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Biotecnologia Microbiana

Extremfilos: microrganismos prova de agresses ambientais extremas


imaginao. Habitats terrestres, aparentemente inspitos, so de facto populados por microrganismos que parecem optimamente adaptados agrestidade desses ambientes. Desde a aridez e salinidade extremas dos desertos salinos da Etipia, s frgidas calotes polares da Antrtida, aos infernos sulfurosos do sul de Itlia, s emanaes de lama negra superaquecida das fossas abissais do Pacfico, ou aos campos fortemente radioactivos de Chernobyl, a Vida subsiste e propaga-se admiravelmente. O termo extremfilo foi usado pela primeira vez por MacElroy em 1974, para designar organismos que proliferam em ambientes extremos. A necessidade de definio transfere-se assim para ambiente extremo. Os taxonomistas definem ambientes extremos como aqueles

Helena Santos1 , Pedro Lamosa1 , Milton S. da Costa2


1

Instituto de Tecnologia Qumica e Biolgica, Universidade Nova de Lisboa, Rua da Quinta Grande, 6, Apt. 127, 2780 Oeiras, Portugal. Departamento de Bioqumica, Universidade de Coimbra, 3000 Coimbra, Portugal.

Sumrio
Microrganismos existem capazes de proliferar numa variedade de ambientes caracterizados por extremos de temperatura, salinidade ou valores de pH, que, primeira vista, inviabilizariam qualquer forma de vida. Esta ideia tradicional de vida deve-se talvez a preconceitos e a limitaes impostas pela nossa prpria filogenia. De facto, estamos adaptados a um ambiente ameno, tal como a maioria dos seres que conosco co-habita este planeta. Por isso, surpreendente encontrar vida a temperaturas prximas do ponto de ebulio da gua ( presso normal) ou mesmo a temperaturas superiores a 100C, sob presses mais elevadas. tambm admirvel que possa existir vida a pH 0 (equivalente a uma soluo 0,5 M em cido sulfrico), ou a pH 11, ou em solues saturadas de NaCl, ou que haja organismos que toleram nveis de radiao gama dezenas de milhares de vezes superiores aos que so letais para a maioria dos seres que conhecemos. Estas propriedades notveis vieram modificar drasticamente o conceito tradicional de ambiente habitvel: embora seja impensvel encontrar vida numa rocha fundente ou organismos capazes de crescer na ausncia total de gua, comea a ser razovel supor que haver microrganismos capazes de habitar certos nichos em outros planetas, tais como Marte ou Europa, at h pouco considerados inspitos. Este artigo de reviso

pretende dar uma viso sumria da diversidade, fisiologia e potencial biotecnolgico deste grupo fascinante de organismos, os extremfilos.

Introduo
A capacidade de adaptao a alteraes ambientais uma das caractersticas mais impressionantes da Vida na Terra. A diversidade de ambientes colonizados e a multiplicidade de solues adaptativas encontrada desafiam a mais frtil

Furnas (Aores)

Fumarola (Fossa no Oceano Pacfico)

Deserto (China)

Salinas (Califrnia, E.U.A.)

Figura 1. Ambientes extremos.

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que apresentam diversidade biolgica restrita visto que a maioria dos organismos excluda. Ns preferimos a definio antropocntrica que considera ambientes amenos aqueles que tm temperaturas prximas da ambiente e at 40C, valores de pH prximos da neutralidade, contedo em sais da ordem do dos oceanos, presso atmosfrica e nveis de radiao semelhantes aos que atingem naturalmente a superfcie terrestre. Portanto, zonas geotrmicas ou regies polares, nascentes cidas ou alcalinas, lagos com nveis de salinidade prximos da saturao, regies abissais frias ou zonas bombardeadas artificialmente com nveis elevados de radiao, so ambientes terrestres imediatamente reconhecidos como extremos luz desta definio (Fig. 1). O estudo dos microrganismos provenientes destes ambientes extremos, pode fornecer informao valiosa acerca da origem da Vida na Terra e das suas estratgias adaptativas aos ambientes onde esta prosperou. Alguns extremfilos, especialmente os que proliferam em zonas hipersalinas (halfilos), so conhecidos h mais de seis dcadas. No entanto, as descobertas na dcada de 70 do terceiro ramo da rvore da vida os Archaea , e na dcada de 80 de organismos hipertermfilos que apresentam temperaturas ptimas de crescimento prximas ou acima do ponto de ebulio da gua, veio injectar um novo flego nas discusses sobre a origem da vida e a sua existncia noutros planetas (Woese et al., 1990;1998). A extremofilia no constitui uma caracterstica filogentica. Embora exemplos de extremofilia ocorram frequentemente em ambos os domnios procariotas (Bacteria e Archaea), os dados disponveis permitem concluir que os organismos resistentes a extremos de agresso das condies ambientais tendem a pertencer ao Domnio Archaea. Por exemplo, todos os hipertermfilos com temperatura

EUKARYA
Fungos (Debaryomyces) Algas Animais (Dunaliella )

