TINJAUAN PUSTAKA Protein merupakan segolongan besar senyawa organik yang dijumpai dalam semua makhluk hidup.

Protein terdiri dari karbon, hydrogen, oksigen, nitrogen, dan kebanyakan juga mengandung sulfur. Bobot molekulnya berkisar antara 6000 sampai beberapa juta. Molekul protein terdiri dari satu atau beberapa rantai panjang polipeptida dari asam- asam amino yang terikat dengan urutan yang khas. Urutan ini dinamakan struktur prmer dari protein. Polipeptida ini dapat melipat atau menggulung, peptide yang menggulung atau melipat ini dinamakan struktur tersier. Struktur kuarterner munculdari hubungan strukturalbeberapa polipeptida yang terlihat ( Page,1997). Enzim adalah protein globular yang umumnya berfungsi sebagai biokatalis pada semua proses kimia dalam makhluk hidup, sehingga disebut life is enzyme. Enzim mammpu meningkatkan reaksi kimia tetapi tidak diubah okeh reaksi yang dikatalisnya serta tdak megubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia. Enzim mempunyai daya katalisis spesifik yang lebih besar dari katalisator lainnya (Toha,2005).

Fungsi biologis Enzim mempunyai berbagai fungsi bioligis dalam tubuh organisme hidup. Enzim berperan dalam transduksi signal dan regulasi sel, seringkali melalui enzim kinase dan fosfatase. Enzim juga berperan dalam menghasilkan pergerakan tubuh, dengan miosin menghidrolisis ATP untuk menghasilkan kontraksi otot. ATPases lainnya dalam membran sel umumnya adalah pompa ion yang terlibat dalam transpor aktif. Enzim juga terlibat dalam fungs-fungsi yang khas, seperti lusiferase yang menghasilkan cahaya pada kunang-kunang. Virus juga mengandung enzim yang dapat menyerang sel, misalnya HIV integrase dan transkriptase balik. Salah satu fungsi penting enzim adalah pada sistem pencernaan hewan. Enzim seperti amilase dan protease memecah molekul yang besar (seperti pati dan protein) menjadi molekul yang kecil, sehingga dapat diserap oleh usus. Molekul pati, sebagai contohnya, terlalu besar

untuk diserap oleh usus, namun enzim akan menghidrolisis rantai pati menjadi molekul kecil seperti maltosa, yang akan dihidrolisis lebih jauh menjadi glukosa, sehingga dapat diserap. Enzim-enzim yang berbeda, mencerna zat-zat makanan yang berbeda pula. Pada hewan pemamah biak, mikroorganisme dalam perut hewan tersebut menghasilkan enzim selulase yang dapat mengurai sel dinding selulosa tanaman. Beberapa enzim dapat bekerja bersama dalam urutan tertentu, dan menghasilan lintasan metabolisme. Dalam lintasan metabolisme, satu enzim akan membawa produk enzim lainnya sebagai substrat. Setelah reaksi katalitik terjadi, produk kemudian dihantarkan ke enzim lainnya. Kadang-kadang lebih dari satu enzim dapat mengkatalisis reaksi yang sama secara bersamaan. Enzim menentukan langkah-langkah apa saja yang terjadi dalam lintasan metabolisme ini. Tanpa enzim, metabolisme tidak akan berjalan melalui langkah yang teratur ataupun tidak akan berjalan dengan cukup cepat untuk memenuhi kebutuhan sel. Dan sebenarnya, lintasan metabolisme seperti glikolisis tidak akan dapat terjadi tanpa enzim. Glukosa, contohnya, dapat bereaksi secara langsung dengan ATP, dan menjadi terfosforliasi pada karbonkarbonnya secara acak. Tanpa keberadaan enzim, proses ini berjalan dengan sangat lambat. Namun, jika heksokinase ditambahkan, reaksi ini tetap berjalan, namun fosforilasi pada karbon 6 akan terjadi dengan sangat cepat, sedemikiannya produk glukosa-6-fosfat ditemukan sebagai produk utama. Oleh karena itu, jaringan lintasan metabolisme dalam tiaptiap sel bergantung pada kumpulan enzim fungsional yang terdapat dalam sel tersebut. Kontrol aktivitas Terdapat lima cara utama aktivitas enzim dikontrol dalam sel. 1. Produksi enzim (transkripsi dan translasi gen enzim) dapat ditingkatkan atau diturunkan bergantung pada respon sel terhadap perubahan lingkungan. Bentuk regulase gen ini disebut induksi dan inhibisi enzim. Sebagai contohnya, bakteri dapat menjadi resistan terhadap antibiotik seperti penisilin karena enzim yang disebut beta-laktamase menginduksi hidrolisis cincin beta-laktam penisilin. Contoh lainnya adalah enzim dalam hati yang disebut sitokrom P450 oksidase yang penting dalam metabolisme obat. Induksi atau inhibisi enzim ini dapat mengakibatkan interaksi obat. 2. Enzim dapat dikompartemenkan, dengan lintasan metabolisme yang berbeda-beda yang terjadi dalam kompartemen sel yang berbeda. Sebagai contoh, asam lemak disintesis oleh

