1.

1 Penyakit Tumor Crown Gall Tumor Crown Gall adalah jaringan tanaman yang pertumbuhannya tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi antara tanaman-tanaman yang rentan dengan strain virulen Agrobacterium tumefaciens (Gb. 1). Transformasi tumor Crown gall akan terus berlangsung jika tidak terdapat serangan bakteri (7, 56, 65). Awal abad ini, ketertarikan untuk meneliti Agrobacterium didasarkan pada kemungkinan bahwa studi tentang Crown gall ini bisa mengungkap mekanisme yang juga berlangsung dalam neoplasia hewan. Akhir-akhir ini, pertumbuhan tumor ditunjukkan oleh hasil ekspresi gen dari Agrobacterium asal yang ditransfer, dan menjadi terintegrasi secara stabil pada genom tanaman (14). Karakterisasi molekuler dari induksi Crown gall ini menunjukkan bahwa Agrobacterium bisa dipakai untuk menghantarkan materi genetik kedalam tanaman dan hal ini menjadi ketertarikan baru dalam studi Agrobacterium tumifaciens. Pengetahuan tentang tumor Crown gall berkembang dengan pesat secara meluas akhir-akhir ini karena teknik-teknik molekuler biologinya. Sekarang ini, sistem transfer DNA dari Agrobacterium ke tanaman dimanfaatkan secara meluas untuk penelitian biologi molekuler dan rekayasa genetika pada tanaman.

1.2 Sifat-sifat Agrobacterium tumefaciens

Agen penyebab (causative agent) penyakit Crown gall, yaitu Agrobacterium tumifaciens, digolongkan kedalam famili Rhizobiaceae yang dibagi seperti ditunjukkan pada Gb.2. Sebagian besar genus Agrobacterium menyebabkan tumor pada tanaman dikotil. Spesies Agrobacterium tergolong bakteri gram-negatif yang merupakan bakteri aerob dan mampu hidup baik sebagai saprofit maupun parasit. Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0.6-1.0 m sampai 1.5-3.0 m, dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Agrobacterium merupakan bakteri yang mudah bergerak (motile) dan memiliki 1-6 flagela peritrichous serta merupakan bakteri tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 2528C. Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat, lembut, dan tak berpigmen (46).

A. tumafaciens mengandung sebuah plasmid besar yang disebut Ti-plasmid. Sebuah Tiplasmid bertanggung jawab pada proses onkogenesitas A. tumefaciens. Namun, Tiplasmid sendiri tidak mampu menyebabkan terjadinya transformasi pada tanaman. Gengen pada kromosom dari A. tumifaciens juga menyumbangkan fungsi lain yang berguna

untuk onkogenesitas in planta (57, 65). Ti-plasmid hidup secara stabil dalam tubuh bakteri meskipun ukurannya yang besar (200-900 kb) (33). Struktur dari Ti-plasmid ditunjukan oleh Gb. 3. Sebuah wilayah T-DNA (DNA yang ditransfer) diduplikasi dan ditransfer ke sel tanaman. Walaupun T-DNA merupakan elemen yang mudah berpindah, T-DNA bukanlah elemen yang dapat diubah urutannya, karena T-DNA sendiri tidak mengkode produk yang memediasi perpindahannya. Sebagai gantinya, sebuah komponen kedua, yaitu wilayah virulen (vir) pada Ti-plasmid, menyediakan sebagian besar produk trans-acting untuk transit T-DNA.

1.3 Induksi Crown gall oleh A. tumefaciens

Peristiwa pembentukan tumor Crown gall yang diakibatkan oleh Agrobacterium digambarkan pada Gb. 4. A. tumefaciens menyerang tanaman pada bagian yang luka. Pengirim pesan kimia (chemical messengers), biasanya senyawa fenolik seperti acetosyringone, yang berasal dari sel tanaman yang luka, mempengaruhi transkripsi gen virulen Ti plasmid-borne yang dihasilkan di dalam bakteri (5, 72). Produk-produk gen vir mempengaruhi transfer T-DNA ke sel tanaman. T-DNA mengkode enzim auksin, sitokinin, biosintesis; fitohormon ini menggangu keseimbangan hormon pada tanaman inang, sehingga terbentuklah tumor. T-DNA juga mengkode enzim-enzim yang mensintesa senyawa yang tidak lumrah yang disebut opines. Opines hanya dapat digunakan oleh Agrobacterium yang membawa Ti-plasmid, sebagai sumber karbon dan nitrogen, tetapi tidak dapat digunakan oleh tanaman inang dan mikroorganisme lainnya. Dengan demikian, proses transformasi membentuk suatu ekologi yang bisa ditempati (ecological niche) untuk bakteri, yang merupakan sejenis transformasi parasitis yang disebut kolonisasi genetik (64, 70)

1.2 PROSES-PROSES YANG TERLIBAT DALAM INDUKSI TUMOR CROWN GALL

Seperti yang telah disebutkan di atas, tumorigenesis dari Crown gall merupakan proses yang terdiri dari beberapa tahap termasuk penempelan Agrobacterium pada sel tanaman, proses dan transfer T-DNA ke sel tanaman diikuti oleh penggabungan dan pengekspresian gen-gen T-DNA di dalam genom tanaman.

