Aula 5

BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA
4.Tcnicas de anlise e manipulao de DNA
4.1 Amplificao enzimtica de DNA
(PCR: Polymerase chain reaction )

Bibliografia :
-Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Sambrook and Russell, 2001; CSHL Press, Volume 2. - Molecular Cell Biology, Lodish et al, 5th edition, W. H. Freeman and Company, 2004.
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ATENO
Aula prtica P1-Dia 8/11/11 ,16-18H P2-Dia 9/11/11, 11-13H obrigatrio levar bata e protocolo (e-conteudos)
PCR (Polymerase Chain Reaction)

Amplificao enzimtica de DNA: permite obter, in vitro, grandes quantidades de uma sequncia especfica de DNA.
PCR : Polymerase chain reactionSaiki, R.M., Scharf, S.J., Faloona, F., Mullis, K.B, Horn, G. T., Erlich, H.A. and Arnheim, N. (1985) Enzymatic amplification of beta-globin sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230: 13501354.

- Permite copiar, rapidamente, qualquer fragmento de DNA;
- Se conhecermos a sequncia das extremidades 5 e 3 do fragmento de DNA de interesse, pode amplificar-se a totalidade da sequncia compreendida entre as 2 regies; - Se no conhecermos a sequncia nas extremidades do fragmento mas apenas regies intermdias, o PCR permite obter um fragmento da sequncia que poder ser usado como sonda para rastrear os bancos de DNA e assim isolar o fragmento de interesse, que pode ou no ser um gene.
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Para isolamento de genes: Podem usar-se variantes do PCR, que tm como base caractersticas das regies 5UTR e 3UTR do mRNA.

1- PCR- definio 2- Os ciclos do PCR 3- DNA molde 4- Primers 5- Enzima 6- Optimizao do PCR
PCR = Reaco de amplificao em cadeia =
amplificao enzimtica de DNA
- amplificao de uma sequncia especfica de DNA, pela utilizao de um par de oligonucleotdeos iniciadores (primers), cada um deles complementar a cada uma das extremidades da sequncia a amplificar.
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- Ao amplificar um fragmento a partir de um DNA molde, os fragmentos com extremidades abruptas, aparecem no 3 ciclo de PCR; - A partir da, os produtos amplificados acumulam-se exponencialmente, tal como descrito na equao:
Nf = No(1+Y)n
Nf = o n de cpias da sequncia amplificada aps n ciclos de amplificao No= o n inicial de cpias da sequncia alvo no DNA molde Y= a eficincia de amplificao por ciclo
aplica-se na fase exponencial de amplificao que, continua at que um dos componentes da reaco se torne limitante.
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Cintica da reaco de PCR

Fase plateau paragem Fase linear Variabilidade Fase exponencial Mxima eficincia Eficincia ~1
Ciclos de PCR
Os ciclos de PCR
1- PCR- definio 2- Os ciclos do PCR 3- DNA molde 4- Primers 5- Enzima 6- Optimizao do PCR
Numa reaco de PCR fazem-se ~ 30-40 ciclos de 3 passos cada um, a temperaturas especficas:
- Desnaturao: as cadeias do DNA molde so desnaturadas, por aquecimento a 94-95C ; - Hibridao dos primers: a temperatura diminuda at 5560C para permitir a hibridao dos primers; - Extenso (elongao, ou polimerizao): a temperatura aumentada at 72C para que se d a polimerizao, que 9 necessita dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) e Mg2+.
Os ciclos de PCR
30-40 ciclos de trs passos:
Passo 1: Desnaturao
Template Molde Primers

Passo 2: Hibridao
Enzimas
Passo 3: Extenso
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PCR - DNA molde

1- PCR 2- Os ciclos do PCR 3- DNA molde 4- Primers 5- Enzima 6- Optimizao do PCR
- Qualquer fonte de DNA que fornea uma ou mais molculas alvo pode ser utilizado como molde para PCR;
- s se pode fazer PCR se for conhecida alguma informao sobre a sequncia, para se poderem desenhar os primers.
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PCR- primers
-Devem ser desenhados para:

hibridarem em cadeias opostas do DNA molde; possuirem entre 18 e 30 nt; terem % G+C equivalentes, de tal modo que hibridem mesma temperatura [com temperaturas de fuso (Tm) prximas]; Tm=2(A+T)+4(G+C): se os primers tiverem entre 18-30 nt, a temperatura de hibridao usada no PCR deve ser ~Tm 5oC;
NOTA: existem programas informticos especficos para desenhar primers (EX: Beacon; Primer designer)
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PCR - variao
Primers degenerados : um pool de primers derivados de uma sequncia proteica. Ex: His-Phe-Pro-Phe-Met-Lys Pode gerar o primer : 5-CAY TTY CCN TTY ATG AAR Y= Pirimidina N= qualquer base R= purine Objectivo: isolar/clonar o gene que codifica para determinada protena. 13
PCR- enzima
Thermus aquaticus.
- A mais comum a Taq polimerase - enzima termo- estvel (DNA polimerase isolada da bactria termoflica Thermus aquaticus); - Esta enzima no tem actividade exonucleoltica proofreading 3 5; - A fidelidade baixa, no boa para clonagem.
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PCR- optimizao
-Para optimizar o PCR pode alterar-se: a temperatura de hibridao ; a concentrao de Mg2+ - o tampo de PCR tem MgCl2 , o Mg2+ influencia a hibridao dos primers. ou fazer nested PCR.
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Nested PCR
First round primers
Gene of interest
Second round PCR
First round PCR Second round primers
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4.Tcnicas de anlise e manipulao de DNA
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Ferramentas para analisar o DNA e o RNA:
aparar copiar
cortar
coser
marcar
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Enzimas para analisar o DNA e o RNA

A maioria das enzimas usadas em Biologia Molecular pode ser dividida em 3 grupos:
- as que hidrolisam ligaes fosfodister (nucleases: exo e endonucleases);

- as que criam ligaes fosfodister (polimerases, transferases, ligases e quinases); - as fosfatases- tambm hidrolisam ligaes fosfodister
(Ex: fosfatase alcalina bacteriana- remove grupos fosfato 5 de DNA, RNA, NTPs e dNTPs.
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4.2.1 Nucleases
Enzimas que hidrolisam ligaes fosfodister :

nucleases: exo ou endonucleases, consoante necessitam ou no de uma extremidade livre de cido nucleico para a sua aco.
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Nucleases
Hidrolisam o DNA dentro da cadeia; activas em DNA circular ou linear Ex.:
-actuam, digerindo os cidos nucleicos, nas extremidades da molcula; activas s em molculas lineares. - ex: a partir da extremidade 3do DNA
Exonucleases- classificadas com base na especificidade da extremidade em que actuam: na extremidade 3 ou 5 livre.
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Nucleases: DNase e RNase

As nucleases podem funcionar como inimigas dos bilogos moleculares que querem preservar a integridade das amostras de DNA ou RNA.
Mas, as desoxirribonucleases (DNases) e as ribonucleases (RNases) tm alguns papis fundamentais!
-As DNases e RNases diferem: especificidade do substrato
co-factores
se clivam na extremidade da molcula (exo) ou internamente (endonucleases).
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DNases e RNases
- A sua especificidade depende apenas da concentrao da enzima usada na reaco:
altas concentraes promovem cortes no especficos
- Nucleases mais usadas: DNase I e RNase A, ambas purificadas a partir do pncreas bovino;
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DNase I- Desoxirribonuclease I
- cortes aleatrios numa das cadeias de DNA- em presena de Mg2+ , pH=7,5-8; - cortes nas duas cadeias- em presena de Mn2+ ;
-os produtos tm extremidades 5 fosfato e 3OH.
Aplicaes da DNAse I: - Eliminar DNA de preparaes de RNA; - Analisar interaces DNA - protena (footprinting com DNase I); - Fazer o nicking de DNA, previamente marcao radioactiva por nick translaction.
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RNase A- Ribonuclease A
- endorribonuclease;
- corta RNA em cadeia simples, a 3 de uma pirimidina (U, C);

- degrada RNA em mononucleotdeos fosfatados a 3.
Aplicaes da RNAse A:
- Eliminar RNA contaminante de preparaes de DNA; - Mapear mutaes no DNA ou RNA por clivagem em mismatch
(RNase A corta o RNA em hbridos RNA:DNA em stios com mismatches de bases nicas, e o produto de clivagem pode ser analisado e sabida a sequncia do mismatch).
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Enzimas de restrio = nucleases

Endonucleases de restrio: - Reconhecem sequncias especficas de DNA
em cadeia dupla;
- cortam as 2 cadeias; - originam extremidades abruptas ou coesivas.
Ex. de uma extremidade coesiva Bgl II

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Enzimas de restrio
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Enzimas de restrio - Tipo II

- Tesouras de DNA;
- nucleases que clivam o DNA em sequncias especficas;

- as sequncias de reconhecimento so geralmente palindrmicas- as enzimas de r. ligam-se a estes stios como dmeros:
Corte Extremidades coesivas

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Enzimas de restrio
- O n de nt da sequncia de reconhecimento varia: Ex.: -EcoRI reconhece uma sequncia de DNA de 6pb -NotI reconhece uma sequncia de DNA de 8pb o comprimento da sequncia de reconhecimento est inversamente relacionado com que frequncia de reconhecimento da enzima de restrio;
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Enzimas de restrio
- A frequncia de ocorrncia de uma sequncia: hexamrica (6pb de sequncia de reconhecimento): 46 = de 4096pb em 4096pb
tetramrica (4pb) 44 = 256pb
- iso-esquismeros= enzimas de restrio diferentes, com a mesma sequncia de reconhecimento.