sekelompok enzim dalam sitosol, retikulum endoplasma, dan aparat golgi, dan digunakan oleh sekelompok enzim lainnya sebagai sumber energi dalam mitokondria melalui oksidasi.[63] 3. Enzim dapat diregulasi oleh inhibitor dan aktivator. Contohnya, produk akhir lintasan metabolisme seringkali merupakan inhibitor enzim pertama yang terlibat dalam lintasan metabolisme, sehingga ia dapat meregulasi jumlah produk akhir lintasan metabolisme tersebut. Mekanisme regulasi seperti ini disebut umpan balik negatif karena jumlah produk akhir diatur oleh konsentrasi produk itu sendiri. Mekanisme umpan balik negatif dapat secara efektif mengatur laju sintesis zat antara metabolit tergantung pada kebutuhan sel. Hal ini membantu alokasi bahan zat dan energi secara ekonomis dan menghindari pembuatan produk akhir yang berlebihan. Kontrol aksi enzimatik membantu menjaga homeostasis organisme hidup. 4. Enzim dapat diregulasi melalui modifikasi pasca-translasional. Ia dapat meliputi fosforilasi, miristoilasi, dan glikosilasi. Contohnya, sebagai respon terhadap insulin, fosforilasi banyak enzim termasuk glikogen sintase membantu mengontrol sintesis ataupun degradasi glikogen dan mengijinkan sel merespon terhadap perubahan kadar gula dalam darah.[64] Contoh lain modifikasi pasca-translasional adalah pembelahan rantai polipeptida. Kimotripsin yang merupakan protease pencernaan diproduksi dalam keadaan tidak aktif sebagai kimotripsinogen di pankreas. Ia kemudian ditranspor ke dalam perut di mana ia diaktivasi. Hal ini menghalangi enzim mencerna pankreas dan jaringan lainnya sebelum ia memasuki perut. Jenis prekursor tak aktif ini dikenal sebagai zimogen. 5. Beberapa enzim dapat menjadi aktif ketika berada pada lingkungan yang berbeda. Contohnya, hemaglutinin pada virus influenza menjadi aktif dikarenakan kondisi asam lingkungan. Hal ini terjadi ketika virus terbawa ke dalam sel inang dan memasuki lisosom.

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim : Pengaruh pH. Enzim mempunyai pH optimum (rentang pH) dimana enzim mempunyai aktivitas maksimal. Di atas atau di bawah pH optimum, aktivitas enzim berkurang.

Ph Gambar 2.1 Grafik Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim

Pengaruh suhu. Semua reaksi kimia dipengaruhi suhu, makin tinggi suhu maka makin tinggi kecepatan reaksi. Akan tetapi pada reaksi enzimatik, suhu terlalu tinggi menyebabkan denaturasi enzim; aktivitas enzim akan berkurang sehingga enzim mempunyai suhu optimum.

suhu Gambar 2.2 Grafik pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim Kepekatan substrat Pada kepekatan substrat rendah, bilangan molekul enzim melebihi bilangan molekul substrat. Oleh itu,cuma sebilangan kecil molekul enzim bertindak balas dengan molekul substrat. Apabila kepekatan substrat bertambah, lebih molekul enzim dapat bertindak balas dengan molekul substrat sehingga ke satu kadar maksimum.

Kepekatan enzim Pada kepekatan enzim rendah, bilangan molekul substrat melebihi bilangan molekul enzim. Oleh itu, cuma sebilangan kecil molekul substrat ditindak balas dengan molekul enzim. Apabila kepekatan enzim bertambah, lebih molekul substrat dapat bertindak balas dengan molekul enzim sehingga ke satu kadar maksimum. Penambahan kepekatan enzim selanjutnya tidak akan menambahkan kadar tindak balas kerana kepekatan substrat menjadi faktor pengehad

Pengaruh inhibitor. Inhibitor bersifat menghambat katalisis; memperlambat atau menahan reaksi enzimatik. Macam-macam inhibitor yaitu 1) inhibitor irreversibel yang biasanya terikat secara kovalen pada enzim, contohnya iodoasetat menghambat kerja enzim dehidrogenase, dan 2) inhibitor reversibel yang dapat terionisasi dari enzim contohnya malonat. Inhibitor reversibel dibagi dua yaitu yang kompetitif dan non kompetitif

(Poedjadi, 1994)

International Commision On Enzymes mengelompokkan enzim menjadi enam kelompok besar berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis yaitu:

1. Oksidoreduktase. Enzim oksidoreduktase berperan dalam pemindahan elektron (sebagai e-, atom H, atau ion hidrida) dari suatu senyawa ke suatu akseptor.