2.1 Penempelan Agrobacterium pada Sel Tanaman Tahap pertama dalam induksi tumor adalah pengikatan Agrobacterium pada sel tanaman. Peristiwa awal ini dimediasi oleh gen-gen yang terletak pada kromosom bakteri. Strain yang membawa mutasi-mutasi sejumlah loci (chvA, chvB, att dan pscA atau exoC) kurang baik dalam penempelan sel tanaman, sehingga dikatakan avirulen atau sangat lemah sifat racunnya (8, 21, 53, 77, 83). Gen-gen kromosom, chvA, chvB, dan exoC, diperlukan dalam sintesis dan penyaluran -1,2-glucan cyclic yang terlibat dalam pengikatan sel tanaman. Protein chvB terlibat dalam biosintesis glucan (67), sementara chvA diperlukan untuk memindahkan glucan dari sitoplasma ke periplasma dan ruang ekstraseluler. ChvA memiliki kesamaan dengan golongan ATPase yang terikat pada membran (membrane-bound ATPase) yang terlibat dalam transpor aktif (22). Walaupun produk-produk dari chvA dan chvB terlibat dalam biosintesis dan transpor -1,2-glucan, namun masih belum jelas apakah glucan terlibat dalam penempelan Agrobacterium atau mempengaruhi sifat-sifat lain dari permukaan sel yang terlibat secara langsung. Mutan-mutan att memiliki flagela, fimbriae dan mudah bergerak (motile) (53). Att normalnya memproduksi -1,2-glucan dan tidak mengalami perubahan pada struktur polisakaridanya. Uji mendalam pada mutan-mutan ini menunjukan bahwa mutan-mutan ini kekurangan dua polipeptida (34 kDa dan 38 kDa), yang ditemukan pada membran luar atau ruang periplasma dari bakteri tipe liar (53). Namun, apakah salah satu dari dua polipeptida ini berperan secara langsung pada induksi tumor dengan cara memediasi proses penempelan, masih belum diketahui.

2.2 Induksi Gen-vir Daerah vir kira-kira 30 kb dan tersusun dalam 7-8 komplementasi kelompok: virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, dan virH (sebelumnya pinF) (73, 86). Gb. 5 menunjukan susunan genetik wilayah vir dari Ti-plasmid tipe oktopin dan nopalin. Perbedaan wilayah vir antara Ti-plasmid tipe oktopin dan nopalin adalah; virF dan virH (pinF) tidak terdapat pada Ti-plasmid tipe nopalin sementara tipe oktopin mengandung kedua gen tersebut.

Aktivasi transkripsi gen-gen vir merupakan hasil langsung dari penerimaan A. tumefaciens terhadap sinyal molekul yang diproduksi oleh sel tanaman yang luka, yang mana memicu sistem regulasi vir. Dua penginduksi potensial, acetosyringone dan hydroxy-acetosyringone, diisolasi dari sel akar tembakau oleh Stachel et al (72). Beberapa monosakarida juga memegang peranan penting pada induksi gen-gen vir (9).

pH medium memiliki pengaruh yang kuat pada induksi vir; induksi akan optimal dalam rentang pH 5.0-5.4 dan tidak akan terjadi induksi pada pH 6.3 atau diatasnya (74). Regulasi gen vir juga dimediasi oleh gen-gen yang terletak pada kromosom Agrobacterium. Gen virulen kromosomal yang dinamai chvD, chvE, ros, miaA, chvG, dan chvI telah dilaporkan terlibat dalam virulensi dengan cara mempengaruhi ekspresi gen-gen vir pada Ti-plasmid (85, 86, 89,36,28, 18, 10,51). chvD, ros, dan miaA memiliki peran yang sulit dimengerti dalam regulasi ekspresi gen vir. Penyelipan transposon pada chvE menyebabkan kisaran inang terbatas dan berkurang sifat racunnya. Induksi gen vir pada Ti-plasmid oleh acetosyringone berkurang sama sekali atau bahkan tidak terdapat dalam mutan chvE. Namun, induksi virG dengan kombinasi antara pH rendah dan konsentrasi posfat rendah tidak merusak mutan chvE jika dibandingkan dengan tipe liar (wild type). Analisis susunan DNA menunjukkan bahwa chvE bisa mengkode protein ruang periplasmik yang terlibat dalam kemotaksis atau pengambilan gula (sugar uptake) (36). Mekanisme dimana protein ini mempengaruhi induksi acetossyringone pada gengen vir masih belum diketahui. chvG dan chvI, anggota dari sistem regulasi dua komponen yang baru-baru ini diidentifikasi, juga terlibat dalam induksi gen vir dengan mekanisme yang belum diketahui (10,51).

