando se dispone de suficiente metionina (otro aminocido azufrado ), y Utilizamos la fenilalanina para sintetizar tirosina, que de lo contrario tambin seria Esencial en la dieta. La mayor parte de las protenas en la dieta humana provienen de semillas, en especial granos de cereales como maz, trigo y arroz. Una contribucin menor, pero an importante, la hacen semillas de leguminosas como frjol, chcharo y soya.

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Comparados con casi cualquier protena animal, las protenas de los granos de cereal tienen bajo contenido de lisina, mientras que las semillas de las leguminosas tienen bajo contenido de metionina. Los agricultores estn logrando algunos avances con la introduccin de especies nuevas o hibridas con mayor contenido protenico y mayores porcentajes de aminocidos esenciales.
Cuadro 3. Contenido proteico y composicin de aminocidos de algunos cereales y Leguminosas.

3.6.

PRUEBAS DE CARACTERIZACIN CUALITATIVA DE AMINOCIDOS: (5,16)

a) Prueba de la ninhidrina: Esta prueba se utilizar en este laboratorio para la deteccin de aminocidos. Al reaccionar la Ninhidrina, un agente oxidante poderoso, con cualquier alfa aminocido a un pH entre 4 y 8 se forma un compuesto azulado o violeta. Con la prolina o Hidroxiprolina, que poseen un grupo amino libre, el color producido es amarillo.

Fig. 6. Reaccin de Ninhidrina

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA b) Prueba de sanger:

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En solucin dbilmente alcalina, el 1-fluor-2,4-dinitrobenceno (FDNB) convierte cualquier aminocido en su derivado 2,4 dinitrofenicado, por sustitucin de un hidrogeno del grupo-amino en un grupo 2,3-dinitrofenilo. En esta prueba, el desarrollo de un precipitado amarillo denota la presencia de aminocidos.

Fig. 7. Reaccin de Sanger

c) Prueba xantoproteica: Los aminocidos que poseen un ncleo aromtico forman nitro derivados de color amarillo cuando se calientan con acido ntrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja. Por lo tanto, el aparecimiento de color naranja, en esta prueba, denota la presencia de aminocidos aromticos. Las protenas que contienen triptfano, tirosina, y fenilalanina, dan prueba positiva. Esta prueba la realizan inadvertidamente los estudiantes cuando derraman cido ntrico sobre su piel.

Figura No. 8 coloracion de los extractos tanto acido como basico despues de la aplicacin de acido nitrico. Ademas de la coloracion de los patrones

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA d) Prueba de millon:

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Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el reactivo de Millon formando compuestos rojos. Los nicos aminocidos fenlicos son la tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reaccin positiva.

Fig. 9 Reaccin positiva de millon

e) Prueba del sulfuro: Los thioaminocidos reaccionan en medio alcalino con el acetato de plomo, precipitando sulfuro de plomo (de color negro) como uno de los productos.

Fig. 10 Reaccin de Sulfuro

f) Prueba del bromo: El bromo acta en medio alcalino con aminocidos que poseen el grupo imidazol (como la Histidina), provocando una reaccin de adicin al eliminar un doble enlace. El compuesto as formado posee una cloracin azul- violeta. Esto quiere decir, que cuando en esta prueba se produce un color azul-violeta, se denota la presencia de Histidina.

Figura No. 11 Reaccin del bromo.

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 4 1. Qu Es la hidrlisis proteica?

2.

Qu tipo de hidrlisis se utiliza para la determinacin por separado del triptfano? Explique.

3.

Elabore una definicin propia de: Aminocido.

4.

A qu se refiere el trmino alfa-aminocido?

5.

A qu se refiere el grupo R que poseen los aminocidos?

6.

Mencione al menos 5 productos que se pueden formar a partir de las distintas combinaciones de aminocidos:

7.

Qu grupos funcionales son los que propician las reacciones qumicas de los aminocidos?

8.

Cmo disolvera usted 3 gramos de un aminocido cuyo grupo R es de naturaleza alcalina?

9.

En la reaccin de Nihidrina Qu reaccin provoca una coloracin azulada o violeta? Cul reaccin provoca un color amarillo?

10. Explique en qu consiste la prueba de Sanger, la prueba Xantoprotica, la prueba de Millon, la prueba de Sulfuro y la prueba del Bromo.

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11. Investigue a que se refieren los trminos: aminocido fenolico, thioaminoacido, y aminocido con grupo imidazol. Consulte a su instructor de laboratorio, a su catedrtico de curso o en alguno de los libros que se le sugieren como bibliografa del curso.

12. Cules son los 8 aminocidos que los adultos debemos obtener del alimento?

13. Refirase al cuadro 1 del material de apoyo de esta prctica. Observe los aminocidos que all se le presentan. Diga cules de ellos se trabajarn en esta prctica (vea cuadro 2 que est en el instructivo de practica).

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES A cargo del grupo de laboratorio: Extracto acuoso Extracto salino Muestra desconocida 4 beackers de 50 Ml 2 varillas de agitacin 1 pizeta 4 tubos grandes con tapn de rosca 1 gradilla de metal grande 4 frascos con gotero para cada una de las siguientes soluciones: NaOH (1N), NaOH(GN), HCl(6N), Y HCl(1N). 30 tubos de ensayo 2 gradillas de metal 2 pinzas p/tubo de ensayo 1 estufa elctrica 2 probetas de 10 mL 1 beacker de 500 mL 1 beacker de 100 ml Frasco gotero identificado para cada una de las siguientes soluciones: Nihidrina, FDNB, Millon, NaNO2 1 % y acetato de plomo 2%

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A cargo del auxiliar de laboratorio 1 estufa elctrica colocada en una campana de gases 1 beacker de 500 mL Recipiente de polietileno con solucin NaOH (6N) Agua destilada Etiquetas autoadhesivas Gotero de pico de gallo con acido ntrico (ubicado en campana de gases) Gotero pico de gallo con acido sulfrico (ubicado en lavadero de laboratorio) Gotero pico de gallo con solucin de bromo (ubicado en campana de gases) Gotero pico de gallo con carbonato de Amonio (ubicado en campana de gases) Solucin de HCl (6N) Solucin HCl Autoclave Mechero de Meckler Manguera de hule Trpode para autoclave Rollos de papel pH Potencimetros (medir pH).

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 6. METODOLOGA.

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6.1. HIDRLISIS CIDA DE PROTENAS: a. Coloque 8 mL de extracto acuoso en tubo de ensayo con tapn de rosca. b. Agregue 12 mL de HCl (6N) c. Coloque el tapn en el tubo de ensayo y cierre (tal como le indica el instructor) d. Identifique este tubo con tapn de rosca, con la letra A e. Repita los pasos del 6.1a al 6.1c, utilizando extracto salino en lugar de extracto acuoso. f. Identifique este tubo con la letra B 6.2. HIDROLISIS ALCALINA a. Coloque 8 mL de extracto acuoso en un tubo de ensayo con tapn de rosca. b. Agregue 12 mL de NaOH(1N) c. Coloque el tapn en el tubo de ensayo (tal como le indica el instructor) d. Identifique este tubo con la letra C. e. Repita los pasos 6.2a al 6.2c, utilizando extracto salino en lugar de extracto acuoso. f. Identifique este tubo con la letra D. 6.3. UTILIZACION DEL AUTO CLAVE a. Toda vez que tenga identificados los tubos con las letras A, B, C y D (adems de una sea que identifique que pertenece a su grupo de trabajo) proceda de la siguiente manera: b. Agregue agua de chorro hasta la marca lmite del autoclave. c. Coloque los 4 tubos en la gradilla que est en el autoclave. d. Cuando su instructor le autorice, cierre el autoclave hermticamente. e. Coloque el autoclave sobre un trpode metlico, cuidando que no exista peligro de caerse. f. Encienda el mechero Meckler y aplique calor al autoclave. g. Procure mantener la temperatura del autoclave en un rango de 212 F a 228 F.
h. Para mantener la temperatura regule el flujo de calor y utilice la vlvula para liberar presin del autoclave. Al usar la vlvula tenga cuidado porque esta estar caliente. i. Mantenga el autoclave a esa temperatura por un periodo no menor a 15 minutos, ni mayor a 20 minutos. j. Libere la presin del autoclave con la vlvula, esperando hasta que no observe mas salida de vapor de agua. k. Asegrese que la presin marca 0 y abra la tapa del autoclave. l. Saque los tubos con tapn de rosca que sean de su grupo.

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NEUTRALIZACION DE LOS HIDRILIZADOS Las pruebas de caracterizacin deben realizarse a un pH neutro o no mayor a 8. Por ello ahora se pretende neutralizar los hidrolizados. Importante es mencionar que aunque aqu se han de neutralizar los hidrolizados, aqu se les seguir llamando hidrolizado acuoso acido (A), hidrolizado salino acido (B), hidrolizado acuoso bsico (C) e hidrolizado salino bsico (D). Proceda as: Tome los cuatro tubos (A, B, C y D) que saco del autoclave y coloque su contenido en cuatro erlenmeyers de 50 ml identificados con la letra respectiva (A, B, C y D). Aqu tenga cuidado de no confundir o revolver los hidrolizados que efectu en los nmeros 6.1 y 6.2 de este instructivo

6.4. NEUTRALIZACION DE LOS HIDROLIZADOS ACIDOS a. A los hidrolizados de los erlenmeyers A y B agregue 11.8 ml de solucin de NaOH 6n. b. Corte en varias tiritas, una tira de papal pH con una tijera c. Proceda a medir el pH de los hidrolizados de los erlenmeyers A y B d. Si el pH es 7 o al menos no es mayor que 8 pase al numeral 6.7 Si no sucede esto siga como se le indica: e. Agregar gota a gota solucin de NaOH 1N, hasta obtener un pH neutro f. Siga conforme el numero 6.7 NOTA: para agilizar el procedimiento, en vez de utilizar papel pH, se deben de utilizar los potencimetros, teniendo el cuidado debido con los bulbos y el aparato completo.

6.5. NEUTRALIZACION DE LOS HIDROLIZADOS BASICOS a. A los hidolizados de los erlenmeyers C y D agregar 11.8 ml de solucin de HCL1n. b. Corte en varias tiritas, una tira de papal pH con una tijera c. Proceda a medir el pH de los hidrolizados de los erlenmeyers C y D d. Si el pH es 7 o al menos no es mayor que 8 pase al numeral 6.7 Si no sucede esto siga como se le indica: e. Agregar gota a gota solucin de HCL 1N, hasta obtener un pH neutro 6.6. COMPROBACION DE LA HIDROLISIS COMPLETA O NO Realice la prueba de Biuret para cada uno de los cuatro hidrolizados. Siga la metodologa indicada en la practica 3 de este laboratorio , utilizada como solucin patrn nicamente la albumina.

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NOTA IMPORTANTE TODO LO QUE SOBRE DE EXTRACTO DE PROTENAS DEBE SER ALMACENADO NUEVAMENTE EN REFRIGERACIN, PARA SER UTILIZADO EN LA PRCTICA 5 PRUEBA DE CARACTERIZACIN CUALITATIVA DE AMINOCIDOS El cuadro siguiente es una gua para el estudiante para que sepa que muestras se van a analizar en las pruebas de esta prctica. Cuadro 4. Resumen de pruebas cualitativas, a realiza a soluciones patrones e hidrolizados de protenas y muestra desconocida.
PRUEBAS MUESTRAS A ANALIZAR Hidrolizado acuoso bsico Hidrolizado acuoso acido Hidrolizado salino bsico Hidrolizado salino bsico Muestra desconocida SOLUCIN PATRN Lisina Triptfano Tirosina Leucina Histidina Cistena Fenilalamina

Ninhidrina

Sanger

Xantoproteica

Milln

Sulfuro

Bromo

TOME EN CUENTA LA LIMPIEZA DE LA CRISTALERA PARA LA REALIZACIN DE ESTAS PRUEBAS EN LA PRESENTE PRCTICA

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6.7. PRUEBA DE NINHIDRINA:


a.Tome 12 tubos de ensayo b. coloque en cada tubo, por separado, 1ml de muestra a analizar. "Tome como referencia lo indicado en el cuadro 4, para saber cuales son las doce soluciones a utilizar". c. Identifique los tubos de ensayo para evitar confusiones en la toma de resultados. d. Aada a cada tubo de ensayo 10 gotas de reactivo fresco de NINHIDRINA. "Al hacer referencia de reactivo fresco se considera el hecho de que este reactivo no debe de tener mas de una semana de haber sido elaborado, por lo cual hay que asegurarse que cumpla con este hecho". e. Agite el tubo de ensayo. f. Coloque todos los tubos en bao mara, durante 3 minutos. g. Observe los resultados y anote en su cuaderno de laboratorio.

6.8. PRUEBA DE SANGER:


a. Tome 12 tubos de ensayo, b. Coloque por separado , 1ml, de la muestra a analizar. "Tome como referencia lo del cuadro 4 para saber cuales son las 12 muestras a analizar". c. Identifique los tubos para evitar confusiones, en la toma de resultados. d. Aada a cada tubo de ensayo 3 gotas de NaOH 6N. e. Aada a cada tubo 10 gotas de reactivo de FDNB. "Tenga mucha precaucin en el manejo del reactivo FNDB, puesto que es un reactivo peligroso". f. Agite los tubos de Ensayo. g. Observe los resultados y anote en su cuaderno de laboratorio.

6.9. PRUEBA XANTOPROTEICA: a. Tome 8 tubos de ensayos limpios y secos.


b. Coloque en cada uno de los tubos, por separado, 2 ml de la muestra a analizar. Tome como referencia lo indicado en el Cuadro 4, para saber cules son las 12 soluciones a utilizar. c. Identifique los tubos de ensayo para evitar confusiones en la toma de resultados. d. Aada a cada tubo, 5 gotas de acido ntrico (HNO3) concentrado. Este reactivo lo encontrara en la campana de extraccin de gases. Tenga cuidado al manipularlo. e. Aada a cada tubo, 3 gotas de acido sulfrico (H2SO4) concentrado. Este reactivo lo encontrara en uno de los lavaderos del laboratorio. Tenga cuidado al manipularlo. f. Agite los tubos de ensayo y Coloque los tubos de ensayo en bao mara, durante 3 minutos. h. Observe los resultados y anote en su cuaderno de laboratorio. Una prueba positiva denota un color naranja.