2. Transferase.

Enzim transferase memiliki fungsi dalam pemindahan gugus fungsional misalnya gugus asil, amino, metil atau fosfat.

3. Hidrolase.

Jenis reaksi yang dikatalisis oleh enzim hidrolase adalah pemisahan ikatan C-O, C-N, atau C-S dengan penambahan H2O pada ikatan.

4. Liase.

Enzim liase mengkatalisis reaksi penambahan gugus ke ikatan rangkap atau pembentukan suatu ikatan rangkap yang baru

5. Isomerase.

Jenis reaksi yang dikatalisis oleh enzim isomerase adalah reaksi pemindahan gugus di dalam molekul untuk menghasilkan bentuk isomerik.

6. Ligase.

Enzim ligase mengkatalisis reaksi pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O dan C-N disertai penguraian berenergi tinggi misalnya ATP. (Djaeni Sediaoetama Prof.Dr.Achmad .
M.Sc.2004. Ilmu gizi untuk mahasiswa dan profesi.Jili I. Dian Rakyat: Jakarta;31-4)

Protease merupakan enzim yand dapat memecah ikatan peptida. Protease dapat diisolasi dari berbagai sumber, yaitu tumbuhan, binatang, dan mikroba (jamur, bakteri). Enzim protease memegang peranan penting dalam berbagai reaksi biokimia yang terjadi di dalam organisme hidup termasuk degradasi protein menjadi asam-asam amino dan peptida sehinga dapat digunakan sebagai nutrien. Selain itu juga berperan penting dalam proses pembentukan spora, modifikasi enzim dan sekresi berbagai enzim-enzim protein. Pada umumnya protease merupakan enzim monomer dengan berat molekul sekitar 15-45 kDa (Suhartono et al., 1997)

Klasifikasi terhadap protease ada beberapa macam. Berdasarkan letak penyerangan terhadap ikatan peptida protein, protease dibagi menjadi 2 golongan, yaitu eksopeptidase dan endopeptidase. Eksopeptidase/peptidase memecah ikatan peptida pada ujung amino rantai polipeptida; dan karboksipeptidase yang memecah ikatan peptida pada ujung karboksil rantai polipeptida. Amino peptidase melepaskan residu asam amino tunggal, suatu dipeptida/tripeptida; sedangkan karboksipeptidase melepaskan asam amino tunggal atau suatu dipeptida. Endopeptidase atau proteinase memecah ikatan peptida di dalam rantai polipeptida, yang letaknya jauh dari ujung amino atau ujung karboksil rantai polipeptida. Oleh karena itu produk yang dihasilkan endopeptidase merupakan fragmen peptidase yang besar (Rao et al., 1998). Protease dapat diklasifikasikan berdasarkan aktivitasnya dan gugus fungsionalnya. Protease serin adalah endopeptidase yang memiliki residu serin yang reaktif dan memiliki pH optimum sekitar pH netral. Protease aspartat merupakan endopeptidase yang memiliki gugus asam aspartat yang penting dan pH optimumnya pada pH yang rendah. Protease sistein adalah endopeptidase yang berbeda dengan protease serin karena memiliki residu sistein yang aktif. Protease seng yang merupakan metalloenzim, beraktivitas pada pH netral (Fresht, 1984). Sentrifugasi merupakan suatu cara pemisahan yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan sedimentasi dari partikel-partikel yang disebabkan oleh medan sentrifugal. Partikel-partikel yang semula terdistribusi secara merata dalam larutannya, pada kecepatan perputaran tertentu akan bergerak meninggalkan larutan induknya. Apabila densitas partikelpartikel terlarut lebih besar dari pelarutnya, maka partilkel-partikel akan mengendap (Wilson & Walker, 2000).

