ACARA III STERILISASI ALAT DAN BAHAN I.TUJUAN Mempelajari berbagai macam teknik sterilisasi II.

DASAR TEORI Hampir semua tindakan yang dilakukan dalam diagnosa mikrobiologis, sterilisasi sangat diutamakan baik alat-alat yang siap pakai maupun medianya. Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikroba baik dalam bentuk vegetatif maupun spora. Oleh karena itu, bagi seorang pemula di bidang mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman, hal ini semua merupakan dasar-dasar kerja dalam laboratorium mikrobiologi (Volk & Wheeler, 1993). Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida, dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993). Sebelum melakukan percobaan dengan mikroorganisme, diperlukan proses dekontaminasi terlebih dahulu untuk meminimalisir organisme yang aktif dari suatu sistem bakteri atau virus. Dekontaminasi adalah proses menghilangkan atau membunuh mikroorganisme sehingga objek aman untuk ditangani, tujuannya untuk melindungi praktikan yang melakukan percobaan menggunakan bakteri atau semacamnya. Ada beberapa metode dekontaminasi, yaitu: 1. Sterilisasi : proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. 2. Desinfeksi : metode untuk memusnahkan atau menghancurkan mikroorganisme patogen. 3. Sanitasi : metode untuk mengurangi tingkat organisme yang hidup. Beberapa mikroorganisme memiliki resistensi terhadap dekontaminan kimia, seperti : bakteri vegetatif, jamur, dan virus yang mengandung lipida relatif yang mudah didekontaminasi dengan senyawa kimia. Virus yang tidak mengandung lipida dan bakteri berlapis lilin memiliki tingkat resistensi tinggi. Resistensi terhadap dekontaminan kimia dipengaruhi beberapa faktor, seperti : konsentrasi dari zat aktif, lamanya kontak, pH, suhu, kelembapan, dan kehadiran senyawa organik. Inaktivasi

mikroorganisme dengan dekontaminan kimia dapat melalui mekanisme sebagai berikut: Koagulasi dan denaturasi protein Lisis Ikatan dengan enzim atau destruksi substrat enzim Oksidasi Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Ada 5 metode umum sterilisasi, yaitu : 1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab) 2. Sterilisasi Panas Kering 3. Sterilisasi dengan Penyaringan (Filtrasi) 4. Sterilisasi Gas 5. Sterilisasi dengan Radiasi Metode yang biasa digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembab) dan metode sterilisasi panas kering. Sterilisasi Uap (Panas Lembab). Sterilisasi Uap dilakukan menggunakan autoclave dengan prinsipnya memakai uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Temperatur sterilisasi biasanya 121C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan: - Penguraian gula - Degradasi vitamin dan asam-asam amino - Inaktifasi sitokinin zeatin riboside - Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar Bila ada kelembapan (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada temperatur yang lebih rendah dibandingkan jika tidak ada kelembapan. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari organisme tersebut. Metode sterilisasi uap umumnya digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan bahan-bahan lain yang tahan terhadap temperatur yang dipergunakan dan tahan terhadap penembusan uap air, larutan dengan pembawa air, alat-alat gelas, pembalut untuk bedah, penutup karet dan plastik, dan media untuk pekerjaan mikrobiologi. Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah : -Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim -Palarut organik, seperti fenol -Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :

-Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat -Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain. -Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar -Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf -Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0 Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum dari total volumenya, sisa ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit. Sterilisasi Panas Kering. Sterilisasi Panas Kering dilakukan menggunakan oven pensteril, karena metode sterilisasi panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan sterilisasi uap. Metode ini memerlukan temperatur yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang, sterilisasi panas kering biasanya ditetapkan pada temperatur 160-170C dengan waktu 1-2 jam. Umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air, seperti minyak lemak, minyak mineral, gliserin (berbagai jenis minyak), petrolatum jelly, lilin, wax, dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah. Karena tingginya suhu yang diterapkan dalam sterilisasi panas kering, maka metode ini dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan. Contohnya alat ukur dan penutup karet atau plastik. Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati. Sterilisasi dengan Penyaringan (filtrasi). Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) digunakan untuk sterilisasi larutan yang termolabil, penyaringan ini menggunakan filter bakteri. Metode ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba hanya akan tertahan oleh pori-pori filter dan terpisah dari filtratnya. Dibutuhkan penguasaan teknik aseptik yang baik dalam melakukan metode ini. Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen. Filtrat bebas dari bakteri tetapi tidak bebas dari virus. Cara kerja dari sterilisasi ini berbeda dari metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme melalui penyaringan dan tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut. Penghilangan mikroorganisme secara fisik melalui penyaring dengan matriks pori ukuran kecil yang tidak membiarkan mikroorganisme untuk dapat melaluinya. Cara sterilisasi ini untuk produk berupa cairan yang dapat disaring atau bahan yang tidak tahan terhadap panas dan tidak dapat disterilkan dengan cara sterilisasi lain. Teknologi tinggi membran filtrasi meningkatkan penggunaan sterilisasi filtrasi,

khususnya jika digunakan berpasangan dengan sistem proses aseptic (Suriawiria, 2005). Sterilisasi gas. Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert, dan kereaktifannya terhadap bahan yang disterilkan harus dipertimbangkan misalnya thiamin, riboflavin, dan streptomisin kehilangan protein ketika disterilkan dengan etilen oksida. Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida. Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85C dan 50% kelembaban relatif dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap, seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi gugus SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba mati. Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas. Sterilisasi dengan radiasi. Sterilisasi dengan radiasi digunakan untuk bahan/produk dan alat-alat medis yang peka terhadap panas (termolabil) dan jika residu etilen oksida tidak diharapkan. Pengukuran presisi dari dosis radiasi, yang tidak berhubungan dengan suhu, adalah merupakan faktor kontrol dalam sterilisasi radiasi selama dengan waktu radiasi. Monitoring dan kotrol proses sangat sederhana, tetapi kehati-hatian akan keamanan harus dilakukan oleh operator sterilisasi. Prinsip sterilisasi radiasi adalah radiasi menembus dinding sel dengan langsung mengenai DNA dari inti sel sehingga mikroba mengalami mutasi. Ada dua macam radiasi yang digunakan yakni gelombang elektromagnetik (sinar x, sinar ) dan arus partikel kecil (sinar dan ). Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi (Indra, 2008):

1.Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik. 2.Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. Pemanasan a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll. b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll. c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf. Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV 3.Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. III. METODE Alat

1. Cawan petri 4 buah 2. Tabung reaksi 4 buah 3. Kertas 3 lembar 4. Kapas penyumbat 4 gulung kecil
5.Autoklaf 1 set 6.Botol semprot 1 buah

Bahan 1.Alkohol 70% secukupnya Cara Kerja :

a.Sterilisasi tangan praktikan dilakukan dengan penyemprotan alkohol 70% pada tangan praktikan. Apabila diperlukan, meja kerja praktikan juga disemprot dengan alkohol 70%. b.Sterilisasi cawan petri dilakukan dengan cara cawan petri dibungkus kertas dengan kencang kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf. Sterilisasi cawan petri pada saat akan dimasuki media atau inokulum dilakukan dengan cara cawan petri diputar-putar didekat bunsen burner.