Hal ini menunjukan bahwa gen-gen vir, virA dan virG yang esensial adalah regulator dari vir-regulon (86,1 ,55, 57). Protein VirA dan VirG harus melaksanakan setidak-tidaknya dua aktifitas yang berbeda. Yang pertama adalah kepekaan ekstraselular terhadap molekul sinyal tanaman dan transduksi dari sinyal lingkungan ini ke dalam bakteri. Yang kedua adalah pengaktifan beberapa vir-operon yang terpisah dalam merespon sinyal tanaman. Menariknya, protein regulasi virA dan VirG menunjukan kesamaan yang cukup berarti dengan beberapa protein bakterial yang termasuk dalam famili sistem regulasi positif dua komponen (87, 62). Produk VirA menyederhanakan protein membran bagian dalam yang peka dan merespon molekul sinyal tanaman seperti acetosyringone (Gb. 6). Lebih lanjut, protein VirA merupakan kelompok kelas protein kinase histidin, dan mampu melakukan autoposporilasi (40, 58, 76). Pospat terikat pada sebuah residu histidine dari protein VirA. Hanya satu residu histidine yang terpelihara di antara protein-protein yang serupa. Ketika pengkodean kodon, residu ini (asam amino 474) diubah oleh sitedirected mutagenesis menjadi glutamat, mutan virA ini tidak berfungsi dalam mengarahkan induksi gen vir dan mutan ini tidak bisa melakukan autoposporilasi (40). VirA yang mengalami autoposporilasi mentransfer pospat ke VirG (39). VirG adalah anggota protein perngatur

respon (the respone regulator protein) (39), yang mana setengah dari N-terminalnya merupakan target dari posporilasi dan setengah C-terminalnya memiliki sifat pengikat promoter (promoter-binding properties) (54,62, 66). Pospat dilekatkan pada residu aspartat 52 dari protein VirG. Residu ini tersimpan dalam protein yang serupa dan dikenali sebagai tempat posporilasi (62). Perubahan aspartat ini menjadi asparagin menghilangkan kemampuan protein untuk menerima pospat dari VirA (39). Protein VirG digolongkan kedalam famili yang memiliki kesamaan susunan, yang disebut kotak vir (vir boxes), terletak pada bagian hulu (upstream) dari masing-masing promoter vir (66). Setengah bagian C-terminal dari protein virG bertanggung-jawab dalam pengikatan vir boxes (66). Penghilangan atau perubahan pada salah satu dari kedua vir boxes yang berada dalam gen VirG menghapus induksi dari promoter tersebut (63). Data yang sama didapatkan saat vir boxes diubah atau dihapus dalam promoter virB, virC, VirD, dan virE (66,63, 61). Pengikatan antara setengahC-terminal VirG pada vir boxes mengaktifkan transkripsi dari loci vir yang lainnya. (Gb. 6)

2.3 Proses dan Transfer T-DNA Proses dan transfer dari T-DNA dimediasi oleh produk-produk yang dikode oleh gen-gen pada wilayah vir (vir-region). Setelah induksi vir gen, produksi transfer tingkat lanjut dimulai dengan pembentukan T-strand, yaitu duplikat dari single stranded (ss) T-DNA (74). Banyak produk gen bertanggung-jawab dalam proses ini. Produk dari loci virC dan VirD terlibat dalam pembentukan dan pemrosesan T-strand. VirD1 dan VirD2 bersamasama mengenali susunan pembatas 25 bp dan memproduksi sebuah belahan endonukleotik ss pada strand bagian bawah dari masing-masing pembatas (25, 27). Sayatan ini digunakan sebagai tempat inisiasi dan terminasi dalam memproduksi T-stand. Setelah penyayatan, VirD2 tetap terhubung kuat dengan ujung 5 dari T-strand (35). Pengikatan VirD2 pada ujung 5 memberi karakter polar pada T-strand yang menjamin bahwa pada langkah berikutnya, ujung 5 merupakan leading end. Produksi T-strand diperkirakan merupakan hasil dari perpindahan strand bagian bawah dari T-DNA di antara sayatan tersebut. Studi terbaru mengungkapkan bahwa langkah awal produksi Tstrand secara evolusioner terkait dengan sistem bakteri yang memproduksi ssDNA, seperti salah satunya selama proses konjugasi (60). Dua protein lainya, VirC1 dan VirC2 kemungkinan berinteraksi dengan VirD1 dan VirD2 selama penyayatan berlangsung. Lokus virC, yang mengkode dua produk yaitu VirC1 (23 kDa) dan VirC2 (26 kDa), digunakan untuk meningkatkan proses penyayatan batas dari T-DNA (81, 82, 89).

