METODE PENETAPAN MELOXICA DALAM DARAHIN M KADAR SECARA KROMATOGRAFI CAIR MANUSIA VITRO KINERJA TINGGI

Harmita, Umar Mansur, Firnando Farmasi, FMIPA Universitas Indonesia Departemen

ISSN : 1693-9883 Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.2, Agustus 2004, 79 92

ABSTRACT
Until nowadays study of drug profile inside body (pharmacokinetic) and its development is still an interesting topic under pharmaceutical service. Development of an accurate analysis method for small quantity of drug in blood is an important step, HPLC method usually recommended for this purpose. Observation in studying the optimal method to analyze drug in human blood by using internal standard has been done for meloxicam, a new generation of NSAID. Two things has been focused to this observation, finding an ideal internal standard for meloxicam and testing the recovery of meloxicam in blood sample by in vitro. Coefficient of distribution of many samples (piroxicam, trimetropim, caffeine, salisilamid) gives caffeine as recommended internal standard for meloxicam. The recovery test gives 83,58% 3,802%, 74,37% 0,711%, 82,14% 1,937% for analysis meloxicam in human blood without internal standard; and 41,58% 1,108%, 61,60% 1,049% , 56,88% 0,478% for analysis meloxicam in human blood within internal standard. Keyword HPLC, quantity analysis, meloxicam, internal standard, in vitro. : PENDAHULUA N Sejak tahun 1920-an, diprakarsai oleh Widmark yang meneliti proses detoksifikasi alkohol, perhatian ilmuwan dunia mulai terfokus pada metabolisme dan eliminasi studi obat dalam tubuh. Bahkan di sampai Dunia II usai, ilmu Perang analisis biofarmasi semakin dikenal secara luas dan bahkan mulai dilakukan secara rutin dengan metode yang sistematis. Hal ini juga didukung oleh perkembangan yang pesat dari instrumen analisis yang mampu men- kadar obat dalam konsentrasi deteksi yang sangat rendah (mikro nano- per mililiter) yang gram terdapat dalam media biologis. (Kelly MT) Intensitas efek farmakologik suatu obat seringkali dikaitkan dosis dengan obat yang dikonsumsi. Namun sebenarnya konsentrasi obat bebas yang berikatan dengan reseptor-lah yang menentukan besarnya efek farmakologik yang diberikan oleh suatu obat. Reseptor sebagian

Vol. I, No.2, Agustus 2004

79

besar terdapat dalam sel-sel jaringan. Oleh karena sebagian besar sel-sel jaringan diperfusi oleh darah, maka pemeriksaan kadar obat dalam darah merupakan suatu metode yang pa- akurat untuk pemantauan ling pengo- dan batan pengoptimalan manfaat dalam pelayanan farmasi. terapi obat (Shargel, Leon, 1941) Penetapan kadar obat dalam cairan biologi membutuhkan metode dengan selektivitas tinggi, sensitivitas sampai tingkat bpj (bagian per juta), dan gangguan yang sedikit mungkin dari zat pengganggu. Salah cara satu yang banyak digunakan adalah metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). (Kelly MT) Beberapa penelitian dari Departemen Farmasi FMIPA UI mengenai dalam darah telah dilaanalisis obat kukan. Diantaranya yaitu, J. A. Kawira dalam jurnalnya mengenai of drug analysis in relation to problems therapeutic drug monitoring menjelaskan bahwa terdapat beberapa ken- serius dalam rangka analisis obat dala dalam darah yang mendorong perlunya pertimbangan terhadap berbagai memperoleh hasil yang aspek guna memuaskan, diantaranya perlunya pengadaptasian metode analisis terhadap kondisi spesifik dari laboratorium yang bersangkutan, pencegahan terhadap adanya kontaminasi dari lingkungan laboratorium dan peralatan, serta evaluasi terhadap prosedur isolasi yang tepat. (Kawira JA, 1994) Sannaria U. Marpaung melakukan penelitian dengan memodifikasi

metode penetapan kadar ambroksol dalam plasma manusia secara in vitro menurut Nobilis untuk memperoleh kembali analisis yang hasil perolehan optimum. Faktor-faktor yang dimo- adalah faktor-faktor yang difikasi berkenaan dengan tahap isolasi antara lain kecepatan dan waktu sentri- dan waktu pengocokan, fus, cara serta cara pemisahan lapisan ekstrak. Berdasarkan penelitiannya diperoleh bahwa kondisi optimum untuk isolasi ambroksol dari dalam plasma adalah dengan menggunakan sentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 6 menit, pencampuran dengan vor- selama 4 menit, dan cara pemiteks sahan lapisan ekstrak dengan metode pembekuan. (Marpaung SU, 1995) Penelitian di atas kemudian dilanjutkan oleh Erlina yang dalam penelitiannya melakukan validasi metode penetapan kadar ambroksol dalam plasma darah secara KCKT dengan menggunakan metode dari Nobilis. Parameter-parameter yang divalidasi adalah spesifitas, stabilitas, limit deteksi, ketelitian dan akurasi, dan linearitas, serta perolehan kembali. Hasil dari penelitian ini diperoleh bahwa gejala peruraian zat dalam ekstrak terjadi setelah penyimpanan lebih dari 3 hari, nilai limit deteksi 10 ng/mL dan limit kuan-20 ng/mL, nilai akurasi 97,52% titasi dan presisi 15,14%, linearitas (r) 0,9991, serta perolehan kembali sebesar 78,21% dengan menggunakan sebagai baku dalam. papaverin HCl (Erlina, 1996) Pada penelitian kali ini hendak