c. Sterilisasi

tabung reaksi dilakukan dengan cara disumbat menggunakan kapas yang dibentuk gulungan serta mulut tabung reaksi didekatkan dengan bunsen burner ketika akan dimasuki suatu media atau inokulum. Karena tabung reaksi juga merupakan alat gelas, maka sterilisasi juga dapat dilakukan di dalam autoklaf (Dwijoseputro, 1994). HASIL DAN PEMBAHASAN Kegiatan sterilisasi awal yang harus diperhatikan adalah sterilisasi tangan praktikan. Sterilisasi ini dapat dilakukan dengan penyemprotan secara merata alkohol 70% pada tangan praktikan. Apabila diperlukan, meja kerja praktikan juga disemprot dengan alkohol 70% agar aseptis. Sterilisasi dengan menggunakan alkohol 70% merupakan jenis sterilisasi secara kimiawi. Alkohol mempunyai daya kerja mengkoagulasi protein serta mendenaturasinya. Sterilisasi cawan petri dapat dilakukan dengan cara cawan petri dibungkus kertas dengan kencang kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf. autoklaf dengan prinsipnya memakai uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Temperatur sterilisasi biasanya 121 C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan: 1.Penguraian gula. 2.Degradasi vitamin dan asam-asam amino. 3.Inaktifasi sitokinin zeatin riboside. 4.Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar. Bila ada kelembapan (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada temperatur yang lebih rendah dibandingkan jika tidak ada kelembapan. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari organisme tersebut. Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan autoclave adalah :

IV.

- Suhu 115,5 C, waktu 30 menit - Suhu 121,5 C, waktu 20 menit - Suhu 126,5 C, waktu 15 menit Pada percobaan ini menggunakan teknik sterilisasi dibandingkan teknik destruktif, dengan beberapa pertimbangan tertentu agar mendapatkan hasil yang maksimak dalam melakukan percobaan ini. Sterilisasi merupakan sebuah proses yang ditujukan untuk membunuh semua mikroorganisme, termasuk spora dan merupakan tingkat tertinggi dari seluruh proses pemusnahan mikoroorganisme. Destruktif adalah membunuh mikroorganisme penyebab penyakit dengan bahan kimia atau secara fisik, hal ini dapat mengurangi kemungkinan terjadi infeksi dengan jalan membunuh mikroorganisme pathogen. Penggunaan germicidal chemical agent (zat-zat kimia germisid) untuk merusak atau membinasakan infektifitas potensial dari suatu benda/material. Perbedaan antara sterilasai & destruktif adalah

Destruktif
-potensial dari benda/material yangdirusak/dibinasakandengan menggunakan germicidal egents -sifatnya melemahkan atau mengurangi patogen,tidak dampai spora.

Sterilisasi
-suatu benda dibebaskan dari semua organisme secara kimiawi atau secara fisika -merupakan tingkat tertinggi dalam menghilangkan mikroorganisme patogen, Menjadikan mikrorganime mati,sampai sporanya. V. KESIMPULAN 1. Sterilisasi merupakan sebuah proses yang ditujukan untuk membunuh semua mikroorganisme, termasuk spora dan merupakan tingkat tertinggi dari seluruh proses pemusnahan mikoroorganisme. 2. Autoklaf merupakan alat sterilisasi dengan teknik uap panas. Alat ini menggunakan uap air jenuh bertekanan dengan suhu 121 0C selama 15 menit. Naiknya titik didih air menjadi 121 0C disebabkan oleh naiknya tekanan dan tekanan 1 atm di atas permukaan laut. VI. DAFTAR PUSTAKA Dwijoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan. Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Prak k. Jakarta: Gramedia. Hadioetomo, ratnasiri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktik. Jakarta: UI Press

Sarles, dkk. 1956. Microbiology: General and Apphed. New York: Harper & Brothers Schlegel, Hans G. 1994. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta: UGM Press Stanier, Y. R. dkk. 2001. The Microbial World. New Jersey: Prenticel Hall. Inc. EigleWood. Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Papas Sinar Sinanti. Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta: Erlangga. Surakarta, 2 Oktober 2011 Mengetahui, Asisten pembimbing Praktikan

Alfin T

Prabasthoro Fendy K NIM. M0410047

LAMPIRAN DOKUMENTASI

Media datar

Media cawan petri

Media miring