T-strand harus bergerak melalui membran dan ruang seluler sebelum sampai pada inti sel tanaman dan tetap menjaga integritasnya selama proses ini. Oleh karena itu, adalah sebuah hipotesis bahwa T-strand seolah-olah bergerak seperti sebuah kompleks proteinssDNA. VirE2 merupakan sebuah protein yang memiliki ikatan asam nukleat ss yang dapat diinduksi (inducible ss nucleic acid-binding protein), yang dikode oleh lokus virE yang terikat tanpa kespesifikan susunan. Sejumlah besar VirE2 (60 kDa) berada dalam sel dan terikat kuat serta saling bekerja sama, yang berarti bahwa sebuah T-strand akan terlapisi secara keseluruhan (Gb. 7). Satu molekul VirE2 diperkirakan melapisi sekitar 30 nukleotida, oleh karena itu 20 kb T-strand akan membutuhkan 600 molekul VirE2 (52). Akibatnya, degradasi T-strand oleh nukleasi akan dicegah dengan ikatan VirE2 dan bahkan, ikatan in vitro virE2 membuat ssDNA resisten terhadap degradasi nuckleolitik. T-strand bersama-sama VirD2 dan virE2 membentuk T-kompleks.

Kemudian, T-komplek harus keluar dari sel bakteri, melewati membran dalam dan luar dan juga dinding sel bakteri (Gb. 7). Perpindahan T-kompleks dari Agrobacterium merupakan salah satu tahapan pada proses transfer yang kurang dikenal. Studi terdahulu mengungkapkan bahwa virB dibutuhkan untuk tumorigenesis tetapi tidak untuk pembentukan T-strand atau T-kompleks (73). Penyusunan virB menunjukan bahwa produk gennya kemungkinan terlibat dalam proses transfer (90). Ada 11 Open Reading Frames (OPR) virB untuk protein dengan perkiraan berat molekuler berikut ini; VirB1 (26 kDa); VirB2 (12 kDa); VirB4 (87 kDa); VirB5 (23 kDa); VirB6 (32 kDa); VirB7 (6 kDa); VirB8 (26 kDa); VirB9 (32 kDa); VirB10 ( 42 kDa); VirB11 (38 kDa) (47,71). Kesebelas OPR dari lokus VirB ini mengkode protein yang menunjukan perkiraan fiturfitur (features) yang dibutuhkan untuk membentuk sebuah alat ekspor yang terasosiasi pada membran, termasuk hidrophobisitas, wilayah jangkauan membran (membranspanning domain), dan/atau susunan sinyal N-terminal yang menargetkan protein untuk keluar dari sitoplasma. Studi lokalisasi subseluler mengkonfirmasi asosiasi membran dari tujuh protein VirB (79, 3, 80). Namun, keseluruhan dari tujuh protein ini disalurkan di antara membran dalam dan luar, dalam proporsi yang bervariasi tergantung pada metode fraksinasinya. Dengan membandingkan susunannya, virB menunjukan hubungan yang evolusioner dengan kumpulan gen bakteri lain yang produk-produknya membentuk asosiasi membran kompleks yang terlibat dalam fimbriae, sekresi protein, atau pengambilan DNA (DNA uptake) (42). Wilayah Tra2 dari RP4 juga mengkode 11 protein

yang terlibat dalam tahapan transfer DNA konjugasi, yang mungkin membentuk pilus atau prekursor pilus. Enam dari protein Tra2 sangat mirip dengan protein VirB, terutama fitur-fitur yang menunjukan lokalisasi membran (48).

Walaupun sebuah saluran ekspor spesifik diperkiraan merupakan produk-produk VirB, namun belum diketahui sedikit pun tentang detail penyusunan (assembly), struktur, atau fungsi dari produk-produk tersebut. Hubungan antara produk-produk VirB dan ekspor Tkompleks masih belum terpecahkan. Dalam transfer DNA yang bersifat konjugatif, pilus berperan menghubungkan sel resipien. Namun, apakah produk-produk VirB ini berperan dalam pengenalan permukaan sel tanaman masih belum diketahui.