80

MAJALAH KEFARMASIAN

ILMU

dilakukan uji metode terhadap penetapan kadar senyawa meloxicam dalam sampel darah in vitro dengan melihat pengaruh penggunaan senyawa baku dalam pada analisis sampel darah. Sampai saat ini Farmakope Indonesia belum melampirkan metode baku untuk penetapan kadar meloxicam . British Pharmacopeia menyatakan meloxicam dapat bahwa ditetapkan kadarnya dengan menggunakan metode KCKT dengan fase gerak metanol/air (70:30; v/v) pada panjang gelombang 354 nm (Anonim, sampel darah secara 2002). Uji in vitro dilakukan dengan maksud sebagai langkah awal menuju analisis yang lebih bermanfaat yaitu analisis darah sampel in vivo . Meloxicam merupakan senyawa terbaru suatu dari golongan AINS inflamasi non steroid), (anti turunan (fenolat), yang memiliki oksikam keunggulan kerjanya yang spesifik menghambat enzim siklooksigenase yang menyebabkan terjadinya infla-( COX- ) sehingga efek samping masi 2 gastrointestinal-nya sangat rendah dibandingkan obat-obat antirheu- lainnya yang telah ada. matik (Re- Drugs and Therapeutics Cengional tre, 1997) Sampai saat ini masalah pada utama obat dalam sampel analisis darah adalah rumitnya prosedur isolasi, mengingat terjadinya ikatan antara molekul obat dengan proteinsampel darah, disamping juga dalam faktor kompleksitas komponen yang terkandung dalam darah yang bisa berinterferensi dalam analisis ikut

serta kecilnya konsentrasi obat yang dianalisis (Kawira JA, 1994). Hal ini bisa memberikan galat (kesalahan) besar pada analisis obat yang cukup dalam sampel darah. Pilihan ekstraksi cair-cair dengan penggunaan senyawa baku dalam internal stan( dard) yang tepat/ideal pada analisis kuantitatif obat dalam darah diharapkan dapat meminimalisasi galat yang timbul selama tahap isolasi darah sehingga diharapkan sampel dapat diperoleh metode analisis yang akurat dan presisi. (Kelly MT; Johson Robert S, EL, 1991) Tujuan penelitian ini adalah mencari metode penetapan kadar meloxicam yang optimal dalam darah manusia in vitro dengan menggunakan senyawa baku dalam yang cocok dengan hipotesis bahwa penggunaan yang tepat pada analisis baku dalam obat dalam darah dapat mengurangi tingkat kesalahan pada tahap isolasi dan meningkatkan keakuratan analisis.

BAHAN DAN CARA KERJA Bahan. Meloxicam (SUN Pharmaceutical Industries, India), Kofein anhidrat (BPFI),Trimetoprim (BPFI), Salisilamid (BPFI), Piroksikam (BPFI), (p.a, Merck ), Kloroform (p.a, Metanol Merck ), Akuabidestilata, Natrium Merck ), Plasma darah hidroksida ( manusia (PMI), yang mengandung dextran (ACD) adenin citrate sebagai antikoagulan, disimpan pada suhu 4 2C selama tidak lebih dari 3 minggu .

Vol. I, No.2, Agustus 2004

81

Alat Kromatograf cair kinerja . tinggi, terdiri dari kolom Whatman Partisil5, ODS-3 25 cm x 6 mm; pompa Shimadzu LC-10AD; Shidetektor madzu SPD-10A; Shimadzu integrator CBM-102, program komputer Class LC- , Spektrofotometer UV-Vis, 10 model UV-1601, Shimadzu , dilengkapi dengan integrator UV-PC v.3,9; Sheaker; Sentrifugator; Kipas angin; pendingin; Tabung reaksi, Lemari tabung sentrifuge dan rak. Cara Kerja Pembuatan larutan(1) larutan: Pembuatan larutan meloxiinduk ditimbang dengan seksama ca ; m 10,0 mg meloxicam dilarutkan dalam 100 mL metanol-air (70:30; v/v) dalam ukur untuk memperoleh labu larutan konsentrasi 100 dengan g/mL. (2) Pembuatan larutan fase gerak terdiri dari campuran yang metanol 0,001 N (70:30; NaOH v/v) Mencari kondisi analisis. (1) Mengetahui waktu meloxiretensi ca . Larutan meloxicam dienm induk cerkan hingga konsentrasi 1,0 g/ mL, kemudian disuntikkan L 20 kromatograf dengan kondisi pada fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL/ dan panjang gelombang menit deteksi 354 nm. Diperoleh waktu retensi meloxicam . (2) Mencari baku dalam (internal standard ) yang cocok dengan langkah-langkah sebagai berikut: (a) Menghitung nilai koefisien distribusi ) beberapa zat D (K Ditimbang pilihan. seksama masingmasing 10,0 mg meloxicam , piroksikam,