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6.10. PRUEBA DE MILLN: a. Tome 6 tubos de ensayo limpios y secos. b. Coloque en cada uno de los tubos, por separado, 1 ml de la muestra a analizar. Tome como preferencia lo indicado en el Cuadro 4, para saber cules son las 12 soluciones a utilizar. c. Identifique los tubos de ensayo para evitar confusiones en la toma de resultados. d. Agregue a cada tubo, 5 gotas de reactivo de milln y agite los tubos de ensayo. f. Caliente los tubos de ensayo en bao de agua hirviendo, por 10 minutos. g. Deje enfriar a temperatura ambiente, durante 9 o 10 minutos. h. Agregue, a cada tubo de ensayo, 5 gotas de solucin de nitrito de sodio (NaNO2 [1%]) i. Observe los resultados y anote en su cuaderno de laboratorio. 6.11. PRUEBA DE SULFURO: a. Tome 6 tubos de ensayo limpios y secos. b. Coloque en cada tubo uno de los tubos, por separado, 1ml de la muestra a analizar. Tome como referencia lo indicado en el Cuadro 4, para saber cules son las 12 soluciones a utilizar. c. Identifique los tubos d ensayo para evitar confusiones en la toma de resultados. d. Agregue a cada tubo, 4 gotas de NaOH [6N]. e. Aadir a cada tubo, 10 gotas de acetato de plomo 2%. f. Agite los tubos de ensayo. g. Caliente los tubos, en bao de Mara, de 3 a 5 minutos. Con ms intensidad que las otras pruebas realizadas, para poder observarse de una forma correcta los resultados. h. Anote los resultados observados. 6.12. PRUEBA DEL BROMO:
a. Tome 6 tubos de ensayos limpios y secos. b. Coloque en cada uno de los tubos, por separado, 1 mL de muestra a analizar. "Tome como referencia lo indicado en el cuadro 4, para saber calcule cuales son las 12 soluciones a utilizar. c. Identifique los tubos de ensayo para evitar confusiones en la toma de resultados. d. Dirjase hacia la campana de extraccin de gases. e. Agregue, a cada tubo de ensayo, 5 o 6 gotas de solucin de bromo. f. Deje reposar durante 10 minutos. g. Agregue, a cada tubo de ensayo, 2 ml de carbonato de amonio 2 %. Este reactivo tambin se encuentra en la campana de gases, caliente los tubos en bao de mara. h. En la estufa elctrica, que encontrara en la campana de gases, caliente los tubos en bao de mara durante 5 minutos.

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7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA: Responda, como trabajo post laboratorio, las cuestiones siguientes: Usted observa en el cuadro 4 una serie de cheques ( ) que le indican que prueba realizarle a cada muestra o solucin patrn. Para cada una de las muestras o soluciones patrn, justifique por que se le deben realizar las pruebas sealadas por los cheques. Ejemplo: Porque en la lisina se van efectuar solamente las pruebas de la Ninhidrina y la Sanger. Qu es una solucin patrn? Por qu se utiliza? Haga un listado de las soluciones patrones que se usaran en cada prueba. Qu utilidades(es) ha encontrado en el uso de soluciones patrn? Qu es la hidrlisis proteica? Esquematice de forma sencilla el procedimiento general para realizar hidrlisis a una solucin extracto de protenas. En qu consiste la hidrlisis proteica mediante acido? En qu consiste la hidrlisis proteica de lcali? Para que se utiliza ese tipo de hidrlisis? A su criterio Cul es la razn de mantener la temperatura de la autoclave en un rango que no sobrepase los 228 F? Investigue en que otros lugares de la Facultad de Agronoma existen autoclaves. Adems indique si hay diferencias entre los autoclaves que encontr. Indique el procedimiento general para detectar, visualmente, la presencia del triptfano en una muestra recin colectada de granos de cebada. (si usted plantea que se debe efectuar hidrlisis, indique y justifique cual utilizara, la acida o la alcalina). Cul es la utilidad de la prueba Biuret? Qu se logra identificar con esta prueba? Qu le indicara un resultado negativo de esta prueba? y un resultado positivo? Para la comprobacin de una hidrlisis completa debe hacer una comparacin entre el resultado obtenido para cada hidrolizado en dos pruebas que son la de Biuret y la de la Ninhidrina. Diga si la siguiente explicacin es falsa o verdadera, justifique su respuesta: Se tiene una solucin X a la cual se le han aplicado las metodologas de hidrlisis. Esta solucin ha dado positivo la prueba de Biuret, y un resultado negativo en la prueba de la Ninhidrina. Por eso podemos decir que en la solucin X hemos identificado solamente aminocidos y por lo tanto estaremos hablando de una hidrolisis completa de protenas. Utilizando los resultados de la Ninhidrina y de Biuret de cada uno de los hidrolizados y justificando su respuesta indique si cada una de las hidrlisis fue o no fue completa. De una razn vlida para la aplicacin de la prueba de Biuret y de la Ninhidrina como comprobante de hidrlisis proteica completa. (En otras palabras, Por qu se usa Biuret para ver si hubo o no una hidrlisis completa de protenas?)

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Para Ninihidrina, Sanger, Xantoproteica, Millon, Sulfuro, bromo colocar lo siguiente. En que se basa esta prueba? Qu expresa para usted un resultado positivo da la prueba? Que se logra identificar con esta prueba. 8. EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRELABORATORIO. La metodologa de evaluacin tambin incluye un informe de prctica. Este informe puede hacerse en parejas o individualmente, y debe incluir: Cartula 9. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS PARA EL REPORTE Resultados de prctica. Estos se presentan segn las siguientes indicaciones: Para los resultados de los numerales 6.1, 6.2, 6.3 y 6.4 solamente debe resolverse los cuadritos negros que aparezcan all. Posteriormente presente resueltos los cuadros negros que aparezcan en la metodologa (numerales 6.5 al 6.10). Procure colocar el titulo de cada pareja de respuestas (es decir el titulo del numeral). Para los resultados de los numerales 6.5, 6.6, 6.8, 6.9 y 6.10, tambin debe presentarse un cuadro de resultados para cada Muestra Problema, (hidrolizado acuoso acido, hidrolizado salino acido, hidrolizado acuoso bsico, hidrolizado salino bsico y Muestra desconocida). Loa cuadros deben seguir el siguiente modelo

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CUADRO 5. Cuadro de resultados de las pruebas realizadas a la muestra de HIDROLIZADO ACUOSO ACIDO: NOMBRE DE LA PRUEBA Biuret Ninhidrina Sanger Xantoproteica Millon Sulfuro Bromo pH COLORACIN DICTAMEN

REFERENCIA: pH = VALOR EN NUMERO Coloracin = color observado como resultado de la prueba Dictamen = prueba positiva (+) o negativa (-). OJO: Utilice como criterio de dictamen, los resultados obtenidos con las soluciones patrn. Procure Intercalar Los Resultados De Cada Muestra Con Su Anlisis respectivo. Toda vez presentados estos resultados, se realizara un anlisis y explicacin de cada cuadro, a fin de establecerla presencia o ausencia de aminocidos en cada muestra problema. Si sus resultados se lo permiten, tambin debe indicar el nombre o nombres posibles de aminocidos identificados. Para el caso de la explicacin que se le pide, haga nfasis si hay concordancia, plantee una justificacin valida. Compare los resultados de sus muestras problemas con los resultados con las soluciones patrn y tener otro criterio de anlisis. Como una gua de anlisis le recomienda utilizar la solucin a los cuadritos negros que aparecen para cada parte de la metodologa.

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PRCTICA No. 5 ESTUDIO DE AMINOCIDOS, CROMATOGRAFA DE AMINOCIDOS Y ESPECTROFOTOMETRA.


1. INTRODUCCIN Esta semana, continua es estudio de aminocidos y protenas. Son prcticas de aplicacin frecuente en los laboratorios de anlisis de bioqumica y hoy se pretende que el estudiante tenga un contacto con estas prcticas. Debido a lo extenso de la metodologa de las prcticas pasadas, estas molculas biolgicas no se han podido estudiar de una sola vez y por ello se emplea una semana ms. La cromatografa es una tcnica que sirve para separa, identificar y a veces purificar una mezcla compleja de solutos solubles en un solvente comn. Esta semana se utilizara esta tcnica para que el estudiante tenga un contacto con esta alternativa de anlisis cualitativo de sustancias en este caso con aminocidos. Por ende tratara de enlazarse lo obtenido con la cromatografa. La continuacin al estudio de protenas se hace desde un punto de vista cuantitativo y para ello se utiliza una tcnica denominada Espectrofotometra.

2. OBJETIVOS Al finalizar la prctica, es estudiante deber estar en capacidad de: Utilizar la tcnica Cromatografa en Capa Fina como parte del anlisis cualitativo de aminocidos de la muestra vegetal. Utilizar Espectrofotometra en la cuantificacin de protenas extradas de la muestra vegetal.

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3. MATERIAL DE APOYO CROMATOGRAFA (11) La cromatografa es una tcnica que sirve para separar identificar y a veces purificar una mezcla compleja de solutos solubles en un solvente comn. Como dice Gaxiola (11), una mezcla de sustancias que van a ser separadas se aplica en solucin a un medio de sostn. Este puede ser papal, una capa de slice, o una columna rellena de resina absorbente o de intercambio inico. La prueba consiste en que se deja correr por el medio de sostn un solvente revelador y dicho solvente lava junto con el la mezcla de las sustancias aplicadas previamente. En el proceso, las diferentes molculas de la mezcla son arrastradas por el lavado a distintas velocidades, resultando en su separacin. En la mayora de los mtodos cromatogrficos la separacin est basada en un proceso de reparto mltiple o uno continuo de absorcin desorcion, aunque en la prctica existe una combinacin de ambos, dominando ms o menos uno y otro tipo. El grado de la separacin depende de cuatro fuerzas que operan independientemente una de la otra. Estas son: (1) la velocidad de flujo del solvente, (2) la solubilidad de las sustancias en el solvente, (3) los efectos de fraccionamiento, y (4) los efectos de absorcin. Los dos primeros factores son responsables de la movilizacin de la mezcla de sustancias a travs del medio de sostn y los dos ltimos factores con responsables del retardo del movimiento de la mezcla a travs del medio de sostn. El flujo del solvente es el mismo para todas las sustancias presentes en la mezcla. Si todas las sustancias fueran completamente solubles, no habra separacin. No obstante, por fortuna es muy raro que las sustancias tengan la misma solubilidad en cualquier solvente. Consecuentemente, si la sustancia es muy soluble, tendera a movilizarse a travs del medio de sostn y aparecer en el frente del solvente en movimiento. Por otra parte, si es relativamente insoluble, tendera a permanecer en su punto de origen. Por lo tanto, uno de los factores primordiales que determinan la separacin cromatogrfica es la combinacin de la solubilidad y del flujo del solvente. Los otros factores, los factores retardants, son igualmente importantes y merecen alguna discusin. Hay cuatro tipos principales de procedimientos cromatogrficos, cada uno de los cuales est basado en ciertos principios fsicos. Ellos son: (1) cromatografa por fragmentacin; (2) cromatografa por absorcin; (3) cromatografa por intercambio inico, y (4) cromatografa con filtracin en gel. En la cromatografa de absorcin existe, como mnimo, un sistema de tres componentesabsorbente, medio de elusin (disolvente) y compuesto cromatografado. El comportamiento cromatogrficos depende tanto del absorbente como del medio de elusin. Entre los absorbentes ms utilizados en la cromatografa en la capa fina, se encuentran los xidos, xidos hidratados y sales. Los ms comunes son la gel de slice (silicagel) y el oxido de aluminio (almina).

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3.1. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (11)

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La cromatografa en capa fina es una tcnica muy utilizada en la actualidad, por su gran rapidez y versatilidad. Tambin se conoce como cromatografa en columna abierta o cromatografa en pelcula delgada. Es una tcnica donde la separacin ocurre sobre una capa delgada de adsorbente que est adherida a un soporte inerte, generalmente vidrio. Se pueden usar variedad de adsorbentes, desde la gel de slice o la almina hasta la celulosa la cual la separacin es similar a la cromatografa de papel. Se diferencia de la hecha en papel porque la separacin ocurre ms rpido, las manchas son ms discretas y compactas, y se pueden usar reactivos detectores corrosivos sin daar el substrato o el adsorbente. El disolvente utilizado para la separacin se mueve sobre esta capa fina, ya sea hacia arriba, por capilaridad (cromatografa ascendente) o hacia abajo, por gravedad (cromatografa descendente). La separacin de sustancias se basa en sus caractersticas de polaridad. Por consiguiente, una sustancia polar se mover muy lentamente con relacin al frente del disolvente, mientras que una sustancia no polar se mover ms rpido. Bajo ciertas condiciones experimentales, el movimiento de una sustancia en particular es constante, con respecto al movimiento del frente de un disolvente determinado. Esta constante se llama valor Rf y se define como:

3.1.1. ACTIVACIN DE LAS PLACAS: Antes de que se puedan usar las placas, generalmente deben ser calentadas para retirar el agua que acta como una impureza y evita una buena separacin. Con frecuencia el agua est firmemente ligada al adsorbente, por lo cual se debe calentar la placa fuertemente. La magnitud del calor depende del tipo de separacin que se requiere. Para compuestos hidroflicos o polares, el secado al aire o con un secador de pelo son generalmente adecuados; pero para los compuestos hidrofbicos o no polares es necesario un calentamiento ms intenso. Las placas de almina o silicagel con adhesivo requieren ser secadas al aire durante aproximadamente 30 minutos y despus ser activadas en un horno a 10C (nunca arriba de 105C) alrededor de 30 minutos. Las placas de xido de aluminio y de silicagel sin adhesivo requieren secado al aire durante 1.5 a 2 horas y ser activadas en el horno a 120C durante aproximadamente 60 minutos. 3.1.2. APLICACIN DE LA MUESTRA: La muestra se aplica en solucin con una micro pipeta o con tubo capilar en cantidades de aproximadamente 5 micro litros. Esto asegura que la mancha no se extienda. Una mancha ideal tendr ms o menos 5 mm de dimetro.