2.4 Integrasi T-strand ke Genom Tanaman Integrasi T-strand ke dalam sebuah kromosom inang merupakan tahapan akhir dalam proses transfer T-DNA (Gb. 7). Integrasi T-strand membutuhkan pengambilan inti (nuclear uptake). Protein yang berukuran lebih besar dari kira-kira 40 kDa membutuhkan NLS (nuclear localization signal) yang memediasi pengambilan inti (34). T-kompleks memiliki 3 komponen yang dapat menyumbang secara potensial sinyal untuk pengimporan inti (91). T-strand sendiri sepertinya tidak memiliki sinyal untuk mengimpor inti, karena beberapa DNA yang berada di antara susunan pembatas (border sequensces) akan ditransfer. Pemindahan inti dari T-kompleks sepertinya dimediasi oleh protein asosiasinya, VirD2 dan VirE2. Analisis susunan VirD2 mengungkapkan bahwa 85% N-terminal terlindungi dalam strain Agrobacterium; C-terminal hanya 25% terlindungi, tetapi persamaan yang sangat nyata terdapat pada 30 asam amino terakhir (90). Dalam wilayah ini, ditemukan susunan yang homolog dengan NLS tipe bipartite (34). Fungsi lokalisasi inti dari susunan ini dikonfirmasi dengan penyatuan wilayah pengkodean (coding region) dengan gen reporter glukoridase (GUD) dan mengekspresikan sementara konstruk ini dalam protoplasma tembakau (34). Lokalisasi inti dari protein fusi diduga berasal dari akumulasi produk GUS biru pada inti sel. Ketika NLS yang diduga dihapus dari untaian penuh VirD2 dan digabungkan dengan GUS, maka produk GUS hanya ada dalam sitoplasma. Akumulasi inti dari ekspresi sementara VirD2 juga telah ditunjukkan dengan imunolokalisasi(78).

T-kompleks merupakan kompleks nukleoprotein yang sangat besar. Di beberapa strain Agrobacterium, T-strand panjangnya mencapai 20 kb (65). T-strand ini akan mengikat

sampai sekitar 600 molekul virE2 dan memiliki panjang terhitung 3600 nm, yaitu 60 kali ketebalan membran inti. Termasuk sebuah VirD2, T-kompleks memiliki massa 50x106 D (70). Apakah sebuah NLS bipartite yang tidak berpasangan dari VirD2 mampu memediasi pengambilan inti pada T-kompleks yang sangat besar? Jika tambahan NLSs diperlukan untuk pengambilan inti, NLSs dapat dipasok dari VirE2, komponen protein yang paling berlimpah dari T-kompleks. Analisis susunan menunjukkan dua NLSs bipartite yang potensial dalam VirE2 (12). Seperti halnya VirD2, lokalisasi inti VirE2 diuji dengan menggabungkan wilayah pengkodeannya dengan GUS. Walaupun mutanmutan di mana salah satu NLSs atau yang lainnya dihapus menunjukkan beberapa transpor inti, kedua NLSs dibutuhkan untuk akumulasi maksimum dalam inti sel (12). Jadi, VirE2 menyediakan NLSs di sepanjang T-kompleks. NLSs ganda pada VirE2 kemungkinan bermanfaat secara fungsional untuk impor inti T-kompleks yang tak terputus/terganggu, seperti contohnya, untuk menjaga sisi sitoplasma dan nukleoplasma secara simultan dari pori-pori inti terbuka.

Mekanika integrasi T-strand ke dalam genom tanaman sebagian besar belum diketahui. Disarankan bahwa ikatan VirD2 dengan ujung 5 pada T-strand bergabung dengan sayatan pada DNA tanaman. DNA tanaman akan lebih terbuka untuk membentuk sebuah celah, dan ujung 3 dari T-strand kemungkinan berpasangan dengan wilayah lain dari DNA tanaman. Reaksi-reaksi ini akan menghasilkan T-strand ke dalam satu strand dari DNA tanaman. Strain yang terpilin kemudian akan menimbulkan sebuah sayatan pada strand yang berlawanan dari DNA tanaman. Reparasi celah dan sintesis DNA menggunakan T-strand sebagai cetakan, menghasilkan produk integrasi akhir. Namun, belum diketahui apapun tentang enzimologi proses integrasinya. Tidak ada faktor-faktor tanaman yang terlibat dalam proses ini. VirD2 dan VirE2 dianggap mengkatalisasi integrasi T-strand kedalam genom tanaman; namun, tidak ada data yang mendukung hipotesis ini.

I.

PENDAHULUAN

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan

suatu tanaman

transgenik.