Pada dasarnya sentrifugasi dilakukan dengan menempatkan partikel dan medium suspensinya dalam suatu medan gaya sentrifugal. Medan sentrifugal menyebabkan partikel bermigrasi lebih cepat ke arah luar dari sumbu rotasi. Dalam opersainya sentrifugasi di jalankan dengan menaruh partikel danmedium suspensinya dalm suatu tabung yang ditempatkan pada ujung dari alat yang berputar yaitu rotor. Macam-macam sentrifugasi adalah :Sentrifugasi klinik, Sentrifugasi dengan pendingin, Ultra sentrifugasi (Scopes, 1994). Kromatografi filtrasi gel disebut juga permiasi gel, kromatografi ekslusi dan saringan molekular (Scopes, 1994). Molekul-molekul gel matriks memiliki pori-pori dengan berbagai diameter. Ketika larutan contoh dilakukan ke dalam kolom yang berisi matriks gel tersebut, maka molekul-molekul yang lebih besar daripada pori-pori matriks tidak akan tertahan oleh gel. Molekul-molekul yang lebih kecil memasuki pori-pori matriks. Oleh karena itu keluarnya contoh dari kolom berurutan dengan menurunnya ukuran molekul (Holme & Peck, 1993). Sephadex merupakan polimer dekstran yang dimodifikasi sehingga terbentuk ikatan silang yang berbeda yang dapat menentukan ukuran pori-pori yang terbentuk. Matriks ini merupakan polimer yang sangat hidrofilik dan mengembang dengan baik dalam air (Holme & Peck, 1993). Masing- masing protein memiliki tingkat stabilitas yang berbeda tergantung dari hal- hal berikut (Lehninger, 1982) : 1. Penambahan Garam Pada penambahan garam ini terjadidua fenomena yaitu : a. Salting in

Pada proses ini, dengan penambahan garam yang sedikit maka akan menyebabkan peningkatan kelarutan protein b. Salting out Fenomena ini terjadi apabila konsentrasi garam yang ditambahkan tesebut dinaikkan terus 2. pH protein memiliki titik isoelektrik,yatu padapH yang menunjukkan jumlah muatanpositif dan negative sama dalam protein itu sehingga pada keadaan ini daya larut protein minimum. Pada pHini tidak akan bergerak bbila dletakkan dalam medan listrik. pH isoelektriknya dtentukan oleh jumlah dan pK gugus R yang berionisasi. Dalam larutan dengan pH diatas pH isoelektrik protein akan bermuatan negatifdan akan bergerak ke anoda, pada pH sebaliknya protein akan bermuatan postif dan bergerak ke katoda. 3. tingkat oksidasi kebanyakan proteinmengandung sejumlah gugus sulfhidril bebas. Pada oksidasi gugus sulfihidril membentuk ikatan disulfida antara dan intermolekuler dan dapat menyebabkan hilangnya aktivitas enzim. 4. Logam berat selan oksidasi, gugus sulfihidril juga dapat bereaksi dengan logam berat seperti Pb, Fe atau Cu. Logam berat ini biasanya berasal dari reagen yang digunakan untuk membuat buffer, resin penukar ion dan air yang dipergunakan pada pembuatanlarutan. Jadi dalan hal ini perlu digunakan air suling yang bebas ion logam.

Salah satu tahap yang banyak digunakan untuk pemurnian protein adalah pengendapan protein. Pengendapan ini dapat dilakukan dengan mengubah kekuatan ionic, pH, pnambahan pelarut organic, polimer dan penambahan garam. Garam garam yang efektif digunakan pada proses pengendapan protein adalah garam yang multi anonik seperti sulfat, fosfat, dan sitrat (Scopes,1994). Ada dua hukum yang menyusun persamaan absorbansi: 1. Hukum Baugness (Lambert) Hukum Lambert menyatakan bila cahaya monokromatik melewati medium tembus cahaya, laju berkurangnya intensitas oleh bertambahnya ketebalan, berbanding lurus dengan intensitas cahaya.Ini setara dengan menyatakan bahwa intensitas cahaya yang dipancarkan berkurang secara eksponensial dengan bertambahnya ketebalan medium yang menyerap (Basset et al.,1994). 2. hukum Beer hubungan antara konsentrasi spesies menyerap dan tingkat adsorpsi dirumuskan oleh Beer. Hokum itu dapat ditetapkan benar- benar hanya untuk radiasi monokromatik dan dimana sifat dasar spesies penyerap berubah sepanjang jangka konsentrasi yang diselidiki. Hokum lambert dan Beer digunakan menjadi rumus yang dikenal dengan persamaan Lambert-Beer: A = a.b.c Keterangan A: absorbansi a : koefsian absorbansivitas b : panjang medium

c : konsentrasi spesi ( Schenk, 1981)