trimetoprim, dan kofein kemudian dilarutkan dalam 100 mL air dalam labu ukur sehingga diperoleh masingmasing konsentrasi 100 g/mL (khusus meloxicam dan pirokuntuk dilarutkan dalam metanol sikam terlebih dahulu baru di-adkan dengan Masing-masing air). larutan tersebut diekstraksi dengan klorokemudian form, lalu diukur nilai serapan masing-masing ekstrak kloroform dengan spektrofotometer UVVis. serapan masing-masing ekstrak Nilai dibandingkan terhadap serapan standard dalam kloroform dengan konsentasi yang sama. Dihitung dan dibandingkan nilai koefisien distribusi (K ) dari keempat zat tersebut. D (b) Membandingkan nilai waktu retensi beberapa zat terhadap waktu retensi meloxicam . Ditimbang seksama piroksikam, masing-masing 10,0 mg trimetoprim, dan kofein kemudian dilarutkan dalam 100 mL metanol ukur hingga diperoleh dalam labu konsentrasi masing-masing 100 g/ mL. Larutan tersebut diencerkan hingga didapat masing-masing konsentrasi 1,0 g/mL. Masing-masing larutan tersebut kemudian disuntikkan sebanyak L pada kromato20 dengan kondisi yang sama graf seperti pada tahap 2. Diamati waktu retensi tiap zat dan dibandingkan waktu terhadap meloxicam . retensi kromatogram zat yang cocok Dipilih sebagai baku dalam untuk analisis meloxicam . (3) Mencari panjang gelombang analisis yang cocok. Dibuat meloxicam dan baku larutanyang diperoleh dari tahap 3 dalam

82

MAJALAH KEFARMASIAN

ILMU

di atas dengan konsentrasi masingmasing 10 g/mL. Masing-masing larutan tersebut kemudian diukur nilai serapannya pada spektrofotometer UV-Vis dan dibuat spektrum serapannya. Dipilih nilai panjang gelombang optimum untuk analisis zat. (4) Uji kesesuaian kedua sistem. Dibuat meloxicam dengan larutan baku dalam dengan konsentrasi masing-masing 400 ng/mL dan 20 g/mL, masing-masing larutan tersebut kemudian dipipet sebanyak dicampurkan pada vial 2,0 mL dan hingga diperoleh campuran larutan meloxicam dengan konsentrasi 200 ng/mL dan baku dalam dengan kon- 10 g/mL. sentrasi Larutan campuran tersebut kemudian disuntikkan L 20 kromatograf dengan kondisi pada fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL/ dan panjang gelombang menit 300 Dihitung nilai resolusi, nm. efisiensi faktor ikutan dari krokolom, dan matogram yang diperoleh. Kemudian seksama 10,0 mg urasil ditimbang lalu dilarutkan dalam 100 mL metanol, kemudian diencerkan hingga didapat konsentrasi 10 g/mL. Larutan tersebut kemudian disuntikkan pada kromatograf dengan fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan panjang gelombang 254 nm. Diper- waktu oleh retensi urasil, kemudian dihitung faktor kapasitas dan faktor selektifitas ( a ) dari analit dan baku dalam (5) Pengujian stabilitas. Dibuat meloxicam dengan konsenlarutan trasi 1000 ng/mL, 400 ng/mL, dan

100 ng/mL (tanpa dan dengan baku 10 g/mL . Masing-masing dalam ) larutan tersebut disimpan pada lemari pendingin dan disuntikkan masing-masing 20 L secara berulang pada kromatograf pada rentang waktu 0 hari, 3 hari, 1 minggu, dan 2 minggu. Diamati adanya gejala ketidakstabilan zat dengan meng- perbandingan luas puncak hitung dan mengamati bentuk masingmasing kromatogramnya. (6) Mencari limit deteksi dan limit kuantitasi. Dibuat meloxicam dengan konsenlarutan trasi 100 ng/mL, 40 ng/mL, 20 ng/ mL, dan 10 ng/mL. Disuntikkan 20 L masing-masing larutan padatersebut kromatograf, kemudian dihitung tinggi puncak masingmasing kromatogramnya. Dihitung nilai S/ ( signal to noise ratio N ) dengan membandingkan tinggi puncak analit tinggi puncak derau ( dengan noise ) dari kromatogram pelarut. (7) Pengujian linearitas. Dibuat larutan meloxicam dengan konsentrasi 20 ng/ mL, 40 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/ 400 ng/mL, 600 ng/mL, dan mL; 1000 dari larutan induk (tanpa ng/mL dan dengan baku dalam g/mL , 10 kemudian disuntikkan ) sebanyak secara berurutan tiap 20 L larutan pada tersebut kromatograf. Dibuatpersamaan garis regresi linier kurva luas puncak (perbandingan luas puncak) terhadap konsentrasi me loxicam dalam larutan. Dihitung nilai r (koefisien korelasi) dari kedua kurva tersebut. (8) Pengujian akurasi presisi. dan Dibuat meloxicam larutan konsentrasi 1000 ng/mL, 400 dengan