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La mancha debe ser secada tan pronto como sea posible, usando un secador de pelo (esto adems evita que la mancha se extienda). Si la solucin est diluida, se pueden repetir muchas aplicaciones en el mismo sitio una vez que la anterior se ha secado. Debe tenerse cuidado de no sobre cargar la mancha, de lo contrario se presentar el rayado (escurrimiento). Otro factor importante es que debe tenerse cuidado de no maltratar la capa delgada del adsorbente durante el manchado. Con paciencia y con prctica resulta posible no tocar la capa con el extremo de la micro pipeta (o tubo capilar) durante el manchado o el trazado de una placa para CCD. An ms, dado que la capa est adherida a su soporte inerte de vidrio o de aluminio, no es necesario usar placas de vidrio para sostener el cromatograma durante el manchado. 3.1.3. REVELADO DEL CROMATOGRAMA: Existen numerosos mtodos para detectar sustancias en los cromatogramas. Algunos de ellos usan sistemas fsicos, pero la mayora utiliza mtodos qumicos. Las tcnicas para localizar en el cromatograma sustancias, que no son visibles, se clasifican en tres categoras: a. Nebulizacin: En esta tcnica el reactivo se disemina en forma de fino aerosol sobre la cromatoplaca mediante un atomizador. Debe aplicarse en un gabinete cerrado (campana de extraccin de gases) para gases y para vapores a fin de evitar que el reactivo penetre en el laboratorio. Si sta se hace muy cerca del papel o la cromatoplaca, se aplicar demasiado reactivo y har que se corra el cromatograma. Es preferible colocar el atomizador a 30-38 cms del cromatograma. b. Inmersin: Esta es mejor que la nebulizacin por numerosas razones, ya que no se requiere de gabinete contra emanaciones en muchos casos; es mucho ms fcil obtener una aplicacin uniforme del reactivo detector. Se necesita un recipiente (preferentemente plstico) que contenga el solvente. La cromatoplaca se pasa uniformemente dentro del solvente de inmersin y se cuelga para que se seque. c. Exposicin a gas o vapor: Est requiere equipo especial y por ello no se trata aqu. 3.1.4. PRESERVACIN DE LOS CROMATOGRAMAS DE CAPA DELGADA: Con la mayora de las placas rociadas con cido, o con reactivos que producen colores que se desvanecen con rapidez (como la ninhidrina), no slo es difcil almacenarlos como referencia, sino que tambin resulta caro, ya que las placas de vidrio se pueden volver a usar. Tan pronto como se seque un cromatograma rociado, las manchas debern ser delineadas con un lpiz afilado o con un alfiler y se deben rastrear. Debido a que los colores tienden a desteirse despus de algn tiempo, es recomendable hacer una copia del original tan pronto como sea posible.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3.2. ESPECTROFOTOMETRA (9)

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Uno de los mtodos fisicoqumicos ms empleados en anlisis bioqumico es el de la medida de la absorcin o emisin de energa radiante. La gran difusin de esta tcnica es consecuencia de: 1. El amplio intervalo de longitudes de onda o de frecuencias de energa radiante y sus diferentes modos de interaccin con la materia. 2. La existencia en el mercado de instrumentos de medida cada vez ms precisos. 3. Las ventajas inherentes al mtodo. La energa radiante se define como la energa transmitida en forma de radiacin electromagntica. Esta energa puede ser absorbida, transmitida, reflejada y refractada por muchas sustancias en diferentes estados de agregacin (slido, lquido, disolucin, gas), si la radiacin incidente tiene una longitud de onda apropiada. En espectrofotometra, la energa que incide sobre una muestra, es una radiacin monocromtica (energa radiante de una sola longitud de onda, o por razones prcticas, una banda muy estrecha de longitudes de onda). Las medidas de la radiacin transmitida se realizan mediante aparatos muy sensibles como el espectrofotmetro. Un espectrofotmetro consta de una Fuente de radiacin; Dispersor de longitud de onda (prisma de cuarzo o de vidrio o de NaCl); Lentes; Clulas espejos; y un Detector (Fotomultiplicador). (Vea figura 1) Cuando se encuentra un sistema coloreado o un color producido en una reaccin, es preciso una investigacin para desarrollar una determinacin espectrofotomtrica adecuada del constituyente, para lo cual es necesario hacer una seleccin de la longitud de onda analtica. 3.2.1. NATURALEZA DE LA ABSORCIN DE ENERGA RADIANTE El espectro de la energa radiante, contado a partir de la de menor longitud de onda (o, lo que es lo mismo, e la de ms alta frecuencia), incluye los rayos csmicos, las radiaciones gamma, los rayos X, la regin del ultravioleta, la regin de la luz visible, la zona del infrarrojo y l regin de las ondas de radio. Tanto los tomos como las molculas pueden adoptar varios estados electrnicos o diversos niveles de energa. La absorcin de energa involucra la transicin de los electrones a niveles energticos ms elevados; cuanto ms larga es la longitud de onda de la radiacin absorbida, menor es la transformacin energtica por esa absorcin. Ahora bien, estas son normas generales, vlidas para todos los casos, pero cuando se pretende interpretar con ms detalle los fenmenos de absorcin, las cosas se hacen bastante ms complicadas, especialmente en el caso de las molculas orgnicas.

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3.2.2. LEYES DE LA ABSORCIN DE LA ENERGA RADIANTE Estas Leyes hacen referencia a las relaciones existentes entre la magnitud de la absorcin de energa radiante y la cantidad de la sustancia absorbente. Para un sistema absorbente (solucin) dado, a una longitud de onda concreta y con una determinada intensidad de la energa incidente, hay dos variables que influencian la intensidad de la absorcin: la concentracin del absorbente y el espacio recorrido por la radiacin energtica a travs de la solucin. La ley de Beer, expresa la absorcin de un rayo de energa radiante, efectuada por un absorbente determinado, en las siguientes condiciones: a) Se supone que la energa radiante es monocromica (es decir, con una longitud de onda nica). b) El medio es homogneo o istropo (es decir, su ndice de refraccin es idntico en todas direcciones). c) La absorcin del solvente es despreciable. d) No hay asociacin ni disociacin de las molculas absorbentes. e) No existe reaccin entre el absorbente y las molculas del solvente. La ley de Beer afirma que, si se cumplen esos requisitos, la absorcin, A, es directamente proporcional a la concentracin del absorbente y a la longitud del trayecto recorrido por la energa radiante a travs de la solucin. De aqu se puede escribir: Donde: A1: Absorcin de una solucin problema (de la que se quiere averiguar la concentracin) A2: Absorcin de una solucin patrn de concentracin conocida. C1: Concentracin de la solucin problema C2: Concentracin de la solucin patrn (estndar) Esta es una frmula que se aplicara en esta prctica de laboratorio, a pesar de que las lecturas de un instrumento determinado espectrofotmetro- pueden variar significativamente en el curso de unas pocas semanas a consecuencia del desgaste de sus componentes, puesto que todo esto no representan un problema cuando se calculan los resultados deducindolos de la comparacin de la absorcin del problema con la de un patrn (9).

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La dificultad es grave, en cambio, cuando hay que deducir los resultados a partir de valores establecidos de absorcin, sea por no disponer de patrones, sea por no resultar practico analizar un patrn simultneamente con cada problema o grupo de problemas (9). 3.3. PROCEDIMIENTO A REALIZAR EN ESPECTROFOTOMETRA (9)

3.3.1. DETERMINACIN DEL ESPECTRO DE ABSORCIN Este se estudia en el espectrofotmetro la disolucin del constituyente que se analiza, despus de desarrollado el color, determinndose su espectro de absorcin. La longitud de onda seleccionada es normalmente una, a la que la diferencia entre la absorbencia del compuesto coloreado y el reactivo sea mxima. Aunque la longitud de onda conseguida no sea muy sensible, debe ser segura.1 3.3.2. BLANCO DE REACTIVOS Generalmente cuando se hace una determinacin con un problema, se hace una lectura similar sustituyendo la solucin problema por agua o por el o los reactivos que sirvan para detectar la sustancia problema. Esta ltima lectura es la del blanco de reactivos y sirve para determinar la absorcin de la solucin problema no derivada de la sustancia cuya concentracin se trata de medir si no de los reactivos en s. En esta prctica la absorcin en blanco se debe a la razn que se explica seguidamente: En esta prctica se utilizara la prueba de Biuret para detectar la sustancia problema de nuestro inters: Protenas. Piense en el reactivo de Biuret. Es de color azul recuerda? Cuando se utiliza este reactivo para detectar protenas, y medir su concentracin, sucede que la lectura en espectrofotmetro es la suma del color del reactivo de Biuret mas el color de la sustancia problema. Por ello se hace necesario hacer una correccin. Al colocar el espectrofotmetro en absorcin 0 (100% transmitancia) con agua u otro solvente, entonces la lectura del problema corresponde a la absorcin del problema en si mas la del blanco de reactivos. Se lee luego el blanco de reactivos, frente al mismo solvente empleado antes y el valor de esta ltima se resta a la absorcin de la solucin problema (extracto de protenas). El valor de absorcin que ahora se tiene, representa presumiblemente, la absorcin debida a la sustancia que se trata de determinar, siempre, que no existan sustancias que interfieran en la calibracin. 3.3.3. USO ADECUADO DE LAS CUBETAS La conservacin de las cubetas exige que se les trate correctamente. Hay que evitar hacerles ralladuras o ponerlas en contacto con sustancias qumicas capaces de alterar sus caractersticas pticas. Por lo tanto no se deben usar, para limpiarlas, ni acido sulfrico concentrado, ni tampoco soluciones fuertemente alcalinas. Lo ms conveniente es un

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detergente de actividad moderada (no excesivamente alcalino) o, tambin, algn solvente orgnico. Las superficies pticas deben limpiarse con un trozo de tejido blando con papel para limpiar los cristales de la guas, y no deben tocarse con los dedos mientras se hacen las lecturas.

Figura No. 12 Espectrofotmetro utilizado en el laboratorio de bioqumica. Fuente: MPH Referencia: Bausch & Lomb, Modelo Spectronic 20 1. Escala de lectura 2. Luz piloto 3. Escala de longitud de onda 4. Control para seleccionar la longitud de onda 5. Control de intensidad de luz 6. Interruptor de corriente y control de cero 7. Compartimiento de la muestra

4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 5 1. Qu es la cromatografa? En qu consiste esta prueba? 2. Cules son las 4 fuerzas que determinan el grado de separacin de sustancias en la cromatografa? 3. A qu tipo de procedimiento cromatogrfico pertenece la cromatografa fina (esta se usara en la prctica)? 4. Cul sera el comportamiento de una sustancia relativamente insoluble, en un proceso de separacin cromatografa? Qu sucedera si la sustancia fuese muy soluble? 64

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5. Explique en qu consiste la cromatografa de absorcin? 6. Qu tipos de adsorbentes se pueden utilizar en la cromatografa de capa fina? 7. Qu es la activacin de de placas en la cromatografa en capa fina? 8. Enumere tres cuidados que se debe tener presentes en la aplicacin de la muestra en la cromatoplaca: 9. En qu consiste la tcnica de nebulizacin para el revelado de cromatograma? 10. Cmo se preservan los cromatogramas de capa delgada? 11. Elabore una definicin propia de espectrofotometra. 12. Para qu se utiliza espectrofotmetro? 13. Qu condiciones debe cumplir la absorcin de un rayo de energa radiante segn la Ley de Beer? 14. Qu dice la Ley de Beer? Para responder a esta pregunta puede tambin referirse a Lehninger, Nelson y Cox. 15. Trate de explicar con sus palabras lo que es un blanco de reactivos. Si se le dificulta mucho, por favor preguntarle a su instructor de Laboratorio o Catedrtico de curso.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES DE LA PRCTICA V A cargo de cada grupo de trabajo: Cromatoplaca de aluminio con slica gel Extraccin acuosa Extraccin salina Un lpiz o un portaminas de grafico 1 regla graduada 1 gradilla de metal 1 beacker de 50 ml 3 tubos capilares 1 pinza /tubo de ensayo 2 probetas de10 ml Muestra problema 1 cromatografa 9 tubos de ensayo 2 pipetas Mohr (1ml y 5 ml) 1 Kleenex

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A cargo del da de laboratorio: 1 caja de placas cromatografas de aluminio con: Slica Gel como medio de sostn. Tubos capilares Cono(s) de hilo 1 Objeto puntiagudo (navaja, clavo, etc) y/o ganchos plsticos de ropa Papel filtro Espectrofotmetro de Bausch y Lomb Modelo Epectronic 20 2 Cubetas (recipientes para lectura en espectrofotmetro) 1 mechero bunsen Solucin n-butanol, acido actico, agua 1 nebulizador de vidrio 1 manguera de hule 1 caja de Kleenex Adems las soluciones siguientes: Sulfato de sodio al 26.6 % Estndar de albumina de concentracin conocida (preparado a base de reactivo o de clara de huevo), Reactivo de Biuret, Agua destilada, Alcohol etlico, Acetona.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 6. METODOLOGA

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6.1. Cromatografa en capa fina de aminocidos Durante todo el procedimiento, evite tocar la capa de slicagel con los dedos a. El instructor de laboratorio tomara una cromatoplaca de aluminio aaacon silicagel y cortara secciones para cada grupo de laboratorio. Las medidas de la cromatoplaca cortada debern ser de 9*2 (7.6* 5 cm).

b. Tome del horno de conveccin una cromatoplaca de silicagel activa. La activacin de la cromatoplaca silicagel es una actividad que debe ser realizada por el preparador de laboratorio, en un tiempo prudencial, antes de la prctica. Esta activacin de la cromatoplaca se logra colocndola en un horno a 110oC, durante un periodo de tiempo de 15 a 30 minutos.

c. Trace, con un grafico, una lnea muy suave, paralela a la base de la cromatoplaca, a una distancia de 1.0 cm de separacin. d. Sobre esta lnea marque cuatro smbolos separados uniformemente entre si y de los bordes laterales. e. Coloque en su cuaderno de laboratorio un smbolo por muestra a analizar e identifquelo en la placa cromatogrfica.