BACTERIA
PROTEOBACTERIA Hydrogenophilus Halomonas Thiobacillus Polaromonas

ARCHAEA
Metallosphaera Desulfurococcus Sulfolobus Hyperthermus Aeropyrum Pyrobaculum Pyrodictium

CYTOPHAGALES Rhodothermus Polaribacter

GRAM-POSITIVAS Alicyclobacillus Bacillus Clostridium Thermus Deinococcus

CYANOBACTERIA Synechococcus

Thermotoga

Dictyoglomus

Pyrococcus Methanothermus Archaeoglobus

Methanopyrus Aquifex Thermoplasma Halococcus

Hipertermfilos Termfilos Halfilos

Extremosde pH Psicrfilos Resistentesa radiao

Picrophilus Natronococcus

Figura 2. rvore filogentica segundo Woese et al., 1990, com localizao de extremfilos. O tipo de extremofilia est identificado com o cdigo de cores indicado.

ptima de crescimento superior a 100C so arquees, bem como os outros recordistas de extremofilia (os mais halfilos ou os mais acidfilos) que parecem situar-se preferencialmente entre os organismos do domnio Archaea (Fig. 2). Exemplos notveis so arquees do gnero Halobacterium, que se desenvolvem em ambientes salinos saturados (5,2 M NaCl); o arqueo Pyrolobus fumarii apresenta uma temperatura ptima de crescimento de 106o C, continuando a proliferar at ao limite de aproximadamente 115o C, enquanto que os arquees do gnero Picrophilus se desenvolvem a pH 0 (Blchl et al., 1997; Schleper et al., 1995). No entanto, vale a pena salientar que as microalgas do gnero Dunaliella so praticamente to halfilas como os arquees da famlia Halobacteriaceae e que os organismos conhecidos com maior resistncia a radiaes, ou melhor adaptados a ambientes alcalinos, pertencem ao domnio Bacteria.

Muitas vezes se tem associado a grande resilincia dos arquees particularidade filogentica de possurem lpidos membranares com isoprenides ligados a glicerol por ligaes ter. No entanto, esta concluso no est suficientemente documentada e no parece plausvel. A adaptao de organismos a condies ambientais extremas obrigou-os a desenvolver componentes celulares e estratgias bioqumicas para o efeito. Devido s caractersticas excntricas destes microrganismos, os componentes moleculares deles retirados possuem muitas vezes propriedades que os tornam especialmente adequados para utilizao em processos industriais. Neste contexto, hoje geralmente aceite que estes microrganismos constituem um precioso repositrio de molculas de interesse industrial e um excelente recurso para o desenvolvimento de novas aplicaes biotecnolgicas

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que se espera possam revolucionar o nosso quotidiano e o avano do conhecimento. De facto, sinais dessa revoluo j so patentes; basta notar as consequncias da introduo das polimerases de DNA termoestveis no desenvolvimento e automatizao da reaco em cadeia da polimerase (PCR) com to notvel impacto no desenvolvimentos das ferramentas genticas e no avano do nosso conhecimento dos fenmenos biolgicos. Assim, no so de estranhar as expectativas da comunidade cientfica e da indstria em relao investigao de extremfilos e dos produtos deles derivados. espcies do gnero Halococcus tm uma parede espessa constituda por um heteropolissacrido sulfurado que estabilizado por concentraes elevadas de sdio. Estas caractersticas das paredes celulares de arquees extremamente halfilos parecem constituir o nico exemplo claro de adaptao da parede celular de arquees a condies ambientais extremas. Se esta estratgia de acumulao de elevados nveis de sais inorgnicos permite aos halfilos extremos ocupar um nicho ambiental praticamente inacessvel aos demais microrganismos, tambm um facto que os restringe a esse mesmo nicho, impossibilitando-os de colonizar outras zonas de salinidade mais moderada ou sujeita a grandes alteraes. Em contraste, os halfilos moderados utilizam, em geral, estratgias de osmoadaptao mais flexveis que lhes permitem responder rapidamente a flutuaes de salinidade do meio exterior. Neste caso, as estratgias de adaptao passam pela acumulao de solutos compatveis, compostos orgnicos de baixa massa molecular, quer importados do meio quer sintetizados de novo, e que, mesmo em concentraes elevadas, so inofensivos para a funcionalidade das protenas e de outros componentes celulares (Fig. 3). Trealose, betanas, ectonas, e glicerol so alguns dos solutos compatveis mais frequentemente associados a estratgias de osmoadaptao em halfilos que proliferam em ambientes com valores moderados de salinidade. No entanto, as microalgas do gnero Dunaliella usam solutos compatveis (glicerol) para contrabalanar a presso osmtica em ambientes extremamente salinos. Esta estratgia no implica a modificao dos componentes celulares como um todo e permite responder com versatilidade a flutuaes rpidas da salinidade do meio. A acumulao de solutos, alm de conferir uma larga adaptabilidade, apresenta ainda a vantagem de proteger a clula contra agresses moderadas de temperatura. Talvez seja por este conjunto de factores que a acumulao de solutos orgnicos constitui a soluo encontrada na grande maioria dos microrganismos conhecidos.