Secara

alami, A.

tumefaciens dapat

menginfeksi

tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor). Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman. Untuk memulai pembentukan tumor, A. tumefaciens harus menempel terlebih dahulu pada yang permukaan akan sel inang dengan untuk dikotiledon, untuk

memanfaatkan polisakarida asam mengkoloniasi/menguasai sel

digunakan tanaman

tanaman. Selain

tanaman monokotiledon seperti jagung, gandum,

dan tebutelah

digunakan

memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik. Sebagian besar genus Agrobacterium menyebabkan tumor pada tanaman dikotil. Species Agrobacterium tergolong bakteri gram negatif yang tergolong bakteri aerob dan mampu hidup baik sebagai saprofit maupun parasit. Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0,6 1,0 m sampai 1,5 3,0 m, dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Agrobacterium merupakan bakteri yang mudah bergerak (motile) dan memiliki 1-6 flagelaperitrichous serta merupakan bakteri tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 25-28C. Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat, lembut, dan tak berpigmen. Agrobacterium diisolasi dari tanaman yang terinfeksi Crown Gall. Tumor Crown Gall adalah jaringan tanaman yang

pertumbuhannya tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi antara tanamantanaman yang rentan dengan strain virulenAgrobacterium tumefaciens.

II.

PEMBAHASAN

2.1. Agrobacterium dan Peranannya dalam Transfer Gen Transformasi gen adalah proses dimana DNA asing dimasukkan kedalam sel tanaman, dimanapara pemuliantanaman dapat memasukkan gen asing kedalam sel atau jaringan tanaman, baik secara langsung maupun tak langsung tanpa merujuk kepada tingkat hubungan genetik atau kompatibelilitas suatu jenis. Teknologi pemindahan gen atau transfer gen dapat dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak langsung. Contoh transfer gen secara langsung adalah perlakuan pada protoplas tanaman dengan eletroporasi atau dengan polyethyleneglycol (PEG), penembakan eksplan gen dengan gene gun atau di vortex dengan karbit silikon. Teknik pemindahan gen secara tak langsung dilakukan dengan bantuan bakteri Agrobacterium. Dari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui media vektorA. tumefaciens paling sering digunakan untuk metransformasi tanaman, terutama tanaman kelompok dikotil. Bakteri ini mampu mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf disc ) atau bagain lain dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi beregenerasi tinggi.(Adis.2010.) Gen yang ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing ). Segmen spesifik DNA plasmid Ti disebut T-DNA (transfer DNA ) yang berpindah dari bakteri ke inti sel tanaman dan berintegrasi kedalam genom tanamn. Karena A. tumefaciens merupakan patogen tanaman maka Agrobacterium sebagai vektor yang digunakan untuk

transformasi tanaman adalah bakteri dari jenis plasmid Ti yang dilucuti virulensinya (disarmed), sehingga sel tanaman yang ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang

mampu beregenerasi akan membentuk suatu tanaman sehat hasil rekayasa genetik. Teknik transformasi melalui media vektor Agrobacterium pada tanaman dikotil telah berhasil dengan baik tetapi sebaliknya tidak umum digunakan pada tanaman monokotil. Namun beberapa peneliti telah melaporkan bahwa beberapa

strain Agrobacterium berhasil metransformasi tanaman monokotil seperti jagung dan padi.

2.2. Proses Transformasi Gen oleh Agrobacterium tumefaciens Dasar dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah transfer dan integrasi T-DNA ke dalam genom di dalam inti sel tanaman. T-DNA adalah suatu bagian pada tumor inducing (Ti) plasmid yang terdapat di dalam sel Agrobacterium. Ti-plasmid berukuran sekitar 200-800 kbp dan T-region (T-DNA)nya sendiri berukuran sekitar 10% nya (10-30 kbp). T-region ini dibatasi oleh duasekuen pembatas (border) yaitu right border dan left border yang mengapit T-region. Bagian lain dari Ti-plasmid yang tidak kalah pentingnya adalah vir-region yang mengandung sejumlah gen-gen virulen (virA, virB, virC, virD, virE, virF,virG dan virH) yang berfungsi didalam proses transfer T-DNA ke dalam sel tanaman. Proses transformasi dimulai dengan melekatnya Agrobacterium pada

seltanaman. Kejadian awal ini dimediasi oleh gen-gen yang berlokasi pada kromosom bakteri (gen chvA, chvB dan att). Langkah berikutnya adalah terinduksinya gen-gen pada vir-region oleh suatu signal yang spesifik didalam sel bakteri sehingga dihasilkan produk dari expresi gen-gen virulen untuk memproses T-DNA dan mentransfernya dari dalam sel bakteri. Prosesing dan transfer T-DNA dimediasi oleh berbagai protein yang dikode

pembentukannya oleh gen-gen virulen. Prosesing T-DNA dimulai dari suatu kejadian memproduksi T-DNA untai tunggal yang disebut T-strand yang ditransfer ke dalam sel tanaman. Kejadian ini dimediasi oleh produk dari genvirD1 dan virD2 yang berfungsi memotong T-DNA di bagian left border dan right border. Salah satu produk yaitu molekul VirD2 tetap melekat secara kovalen pada 5 end dari T-strand dan membentuk apa yang disebut T-complex yang masih setengah jadi. Pembentukan T-complex ini dilaporkan berfungsi untuk menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju inti sel tanaman inang. Tahap akhir dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah integrasi T-DNA ke dalam genom sel tanaman inang.