Seleccione que muestras- va a utilizar para realizar la cromatografa. Recuerde que debe tener una muestra por cada smbolo como en la figura de la izquierda. Las soluciones a utilizar en esta prueba, son las que dieron positivo en la practica 4 de las pruebas siguientes: Xantoproteica, Sulfuro, Bromo o milln.

f. Utilizando un tubo capilar de punta fina colocar la muestra con acuidado en el punto marcado. La mancha de cada aplicacin de muestra debe tener un dimetro entre 2mm y 4mm. g. Deje secar esta aplicacin y repita hasta lograr de cuatro a cinco aplicaciones de la muestra. No permita que la mancha se esparza demasiado. Se debe ser paciente con el secado de la muestra aplicada.

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h. Utilizando un frasco de vidrio que le dar su instructor, prepare una cromatocamara agregando una capa de eluente (n-butanol, agua, acido actico en proporcin (12:3:5), con volumen suficiente para elevar el nivel del mismo unos 2 cm. por encima del fondo del frasco.

i. Coloque papel filtro mojado con el eluente (n-butanol, agua , acido actico (12:3:5) en las paredes laterales de la cromatocmara. El papel filtro de las paredes de la cromatocamara se coloca para favorecer la saturacin del ambiente interno de la cmara, con los productos voltiles del eluente. PROCURE NO SOBREPASAR LA LINEA DE APLICACIN DE MUESTRAS CON EL "ELUENTE", PARA EVITAR EL LAVADO DE LAS MUESTRAS.

La cromatoplaca se introduce con el extremo donde se aplicaron las muestras hacia abajo de forma tal que el nivel del eluente quede por debajo de la lnea de aplicacin de las muestras, como muestra la en la siguiente figura. Vista de una cromatoplaca colocada correctamente en una cromatocmara.

j. Cierre hermticamente la cromatocamara, y permita el desarrollo de la prueba (tipo ascendente) de 30 a 40 minutos. Si no lo ha hecho, ahora puede ser el momento justo para iniciar la prueba de ESPECTROFOTOMETRIA para evitar retrasos en su tiempo de prctica de Laboratorio.

k. Remueva la cromatoplaca del recipiente y marque con un lpiz la posicin del frente del disolvente, antes de que se evapore. l. Deje secar la cromatoplaca a temperatura ambiente, primero y luego colquela a 80oC en un horno de conveccin.

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m. Cuando observe que la cromatoplaca esta seca, squela del horno y dirjase a la campana de extraccin de gases para revelar el cromatograma. n. Para el revelado, utilice el nebulizador que le proporcionara su instructor y que que contiene una solucin de Ninhidrina (0.3 gramos de ninhidrina en 100 ml de n-butanol y 3 ml de acido actico glacial).

o. Marque alrededor de las manchas con un lpiz y obtenga la distancia, en centmetros desde el centro de ellas a la marca inicial. Recuerde que una mancha color azulado o violeta denota la presencia de aminocidos. No olvide comparar la mancha de la muestra desconocida con la de los aminocidos patrn. (Como se observa en la siguiente figura)

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6.2 ESPECTROFOMETRIA DE PROTEINAS a. Tome 4 tubos de ensayo limpios y secos. b. Identifquelos con letras (A,B,C y D) c. Agregue a cada tubo 9.5 ml de solucin de Sulfato de Sodio al 26.6%.

d. Coloque por separado, en cada tubo lo siguiente: - 0.5 ml del extracto acuoso; - 0.5 ml del extracto salino; -0.5 ml de una muestra con concentracin desconocida . -0.5 ml de Estndar de albumina u ovoalbumina, de concentracin aconocida. (La concentracin ser reportada por el instructor).

e. f. g. h. i. j.

Agite bien estos 4 tubos de ensayo. Prepare otros 5 tubos de ensayo limpios y secos. Identifquelos con letras (E,F,G, H e I). Al tubo E (blanco de reactivo) aada 2 ml de Sulfato de Sodio al 26.6%. Al tubo F (estndar) aada 2 ml de la solucin del tubo de ensayo D . Al tubo G aada 2 ml de la solucin del tubo de ensayo C.

k. Al tubo H aada 2 ml de la solucin del tubo de ensayo B. l. Al tubo I aada 2 ml de la solucin del tubo de ensayo A. m. Tome los tubos E,F,G,H e I y aada a cada uno, 8 ml del reactivo de aaaBiuret. n. Agite bien estos tubos de ensayo.

o. Observe los tubos y seale que color observa en cada uno. Haga referencia a la diferencia de tonalidades. p. Si usted recuerda, la prueba de biuret ayuda a detectar protenas a travs de una reaccin de color, entre la protena y el reactivo biuret. En donde cree que habr mas cantidad de protenas: en el tubo de ensayo con un tono mas oscuro o en el tuvo de ensayo con un tono ms claro? Justifique su respuesta. 70

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6.3. Realizacin de la espectrofotometra utilizando espectrofotmetro de Bausch y Lomb Modelo Spectronic 20: NOTA: Todos los botones y partes del mencionado espectrofotmetro estn indicados en la Fig. 1 del material de apoyo a esta prctica. a. Rote el control para seleccin de longitud de onda (1) hasta lograr la longitud de onda deseada, de acuerdo a lo indicado en la escala (3) En este caso tendremos una longitud de onda de 540 nm, pues esta longitud de onda permite medir con un mayor porcentaje de certeza, la absorbancia de radiacin de las soluciones reveladas a travs del reactivo de Biuret.

b. Rote el botn interruptor de corriente y control de cero (6) en sentido que giran las agujas del reloj. Al hacer esto se encender la luz piloto (2) c. Esperar por lo menos cinco minutos para que el aparato se caliente y se estabilice.

d. Usando el interruptor de corriente y control del cero (6), ajuste la aguja de la escala de lectura (1) para que marque 0 en la escala de porcentaje de transmitancia. Durante esta etapa el compartimiento de la muestra (7) debe ser vacio y con la cubierta cerrada. e. Lave una cubeta (se la proveer su instructor) con agua destilada, luego alcohol y finalmente cetona.

f. Seque totalmente la cubeta con Kleenex, evitando tocar nuevamente este recipiente con las manos. La cubeta es un recipiente de un vidrio especial muy costoso por lo que se le recomienda tener mucho cuidado con su manejo. De ser posible utilice guantes o tome con un Kleenex la cubeta para evitar contaminacin con la grasa de los dedos. La cubeta debe estar lo mas limpia posible pues este instrumento no debe interferir con la lectura correcta de la absorbancia o transmitancia. .

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g. Utilizando uno de los tubos especiales para este instrumento (cubeta), llnelo aproximadamente a la mitad con la solucin del tubo de ensayo E (blanco de reactivo) y despus colquelo en el compartimiento de la muestra (7), alineando la marca que se encuentra en la cubeta, con la marca situada en el borde de este compartimiento.

h. Cierre la cubierta del compartimiento de la muestra (7) y utilizando el control de intensidad de la luz (5) haga que la aguja de la escala de lectura (1) marque 100 con la escala de porcentajes de transmitancia. i. Saque la cubeta y lavar la cubeta o tomar otra cubeta limpia.

j. Tome la cubeta y agregue 4.0 ml de solucin del tubo F. y repita los pasos 6.3. e al h. k. Baje la cubierta del compartimiento de la muestra (7) y lea directamente en la escala de lectura (1) utilizando la escala de absorbancia y la de porcentajes de transmitancia.

m. Utilizando 4.0 ml de cada uno de las soluciones de los tubos restantes (G, H e I), repita los pasos del 6.3 i al 6.3 k.

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7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA: Resuelva lo siguiente: Definir Cromatografa. En qu consiste esta prueba? Enumere las cuatro fuerzas, de accin independiente, que definen el grado de separacin de sustancias en la cromatografa. Cules de esos factores son responsables de la movilizacin de la mezcla de sustancias a travs del medio de sostn? Cul es la diferencia entre la cromatografa en papel y la cromatografa en capa fina? Seale al menos 3 recomendaciones para la aplicacin de muestras en las cromatoplacas. Elabore un flujo grama de la metodologa para realizar cromatografa en capa fina. (No es necesario que sea muy especfico, puede hacer simplemente un bosquejo de dicha metodologa). Indique que soluciones utilizo en la cromatografa (muestra problema y soluciones patrn) y explique el fundamento que le ayudo a decir que soluciones utilizar. Calcule el valor de Rf para todas las manchas. Vea la formula que aparece en su material de apoyo a la prctica. Con base a los valores Rf obtenidos, identifique de ser posible, la muestra desconocida. Compare los Rfs de cada una de las manchas obtenidas de sus muestras de hidrolizado, con los obtenidos para los aminocidos patrn. Analice la correspondencia existente entre estos resultados y los de las pruebas de color, desarrolladas en la prctica 2 parte II. Resuelva lo siguiente: Indique como se activa una cromatoplaca. Cul es la razn de utilizar tubos microcapilares? Cul es la razn de esperar a que se seque cada aplicacin? Por qu se coloca papel filtro mojado con eluente? Por qu se marca con lpiz la posicin del frente del disolvente?

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Qu indicara para usted el aparecimiento de una mancha de un color muy diferente al azul o violeta que denota aminocidos segn la prueba de la Ninhidrina?. Indique las dimensiones de una cromatoplaca completa (de donde su instructor de laboratorio recorto varias porciones). Cules son las dimensiones de la seccin de cromatoplaca que usted utilizo en esta prctica? Investigue si una cromatoplaca se recorta o si se utiliza completa. Por qu se uso una cromatoplaca recortada? Todas las cromatocamaras son iguales a las que se utilizaron aqu? Justifique su respuesta; si hubiese cromatocmaras de fabrica Cul es su tamao? Adems trate de justificar por qu aqu se usaron cromatocamaras pequeas. Responda las siguientes preguntas: Qu es espectrofotometra? Qu es un espectrofotmetro? Por qu hay que limpiar tan minuciosamente la cubeta antes de agregar la solucin que se medir en el espectrofotmetro? Por qu se utiliz una longitud de onda de 540 nm, en el espectrofotmetro, para realizar esta prctica de laboratorio? Qu es un blanco de reactivo? Elabore una tabla para indicar el contenido de los 9 tubos de ensayo identificados con letras maysculas. Justifique los pasos 6. 2 g y 6.2 h de la metodologa de esta prctica. Se le sugiere leer el tema blanco de reactivos de el material de apoyo a esta prctica o consultar a su instructor de Laboratorio o Catedrtico de Curso. Reporte los datos siguientes: Lectura (absorbancia y transmitancia) para las soluciones siguientes: blanco de reactivo (Na2SO4 + Biuret); Estndar (albmina); Solucin problema (extracto). Concentracin [% peso/volumen] de protenas en el extracto acuoso de protenas. (utilice la frmula incluida en el Material de apoyo a esta prctica). Concentracin [% peso/volumen] de protenas en el extracto salino de protenas. (utilice la frmula incluida en el Material de apoyo a esta prctica.

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Investigue lo siguiente: Cantidad (en gramos) de Protenas (solubles en agua) en 100 gramos de harina vegetal seca. Cantidad (en gramos) de Protenas (solubles en agua) en 100 gramos de muestra vegetal hmeda. Cantidad (en gramos de Protenas (solubles en agua) en 100 gramos de muestra vegetal seca.

Para resolver esto tome en consideracin los siguientes datos: Concentracin [1% peso/volumen] de protenas en el extracto acuoso de protenas. La cantidad obtenida de Extracto Acuoso en la prctica 3 de este Manual de Prcticas. La Cantidad de Harina Vegetal utilizada para preparar el Extracto Acuoso. La cantidad de Muestra Vegetal (semilla, hoja, etc.) utilizada para preparar la harina vegetal y la Cantidad de Harina Vegetal preparada. El % de humedad de su Muestra Vegetal .

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Prctica No. 6 EXTRACCIN DE GLCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES


1. INTRODUCCIN Los glcidos han sido conocidos durante mucho tiempo como carbohidratos, pero en la actualidad suele usarse ms el nombre glcido. Segn Lehniger, Nelson y Cox (15), los glcidos son las biomolculas ms abundantes en la naturaleza. Cada ao, el proceso de la fotosntesis llevado a cabo por plantas y algas convierte ms de 1000.000 millones de toneladas mtricas de CO2 y H2O en celulosa y otros productos vegetales. Ciertos glcidos (como el azcar y el almidn) son fundamentales en la dieta humana de la mayor parte de pases, y la oxidacin de glcidos es la principal ruta de obtencin de energa en la mayora de clulas no fotosintticas. Los polmeros insolubles de glcidos actan como elementos estructurales y de proteccin en las paredes celulares de bacterias y plantas y en los tejidos conjuntivos y envolturas celulares anmales. Otros polmeros de glcidos funcionan como lubricantes de articulaciones seas o como adhesivos celulares. En esta prctica de laboratorio se trabajar una metodologa sencilla para la extraccin de glcidos (carbohidratos). Aquel fundamento terico que se ha seleccionado para el trabajo con esta biomolcula, se presenta en la Prctica 7 de este Manual. Por ello no encontrar usted aqu cuestionario pre laboratorio. 2. OBJETIVOS Al finalizar la prctica el estudiante deber estar en capacidad de: Utilizar el Sistema Soxhlet para la extraccin de glcidos de una muestra vegetal pulverizada. Utilizar adecuadamente la cristalera y equipo a emplear un esta prctica de laboratorio.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MATERIALES A carga de cada grupo de trabajo:

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Harina de muestra vegetal (preparada y almacenada desde la Prctica 2 de este laboratorio). Un destilador Soxhlet contenido en una caja de cartn: esto incluye: un refrigerante o condensador, una cmara de extraccin, un baln de fondo plano de 250 ml y dos mangueras de hule largas. 1 mechero 1 manguera de hule 1 soporte universal 1 anillo de hierro 1 rejilla de asbesto 2 pinzas fisher 1 erlenmeyer de 250 ml A cargo del da de laboratorio 1 caja con perlas de ebullicin - papel parafilm - fsforos

NOTA: Del destilador Soxhlet cabe sealar que es un sistema de cristal que requiere de mucho cuidado en su manejo, pues es muy frgil. En funcin de esto es posible que alguno(s) o todos los grupos utilicen un sistema aleatorio que venga a sustituir a este destilador, pero esto ser decisin de la Subrea de Ciencias qumicas y la explicacin pertinente de su uso estar a cargo del Instructor de Laboratorio.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 4. METODOLOGA

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4.1 . Preparacin del destilador soxhlet: a. Lave y seque con cuidado las tres partes que componen este destilador. b. Tome el baln de fondo plano y agregue en l, aproximadamente tres cuartas partes de agua destilada (de 180 a 190 ml de agua aproximadamente) c. Coloque 5 perlas de ebullicin en este baln.

d. Coloque la rejilla de asbesto y el anillo de bierro en el soporte universal. " A una distancia aproximada de 2mm, coloque el baln de fondo plano, sujetndolo con una pieza fisher al soporte universal". e. Coloque las mangueras en la salida del condensador (refrigerante del destilador Soxhlet.