Adaptao a ambientes salinos: halfilos


Halfilos extremos (arquees da famlia Halobacteriaceae ou bactrias da famlia Haloanaerobiales) acumulam, em + + geral, ies inorgnicos (K , Na , Cl ) em concentraes elevadas para contrabalanarem a presso osmtica externa e manterem a integridade celular. Esta forma de osmoadaptao evoluiu concomitantemente com modificaes estruturais num grande nmero de componentes celulares. As protenas destes organismos contm um excesso considervel de resduos com carga elctrica negativa e a actividade cataltica das enzimas depende da presena de sais, caractersticas moleculares de adaptao a ambientes com salinidade extrema. A composio de aminocidos das protenas talvez o efeito mais bvio e notvel da elevada concentrao salina no citoplasma, mas outros componentes celulares, como os ribossomas, tambm apresentam modificaes. Alm disso, a parede celular dos arquees do gnero Halobacterium contm glicoprotenas com elevado nmero de aminocidos carregados negativamente e que so estabilizadas por interaco com ies sdio do meio exterior. Tambm as

Adaptao a temperatura elevada: termfilos e hipertermfilos


No contexto de extremofilia, a descoberta contempornea mais surpreendente foi sem dvida a dos organismos hipertermfilos por Karl O. Stetter, que obrigou extenso para cerca de 115C do limite superior da gama de temperatura em que clulas vivas proliferam eficientemente (Blchl et al., 1997) (Fig. 4). Esta caracterstica notvel implica estabilizao de todos os

H2O O

H2 O H

H2 O H

Figura 3. Diversas estratgias usadas por microrganismos em resposta a um aumento da salinidade do meio de modo a manter o balano osmtico. AImportao de sais inorgnicos para o citoplasma. B- Importao de solutos compatveis presentes no meio. C- Sntese de novo de solutos compatveis.

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1,2 Taxa de crescimento (h-1) 1,0 Actividade (%) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 95 100 105 110 Temperatura (oC) 115 Temperatura(C) 100 80 60 40 20 0 40 50 60 70 80 90 100 110

Figura 4. Perfil de crescimento do hipertermfilo Pyrolobus fumarii em funo da temperatura. de notar que o organismo no cresce abaixo de 95 C (Blchl et al., 1997).

Figura 5. Perfil de actividade de uma enzima intracelular de Pyrococcus horikoshii (sintetase do manosilfosfoglicerato) em funo da temperatura. A enzima apresenta actividade mxima entre 90 o C e 100o C (Empadinhas et al., 2001).

componentes celulares de modo a que a sua funcionalidade seja mantida em condies de temperatura que seriam danosas para a maioria das biomolculas dos organismos mesfilos (Fig. 5). A elucidao das estratgias usadas na estabilizao de componentes celulares, e em especial de protenas, representa um desafio fascinante para a Biofsica actual. Apesar da intensa actividade de investigao desenvolvida nesta rea, a questo da estabilizao de biomolculas a temperaturas to elevadas permanece enigmtica. Surpreendentemente, as protenas de hipertermfilos so constitudas pelos mesmos 20 aminocidos presentes em todas as outras; estudos comparativos de estruturas primrias de protenas homlogas isoladas de organismos mesfilos e tambm de psicrfilos, no revelaram diferenas consistentemente correlacionveis com diversos graus de termoestabilidade. A dificuldade inerente resoluo desta questo deriva do facto de a energia livre de estabilizao correspondente a uma protena termoestvel proveniente de um hipertermfilo diferir muito pouco da de uma protena homloga mas proveniente de um mesfilo. De facto, a energia livre de estabilizao de uma protena globular varia entre 5 e 15 kcal mol-1 independentemente dos requisitos em relao temperatura para crescimento do organismo de que provm (Vieille & Zeikus, 1996). Este valor equivale

formao de um pequeno nmero de ligaes por ponte de hidrognio, interaces inicas ou hidrfobas; assim, a soluo do problema tem um grau de indeterminao extremamente elevado uma vez que as variaes estruturais susceptveis de produzir esta pequena estabilizao adicional podero ser mltiplas e subtis. O conhecimento actual, baseado em comparaes de protenas com diferentes graus de estabilidade trmica, sugere que a estabilizao envolve vrios nveis na hierarquia da estrutura de protenas, nomeadamente secundria, supersecundria, terciria e quaternria (Jaenicke & Bhm, 1998). Apesar desta expectativa pouco animadora e de muitos exemplos em que argumentos de senso comum conduziram a resultados frustrantes, h algumas tentativas com sucesso em que a substituio pontual de resduos em enzimas conduziu a incrementos notveis na estabilidade trmica e tambm na actividade cataltica (Arnold et al., 1999; Giordano et al., 1999). Uma das particularidades interessantes que estes estudos comparativos revelaram foi o desempenho pouco eficiente das enzimas de hipertermfilos quando comparadas com as anlogas provenientes de mesfilos ou psicrfilos. Em geral, as actividades catalticas especficas das enzimas altamente termo-estveis so inferiores, ou quando muito semelhantes, s das enzimas de