Vol. I, No.2, Agustus 2004

83

ng/mL, dan 100 ng/mL dari larutan (tanpa dan dengan baku induk dalam 10 g/.mL), kemudian disuntikkan 20 L masing-masing larutan tersebut secara berulang pada kromatograf. Dihitung nilai % akurasi dan simpangan baku relatif (SBR) dari masing-masing larutan tersebut. (9) Uji ketangguhan metode. Dibuat meloxicam dengan konsenlarutan trasi 1000 ng/mL, 400 ng/mL, dan ng/mL dari larutan induk 100 (tanpa dan dengan baku dalam g/.mL), 10 kemudian disuntikkan L masing20 masing larutan tersebut secara berulang pada kromatograf. Dihitung nilai % akurasi dan simpangan baku relatif (SBR) dari masingmasing larutan tersebut untuk penyuntikkan Diuji ketangguhan inter hari. metode dengan menggunakan perhitungan statistik. (10) Pengujian sampel darah dengan meloxicam penambahan secara in vitro (a) Uji spesifitas. Diambil 10,0 mL darah segar dalam labu ukur kemudian disentrifuge selama 6 menit dengan kecepatan 2000 rpm, lalu diambil bagian plasmanya. Dipipet 2,0 mL plasma lalu diekstraksi dengan 4,0 tersebut mL kloroform dengan cara dikocok dengan sheaker selama 10 dengan kecepatan menit 100 rpm. Diambil bagian kloroform, kemudian ekstraksi diulang untuk kedua kalinya. Dikumpulkan ekstrak kloroform kemudian diuapkan sampai kering (dengan kipas angin). Residu dilarutkan dalam 2,0 mL metanol (p.a) kemudian masing-masing disuntikkan sebanyak L pada kroma20

tograf dengan kondisi fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), panjang gelombang 300 nm, dan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Diamatigangguan/interferensi pada adanya kromatogram dari ekstrak plasma blanko. (b) Uji perolehan kembali. Dibuat meloxicam dengan larutan masing-masing konsentrasi 10 ppm, 4 ppm, dan 1 ppm dari larutan induk dan dengan baku dalam (tanpa 10 g/mL). Dipipet 1,0 mL masing- larutan masing tersebut kemudian dicukupkan volumenya hingga 10,0dengan darah segar dalam labu mL ukur sehingga diperoleh konsentrasi meloxicam dalam darah 1000 ng/mL, 400 ng/mL, dan 100 ng/mL. Setelah darah itu yang telah ditambahkan tersebut meloxicam disentrifuge selama 6 menit dengan kecepatan 2000 rpm, lalu diambil bagian plasmanya. Dipipet 2,0 mL plasma ter- lalu diekstraksi dengan 4,0 sebut mL kloroform dengan cara dikocok dengan sheaker selama 10 menit dengan kecepatan 100 rpm. Diambil bagian kloroform, kemudian ekstraksi diulang untuk kedua kalinya. Dikumpulkan ekstrak kloroform kemudian diuapkan sampai kering (dengan kipas angin). Residu dilarutkan dalam 2,0 mL metanol (p.a) kemudian masing-masing disuntikkan sebanyak L pada kromato20 dengan kondisi fase gerak graf metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), panjang gelombang 300 nm, dan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Dihi- nilai perolehan kembali tung recov( ery) dari setiap konsentrasi ekstrak

84

MAJALAH KEFARMASIAN

ILMU

metanol yang disuntikkan tersebut. Dibandingkan nilai perolehan kembali sampel tanpa penambahan baku dan dengan penambahan dalam baku dalam.

piroksikam 97,82%, trimetoprim 90,69%, kofein 84,14%, dan salisilamid 80,52%. (b) Koefisien distribusi menunjukkan nilai kepolaran suatu dengan membandingkan zat kelarutannya dalam pelarut nonpolar pelarut polar. Dalam perHasil dan Pembahasan terhadap (1) Mengetahui waktu cobaan ini sebagai pelarut nonpolar retensi meloxicam . Fase gerak yang digunadigunakan kloroform dan pelarut kan adalah metanol-NaOH 0,001 N polar adalah air. Nilai K dapat juga D (70:30; v/v). Diperoleh ditentukan sebagai fraksi terekstraksi puncak meloxicam yang lebih tajam dan (dalam pelarut nonpolar). Nilai D tidak K berekor pada waktu tambat 1,595 daakan menentukan nilai waktu tambat pat dilihat pada gambar zat pada kolom. Mengingat salah 1. satu syarat suatu baku dalam yang adalah memiliki puncak ideal yang dekat dengan analit namun terpisah serta diharapkan mengurangi mampu galat tahap isolasi sampel pada darah (Johnson EL, Robert S, 1991), maka diharapkan dapat ditemukan zat yang memiliki yang dekat/mirip nilai K D dengan meloxicam dan dapat dijadikan sebagai baku dalam untuk meloxicam dalam analisis darah. waktu (menit) Dari tabel 1 (lihat Gambar 1. Kromatogram meloxicam 1,012 g/ belakang) halaman didapat mL dengan fase gerak metanol-NaOH 0,001 N diurutkan sifat kepolaran dari kedekatan (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan zat-zat tersebut me panjang gelombang deteksi 354 terhadap adalah piroksikam, tri- loxicam nm. (2) Mencari baku dalam internal metoprim, kofein, dan salisilamid. ( standard ) yang cocok (a) Untuk meyakinkan pilihan Menghitung dari bebebaku yang tepat, maka setiap nilai koefisien distribusi dalam zat rapa zat pilihan. Ditentukan tersebut dicoba disuntikkan empat pada zat sebagai pilihan baku dalam kromatograf dan dibandingkan nilai yaitu piroksikam, trimetoprim, kofein, dan waktu retensinya meloxiterhadap salisilamid. Diperoleh nilai koefisein ca . (c) Membandingkan nilai m waktu distribusi dari meloxicam 96,322%, retensi beberapa zat terhadap waktu