4.2. Preparacin de la muestra vegetal para extraccin por destilados soxhlet:l a. Corte una seccin de papel filtro de aproximadamente 12 cm X 12 cm Este papel filtro es para la construccin de un dedal en el cual pueda agregarse la muestra pesada de un tamao para una cantidad de 15 grs. de muestra vegetal.

b. Enrolle el papel filtro con el fin de crear un cilindro con un dimetro aproximado de 2.5 cm a 3.0 cm. c. Doble uno de los extremos de este cilindro de papel a modo de crear un dedal (recipiente que tenga un extremo sellado). d. Engrape el extremo doblado y procure que este dedal no tenga salidas en uno de sus bordes, para que no se pierda muestra. e. agregue la muestra vegetal en el dedal. 4.3. Extraccin de Glcidos de la Muestra vegetal a. Coloque el dedal con la muestra vegetal, dentro de la cmara de extraccin del destilador Soxhelt, con el extremo sellado hacia abajo. Es indispensable que este dedal quede bastante flojo dentro de la cmara. En caso contrario la prueba tardara mucho tiempo y no sera una buena extraccin.

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b. Observe que el nivel de la muestra vegetal no sobrepase la altura de e sifn pequeo de vidrio de la cmara soxhlet. c. Coloque una pieza fisher a la cmara soxhlet, procurando que no dae este cristal. d. Coloque el extremo puntiagudo de la cmara de extraccin, dentro del baln de fondo plano colocado en el soposrte universal, y asegure ambas pinzas fisher. Coloque el extractor del condensador dentro de la cmara de extraccin soxhlet. El condensador tiene un nico extremo que cabe dentro de la cmara de extraccin soxhlet. Conecte a la llave de agua, la manguera que qued en el extremo m{as abajo del condensador. Coloque la otra manguera del condensador en la una de las reposaderas de la mesa de laboratorio. Abra la llave de paso de agua, procurando tener caudal continuo pero no muy elevado. "CUIDAR EL AGUA" Encienda el mechero y aplique calor al destilador soxhlet.

usted observar una ebullicin continua y cmo, poco a poco, la cmara de extraccin soxhlet se llena de solvente (agua). Llegar un momento en donde la cmara de extraccin empezar a vaciarse del solvente que contiene. A esto se le llama reflujo. Observe que se de un minuto de 5 (cinco) reflejos y suspenda el proceso de extraccin.

Tome la solucin contenida en un erlenmeyer de 250 ml. Identifique su erlenmeyer y toda vez fro coloqu en una refrigeradora. Este extracto se utilizar en la practica 7.

5. EVALUACIN DE LA PRCTICA

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Esta prctica ser evaluada junto con la practica 7. as que esta vez no habr entrega de cuestionario pre laboratorio, ni examen cort ni entrega de informe.

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PRCTICA 7 ESTUDIO DE GLCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES


1. INTRODUCCIN
Los carbohidratos tambin llamados hidratos de carbono o glcidos, son compuestos de amplia distribucin en la naturaleza, la mayora son de origen vegetal formados durante el proceso de la fotosntesis. Los carbohidratos son los principales componentes de casi todas las plantas y comprenden del 60 al 90 % de su masa seca. Los hidratos de carbono son sustancias orgnicas que contienen grupos aldehdos o cetnicos potenciales (que en su estado libre poseen un intenso poder reductor) y numerosos grupos alcohlicos secundarios y primarios. A causa de la similitud de sus estructuras y reacciones, resulta difcil identificarlos y determinarlos. Se crea un contexto agronmico en las prcticas de laboratorio de Bioqumica, de la FAUSAC, al estudiar los carbohidratos extrados de una muestra vegetal. Para el mencionado estudio, se ha de trabajar con reacciones caractersticas de las biomolculas (aplicacin de pruebas para su caracterizacin cualitativa) en el extracto de la muestra vegetal), en el extracto hidrolizado de la muestra vegetal, a la par de soluciones patrones de carbohidratos.

2. OBJETIVOS Al finalizar la prctica, el estudiante deber estar en la capacidad de: Aplicar tcnicas qumicas en la caracterizacin de carbohidratos en una muestra vegetal. Sealar los criterios de clasificacin y caracterizacin de los carbohidratos. Manipular adecuadamente, la cristalera, reactivos y equipo a utilizar en la presente prctica.

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3. MATERIAL DE APOYO GLCIDOS (CARBOHIDRATOS) (3,7,15,20) Segn Lehninger, Nelson y Cox (15), loe glcidos son las biomolculas ms abundantes en la naturaleza. Cada ao, el proceso de la fotosntesis llevado a cabo por plantas y algas convierte ms de 100.000 millones de toneladas mtricas de CO2 y H2O en celulosa y otros productos vegetales. Ciertos glcidos (como el azcar y el almidn) son fundamentales en la dieta humana de la mayor parte de pases, y la oxidacin de glcidos es la principal ruta de obtencin de energa en la mayora de clulas no fotosintticas. Los polmeros insolubles de glcidos actan como elementos estructurales y de proteccin en las paredes celulares de bacterias y plantas y en los tejidos conjuntivos y envolturas celulares animales. Otros polmeros de glcidos funcionan como lubricantes de articulaciones seas o como adhesivos celulares. Los glcidos han sido conocidos durante mucho tiempo como carbohidratos, pero en la actualidad suele usarse ms el nombre "glcido". Literalmente, carbohidrato significa hidrato de carbono. Este nombre deriv de investigaciones de los primeros qumicos, cuyos anlisis demostraron que contenan nicamente carbono, hidrgeno y oxgeno. Ahora se sabe que algunos carbohidratos contienen nitrgeno y azufre, adems de los 3 elementos ya mencionados. Muchos glcidos comunes cumplen la frmula emprica (CH2O)n, mientras que otros no. En definitiva no son compuestos hidratados, como lo son muchas sales inorgnicas (CuSO4.5H20). La mayor parte de sustancias de este tipo tienen frmulas empricas que sugieren que son `hidratos' de carbono, en los que la relacin C:I3:0 es de 1:2:1. (3, 20) Como sealan I-P-hninger, Nelson y Cox (15), los glcidos o carbohidratos son polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas, o bien, sustancias que dan lugar a estos compuestos despus de su hidrlisis. En otras palabras los, carbohidratos son aldehdos o cetonas polihidroxiladas o productos derivados de ellos por oxidacin, reduccin, sustitucin o polimerizacin. (20) Los carbohidratos son los principales componentes de casi todas las plantas, comprenden del 60 al 90% de su masa seca. Los vegetales usan los carbohidratos tanto como fuente de energa as como tejido de sostn, de la misma manera que los animales emplean las protenas. Los vegetales sintetizan sus propios carbohidratos a partir del dixido de carbono del aire y del agua del suelo (3, 7) El hombre no slo utiliza carbohidratos en su alimentacin (aproximadamente del 60 al 65% en masa de su dieta media), sino tambin para su vestimenta (algodn, lino, rayn), habitacin (madera), combustible (madera) y productos de papel (madera). (3, 7)

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3.1.

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CLASIFICACIN DE LOS CARBOHIDRATOS (3,7,15,20)

Los carbohidratos se pueden clasificar segn sus productos de hidrlisis cida. Se aceptan tres categoras: Monosacridos, Oligosacridos y Polisacridos (la palabra "sacrido" viene del griego sakkharon, que significa azcar). 3.1.1. Monosacridos: Son azcares simples y no pueden fragmentarse en molculas ms pequeas por hidrlisis. Consisten de una sola unidad de un polihidroxialdehdo o cetona. Los monosacridos son slidos incoloros y cristalinos solubles en agua e insolubles en disolventes no polares. La mayora tienen sabor dulce. Los monosacridos, por el grupo carbonlico, pueden ser aldosas (contienen un grupo aldehdo; ejemplo glucosa) o cetosos (contienen un grupo cetnico; ejemplo fructosa). A su vez, los monosacridos, pueden clasificarse por el nmero de tomos de oxgeno: hexosas (glucosa, galactosa, manosa, fructosa), pentosas (arabinosa, xilosa, ribosa), tetrosas, treosas (treosa, eritrosa). 3.1.2. Oligosacridos: Consisten en cadenas cortas de unidades de monosacridos unidas por los caractersticos enlaces glucosdicos. Los ms abundantes son los disacridos, que producen dos molculas de monosacridos por hidrlisis. Aqu los monosacridos estn unidos mediante "enlaces glucosdicos". Incluyen: sacarosa, lactosa y maltosa. Todos los monosacridos y disacridos comunes tienen nombres que terminan con el sufijo "-osa". La mayor parte de oligosacridos que tienen tres o ms unidades de monosacridos, no se encuentran libres sino que se unen a otro tipo de molculas (lpidos o protenas) formando estructuras hbridas (glucoconjugados). 3.1.3. Polisacridos: Consisten en cadenas largas de centenares o miles de unidades de monosacridos; es decir, los polisacridos forman muchas molculas de monosacridos por hidrlisis. Son los carbohidratos ms abundantes en la naturaleza; sirven como componentes estructurales de las clulas y como sustancias alimenticias de reserva. Aqu encontramos: almidn, glicgeno y celulosa. Aqu puede hacerse una subdivisin ms: se tienen por un lado los homoopolisacridos (molculas muy grandes compuestas nicamente por un tipo de monosacrido) y por otro lado los heteropolisacaridos (se forman a partir de dos o ms unidades bsicas y estn frecuentemente asociadas con protenas; cuando predomina el carbohidrato el compuesto se conoce como proteoglicano o mucoprotena, pero sin el carbohidrato es el componente menor, se le conoce como glicoprotena).

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Casi todos los monos y disacridos son slidos cristalinos, de sabor dulce y fcilmente solubles en agua. Los polisacridos frecuentemente son compuestos amorfos, insolubles e inspidos, con masas molares sumamente grandes. Los carbohidratos tambin pueden clasificarse en funcin de sus propiedades "reductoras", de acuerdo a su capacidad para reducir soluciones con iones metlicos como Cu+2 y Ag+1. Un carbohidrato reductor es todo carbohidrato que se reduce sin necesidad de hidrlisis previa. Se caracterizan por poseer sus grupos aldehdicos o cetnicos libres, es decir, que no forman parte de uniones glucosdicas. En los carbohidratos, los grupos aldehdicos y cetnicos se encuentran en forma de hemiacetales, por lo que su poder reductor es menor que el de un aldehdo o cetona libres. El poder reductor tambin vara entre loa diferentes tipos de carbohidratos (aldosas y cetosas, monosacridos y disacridos), por lo que el tiempo en que se realiza la reduccin del cobre, a una temperatura controlada, permite identificar en una muestra el tipo de carbohidrato reductor que se encuentra presente. Todos los monosacridos y algunos disacridos son reductores; los polisacridos contienen slo un grupo reductor por varios cientos o ms de residuos, as que, en la prctica no son reductores. 3.2. HIDRLISIS DE CARBOHIDRATOS (3)

La hidrlisis de los carbohidratos es la liberacin de las unidades monmeras, los monosacridos, a partir de carbohidratos que se componen de por lo menos dos de stas unidades. Esto quiere decir que la hidrlisis sucede desde los disacridos hasta los polisacridos. Por ejemplo, la escama es un disacrido de molcula demasiado grande por lo que no puede pasar a travs de las membranas celulares por lo que el cuerpo humano es incapaz de utilizarla como tal, por lo que debe fragmentarse en sus componentes (glucosa y fructosa) por hidrlisis. Esta reaccin es catalizada por enzimas en el cuerpo humano, y en el laboratorio puede llevarse a cabo utilizando cido clorhdrico. El almidn, un polmero de glucosa, se hidroliza tambin por enzimas y cidos obtenindose glucosa al final.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3.3.

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PRUEBAS PARA CARBOHIDRATOS (3, 7, 8, 20)

3.3.1. Prueba de molish Esta prueba es utilizada para identificar la presencia de carbohidratos, incluso glucoprotenas. El resultado positivo (indicado por la aparicin de un anillo prpura) se da con todos los carbohidratos ms superiores que las tetrosas. El cido sulfrico concentrado hidroliza enlaces glicosdicos para dar monosacridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus derivados. Estos productos pueden condensarse con compuestos fenlicos como el -naftol para dar sustancias coloreadas (mayormente prpuras).

Figura No. 13 Resultado de la prueba de molish. Fuente: MPH.

3.3.2. Prueba de benedict: Esta prueba se realiza en condiciones moderadamente alcalinas. Es una prueba sumamente sensible para detectar la presencia de carbohidratos, pero no especfica para los azcares en particular (el reactivo de Benedict demuestra la presencia hasta de 0.01% de glucosa en agua). Esta reaccin suele usarse para demostrar la presencia de carbohidratos reductores, y se basa en la reduccin del ion cprico, en medio alcalino, para formar xido cuproso [Cu 2O]. Los aldehdos, al igual que muchos otros compuestos, dan prueba positiva con el reactivo de Benedict. La formacin de un precipitado de xido cuproso es el criterio para una prueba positiva. El color del precipitado puede ser rojo, pardo naranja, amarillo o amarillo verdoso, dependiendo de la naturaleza y cantidad del agente reductor presente.

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El reactivo de Benedict es reducido por O-hidroxialdehidos, por O-hidroxicetonas y por Ocetoaldehdos. Las molculas que slo contienen el grupo funcionar alcohol, se oxidan con la solucin de Benedict.