mesfilos ou psicrfilos quando determinadas aos valores respectivos de temperatura ptima de funcionamento. A explicao mais frequentemente encontrada a de que a estrutura de enzimas de hipertermfilos mais rgida. Do compromisso entre rigidez necessria para estabilidade trmica e flexibilidade requerida para actividade cataltica, resultaria um estado funcional optimizado semelhante ao do das enzimas dos mesfilos temperatura ambiente (Danson et al., 1996; Gerday et al., 2000; Ladenstein & Antranikian, 1998). Apesar do interesse fundamental e tambm aplicado deste tpico, os dados disponveis so ainda escassos e, muito recentemente, resultados de medidas de velocidade de permuta proto/deutrio na rubredoxina do hipertermfilo Pyrococcus furiosus parecem questionar a validade da hiptese da maior rigidez das protenas extremamente termoestveis (Hernandez et al., 2000; Jaenicke, 2000). Embora a maioria das protenas isoladas de hipertermfilos tenha uma estabilidade trmica elevada, h vrios exemplos de enzimas intracelulares que in vitro apresentam uma baixa estabilidade temperatura ptima de crescimento do organismo. Esta observao sugere a presena de factores extrnsecos que contribuam para a estabilizao de biomolculas a

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OH OH HO HO OH

O P O

OH

OH OH HO OH OH OH HO

CH2OH

O OH CH2OH O

Manosilglicerato

Fosfato dedi-myo-inositol

COOH

CH2OH HO HO

O OH

O O O OH P O OH Fosfato de di-manosil-di-myo-inositol O HO

O HO

CH2OH OH OH HO HO

CH2OH

O OH CH2OH

OH HO HO

OH OH OH Manosilgliceramida O

C O OC O

NH2

O P HO OH O

OH O O OH OH O

O O

P O

P O

Fosfatode diglicerol

2,3-Bisfosfoglicerato cclico

Figura 6. Solutos compatveis essencialmente restritos a arquees ou bactrias termfilas ou hipertermfilas.

temperaturas elevadas. Em anos recentes foram isolados e caracterizados vrios compostos orgnicos de baixa massa molecular, que se acumulam intracelularmente em resposta a uma elevao da salinidade e/ou da temperatura do meio de cultura em hipertermfilos halfilos ou halotolerantes. Alguns destes compostos (manosilglicerato, fosfato de di-mio-inositol, fosfato de diglicerol) foram detectados apenas em microrganismos termfilos ou hipertermfilos (Fig. 6). Alm disso, testes in vitro demonstraram a sua capacidade termoestabilizadora sobre uma variedade de protenas (Lamosa et al., 2000; Ramos et al., 1997) (Fig. 7). Portanto, possvel que estes compostos participem nas mltiplas estratgias usadas pelos organismos hipertermfilos para contrariar os efeitos adversos da temperatura elevada sobre a integridade das estruturas celulares (Santos & da Costa, 2001).

Contrariando as expectativas iniciais, a procura de marcadores de hipertermofilia no tem tido grande sucesso; as caractersticas ou componentes apontados a certo tempo como marcadores foram sendo sucessivamente desmentidos, medida que o volume de dados crescia e se constatava que as caractersticas eleitas estavam afinal mais relacionadas com filogenia do que com hipertermofilia ou mesmo extremofilia. O nico marcador enzimtico que at agora resistiu ao acumular de dados a girase reversa, encontrada apenas em organismos hipertermfilos e que parece ter uma funo importante em conferir estabilidade trmica adicional dupla hlice do DNA (Bouthier de la Tour et al., 1990). A nvel de caractersticas metablicas tambm no se encontrou correlao credvel. Os primeiros hipertermfilos extremos isolados eram estritamente anaerbios e esta observao conduziu hiptese de que um metabolismo aerbio seria

incompatvel com hipertermofilia extrema devido baixa solubilidade do oxignio a 100C. No entanto, no incio da dcada de 90 a comunidade cientfica foi surpreendida pela descoberta de hipertermfilos aerbios com temperatura ptima de crescimento de 100C (Sako et al., 1996). De facto, a solubilidade do oxignio em gua diminui com a elevao da temperatura, mas necessrio ter em conta tambm o aumento do coeficiente de difuso com a temperatura. Em relao ao metabolismo de acares em hipertermfilos os resultados ficaram aqum das expectativas quanto a grandes inovaes em vias metablicas e enzimas. O sistema de transporte para a maltose em Thermococcus litoralis relativamente semelhante ao de Escherichia coli. No entanto, a afinidade para o substrato notvel: trs ordens de grandeza