Vol. I, No.2, Agustus 2004

85

Tabel 1. Nilai serapan ekstrak kloroform dan standard dari meloxicam , piroksikam, trimetoprim, kofein dan salisilamid disertai dengan hasil perhitungan konstanta (K ) distribusi masing-masing D zat.

Serapan Serapan zat ekstrak standard K kloroform Meloxicam 3,612 96,322 Piroksikam 3,913 3,999 97,82 Trimetoprim 2,370 2,613 90,69 Kofein 3,311 3,935 84,14 Salisilamid 3,215 3,860 80,52 3,999
D

(%)

retensi meloxicam . Tiap larutan Trimetoprim memiliki puncak zat disuntikkan pada kromatograf deyang cukup terpisah = 1,9 R (t menit), ngan kondisi yang sama namun tidak stabil. dengan Penyuntikkan kali penyuntikka meloxicam , yaitu fase beberapa larutan n trimetoprim gerak metanol-NaOH 0,001 N menghasilkan nilai yang selalu R (70:30; Kromatogram t v/v). hasil berubah-ubah, terkadang ada penyun- tiap zat ditunjukkan di tikkan depan puncak meloxicam dan kadang pada gambar 2 yang merupakangabungan tampilan multi( vie ) tiap kromatogram. w Piroksikam memiliki nipiroxicam lai kepolaran yang paling dekat dengan meloxicam namu n ternyata memiliki puncak yang berimpit melodengan dimana puncak pirokxicam , sikam muncul pada = 1,5 R t menit. Alternatif trimetoprim meloxica kofein unutk pemisahan kedua puncak ini m dapat dilakukan dengan penambahan diammonium ortohidrogenfosfat pada fase waktu (menit) gerak (Vel Paridian P, Jaiswal J B, Harbwaz R Gambar 2. Kromatogram multiview dari K, meloxicam , piroksikam, trimetoprim, dan kofein Gupita S K, 2000), dengan kondisi fase gerak metanol-NaOH 0,001 namun ini tidak dipilih alternatif N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL.menit karena dapat beresiko memdan panjang gelombang 354 nm, guna melihat profil perpendek umur kolom. internal standard yang
cocok.

86

MAJALAH KEFARMASIAN

ILMU

ada dibelakang bahkan berimpit. Hal kemungkinan terjadi karena ini sifat trimetoprim yang sangat sensitif ter- perubahan pH, dimana fase hadap gerak menggunakan 30 bagian 0,001 N. NaOH Kofein merupakan pilihan lebih yang baik dari yang lainnya karena kepolaran yang cukup dekat memiliki dan puncak yang cukup terpisah dari meloxicam (t = 2,8 , serta stabil R menit) (tidak sensitif terhadap perubahan Salisilamid pH). tidak disuntikkan dapat diprediksi akan karena sudah memberikan puncak dengan yang R t lebih jauh dari kofein karena kepolarannya yang ada di bawah kofein, dengan melihat keefektifansehingga nya dari keempat zat di atas maka kofein sebagai baku dalam dipilih yang cocok untuk meloxicam analisis dalam darah. (d) Mencari panjang gelombang analisis yang cocok. Spektrum se-