Figura No. 14 Prueba de benedict dando una coloracin anaranjada.

3.3.3. PRUEBA DEL, YODO: Se utiliza para la deteccin de polisacridos y para seguir el curso de la hidrlisis, a travs del cambio gradual de color que se produce entre el "hidrolizado" y el yodo. Esto se debe a que el yodo forma complejos coloreados de adsorcin con los polisacridos. El almidn da un color azul o negro azulado con el yodo, mientras que el glicgeno y el almidn parcialmente hidrolizado dan una coloracin pardo rojiza o violeta rojizo.

Figura No. 15 Coloracin de los extractos con la prueba de yodo dando una coloracin azul.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3.3.4. PRUEBA DE BARFOED:

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La prueba o reaccin de Barfoed se emplea para diferenciar entre mono y disacridos. La base de esta prueba la constituye la diferente velocidad de la reaccin con el acetato cprico. La velocidad de la reaccin se determina por la velocidad de formacin de Cu2O. Concentraciones equimolares de monosacridos y disacridos poseyendo un grupo reductor por molcula reaccionan con el reactivo de Barfoed a velocidades distintas. Una clara diferencia entre mono y disacrido, es su tamao molecular, lo que parece constituir un factor limitante en la velocidad de la reaccin. Tambin pueden estar implicados otros factores, tales como una interaccin ms compleja con los dos anillos monosacridos. Ello parece suficiente para suponer que las molculas ms pequeas tienen una mayor reactividad. La prueba es positiva por el aparecimiento de un color rojo ladrillo, que se debe al aparecimiento de precipitado 0120 (a pesar de ser el mismo precipitado formado con Benedict, el color obtenido en estas pruebas es diferente).

Figura No. 16 coloracin que se obtiene con la prueba de barfoed en glucosa y fructuosa.

3.3.5. PRUEBA DE SELIWANOFF Esta prueba permite diferenciar las aldohexosas de las cetohexosas en base a sus velocidades de reaccin. El HCl caliente deshidrata a las cetohexosas para formar hidroximetilfurfural mucho ms rpido que a las aldohexosas correspondientes. Las cetosas se deshidratan ms rpido que las aldosas, dando derivados de furfural, que, condensados con resorcinol, dan un complejo rojo.

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Esta reaccin est basada en la transformacin de la fructosa en un derivado del furfural por la accin del calor y el cido clorhdrico. Como ya se mencion, este derivado se condensa con el resorcinol para formar un compuesto rojo. La reaccin la dan todas las cotosas. La concentracin del azcar y el tiempo de calentamiento deben ser controlados cuidadosamente. Un calentamiento prolongado hace que la glucosa y otras aldosas den positiva la reaccin. Las pentosas reaccionan con esta prueba dando un producto de color verde a azul.

Figura No. 17 Coloracin de los extractos y patrones con la prueba de seliwanof.

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 7 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Elabore una definicin propia de: carbohidrato (glcido) Mencione al menos 5 funciones de los glcidos. Cmo se pueden clasificar a los carbohidratos segn sus productos de hidrlisis cida? Elabore una definicin para "monosacridos". Seale las caractersticas generales de este grupo y adems indique cul(es) monosacridos se usar(n) en esta prctica. Cules la diferencia entre aldosa y cetosa? Qu es un oligosacrido? Elabore una definicin para "disacrido. Seale las caractersticas generales de este grupo y adems indique cul(es) disacrido(s) se usarn en esta prctica. Elabore una definicin para "polisacrido". Adems indique cul(es) polisacrido(s) se usar(n) en esta prctica. Qu es un carbohidrato reductor? Qu caracteriza a los carbohidratos reductores? Diferencie a los monosacridos y disacridos; de los polisacridos, en funcin de su solubilidad y de su propiedad "reductora'. Qu es hidrlisis de carbohidratos? Para qu se utiliza la prueba de Molisch? Qu cambio indica una prueba de Molisch positiva? En qu consiste la prueba de Benedict? Cul es su utilidad? Qu se puede detectar con la prueba del yodo? Qu cambio indica que la prueba es positiva? Cul es la utilidad de la prueba de Barfoed? en qu se fundamenta esta prueba? Qu compuesto es identificado en la prueba de Seliwanoff, cuando el resultado es un complejo color rojo?

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES Preparar el rea de trabajo del rea de trabajo:

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30 tubos de ensayo 2 gradillas de metal 1 pinza p/tubo de ensayo 1 estufa elctrica 2 probetas de 10 ml 1 beacker de 600 ml 1 pizeta 1 beacker de 100 ml tubos de ensayo grandes frascos con gotero identificados en funcin de su contenido, as: -naftol; Benedict; Solucin de Yodo; Barfoed; Seliwanoff. Muestras de extracto, de extracto hidroliza.do, de almidn hidrolizado y de sac-fruosa hidrolizada. A cargo del da de laboratorio: Agua destilada 2 goteros pico de gallo con cido sulfrico (en lavaderos) 1 gotero pico de gallo con cido clorhdrico (en la campana de gases). - Frascos con gotero con las soluciones siguientes: Celulosa, AL-pidn, Sacarosa, Lactosa, Maltosa, Glucosa, Fructosa.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 6. METODOLOGA

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6.1. HIDROLISIS DE DISACARIDOS Y POLISACARIDOS Tome el tubo 1 y coloque 20 mL de extracto y 20 gotas de HCl concentrado. Tome el tubo 2 y coloque 20 mL de sacarosa y 20 gotas de H:CI concentrado. Tome el tubo 3 y coloque 20 mL de almidn y 20 gotas de HCl concentrado. Coloque los tubos en bao mara por 5 minutos. Nota: Utilice los hidrolizados para las pruebas que se indican en el cuadro 1. 6.2. PRUEBA DE MOLISH. lave 12 tubos de ensayo e identifiquelos en cada tubo coloque 2 gotas de -naftol (5% P/V en etanol) el reactivo debe de ser lo mas fresco posibile. Aada separadamente, en cada tubo de ensayo 2 ml de las muestras indicadas.

Aada cuidadosamente, por las paredes del tubo,en cada tubo 1 ml de acido sulfurico H2SO4 Observe y anote el cambio de color en la interfase del liquido como en la figura a la izquierda.

6.3. PRUEA DE BENEDICT Lave 10 tubos de ensayo e identifiquelos agregue 2 ml de muestra en cada uno de los tubos Agregue 2 ml de reactivo de benedict *preparado por el instrutor de laboratorio previamente Colocarlo en bao maria , y llevarlo a ebullicin durante un lapso de 5 a 16 minutos. Observe y anote el cambio e coloracion, recuerde que el color rojizo o amarillo verdoso indica positivo.

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VER PREPARACIN DE LOS REACTIVOS.

6.4. PRUEBA DE YODO Lave 5 tubos de ensayo e identifiquelos Agregue 2 ml de muestra en cada tubo de ensayo Agregue a cada tubo de essayo, 6 gotas de yodo* (Solucion al 5mmol) Observe el restultado y anote en el cuaderno de laboratorio, recuerde que un color pardo rojizo o azul violeta indica positivo.

6.5. PRUEBA DE BARFOED lave 10 tubos de ensayo e identifiquelos Agregue a cada tubo de ensayo 2 ml de muestra atgregue 2 ml de reactivo de Barfoed* Lleve los tuvos a ebullicon a bao maria observe y anote el cambio de color en la interfase del liquido com en la figura.

6.6. PRUEBA DE SELIWANOFF


Lave 7 tubos de ensayo e identifiquelos agregue por separado 1 ml de muestra en cada uno de los tubos (referencia cuadro 1) Agregue 2 ml de reactivo de Seliwanoff* preparado por el instrutor de laboratorio previamente Colocarlo en bao maria por un minuto. Observe y anote el cambio e coloracion, recuerde que el color rojizo o amarillo verdoso indica positivo.

N o t a : L a L I M P I E Z A de la cristalera es fundamental para las pruebas a realizar en esta prctica de laboratorio

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El cuadro siguiente es una gua para el estudiante para que sepa que muestras se van a analizar en las pruebas de esta prctica. Cuadro 6. Resumen de pruebas cualitativas, a realiza a soluciones patrones e hidrolizados de carbohidratos y muestra desconocida. PRUEBAS MUESTRAS A ANALIZAR 1. Extracto 2. Extracto Hidrolizado 3. Celulosa (Papel Bond) 4. Almidn 5. Almidn Hidrolizado 6. Sacarosa 7. Sacarosa Hidrolizada 8. Lactosa 9. Maltosa 10. Glucosa 11. Fructosa 12. Muestra desconocida

Molisch

Benedict

Yodo

Barfoed

Seliwanoff

7. PREPARACIN DE REACTIVOS a) Prueba de Benedict: El reactivo de Benedict se p re p a ra disolviendo 1..3 g de curato de sodio y 10 gramos de carbonato de sodio en aproximadamente 80 ml de agua tibia. Si la solucin est turbia, filtrar. Colocar en una probeta de 100 ml y se completa con agua hasta la marca de 85 ml. Enseguida, se disuelven 1.73g de sulfato de cobre en aproximadamente 10 ml de agua destilada. Se mezclan las dos soluciones y se agitan. Se diluye la solucin a 100 ml con agua destilada (en un baln volumtrico de 1OOmL).

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA b) Prueba del Yodo:

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Esta solucin de yodo es al 5mmol I2 por litro de solucin de KI al 3% p/v, c) Prueba de Barfoed: El reactivo de Barfoed se prepara utilizando 13.3 g de acetato de cobre en 200 mL de agita destilada, ms 1.8 mL de cido actico glacial. d) Prueba Seliwanoff. El reactivo de Seliwanoff se prepara utilizando 0.5g de resorcinol por cada litro de HCl 3M. 8. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA: Explique el por qu de la distribucin de las muestras, del cuadro anterior, para cada prueba de caracterizacin. En otras palabras, justifique el uso de cada muestra en cada prueba que se le indica en el cuadro 6. 9. EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO La metodologa de evaluacin incluye tambin un Informe de prctica. El informe puede hacerse en parejas o individualmente, y debe incluir: Cartula RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS Resultados de prctica. Estos se presentan segn las siguientes indicaciones: Es un cuadro de resultados para CADA UNA DE LAS 12 MUESTRAS (Vea el cuadro 6). Los cuadros deben seguir el modelo del Cuadro 7, presentado a continuacin:

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CUADRO 7. Cuadro de resultados de las pruebas realizadas a la muestra de EXTRACTO DE CARBOHIDRATOS NOMBRE DE LA PRUEBA Molisch Benedict Yodo Barfoed Seliwanoff REFERENCIA: Coloracin = color observado como resultado de la prueba Dictamen = prueba positiva (+) o negativa (-). NOTA: Procure intercalar los resultados con su respectivo anlisis explicacin. Anlisis y explicacin de cada cuadro de resultados, a fin de establecer la presencia o ausencia de glcidos en cada muestra problema. (Para el caso de la explicacin que se le pide, haga nfasis sobre si hay concordancia de los resultados prcticos con el fundamento terico. Si no hubiese tal concordancia, plantee una justificacin vlida). COLORACIN DICTAMEN

Dar solucin a los "cuadros" que aparezcan en su metodologa y presentarlos tambin, intercalados con los resultados y anlisis de resultados.

Como una gua de su anlisis se le recomienda utilizar la solucin a los cuadritos que aparecen para cada parte de la metodologa.

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Prctica No. 8 EXTRACCIN DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES


1. INTRODUCCIN Cuando se iniciaban las prcticas de laboratorio de Bioqumica, se haca referencia al estudio de las tres biomolculas ms importantes: protenas, carbohidratos y lpidos. Con el estudio de esta prctica se iniciara el trabajo con los lpidos. Los lpidos forman un grupo heterogneo de compuestos orgnicos y son componentes importantes de los tejidos vegetales y animales. Poseen caractersticas comunes de solubilidad (poco o nada solubles en agua, pero solubles en solventes no polares como cloroformo, ter, etanol, benceno, etc.). Los lpidos constituyen el grupo de compuestos de reserva de energa ms importante en el reino animal. En contraste, los vegetales almacenas casi toda su energa en forma de carbohidratos, fundamentalmente como almidn. Los lpidos sirven de aislamiento a los rganos vitales, protegindolos de los golpes y manteniendo la temperatura optima del cuerpo. Los lpidos forman parte integral de la estructura de la membrana celular y, como tales, estn asociados con el transporte a travs de las membranas celulares. Los aceites vegetales tienen un sin nmero de aplicaciones industriales, medicinales, etc. Y existe gran cantidad de especies que son cultivadas para extraer y procesar los aceites presentes en sus semillas, hojas u otros rganos. En esta prctica de laboratorio se trabajara una metodologa sencilla para la extraccin de lpidos. Aquel fundamento terico que se ha seleccionado para el trabajo con esta biomolecula, se presenta en la practica 9 de este manual. Por ello no encontrara usted aqu cuestionario pre laboratorio.

2. OBJETIVOS Al finalizar la prctica el estudiante deber estar en capacidad de: Utilizar el sistema soxhlet para la extraccin de lpidos de una muestra vegetal pulverizada. Utilizar adecuadamente la cristalera y equipo a emplear en esta prctica de laboratorio.

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FACULTAD DE AGRONOMA 3. MATERIALES A cargo de cada grupo de trabajo:

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Harina de muestra vegetal (preparada y almacenada desde la practica 2 de este laboratorio). NOTA: es posible que su instructor de laboratorio decida asignar una muestra vegetal a cada grupo. Esto se har con la finalidad de que todos los grupos trabajen con un vegetal con un contenido relativamente alto de LPIDOS (por ejemplo man, ajonjol, etc.). Un destilador soxhlet contenido en una caja de cartn: esto incluye: un refrigerante o condensador, una cmara de extraccin, un baln de fondo plano de 250 ml. y dos mangueras de hule largas. 1 mechero 1 anillo de hierro 1 erlenmeyer de 250 ml. 1 manguera de hule 1 rejilla de asbesto 1 soporte universal 2 pinzas fisher A cargo del da de laboratorio: 1 caja con perlas de ebullicin. Solvente n-hexano o algn otro solvente apolar que le indique su instructor de laboratorio.Papel parafilm Fsforos. NOTA: del destilador soxhlet cabe sealar que es un sistema de cristal que requiere de mucho cuidado en su manejo, pues es muy frgil. En funcin de esto es posible que algunos o todos los grupos utilicen un sistema aleatorio que venga a sustituir a este destilador, pero esto ser decisin de la Subarea de Ciencias Qumicas y la explicacin debida estar a cargo del Instructor de Laboratorio.