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elevadas (Forterre & Philippe, 1999). Nas espcies examinadas da ordem Thermococcales, gliceraldedo-3-fosfato convertido num nico passo em 3-fosfoglicerato, sendo uma ferredoxina (e no NAD+) o aceitador de electres. Poderia pensar-se que esta uma estratgia para evitar a utilizao de uma coenzima instvel em hipertermfilos. No entanto, em Thermoproteus tenax (temperatura ptima 90C), NAD+ usado como coenzima nesta mesma reaco, e Pyrobaculum aerophilum (temperatura ptima 100C) contm quantidades elevadas de desidrogenase de glutamato dependente de NAD+. Provavelmente existem estratgias especficas para estabilizar esta e outras coenzimas. Opes concebveis so: reciclagem rpida das coenzimas, direccionamento metablico, factores estabilizadores extrnsecos, ou elevada eficincia cataltica das enzimas relevantes. O avano no conhecimento
Via Embden-Meyerhof modificada
Glucose
ADP AMP

A
120
CH OH 2

B
400
HO O OH CHOH 2 O HO O P O OH O OH OH OH HO

% de actividade residual

100 80 60 40

300

t 1/2 (min)

COOH

200

100 20 0 0

40

45

50

55

62

Temperatura (C)
Sem adies K- Mannosilglicerato(500 mM) Sem adies

RdDd

rRdCp

rRdDg

Fosfato de diglicerol (100 mM)

Figura 7. Efeito estabilizador de hipersolutos em protenas. A- As barras representam os valores de actividade residual determinados numa soluo de desidrogenase do lactato de coelho aps tratamento durante 10 minutos s temperaturas indicadas, na ausncia ou presena de manosilglicerato (Ramos et al., 1997). B- As barras indicam os tempos de meia-vida para a desnaturao trmica a 90o C, na presena ou ausncia de fosfato de diglicerol, de trs rubredoxinas: RdDd- extrada de Desulfovibrio desulfuricans, rRdCp- rubredoxina recombinante de Clostridium pasteurianum , rRdDg- rubredoxina recombinante de Desulfovibrio gigas (Lamosa et al., 2001).

superior no organismo hipertermfilo, sendo este o sistema de transporte conhecido com afinidade mais elevada (Horlacher et al., 1998; Xavier et al., 1996). A proposta inicial de Michael Adams sobre a ocorrncia em Pyrococcus furiosus de uma via Entner-Doudoroff no fosforilativa (pirogliclise), associada a hipertermofilia, mostrou-se incorrecta (Kengen et al., 1994); este organismo utiliza uma via EmbdenMeyerhof em que inesperadamente tanto a hexocinase como a fosfofructocinase usam ADP como doador do grupo fosforilo (Fig. 8). Esta particularidade metablica s foi at agora encontrada em espcies da ordem Thermococcales, mas as vias glicolticas de hipertermfilos extremos, nomeadamente pertencentes aos gneros Pyrolobus, Pyrobaculum e Pyrodictium, ainda no foram estudadas (Selig et al., 1997). provvel, no entanto, que a utilizao de ADP, em vez de ATP ou de pirofosfato, no esteja relacionada com hipertermofilia. Uma questo talvez to importante como a das estratgias de estabilizao de protenas e de outras macromolculas a da estabilizao de coenzimas, nomeadamente de NAD+ que muito instvel a

temperaturas prximas de 100C. Alis, a instabilidade trmica de algumas biomolculas essenciais serve de base a um dos argumentos usados pelos opositores teoria que defende que a Vida teve origem a temperaturas
Via Embden-Meyerhof convencional
Glucose
ATP

Hexocinase
ADP

Glucose-6-P

Glucose-6-P

Frutose-6-P
Fosfofrutocinase
ATP ADP

Frutose-6-P
ADP AMP

Frutose-1,6-bP

Frutose-1,6-bP

DHA-P

Gliceraldedo -3-P
Gliceraldedo-3-P desidrogenase
Pi + NAD +

DHA-P

Gliceraldedo -3-P
Ferredoxinaox

NADH + H+

1,3-bP-Glicerato
ADP

Fosfoglicerato cinase

Gliceraldedo-3-P: ferredoxina oxidorredutase

Ferredoxinared

ATP

3-P-Glicerato

3-P-Glicerato

Piruvato

Piruvato

Figura 8. Vias metablicas para a gliclise. A via Embden-Meyerhof modificada foi encontrada em arquees hipertermfilos pertencentes ordem Thermococcales (gneros Thermococcus e Pyrococcus). As reaces diferentes esto indicadas a vermelho.