2.3 Transfer T-DNA oleh A. Tumefaciens kedalam sel tanaman. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah yang dapat menyebabkan penyakit tumor pada beberapa tanaman. Bakteri menginfeksi melalui bagian yang luka pada batang tanaman dan mengakibatkan tumor pada daerah sekitar akar dan batang tanaman. Penyebab pembentukan tumor bukan berasal dari bakteri itu sendiri tetapi dari plasmid yang dikenal dengan plasmid Ti. Ukuran DNA plasmid Ti cukup besar, berkisar antara 140-235 kb (1 kb = 1000 pasang basa). Selama menginfeksi, sebagian kecil dari DNA plasmid Ti (15-30 kb), disebut T-DNA, ditransfer kedalam inti sel tanaman dan tersisipi kedalam DNA inti sel tanaman. Dari sini T-DNA sudah terintegrasi dan stabil terpelihara dalam genom sel.

T-DNA membawa gen yang bertangung jawab terhadap pembentukan tumor dan sintesa asam amino yang dikenal sebagai opine. Gen-gen yang bertanggungjawab untuk transfer T-DNA juga terdapat dalam plasmid Ti yang disebut gen-gen virulen (gen vir). Infeksi Agrobakterium memerlukan jaringan tanaman yang luka karena gen vir dapat terinduksi oleh senyawa fenolik yang dilepaskan ole sel-sel tanaman yang terluka.

Daerah ini merupakan potongan DNA berukuran relatif pendek berisi urutan 25 pasang basa yang berulang. Setiap potongan DNA yang tersisipi diantara kedua batas T-DNA akan ditransfer dan diintegrasikan kedalam genom tanaman. Oleh karena itu plasmid Ti merupakan vektor yang sangat cocok untuk mengintroduksi gen-gen asing ke dalam sel tanaman.

Gambar : Ilustrasi transfer T-DNA oleh A. Tumefaciens kedalam sel tanaman

2.4 Tanaman Kedelai Tahan Penggerek Polong Melalui Transformasi Genetik Gen Cry 1AB dengan Vektor Agrobacterium Tumefaciens

Kedelai merupakan tanaman penting diIndonesia setelah padi dan jagung, yanghingga saat ini untuk memenuhi tingginya permintaan masih perlu dilakukan

impor dalam jumlah yang sangat tinggi.Kebutuhan kedelai Indonesia meningkat hingga mencapai2.24 juta setiap tahunnya, padahal produksi kedelai nasional pada tahun 2000 saja, hanya mencapai 1.19 juta ton. Hingga tahun 2000, Indonesia mengimpor kedelai 342.124 ton pertahun dan menghabiskan devisa sebesar USD 200-300 juta (Biro Pusat Statistik Indonesia 2002). Upaya peningkatan produksi kedelai diIndonesia terkendala oleh beberapa faktor, diantaranya adalah tingginya serangan hama penggerek

polong kedelai (Etiella zinkenella). Serangan hama ini dapat menurunkan hasil hingga 20-40 % pada 90 % areal pertanaman tidak sekitar 11.000 ha setiap tahunnya, (Nurdin et al.,

bahkanmencapai

apabila

dilakukanpengendalian

1995). Serangan hama ini dapat diatasi dengan penggunaan insektisida kimia. Namun demikian, dilakukan pada itupenggunaan penggunaan daerah fungisida dengan yang fungisida tingkat inimenjadi serangan yang dapat tidak sangat efektif tinggi. apabila Selain

terus menerus

menyebabkan pencemaran

lingkungan dan timbulnya resistensi serangga terhadap bahan kimia. Upaya yang aman dan efektif untuk mengatasi hama tersebut adalah dengan perakitan kultivar kedelai yang tahan terhadap hama penggerek polong. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk merakit tanaman kedelai tahan hama penggerek polong adalah dengan membentuk tanaman kedelai transgenic dengan menggunakan metode transformasi gen. Transformasi genpada tanaman dapat dilakukan dengan dua cara yaitu transformasi secara langsung meliputi metode mikroinjeksi DNA,

elektroforasi, fusi protoplas dan particle bombardment, serta transformasi tidak langsung dengan bantuan vektorAgrobacterium tumefaciens yang merupakan

bakteri obligat gram negatif yang hidup alamidi tanah. Transformasi tidak langsung melaluiA. tumefaciens memanfaatkan vektor ganda dengan dua

plasmid (plasmid biner).