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FACULTAD DE AGRONOMA 4. METODOLOGA

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4.1 . Preparacin del destilador soxhlet: a. Lave y seque con cuidado las tres partes que componen este destilador. b. Tome el baln de fondo plano y agregue en l, aproximadamente tres cuartas partes de agua destilada (de 180 a 190 ml de n- hexano aproximadamente) c. Coloque 5 perlas de ebullicin en este baln.

d. Coloque la rejilla de asbesto y el anillo de bierro en el soporte universal. " A una distancia aproximada de 2mm, coloque el baln de fondo plano, sujetndolo con una pieza fisher al soporte universal". e. Coloque las mangueras en la salida del condensador (refrigerante del destilador Soxhlet.

4.2. Preparacin de la muestra vegetal para extraccin por destilados soxhlet: a. Pese 15 gramos de la muestra vegetal indicada por su instructor de laboratorio. b. Corte una seccin de papel filtro de aproximadamente 12 cm X 12 cm Este papel filtro es para la construccin de un dedal en el cual pueda agregarse la muestra pesada de un tamao para una cantidad de 15 grs. de muestra vegetal. c. Enrolle el papel filtro con el fin de crear un cilindro con un dimetro aproximado de 2.5 cm a 3.0 cm. d. Doble uno de los extremos de este cilindro de papel a modo de crear un dedal (recipiente que tenga un extremo sellado). e. Engrape el extremo doblado y procure que este dedal no tenga salidas en uno de sus bordes, para que no se pierda muestra. f. agregue la muestra vegetal en el dedal. 4.3. Extraccin de lipidos de la Muestra vegetal a. Coloque el dedal con la muestra vegetal, dentro de la cmara de extraccin del destilador Soxhelt, con el extremo sellado hacia abajo. Es indispensable que este dedal quede bastante flojo dentro de la cmara. En caso contrario la prueba tardara mucho tiempo y no sera una buena extraccin.

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b. Observe que el nivel de la muestra vegetal no sobrepase la altura de e sifn pequeo de vidrio de la cmara soxhlet. c. Coloque una pinza fisher a la cmara soxhlet, procurando que no dae este cristal. d. Coloque el extremo puntiagudo de la cmara de extraccin, dentro del baln de fondo plano colocado en el soposrte universal, y asegure ambas pinzas fisher. e. Coloque el extractor del condensador dentro de la cmara de extraccin soxhlet. El condensador tiene un nico extremo que cabe dentro de la cmara de extraccin soxhlet. f. Conecte a la llave de agua, la manguera que qued en el extremo mas abajo del condensador.

g. Coloque la otra manguera del condensador en la una de las reposaderas de la mesa de laboratorio. h. Abra la llave de paso de agua, procurando tener caudal continuo pero no muy elevado. "CUIDAR EL AGUA" i. Encienda el mechero y aplique calor al destilador soxhlet.

j. mantenga la extraccin en el soxhlet durante un periodo mnimo de 3 horas y suspenda el proceso de extraccin. - Tenga mucha precaucin para evitar perder demasiado solvente n-hexano en el destilador soxhlet; que no haya menos de dos quintas partes de este solvente en el baln de fondo plano del destilador. k. tome la solucin contenida en el baln de fondo plano (esto es el EXTRACTO DE LIPIDOS) y almacnelo en un erlenmeyer de 250 ml. - Si su proceso de extraccin de lpidos fue hecho con cuidado y siguiendo las indicaciones descritas en esta metodologa, en este momento deber tener un mnimo de 100 ml. de extracto de lpidos. l. identifique su erlenmeyer y toda vez fro colquelo en una refrigeradora. Este extracto se utilizara en la practica 9. 5. EVALUACIN DE LA PRCTICA: Esta prctica ser evaluada junto con la practica 9. As que esta vez no habr entrega de cuestionario pre laboratorio, examen corto ni entrega de informe.

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Prctica No. 9 ESTUDIO DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES


1. INTRODUCCIN En la prctica anterior se han extrado lpidos de una muestra vegetal. Ahora se proceder a realizar una metodologa sencilla para estudiar cuantitativa y cualitativamente esta Biomolcula. Respecto a ella aqu se presenta el fundamento terico para hacer ms accesible el conocimiento dentro del laboratorio. Si usted compara los contenidos de las biomolculas en los vegetales, podr notar que regularmente son los lpidos los de menor proporcin. Esto no se debe a que carezcan de importancia, sino que las plantas han creado un medio de almacenamiento de energa a travs de almidn y utilizan los lpidos sobre todo en el transporte a travs de las membranas celulares (Segn White et.al. (20)). Los lpidos son molculas biolgicas fundamentales en las plantas, como se cit anteriormente, y por ello, en esta prctica, se buscara, a travs de experiencias sencillas, que el estudiante obtenga bases para realizar pruebas de caracterizacin de lpidos en muestras vegetales, utilizando adecuadamente la cristalera, equipo y reactivos necesarios.

2. OBJETIVOS Al finalizar la prctica, el estudiante deber estar en capacidad de: Determinar experimentalmente el porcentaje de pureza del extracto de lpidos de la muestra vegetal. Realizar las pruebas de solubilidad de lpidos y de instauracin como estudio cualitativo de caracterizacin de lpidos de la muestra vegetal. Obtener experimentalmente el ndice de Saponificacin de los lpidos de la muestra vegetal. Obtener experimentalmente el ndice de acidez de los lpidos de la muestra vegetal. Manipular adecuadamente, la cristalera, reactivos y equipo a utilizar en la presente practica.

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3. MATERIAL DE APOYO ESTUDIO DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES 3.1. LPIDOS (15,20) Los lpidos se encuentran generalmente distribuidos en la naturaleza como esteres de cidos grasos de cadena larga. Forma un grupo heterogneo de compuestos orgnicos y son componentes importantes de los tejidos vegetales y animales. Poseen caractersticas comunes de solubilidad (poco o nada solubles en agua, pero solubles en solvente no polares como cloroformo, ter, etanol, benceno, etc.) Los lpidos constituyen el grupo de compuestos de reserva de energa ms importante en el reino animal. En contraste, los vegetales almacenan casi toda su energa en forma de carbohidratos, fundamentalmente como almidn. Los lpidos sirven de aislamiento a los rganos vitales, protegindolos de golpes y manteniendo la temperatura ptima del cuerpo. Los lpidos forman parte integral de la estructura de la membrana celular y, como tales, estn asociados con el transporte a travs de las membranas celulares. Los aceites vegetales tienen un sin nmero de aplicaciones industriales, medicinales, etc, y existe gran cantidad de especies que son cultivadas para extraer y procesar los aceites presentes en sus semillas, hojas u otros rganos. 3.2. CLASIFICACIN DE LOS LPIDOS (15,20)

A diferencia de los polisacridos y protenas, los lpidos no son polmeros no poseen unidad monmerica repetitiva-. Sin embargo, al igual que los carbohidratos, pueden clasificarse en base a sus productos de hidrlisis y segn su semejanza en cuanto a estructura molecular. Se clasifican as: 1. Lpidos simples 2. Lpidos compuestos 3. Esteroides. 3.2.1. LPIDOS SIMPLES: Se subdividen en: Grasas y aceites (triacilgliceroles): Producen cidos grasos y glicerol (un alcohol trihidroxilado) por hidrlisis. Se les llama triacilgliceroles, debido a que son esteres que se componen de tres cidos grasos unidos al glicerol.

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Se dice que un lpido es una grasa si se encuentra en estado slido a 25C y un aceite, si sta es lquido o la misma temperatura. Estos compuestos constituyen la mayor parte de los lpidos ingeribles. Son degradados parcialmente por las lipasas en el intestino y luego son re-esterificados en la mucosa intestinal. Un cido es un cido monocarboxilico de cadena larga continua. La presencia de dobles enlaces en ellos disminuyo el punto de fusin del compuesto. Estos cidos pueden ser saturados o insaturados. En general cuando mayor sea el grado de instauracin de un cido graso, tanto menor ser su punto de fusin. Las grasas estn formadas por una gran proporcin de cidos grasos insaturados y los aceites tienen ms proporcin de cidos grasos insaturados. Los steres de glicerol y cidos grasos se conocen como acilgliceroles. Los triacilgliceroles son la forma predominante en la naturaleza. Los acilgliceroles on molculas no cargados y por ello se conocen tambin como lpidos neutros Los lpidos pueden ser oxidados en el hgado para suministrar energa o pueden ser depositados como grasa en regiones caractersticas donde actan como depsitos de reserva a largos plazo y como aislamiento trmico. En algunas semillas los triacilgliceroles se almacenan en fomra de aceites. Los lpidos que se obtienen de fuentes animales, por lo general son slidos, en tanto que los aceites normalmente son de origen vegetal. Por ende es comn hablar de grasas animales y de aceites vegetales. Ceras: una cera es un ster de un alcohol aliftico superior y un cido graso de cadena muy larga. Producen cidos grasos y alcoholes de cadena larga por hidrlisis. Las ceras no se hidrolizan con facilidad, por lo tanto, resulta til como recubrimientos protectores. En las clulas, las ceras son cubiertas a prueba de agua para proteger contra infecciones, dao mecnico o ganancia excesiva de agua.

3.2.2. LPIDOS COMPUESTOS Se subdividen en: Fosfolipidos: Producen por hidrlisis cidos grasos, glicero, cido fosforito y un alcohol nitrogenado. Los fosfolpidos, tambien llamados fosfticos, son lpidos compuestos qu se derivan del fosfato de glicerol. Qumicamente son similares a los triacilgliceroles ya que son steres de cidos grasos y glicerol, pero adems contienen cido fosfrico eterificado con un alcohol.

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Son especialmente abundantes en el hgado, cerebro y tejido espinal y se localizan en las membranas externas de casi todas las clulas. Son los lpidos de mayor polaridad. Se supone que su funcin fundamental es la de actuar como un agente emulsionante en las superficies de las membranas celulares, donde los lpidos insolubles en agua y los materiales solubles en ella deben ser capaces de asociarse inmediatamente. Glicolpidos: Producen por hidrlisis cidos grasos, esfingosina o glicerol y un carbohidrato. Existen algunos grupos de compuestos que contienen estructuras tanto de lpidos como de carbohidratos. Aquellos que son solubles en agua reciben el nombre de liposacridos y se consideran como derivados de carbohidratos. Aquella que sigue siendo solubles en disolventes orgnicos no polares se clasifican como glicolpidos. Un grupo de glicolpidos contiene cidos grasos, glicerol y diversos carbohidratos. Esfingolpidos: Producen por hidrlisis cidos grasos, esfingosina, cido fosfrico y un componente alcohlico. Se encuentran en las membranas de plantas y animales, pero slo muy poco cantidad en los depsitos de grasa. Aqu, el esqueleto de la molcula es el alcohol aminado esfingosina en lugar de glicero. Tambin estn presentes en ellos, cidos grasos, fosfato y un compuesto alcohlico. Lipoprotenas: En los materiales biolgicos se encuentran frecuentemente asociados con protenas formando complejos lipoprotenicos. Las lipoprotenas solubles se encargan principalmente del trasporte los lpidos en la sangre, mientras que las insolubles constituyen la parte principal de muchas membranas biolgicas. 3.2.3. Esteroides: Los esteroides son compuestos que poseen una estructura fenantrnica muy diferente de los lpidos formados por cidos grasos. Se hallan en tejidos vegetales y animales, levaduras y hongos y pueden existir libre o combinacin con cidos grasos o carbohidratos. Puesto que los esteroides esenciales son hidrocarburos de masa molar grande, son solubles solo en los disolventes de grasas. Difieren de los dems lpidos en cuanto a que no experimentan saponificacin. El esteroide mejor conocido y ms abundante en el cuerpo humano el colesterol. Se encuentra sobre todo en el cerebro y el tejido nervioso. Es el principal componente de los clculos biliares, de las cuales puede separarse como slido cristalino de color blanco. Aproximadamente el 95 % de las muertes debidas a enfermedades cardiovasculares directamente ligadas a la arteriosclerosis

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(endurecimiento de las arterias que producen enfermedad cardiaca degenerativa apopleja y otras enfermedades arteriales). La arterosclerosis (una forma de arteriosclerosis) resulta de la deposicin de un exceso de colesterol. 3.3. PRUEBAS CUALITATIVAS DE LPIDOS (15,20)

3.3.1. SOLUBILIDAD: Las propiedades de solubilidad de los lpidos son una funcin de su estructura tipo alcano. Los grupos principales de los lpidos tienen caractersticas de solubilidad diferentes y esta propiedad se usa su extraccin y purificacin a partir de materiales biolgicos. La mayora de los lpidos son solubles en etanol, pero forman una emulsin de gotas pequeas cuando se les agrega agua. Esto da a la suspensin una apariencia lechosa caracterstica y constituyente una prueba muy sensible para grasas. 3.3.2. INSTAURACIN: Los cidos grasos presentes en las grasas animales estn generalmente saturados, mientras que aquellos presentes en los aceites vegetales contienen uno o ms enlaces dobles. La hidrogenacin de estos enlaces convierte los aceites vegetales lquidos en grasas slidas, siendo esto lo se hace comercialmente para la produccin comercial de margarina. Los halgenos17 pueden unirse fcilmente a los enlaces dobles. La decoloracin de una solucin de bromo o yodo por un lpido indica la presencia de los enlaces doble.

3.4.