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relativamente a este tpico requer a disponibilidade de um maior nmero de dados experimentais. A acessibilidade cada vez maior a sequncias completas de genomas de hipertermfilos faz prever um progresso considervel no conhecimento da fisiologia destes organismos nos prximos dez anos. A importncia e o interesse desta rea de investigao denota-se, por exemplo, no detalhe de todos os arquees com sequenciao do genoma finalizada ou em curso serem termfilos ou hipertermfilos: Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Aeropyrum pernix, Pyrobaculum aerophilum e Sulfolobus solfataricus. As questes levantadas pela ocorrncia de organismos extremfilos, que no hipertermfilos no so menos interessantes; no entanto o nvel de conhecimento , em geral, mais limitado. que, em relao a pH, no difere substancialmente do do citoplasma dos neutrfilos. Mas uma questo que surge imediatamente a seguinte: como conseguida a homeostase de pH nestes organismos? Nos alcalfilos respiratrios, existe ainda o enigma fundamental da sntese de ATP numa situao em que existe um elevado gradiente transmembranar de protes com uma orientao inversa da que quimiosmoticamente produtiva. Estudos sobre a bioenergtica de alcalfilos foram feitos de modo sistemtico em espcies de Bacillus firmus. A ATP sintase dos organismos alcalfilos examinados utiliza um gradiente de protes e no de sdio, como foi inicialmente sugerido. No entanto, a homeostase de pH depende da presena de io sdio, atravs de antiportes electrognicos Na +/H+ em que protes so importados para o interior da clula em troca de ies sdio exportados para o meio. O sdio reentra na clula por aco de sistemas de simporte Na +/solutos. Este ciclo do sdio tem sido proposto como estratgia para manter a homeostase de pH em vrios alcalfilos (Matin, 1999; Skulachev, 1999). Existem, no entanto, muitas questes em aberto nomeadamente no que respeita aos mecanismos de oxidao fosforilativa a partir de valores to baixos determinados para p. Neste contexto, uma das hipteses avanadas sem demonstrao, prope que os protes poderiam ser direccionados desde os complexos respiratrios at ATP sintase, por movimento rpido ao longo da superfcie de protenas e lpidos membranares, sem oportunidade de estabelecimento de equilbrio com o meio circundante. Alm disso, tem sido sugerido que o pH local junto superfcie externa da membrana plasmtica poderia ser inferior ao do meio devido presena de uma matriz de componentes acdicos. Nos acidfilos, a questo vital a da manuteno do pH intracelular em valores prximos da neutralidade quando a diferena entre o pH exterior e o interior pode atingir 4-5 unidades de pH. Estes organismos tm a capacidade de exportar protes contra uma barreira termodinmica extremamente desfavorvel, para alm de necessitarem de sistemas transportadores capazes de resistir a condies fortemente acdicas.

Microrganismos radiorresistentes
Os microrganismos resistentes a radiaes, principalmente as bactrias dos gneros Deinococcus e Rubrobacter, tm uma capacidade notvel de adaptao a ambientes com doses elevadas de radiaes gama ou ultravioleta (Ferreira et al., 1999). O desenvolvimento desta capacidade que lhes permite sobreviver, sem perda de viabilidade, a doses elevadas de radiao gama (at 5 a 8 kGy) verdadeiramente intrigante j que no existem ambientes naturais superfcie da Terra com nveis de radiao ionizante superiores a 200 mGy/ano. A sequenciao do genoma de D. radiodurans veio reforar resultados anteriores que apontavam para a existncia de extensiva duplicao de informao gentica entre os dois cromossomas e o megaplasmdeo constituintes do genoma, podendo esta ser uma caracterstica de adaptao s agresses causadas por radiaes (Battista et al., 1999). Alm disso, estes organismos apresentam mecanismos reparadores de DNA extremamente eficientes. Curiosamente, esta mesma caracterstica permite-lhes sobreviver em condies de secura extrema ou agresso oxidativa, que induzem fragmentao de DNA, letal para a maioria dos microrganismos. Interessante tambm foi a descoberta recente de que arquees hipertermfilos tm uma capacidade invulgar para reparar danos causados no DNA por radiaes ionizantes. Portanto, possvel que o desenvolvimento de mecanismos de reparao de DNA eficientes constitua uma

Adaptao a extremos de pH: acidfilos e alcalfilos


Os organismos acidfilos e os alcalfilos preferem ambientes com valores de pH extremos, at cerca de 0 e 11,5, respectivamente, e so incapazes de proliferar em meios com valores de pH prximos da neutralidade. Estes organismos suscitam questes interessantes, especialmente no que respeita bioenergtica e aos mecanismos que lhes permitem manter to elevados gradientes protnicos transmembranares. De facto, mostrou-se que o pH intracelular dos acidfilos varia entre aproximadamente 5 e 7 e o dos alcalfilos entre 7 e 9. Portanto, os componentes intracelulares, tais como protenas, no necessitam de estratgias especficas de adaptao pois encontram-se num ambiente