rapan dari meloxicam dan kofein dalam metanol terlampir pada gambar 3. Meloxicam memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang ( ) 353,0 nm sedangkan mak kofein s pada 260,0 nm. Perbedaan yang mak s cukup jauh ini mendorong perlunya optimasi/mencari panjang gelombang yang optimum untuk analisis secara bersamaan. Dari kedua zat spektrum serapan kedua zat, dipilih panjang gelombang 300 nm untuk yang merupakan perpotongan analisis dari serapan kedua zat tersebut. Pada panjang gelombang ini serapan meloxicam tetap cukup besar sehingga analisis tetap akurat untuk analisis darah yang menuntut dalam kepe-analisis untuk kadar kecil (ng/ kaan mL), sementara kofein sebagai baku dapat digunakan dengan dalam konsentrasi 10,0 g/mL dimana dihasilkan respon luas puncak sebesar 6000 v (gambar 4). sistem. (e) Uji kesesuaian meloxica Hasil penyuntikkan m larutan meloxicam dengan konsentrasi kofein 200 ng/mL dan kofein dengan konsentrasi 10 g/mL. Hasil penghitungan secara manual memberikan nilai resolusi sebesar 5,538. Berdasarkan hasil perhitungan, jumlah pelat teoritis untuk meloxipuncak ca diperoleh N sebesar 787 m dengan nilai HETP 0,0319 panjang gelombang (nm) cm dan untuk puncak kofein N sebesar 1.986,61 diperoleh Gambar 3. Spektrum serapan gabungan multidengan nilai HETP ( view ) larutan meloxicam dan kofein dengan 0,01258. bahwa kofein mekonsentrasi 10 g/mL dalam Tampak
metanol.

Vol. I, No.2, Agustus 2004

87

t atau untuk M 0 t menghitung faktor kapasitas kedua zat. Suatu zat yang tidak tertambat digunakan pada yang dapat kromatografi fase terbalik diusulkan diantaranya adalah atau larutan pekat urasil dari natrium nitrat. Untuk kedua zat deteksi dapat dilakukan ini pada panjang gelombang 210 nm (Snyder LR, Kirkland JJ, Glajch JL,1997). Diperoleh nilai waktu retensi urasil adalah 1,3312 menit, sehingga faktor kapasitas untuk kedua zat dapat waktu dihitung. Diperoleh nilai (menit) k untu meloxicam adalah 0,141 Gambar 4. Kromatogram meloxicam 200 ng/ k dan kofein adalah 1,112. mL dengan baku dalam kofein 10 g/mL Nilai relatif/perbandingan dari dengan menggunakan fase gerak metanolNaOH 0,001 N (70:30; v/v) dengan kecepatan kedua faktor kapasitas ini alir 1,0 mL/menit dan panjang gelombang diberikan oleh parameter daya analisis 300 pisah ( a ), yang mana diperoleh nm. miliki nilai N yang lebih besar daya pisah meloxicam dan dari- meloxicam , sebab memiliki untuk yang cukup besar yaitu pada kofein 7,889. disimpulkan bahwa waktu retensi yang lebih besar. Dapat Peuntuk misahan berbagai komponen sampel keperluan uji kesesuaian sistem oleh kolom tergantung kepada daya berdasarkan parameter R, N, Tf, k pisah kolom terhadap komponendan a , sistem dengan menggunakan komponen tersebut. Daya pisah fase gerak metanol-NaOH 0,001 N ini sangat dipengaruhi oleh faktor kapa(70:30; v/v) dengan kecepatan alir 1,0 sitas tiap komponen sampel. Faktor mL/menit dapat dinyatakan efektif kapasitas (k) didefinisikan sebagai untuk meloxicam dengan analisissebagai baku dalam. waktu tambahan yang diperlukan kofein zat terlarut untuk terelusi, (f) Uji Stabilitas. Hasil uji dibandingkan yang tidak stadengan zat bilitas yang dilakukan dari hari ketertahanPada kromatogram tidak (k=0). 1, 2, 6, dan 14 menunjukkan bahwa dapat diidentifikasi adanya puncak campuran meloxicam dan kofein masih pelarut sehingga diperlukan stabil (F < ; a= 0,05) 0 t abe l suatu yang tidak tertambat zat dengan F tidak ditunjukkan adanya (sangat yang memberikan nilai perubahan poolar) yang bermakna pada perbandingan R t yang dapat merepresentasikan nilai luas puncak meloxicam dengan kofein.

88

MAJALAH KEFARMASIAN

ILMU

(g) Uji limit deteksi dan limit kuantitasi. Dari hasil pengujian limit deteksi diperoleh meloxicam pada konsentrasi 20 ng/mL.dan limit kuantitasi pada konsentrasi 120 ng/ mL . (h) Pengujian linearitas. kan Berdasarperhitungan statistik regresidiperoleh nilai koefisien korelinier, lasi untuk meloxicam tanpa larutan baku dalam adalah 0,9988 dan untuk larutan meloxicam dengan baku dalam adalah 0,9988. Konsentrasi yang digunakan adalah 20, 40, 100, 200, 400, dan 1000 ng/ml. (i) Pengujian akurasi dan presisi. Laruta meloxicam tanpa baku dalam, n konsentrasi 1000 ng/mL memberikan dan presisi 105,18% nilai akurasi 0,7622%, konsentrasi 400 ng/mL memberikan nilai akurasi dan presisi 103,94% 1,0047%, dan konsentrasi 100 ng/mL memberikan nilai akurasi dan presisi 103,44% 1,0593%. Laruta meloxicam dengan baku n dalam memberikan nilai akurasi dan presisi 92,65% 0,8359, konsentrasi 400 ng/mL memberikan nilai akurasi dan presisi 98,28% 0,5284%, dan konsentrasi 100 ng/mL memberikan dan presisi 104,57% nilai akurasi 0,6048%. Syarat suatu metode yang adalah memberikan nilai akurat aku-90 110% (Anonim, 1990), rasi sedangkan syarat presisi adalah memberikan nilai simpangan baku (SBR) 2% atau kurang. relatif Kriteriasebenarnya ini relatif/bisa berubah tergantung banyaknya penyuntikkan Berdasarkan kriteria yang dilakukan. di atas dan data yang diperoleh dari