PRUEBAS CUANTITATIVAS DE LPIDOS (14,15,20)

Un anlisis qumico completo de las grasas encontradas en la naturaleza es un procedimiento bastante dispendioso (costoso), pero hay un nmero de mediciones tales como el valor de acidez, el ndice de saponificacin y el ndice de yodo, que dan informacin til acerca de la composicin y pureza de una grasa determinada. 3.4.1. NDICE DE ACIDEZ: Por ACIDEZ de un lpido se entiende el contenido de cidos grasos libres de un aceite o una grasa y se expresa en porcentaje en masa de cido oleico, palmtico o lurico, segn la naturaleza del producto que se trate

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Las grasas almacenadas pueden enranciarse debido a la oxidacin de los dobles enlaces para formar perxido y su hidrlisis por microorganismos con liberacin de cidos grasos. La cantidad de cidos grasos libres, da por lo tanto, un ndice de la frescura y calidad de la grasa. Como dice el documento de ICAITI (14) el ndice de acidez es la cantidad de hidrxido de potasio necesario para neutralizar la acidez y se expresa en miligramos de KOH requeridos Para neutralizar los cidos grasos libres presentes en un gramo de producto. En otras palabras, el valor de acidez es el nmero de miligramos de KOH requeridos para neutralizar los cidos grasos libres presentes en un gramo de grasa. Es una medida de los cidos grasos libres de un lpido. La reaccin es simplemente la titulacin de un cido (el graso) y una base fuerte. Para neutralizar los cidos grasos libres de la cantidad de lpidos analizados se efecta la conversin a un gramo de grasa y se expresa el resultado como IA. En el documento de ICAITI (14) est indicado que la acidez y el ndice de acidez se calcula aplicando las siguientes ecuaciones y promediando los resultados obtenidos en las determinaciones en duplicado. Es decir que para obtener valores confiables es necesario repetir, al menos una vez, la prueba de IA.

Donde: V=Volumen de la solucin de hidrxido de potasio empleado en la titulacin, en centmetros cbicos. N=Normalidad de la solucin de hidrxido de potasio. m=Cantidad de Lpido en gramos. Nota: Tenga cuidado de no confundir la masa m con la masa del extracto El IA tambin puede calcularse utilizando un procedimiento estequiomtrico. Para ello el estudiante deber consultar su memoria y algn texto utilizando en la Qumica General 1 y 2.

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La hidrlisis de los triacilgliceroles puede efectuarse por varios procedimientos, los ms comunes utilizan lcalis o enzimas llamadas lipasas. La hidrlisis alcalina recibe el nombre de saponificacin, debido a que uno de los productores de la hidrlisis es un jabn, de ordinario, de sales de sodio o potasio de los cidos grasos. Esta reaccin de hidrlisis tambin proporciona un mtodo analtico, til para la determinacin de una constante, el ndice de saponificacin, el cual es caracterstico de los lpidos simples. El ndice de saponificacin de un lpido se define como el nmero de miligramos de hidrxido de potasio necesario para saponificar un gramo de grasa o de aceite. Tambin puede definirse como el nmero de miligramos de KOH que se requiere para neutralizar la masa molar media del lpido. El ndice de saponificacin da una idea del tipo de cidos grasos presentes en el lpido ya que entre ms larga sea la cadena hidrocarbonada, menor ser la cantidad de cido liberado por gramo de lpido. En otras palabras, un ndice de saponificacin pequeo de un cido o aceite indica una masa molar elevada. Materia insaponificable de un lpido es el conjunto de sustancias que se encuentran disueltos en los cuerpos grasos, no saponificables por lcalis, pero solubles en los solventes ordinarios de los aceites y grasas. Experimentalmente, una muestra pesada de grasa se saponifica con una Cantidad X de una solucin alcohlica valorada de hidrxido de potasio. Despus de la saponificacin, el exceso de lcali (cantidad y) se titula con cido valorado. Usando la cantidad de mililitros de cido valorado qu se emplearon en la titulacin, se averigua los ml de KOH que sirvieron para saponificar los lpidos (cantidad Y) Para su clculo puede serle til la ecuacin siguiente: Cantidad X = Cantidad Y + Cantidad Z Utilizando esta ecuacin puede averiguarse la Cantidad de Z, es decir, los ml de KOH que se emplearon en la saponificacin. Ya con esto puede averiguarse el IS. 3.4.3. PORCENTAJE DE PUREZA (%) (14,15) Para el caso de las prcticas de laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC, el porcentaje de pureza va a representar los gramos de lpido contenidos en 100 gramos del extracto que se obtuvo. Dicho porcentaje se hace necesario para realizar el clculo del ndice de acidez y el ndice de saponificacin.

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En la actualidad para el anlisis de lpidos se emplean la cromatografa gas-liquido y la cromatografa en capa fina identificacin cualitativa de lpidos y cidos grasos componentes y la determinacin cuantitativa del porcentaje de cada componente presente. 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 9 1. Elabore una definicin propia de: lpido. 2. Cmo almacenan energa los animales? Como lo hacen las plantas? 3. Enuncie una diferencia entre polisacrido y protenas respecto a los lpidos. 4. Qu es un triacilglicerol? Cul es la diferencia entre grasa y aceite? 5. Cmo es el punto de ebullicin de un lpido respecto al grado de saturacin de sus cidos grasos? 6. Cules son los productos de la hidrlisis de una cera? 7. Qu es un fosfolpido? Cul se supone que es su funcin fundamental? 8. Cul es la diferencia entre un glicolpido y un esfigolpido? 9. De una definicin de lipoprotena. 10. Cul es la diferencia de los esteroides respecto a los dems lpidos? 11. Cmo se detectara la presencia de lpidos en una solucin de etanol con agua? 12. Cul es la diferencia entre cido graso de grasas animales y cido graso de aceite vegetal? 13. Qu es acidez de un lpido? 14. Qu es el ndice de acidez de un lpido? Segn su material de apoyo de cuntas maneras puede calcularse el IA de un lpido? 15. Qu es una materia insaponificable? 16. Qu es saponificacin? Qu es ndice de saponificacin? 17. Explique la diferencia entre ndice de Acidez e ndice de Saponificacin.

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FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES A cargo de cada grupo de trabajo: 5 tubos de ensayo. 1 gradilla de metal. 1 pinza p/tubo de ensayo. 1 estufa elctrica. 2 probetas de 10 mL. 1 bao de mara metlico. 2 soportes universales. 2 pinza para bureta. 1 balanza mono plato. 2 Erlenmeyers de 100 mL. 1 varilla de Vidrio. 1 probeta de 25 mL. 1 frasco gotero con etanol. 1 frasco gotero c/fenoftaleina. 50 ml de extracto de lpidos. A cargo del da de laboratorio:

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Agua destilada. Solucin de KOH [0.5 M] Solucin de HCl [0.5 M]. Alcohol etlico. Solucin de KOH [0.1 N] Un frasco gotero con solucin de I2 en CHCl3 (cloroformo), al 1%p/v. Un frasco gotero con solucin de Br2 en agua, al 1%p/v. Dos balanzas semianalticas.

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FACULTAD DE AGRONOMA 6. METODOLOGA

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6.1. PRUEBAS DE CARACTERIZACIN CUANTITATIVA DE LIPIDOS 6.1.1. Porcentaje de pureza (%): a. Utilizando la balanza semianaltica, pese aproximadamente 40 gramos de extracto de lpidos en un beaker. Este extracto es el que prepar la prctica anterior. Recuerda? No es necesario que sean exactamente 40.0 gramos de extracto, lo importante es que sea un peso similar y usted anote dicho peso en su cuaderno de laboratorio.
b. Anote en su cuaderno la cantidad exacta de extracto que midi en la balanza. c. Coloque el extracto contenido en el beaker de 50 mL en bao de mara. Mantenga su atencin en el contenido de este beaker a fin de evitar perder toda la muestra. Esto ltimo se hace para eliminar, en lo posible, el n-hexano utilizado como solvente en la extraccin de lpidos.

d. Poco a poco usted percibir cada vez menos el olor del solvente n-hexano. Este es el momento en que usted debe suspender el calentamiento. e. Deje enfriar a temperatura ambiente y proceda a determinar la masa del lpido que queda en el recipiente. f. No deseche este residuo, pues el lpido que se utilizar en dos pruebas siguientes. g. Calcule l % de pureza con la formula siguiente:

6.1.2. ndice de Saponificacin: a. Pese 10 gramos de extracto en un erlenmeyer de 100 mL. b. Agregue 25 mL de KOH [0.5 M] (solucin etanlica). c. Caliente en bao de mara durante 30 minutos. e. Deje enfriar a temperatura ambiente. f. Agregue 3 gotas de fenolftalena en el erlenmeyer de 100 mL. g. Titule con HCl [0.5 M], hasta observar el viraje de coloracin.

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Calcule el IS de los lpidos de su muestra vegetal, dejando constancia del procedimiento utilizado. Utilice el nmero de mililitros de KOH [0.5 M] utilizados para neutralizar los cidos grasos de los lpidos, para calcular el IS. Eso es la diferencia entre los 25 mL de KOH [0.5 m] y los X mL de KOH [0.5 M] que fueron neutralizados con HCl [0.5 M].

6.1.3. ndice de acidez: a. Pese 10 gramos de extracto en un erlenmeyer de 250 mL. b. Agregue 5 mL de etanol y 3 gotas de fenolftalena. c. Titule con KOH [0.1 N] (solucin etanlica). d. Agite vigorosamente despus de cada gota de valorante aadido, para liberar los cidos grasos de los lpidos.

e. Anote el nmero de mililitros de lcali consumidos hasta el viraje del colorante. f. Dejando constancia de su procedimiento calcule la Acidez del lpido de su muestra vegetal. (Ver frmulas que aparecen en el Material de Apoyo de esta prctica? NOTA: S su grupo de trabajo posee suficiente muestra de extracto de lpidos. Procure repetir, al menos una vez las pruebas para el clculo de IA e IS.

6.1.4. Solubilidad de lpidos: Agregue en un tubo de ensayo 1 mL de lpido, 1 mL de etanol y 1 mL de agua destilada. El mililitro de la prueba de porcentaje de pureza Agregue en otro tubo de ensayo 1 mL de extracto ms 1 mL de etanol (testigo). Anote cuidadosamente las diferencias entre los dos tubos. Al observar en esta mezcla una coloracin lechosa o dos fases, se denota la presencia de lpidos.

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6.1.5. Instauracin a. Agregue en un tubo de ensayo 1 mL de muestra de lpido. El mililitro de lpido es el residuo de la prueba 6.1.2. b. Aada poco a poco, de 10 a 15 gotas de solucin de I2 en CHCl3 (cloroformo), al 1%p/v. La solucin de I2 en CHCl3 (cloroformo), al 1%p/v, se trabajar en la campana de extraccin de gases.

c. Observe cuidadosamente que sucede aqu y anote en su cuaderno de laboratorio. d. Agregue en un tubo de ensayo 1 mL de solucin de I2 en CHCl3 (cloroformo), al 1% p/v. e. Agite ambos tubos de ensayo. f. Observe si hay diferencias de coloracin en el contenido de cada tubo de ensayo. Recuerde que la decoloracin de la solucin de yodo implica la presencia de cidos grasos insaturados.

g. Dirjase a la campana de gases y observe si all encuentra una solucin de Br2 en agua, al 1%p/v. h. Si no la encuentra pregunte a su instructor. En caso de poseer esta solucin, siga con la metodologa. i. Agregue en un tubo de ensayo 1 mL de extracto. j. Aada poco a poco, de 10 a 15 gotas de solucin Br2 en agua, al 1 %p/v. La solucin de Br2 en agua, al 1%p/v, se trabajar en la campana de extraccin de gases.

Observe cuidadosamente que sucede aqu y anote en su cuaderno de laboratorio. Agregue en un tubo de ensayo 1 mL de solucin de Br2 en agua, al 1 %p/v. Agite ambos tubos de ensayo. Observe si se dan cambios de coloracin en el contenido de cada tubo de ensayo. Recuerde que la decoloracin de la solucin de bromo implica la presencia de cidos grasos insaturados.

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Examen Corto con un nivel de dificultad similar al CUESTIONARIO PRE LABORATORIO. La metodologa de evaluacin tambin incluye un Informe de prcticas. Este informe puede hacerse en parejas o individualmente, y debe incluir: Cartula. Resultados y Anlisis de Resultados.

Resultados de prctica. Estos se presentan segn las siguientes indicaciones: Aqu ha de hacerse la presentacin que se considere ms conveniente. Pueden utilizar esquemas, cuadros y/o frases para expresar lo observado durante la prctica. Aqu se incluyen tambin los resultados de la solucin a los cuadros negros. NOTA: Procure intercalar los resultados con su respectivo anlisis y explicacin. 8. PARA EL REPORTE DE PRCTICA Anlisis y explicacin de cada cuadro de resultados, es decir, expresar en palabras aquello que el estudiante crea tiene relevancia mencionar como parte del informe y que ha influido en los resultados presentados con anterioridad. (Para el caso de la prctica con el fundamento terico. Si no hubiese tal concordancia, plantee una justificacin vlida). Dar solucin a los cuadros que aparezcan en su metodologa y presentarlos tambin, intercalados con los resultados y anlisis de resultados. Como una gua de su anlisis se le recomienda utilizar la solucin a los cuadritos que aparecen para cada parte de la metodologa. Resuelva lo siguiente y colquelo al final de su Informe de prctica. o Investigue qu utilidad tiene calcular el ndice de yodo en lpidos. o Qu es un aceite esencial y qu relacin tiene con los lpidos? o Dibuje la estructura de un triacilglicerol, un fosfoglicrido y un esfigonlpido. o Por qu los asteroides y las vitaminas liposolubles son considerados como lpidos? Qu es el ndice de saponificacin? Para qu utilizo el porcentaje de pureza del extracto, para averiguar el IS? Cmo se define la Acidez de un Lpido? Cmo se define el ndice o valor de acidez? Cul es la importancia de utilizar el valor porcentaje de pureza para el clculo acidez? Justifique su respuesta. Seale la utilidad de la prueba de yodo. LABORATORIO BIOQUMICA 117

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Ha podido identificar algo con la prueba de yodo? Qu es un halgeno? Qu es un halogenuro? Qu relacin tienen estos trminos con esta parte de la metodologa? Si usted es observador notar que la metodologa de la prueba de instauracin est planteada para utilizar dos halgenos, uno en un solvente apolar (cloroformo) y otro en un solvente polar (agua). Trate de explicar la razn de este hecho particular de esta parte de la metodologa.

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