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caracterstica de adaptao comum a diversos tipos de agresso ambiental. facto de que temperatura em que a fermentao conduzida, o etanol poder ser continuamente removido por uma corrente de vapor do meio de cultura, evitando assim o envenenamento das clulas antes de concluda a reaco. Este tipo de estratgia fermentativa presta-se ainda ao desenvolvimento de processos contnuos mais competitivos. Os organismos que proliferam em lagos fortemente alcalinos tm actualmente um fortssimo impacto na indstria dos detergentes (Horikoshi, 1999). As enzimas utilizadas como aditivos a detergentes constituem hoje cerca de 25% do mercado enzimtico. As enzimas mais utilizadas so proteases, celulases e lipases provenientes de alcalfilos representando um valor que ascende a mais de 40 milhes de contos por ano. Outras reas de aplicao so a bioremediao de solos, o tratamento de efluentes, a desulfurizao de pneus ou a extraco de metais. Actualmente, 10% do cobre extrado em todo o mundo feito a partir de minrio de pirite (com nveis elevados de FeS2 ) utilizando o acidfilo Thiobacillus ferroxidans. Mas, sem dvida, a descoberta com maior impacto cientfico foi a das polimerases de DNA termoestveis (isoladas de Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus, Thermococcus litoralis) que foram essenciais para o desenvolvimento e automatizao de reaces em cadeia catalisadas por polimerases, ferramenta essencial ao avano da engenharia gentica e do conhecimento da fisiologia celular. vamos compreendendo melhor a fisiologia, enzimologia e bioqumica destes organismos e avanando no conhecimento dos mecanismos utilizados para proteger as suas estruturas celulares, de prever que se desenvolvam protocolos para produzir extremo-molculas ou adaptar as existentes s nossas exigncias especficas, tornando os processos biotecnolgicos mais rentveis. A sua aplicao nas indstrias farmacutica, alimentar, txtil, de detergentes, de petrleo e mineira hoje uma realidade que nos permite imaginar a mirade de aplicaes ainda por explorar. Referncias Bibliogrficas
Arnold F. H., Giver L., Gershenson A., Zhao H., Miyazaki K. 1999. Directed evolution of mesophilic enzymes into their thermophilic counterparts. Ann N Y Acad Sci 870:400-3. Battista J. R., Earl A. M., Park, M. J. 1999. Why is Deinococcus radiodurans so resistant to ionizing radiation? Trends Microbiol 7:362-365.. Blchl E., Rachel R., Burggraf S., Hafenbradl D., Jannasch H. W., Stetter K. O. 1997. Pyrolobus fumarii, gen. and sp. nov., represents a novel group of archaea, extending the upper temperature limit for life to 113C. Extremophiles 1:14-21. Bouthier de la Tour C., Portemer C., Nadal M., Stetter K. O., Forterre P., Duguet M. 1990. Reverse gyrase, a hallmark of the hyperthermophilic archaebacteria. J Bacteriol 172:6803-8. Danson M. J., Hough D. W., Russell R. J., Taylor G. L., Pearl L. 1996. Enzyme thermostability and thermoactivity. Protein Eng 9:629-30. Empadinhas N., Marugg J., da Costa M. S., Santos, H. 2001. Pathway for the synthesis of mannosylglycerate in Pyrococcus horikoshii: characterization of the recombinant key-enzymes. Submetido. Ferreira A. C., Nobre M. F., Moore E., Rainey F. A., Battista J. R., da Costa M. S. 1999. Characterization and radiation resistance of new isolates of Rubrobacter radiotolerans and Rubrobacter xylanophilus. Extremophiles 3:235-238.

Aplicaes biotecnolgicas
As condies extremamentes agrestes que caracterizam os ambientes donde so isolados os extremfilos desencadearam uma curiosidade enorme da parte da comunidade cientfica no conhecimento da fisiologia destes organismos. No entanto, a grande fora impulsionadora destes estudos foi o potencial biotecnolgico de produtos provenientes destes organismos, principalmente enzimas (Soberon, 1999). Uma vez que muitos processos industriais decorrem a temperatura elevada, existe desde h muito uma presso comercial para o desenvolvimento de biocatalizadores termoestveis. A ttulo de exemplo, podemos referir os casos de amilases e pululanases de hipertermfilos que so utilizadas na produo de xaropes a partir de amido, ou de xilanases termoestveis usadas na indstria de pasta de papel. No entanto, a lista de enzimas de origem hipertermfila utilizada em processos industriais j se tornou to extensa que a sua descrio exaustiva se tornaria fastidiosa (Hough & Danson, 1999; Niehaus et al., 1999). As vantagens de utilizar enzimas ou clulas hipertermfilas em processos a alta temperatura podem compreender vrios factores como a esterilizao dos reactores, o aumento da solubilidade de reagentes e produtos, ou a diminuio da viscosidade do meio, acelerando a difuso das espcies dissolvidas e por isso acelerando as reaces. Outras vantagens podem advir do prprio processo de produo ou extraco do produto. este o caso de um processo recentemente descrito de produo de etanol a 75o C a partir de resduos de hemicelulose provenientes de material de baixo custo. A elevada eficincia deste processo devida ao

Consideraes finais
A contribuio prtica mais significativa dos extremfilos para a biotecnologia sem dvida a vasta coleco de extremozimas actualmente disponveis no mercado. Estas enzimas provam cada vez mais a sua capacidade para alargar o espectro de condies em que possvel a utilizao de biocatalizadores em processos industriais. medida que