hasil percobaan, maka dapat dikatakan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi kriteria akurat dan presisi. (j) Uji ketangguhan metode. Laruta meloxicam tanpa baku dalam n untuk konsentrasi 1000 ng/mL mem- nilai akurasi dan presisi berikan 102,61% 1,4367%, untuk konsentrasi 400 ng/mL memberikan nilai dan presisi 95,27% 0,8512%, akurasi dan untuk konsentrasi 100 ng/mL memberikan nilai akurasi dan presisi 104,90% 0,4698%. Sedangkan larutan meloxicam dengan penambahan baku dalam untuk konsentrasi 1000 ng/mL memberikan nilai aku-dan presisi 92,09% 0,9084%, rasi untuk konsentrasi 400 ng/mL mem- nilai akurasi dan presisi berikan 102,71% 0,5572%, dan untuk konsentrasi 100 ng/mL memberikan dan presisi 105,46% nilai akurasi 0,3403%. Bila dibandingkan dengan data akurasi dan presisi yang dilakukan pada hari pertama (tahap i di atas), maka dari data di atas (penyuntikkan hari kedua) secara umum tidak memberikan perbedaan yang bermakna/signifikan ( a = 0,05) antara penyuntikkan intra hari dan penyuntikkan inter hari (hari2). (k) Pengujian sampel. (i) Uji spesifitas. Kromatogram hasil penyuntikkan ekstrak darah tanpa penambaha meloxicam (blangko) dapat n dilihat pada gambar 5 pada lampiran. Darah yang digunakan pada analisis ini adalah darah total ( whole blood ). Pada kromatogram tampak ada bagian-bagian baseline yang tidak rata

Vol. I, No.2, Agustus 2004

89

yang berada di daerah 1 sampai 5 menit, yang merupakan daerah munculnya puncak meloxicam dan kofein. Bagian-bagian tidak rata ini memang tidak membentuk suatu puncak yang sangat mengganggu, namun sedikitnya bisa tetap mempengaruhi bentuk kromato- analisis kedua zat gram pada saat uji perolehan kembali yang membutuhkan waktu (menit) keaku- yang ratan sangat Gambar 5. Kromatogram ekstrak sampel tinggi. Pengganggu ini darah tanpa penambahan meloxicam (blangko) dengan kemungkinan berasal dari komponen fase gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan pada panjang darah yang terbawa ke dagelombang 300 lam ekstrak metanol pada nm. tahap isolasi obat. Ekstraksi plasma larutan meloxicam tanpa baku dalam dilakukan dengan dan meloxicam dengan baku menggunakan larutanditunjukkan pada gambar 6 kloroform, namun dari dalam penyuntikkan ekstrak kloroform ternyata dihasildan 7. Kedua puncak, baik meloxicam kan puncak-puncak gangguan dan kofein muncul pada nilai seR yang t sangat besar, yang perti yang diharapkan. Secara kemungkinan umum telah berjalan dengan baik berasal dari komponen lemak darah isolasi yang dapat terekstrak ke dalam karena dapat dianalisis puncak me kloroform. Oleh karena itu, diupayaloxicam dan kofein tanpa pengganggu kan memindahkan molekul obat yang berarti. Melihat ke kompleksnya dalam metanol dengan cara mengkomponen-komponen dalam darah uapkan kloroform di bawah kipas sampai sejauh ini prosedur isolasi angin (untuk menghindari tampaknya dapat dikatakan peruraian telah zat karena pemanasan) lalu berhasil. Permasalahan utama dilarut-dalam metanol, sehingga diberikan ke kutnya yang harus diamati adalah peroleh ekstrak metanol untuk besar perolehan kembali yang dihasildisuntikkan. Penyuntikkan ekstrak kan oleh metode KCKT dan prosedur meta- relatif lebih bersih dan nol isolasi untuk menghasilkan komponen perolehan analit yang mendekati lemak darah yang tidak ikut kembali terbawa ke dalam kolom. 100%. dan masuk Ekstrak meloxicam tanpa adanya (ii) Uji Perolehan Kembali. baku dalam memberikan hasil perKromatogram hasil penyuntikkan olehan kembali untuk hasil konsentrasi sebesar 82,14% 1,937%, ekstraksi darah yang 1000 ng/mL ditambahkan