A. tumefaciens yang dilengkapi dengan plasmid biner mampu memindahkan gen asing dan mengintegrasikannya ke dalam genomtanaman (Smith & Hood, 1995). Klon gen yang sudah banyak diteliti dalam usaha mengatasi serangan hama dari ordo Lepidoptera adalah gen Cry yang merupakan penyandi protein aktifanti serangga yang diisolasi dari bakteriBacillus thuringiensis (Bt). Gen inimenghasilkan kristal protein yang bersifat racun bila terhidrolisis dalam jaringan usus serangga. Bt yang dikode oleh Cry1Ab terbukti efektif terhadap hama ordo Lepidoptera (Wunn et al.1996). Transformasi gen Cry untuk perakitan tanaman tahan hama Lepidoptera telahberhasil dilakukan pada tanaman jagung (Jagung Bt tahan penggerek

batang), tanaman kapas (kapas Bt tahanpenggerek buah), dan tanaman padi (padi Bt tahan penggerek batang). Saat ini beberapa tanaman transgenik seperti kentang, kapas, dan jagung telah dilepas secara komersial di Indonesia (Loedinet al. 1998). Studi mengenai transformasi genCry1AB pada tanaman kedelai di Indonesia belum banyak dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui tingkat keberhasilan transformasi

gen Cry1ABkedalam Perakitan Tanaman Kedelai Tahan Penggerek Polong tanaman kedelai dengan menggunakanvektor Agrobacterium tumefaciens. Kedelai tahan penggerek polong dengan transformasi genetik

gen cry1Abdengan vector Agrobacterium tumefaciens.Transformasi gen Cry1AB pada eksplan dua varietas kedelai. Transformasi gen pada tanaman dapat dilakukan dengan dua cara yaitu transformasi secara langsung meliputi metode

mikro injeksi DNA, elektroforasi, fusi protoplas dan transformasi tidak langsung dengan bantuan vektor Agrobacteriumtumefaciens yang merupakan bakteri obligat

gram negatif yang hidup alami di tanah. Transformasi tidak langsung melalui A. tumefaciens memanfaatkan vektor ganda dengan dua plasmid (plasmid

biner).A.tumefaciens yang dilengkapi dengan plasmid mampu memindahkan gen asing ke dalam genom tanaman. transformasi gen Cry1AB pada tanaman kedelai di Indonesia belum banyak dilakukan. transformasi gen Cry1AB kedalamPerakitan Tanaman Kedelai Tahan Penggerek tumefaciens Transformasi pada tanaman kedelaidibutuhkan pengetahuan dan kemampuan baik dalam bidang kultur jaringan maupun transformasi. Salah satu hambatan yang paling besar dalam transformasi adalah respon dari tanaman kedelai pada saat manipulasi kulturin vitro. Pertumbuhan semua eksplan yangberasal dari kotiledon tua tanaman kedelai Selain faktor setelah ditransformasi kecilnya dengan A.tumefacienstampak transformasi normal. yang Polong tanaman kedelai dengan menggunakanvektor Agrobacterium

seleksi,

kemungkinan terjadinya

diperoleh juga disebabkan oleh faktor kontaminasi dari jamur mulai dari media ke media kokultivasi sampai dengan mediaseleksi. Transformasi pada tanaman legume lebih sulit dilakukan dibandingkan dengan tanaman lain sehingga harus diperhatikan sel target yang bersifat totipoten, sistem transfergen ke dalam sel target, dan system seleksi, serta teknik identifikasinya.

III.

KESIMPULAN

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak

digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik. Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi

tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor).

Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens.

Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di dalam plasmid Ti terdapat gen yang menyandikan sifat virulensi untuk menyebabkan penyakit tanaman tertentu. Gen asing yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman dapat disisipkan di dalam plasmid Ti. Selanjutnya, A. tumefaciens secara langsung dapat memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA) tanaman. Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan.

Di era transformasi genetik sekarang ini, peran Agrobacterium sangat besar

dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi untuk mendapatkan sifat yang diinginkan. Peran Agrobacterium dalam hal ini ialah sebagai pembawa gen (DNA) yang diinginkan. Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri aerob obligat gram negatif yang hidup alami di tanah. Bakteri ini banyak menyebabkan penyakit crown gall (tumor) pada tanaman dikotil. Kemampuannya dalam menyebabkan penyakit ini berhubungan dengan gen penginduksi tumor yang ada pada plasmid (Ti) yang dijumpai dalam bakteri tersebut. Dalam sel tumor yang terbentuk terkandung enzimenzim yang tidak tampak pada tanaman normal, karena enzim tersebut hanya dihasilkan oleh sel Agrobacterium. Enzim-enzim tersebut menghasilkan suatu senyawa gula spesifik yang dinamakan opin. Senyawa opin ini merupakan makanan bagi Agrobacterium itu sendiri.