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Forterre P., Philippe H. 1999. Where is the root of the universal tree of life? Bioessays 21:871-9. Gerday C., Aittaleb M., Bentahir M., Chessa J. P., Claverie P., Collins T., D'Amico S., Dumont J., Garsoux G., Georlette D., Hoyoux A., Lonhienne T., Meuwis M. A., Feller G. 2000. Coldadapted enzymes: from fundamentals to biotechnology. Trends Biotechnol 18:103-7. Giordano A., Cannio R., La Cara F., Bartolucci S., Rossi M., Raia C.A. 1999. Asn249Tyr substitution at the coenzyme binding domain activates Sulfolobus solfataricus alcohol dehydrogenase and increases its thermal stability. Biochemistry 38:3043-54. Hernandez G., Jenney F. E. Jr., Adams M. W., LeMaster D. M. 2000. Millisecond time scale conformational flexibility in a hyperthermophile protein at ambient temperature. Proc Natl Acad Sci USA 97:3166-70. Horikoshi K. 1999. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev 63:735-50. Horlacher R., Xavier K. B., Santos H., DiRuggiero J., Kossmann M., Boos W. 1998. Archaeal binding proteindependent ABC transporter: molecular and biochemical analysis of the trehalose/maltose transport system of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus litoralis. J Bacteriol 180:680-9. Hough D. W., Danson M. J. 1999. Extremozymes. Curr Opin Chem Biol 3:39-46. Jaenicke R. 2000. Do ultrastable proteins from hyperthermophiles have high or low conformational rigidity? Proc Natl Acad Sci U S A . 97:2962-4. Jaenicke R., Bhm G. 1998. The stability of proteins in extreme environments. Curr Opin Struc Biol 8:738-48. Kengen S. W., de Bok F. A., van Loo N. D., Dijkema C., Stams A. J., de Vos W. M. 1994. Evidence for the operation of a novel Embden-Meyerhof pathway that involves ADP-dependent kinases during sugar fermentation by Pyrococcus furiosus. J Biol Chem 269:17537-41. Ladenstein R., Antranikian G. 1998. Proteins from hyperthermophiles: stability and enzymatic catalysis close to the boiling point of water. Adv Biochem Eng Biotechnol 61:37-85. Lamosa P., Burke A., Peist R., Huber R., Liu M.Y., Silva G., Rodrigues-Pousada C., LeGall J., Maycock C., Santos H. 2000. Thermostabilization of proteins by diglycerol phosphate, a new compatible solute from the hyperthermophile Archaeoglobus fulgidus. Appl Environ Microbiol 66:1974-9. Matin A. 1999. pH homeostasis in acidophiles. Novartis Found Symp 221:152-63. Niehaus F., Bertoldo C., Kahler M., Antranikian G. 1999. Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. Appl Microbiol Biotechnol 51:711-29. Ramos A., Raven N. D. H., Sharp R. J., Bartolucci S., Rossi M., Cannio R., Lebbink J., van der Oost J., de Vos W. M., Santos H. 1997. Stabilization of enzymes against thermal stress and freeze-drying by mannosylglycerate. Appl Environ Microbiol 63:4020-4025. Sako Y., Nomura N., Uchida A., Ishida Y., Morii H., Koga Y., Hoaki T., Maruyama T. 1996. Aeropyrum pernix gen. nov., sp. nov., a novel aerobic hyperthermophilic archaeon growing at temperatures up to 100C. Int J Syst Bacteriol 46:1070-7. Santos H., da Costa M. S. 2001. Unusual solutes from thermophiles and hyperthermophiles. Meth Enzymol 334: Part C, 302-315. Schleper C., Puehler G., Holz I., Gambacorta A., Janekovic D., Santarius U., Klenk P., Zillig W. 1995. Picrophilus gen. nov., fam. nov.: a novel aerobic, heterotrophic, thermoacidophilic genus and family comprising archaea capable of growth around pH 0. J Bacteriol 177:7050-9. Selig M., Xavier K. B., Santos H., Schnheit P. 1997. Comparative analysis of Embden-Meyerhof and EntnerDoudoroff glycolytic pathways in hyperthermophilic archaea and the bacterium Thermotoga. Arch Microbiol 167:217-32. Skulachev V. P. 1999. Bacterial energetics at high pH: what happens to the H+ cycle + when the extracellular H concentration decreases? Novartis Found Symp 221:20013. Soberon X. 1999. Enzymes directly evolving toward commercial applications. Nat Biotechnol 17:539-40. Vieille C., Zeikus J. G. 1996. Thermozymes: identifying molecular determinants of protein structure and functional stability. Tibtech 14:183-9. Woese C. R. 1998. The universal ancestor. Proc Natl Acad Sci USA 95:6854-9. Woese C. R., Kandler O., Wheelis M. L. 1990. Towards a natural system of organisms. Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc Natl Acad Sci USA 87:4576-4579. Xavier K. B., Martins L. O., Peist R., Kossmann M., Boos W., Santos H. 1996. High-affinity maltose/trehalose transport system in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus litoralis. J Bacteriol 178:4773-7.

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