90

MAJALAH KEFARMASIAN

ILMU

perolehan kembali untuk sampel darah di atas analisis 80% sebenarnya bisa dikatakan baik. (Kawira JA,1994). uji perolehan kemDari hasil bali di atas, tampak bahwa penggunaan kofein sebagai baku dalam meloxicam untuk efektif, karena justru kurang dihasilkan nilai perolehan kembali meloxicam yang lebih besar tanpa penggunaan baku dalam pada analisis. Gambar 6. Kromatogram ekstrak metanol dari sampel darah dengan penambahan meloxiHal ini mendorong larutan cam tanpa baku dalam secara in vitro dengan fase perlunya pertimbangan lebih gerak metanol-NaOH 0,001 N (70:30; v/v), lanjut dalam memilih baku kecepatan alir 1,0 mL/menit dan pada panjang dalam ideal. Salah satu yang gelombang 300 nm. hal utama yang harus yang diuntuk konsentrasi 400 ng/mL evaluasi adalah fraksi ikatan protein sebesar 74,37% 0,711%, dan untuk (Fu = fraction of unbounded ) kon- 100 ng/mL sebesar 83,58% sentrasi meloxicam (analit) dengan kofei antara n 3,802%. Sedangkan hasil perolehan (baku dalam). kembali ekstrak meloxicam dengan penggunaan baku dalam diperoleh hasil untuk kofein konsentrasi 1000 ng/mL adalah 56,88% 0,478%, untuk konsentrasi 400 ng/mL adalah 61,60% 1,049%, dan untuk konsentrasi adalah 41,58% 100 ng/mL 1,108%. Penggunaan baku da- sebenarnya diharapkan lam mampu meningkatkan % pero- kembali dari analisis obat lehan dalam darah. Namun hal waktu (menit) ini sangat tergantung dari kecoGambar 7. Kromatogram ekstrak metanol cokan suatu zat untuk dari sampel darah dengan penambahan digunakan sebagai baku dalam larutan meloxicam dan baku dalam secara in atau bisa dikatakan bahwa vitro dengan fase gerak metanol-NaOH 0,001 tantangan utama adalah menemukan N (70:30; v/v), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan pada panjang gelombang 300 nm. sua-baku dalam yang ideal. tu Hasil

Vol. I, No.2, Agustus 2004

91

KESIMPULA N 1. Analisis meloxicam tanpa baku dalam menggunakan metode KCKT fase gerak metanol-NaOH dengan 0,001 N (70:30; v/v), kecepatan alir mL/menit dan panjang 1,0 gelom-354 nm memenuhi kriteria bang akurat, presisi, dan tangguh. 2. Metode penetapan kadar meloxicam dalam darah manusia in vitro dengan menggunakan baku dalam memberikan hasil yang kurang baik atau negatif dibandingkan dengan penetapan kadar tanpa menggunakan baku dalam.

Chromatography , oleh Padmawinata K. Penerbit ITB Bandung, 2131991: 321. Kawira J.A. Problems Of Drug Analysis in Relation to Therapeutic Drug Dala : Ab Monitoring.4 th Pan Pasific Asianm stracs, The Congress On Clinical Pharmacy . July 10 14, 1994, Horison Ho- Jakarta Indonesia. The tel, Indonesian Pharmacist Association. 1994. hal.18. Kelly MT. Drug Analysis in Biologi-Fluids. Dala : Chemical Analycal m sis in Complex Matrices . Dublin, Ireland. Hal.17-97. Marpaung Modifikasi Metode SU. Penetapan Kadar Ambroksol dalam Plasma Manusia secara In Vitro menurut Nobilis . Skripsi Program Sarjana Farmasi FMIPA UI. Depok. 1995: 68+xiv. and Therapeutics CenRegional Drug tre. New Drug Evaluation: Meloxicam . Juni 1997. 2 hlm. http://www.jpet.aspetjournals . org. 25 Maret 2004, pk.16.00. Shargel, Leon; Andrew Ap B.C.Yu. Biopharmaceutics and Phar- plied macokinetics, Third edition . Appleton & Lange. 1941: 33Vel 110. Paridian P, Jaiswal J B, Harbwaz K, R Gupita S K. Development and Validation of A New High Performance Liquid Chromatography Estimation Method of Mix Biological Sample. Dari: in Jour- Chromatography and nal Bio- Science. Department med of Pharmacology, New Delhi, In- 2000. dia.

DAFTAR PUSTAKABritish Pharmacopeia , 2002. Anonim, Hal 1110 1112. Anoni . Clarkes Isolation and Identim fication of Drugs, second edition . The Pharmaceutical Press. Lon- 1986. Hal. 212 don, 213. Erlina. Validasi Metode Penetapan Kadar Ambroksol dalam Plasma Darah secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi . Skripsi Program Sarjana Farmasi FMIPA UI. Depok. 1996: 51+xiv. Ibrahim, Penggunaan Statistika Slamet. dalam Validasi Metode Analitik dan Penerapannya . Dari: Prosiding Temu Ilmiah Nasional Bidang VI. Hal 15 Farmasi 37. Indrayanto, Metoda Validasi pada G. Analisis dengan Kromatografi . Dari: Medika - Jurnal Kedokteran dan Farmasi, 1994. Hal 49-51. Johnson EL, Robert Dasar S. tografi Cair . Terj. dariKroma- Liquid Basic

92

MAJALAH KEFARMASIAN

ILMU