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Enzimas de restrio
- H enzimas de r. sensveis metilao no cortam as molculas de DNA se as sequncias especficas estiverem metiladas:
DNA no metilado
EcoRI no corta DNA metilado DNA metilado
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Enzimas de restrio - padres de corte
- hidrolisam a cadeia de DNA entre a desoxirribose e o grupo fosfato grupo fosfato(-P) na extremidade 5 e grupo hidroxilo(-OH) na 3, em cada uma das molculas; - h poucas enzimas de r. que hidrolisam DNA em cadeia simples;
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Enzimas de restrio
- Podem originar 3 tipos de extremidade:
coesiva 5 Ex: coesiva 3 Ex:
OH OH
p p HO
HO
abrupta
OH
p
33
Ex:
p HO
Enzimas de restrio
-O nome de uma enzima est relacionado com o nome da bactria a partir da qual esta foi isolada:
A 1 letra usada para a enzima a 1 letra da espcie da bactria, em itlico; depois vm as primeiras duas letras da categoria, tambm em itlico;
depois a 1 letra da estirpe do organismo;

Por fim, em nmeros romanos, o significado numrico da ordem da descoberta.
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Nomes- enzimas de restrio
Ex: EcoRI Escherichia coli

Espcie categoria
a 1 enzima deste R13 tipo encontrada

estirpe
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Enzimas de restrio
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Digesto de um fragmento de DNA com EcoRI
(O fragmento maior)
(O fragmento mais pequeno)
-Uma molcula de DNA linear com 6 cpias de GAATTC:

cortada, pela Eco RI, em 7 fragmentos, que podem ser separados, por tamanho, numa electrofore em gel
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Anlise de restrio- mapas
As endonucleases podem ser utilizadas para fazer mapas de restrio : ex.: uma combinao de EcoRI + HindIII
Uma dada molcula de DNA origina um conjunto de padres caractersticos, quando digerida com uma srie de enzimas diferentes.
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Extremidades compatveis
Fragmentos de restrio com extremidades coesivas complementares so ligveis:
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4.2.2 Enzimas de modificao
Enzimas que criam ligaes fosfodister
polimerases, ligases, transferases e quinases
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Enzimas de modificao
- polimerases do DNA ou do RNA- requerem uma cadeia molde e podem ou no necessitar de uma extremidade iniciadora;
- ligases - requerem uma extremidade de DNA, 3OH livre, que ligam a um grupo 5-P livre , de outro DNA;
- transferases - requerem uma extremidade 3OH livre, qual adicionam nucleotdeos por passos sucessivos; - quinases - requerem uma extremidade 5OH livre, para a qual transferem um grupo fosfato.
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DNA polimerase
- in vivo: replicam e ajudam reparao do DNA
DNA - in vitro: polimerizam a partir de uma extremidade polimerases 3OH (primer) de uma cadeia de DNA, fazendo uma
cpia complementar da cadeia molde, qual este est hibridado
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DNA polimerase
- DNA polimerase I de E. coli actua no DNA; tem actividade polimersica e as actividades exonuclesicas 35 e 5 3;
- de um modo geral, no se usa a haloenzima;
- cada uma das 3 actividades est num domnio diferente da enzima fazem-se deleces proteolticas de tal modo que a enzima perca uma ou mais actividades;
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DNA polimerase - fragmento de Klenow

Domnio polimersico + 3 5 exonuclesico
- O fragmento de Klenow da DNA polimerase I (= grande fragmento da DNA polimerase I)- tem as actividades: polimersica e exonuclesica 35.
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usado para vrios fins:
sntese de DNA em c.d. a partir de moldes em cadeia simples:
preenchimento de extremidades de DNA, recessivas 3 :
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preparao de sondas radioactivas por incorporao de nucletidos marcados com um composto radioactivo, em qualquer uma das reaces anteriores, o fragmento neosintetizado fica marcado.
digesto de extremidades coesivas 3 :
46
DNA polimerase do fago T4
Actividade idntica do fragmento de Klenow, embora a actividade exonuclesica 3 5 seja mais forte.
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RNA polimerase
RNA polimerase - in vivo: transcreve genes originando cpias de RNA; - in vitro: usada para gerar grandes quantidades de RNAs, a partir de uma sequncia desejada.
- catalisa a polimerizao de NTPs; - no necessita de iniciador; -necessita de uma cadeia molde: DNAc.d., DNA c.s. ou RNA; -a polimerizao mais longa a partir de DNA c.d. que contenha stios especficos para a ligao da RNA polimerase (promotores).
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RNA polimerase
H s RNA polimerases de fago, disponveis no mercado:
-designadas pelo nome do fago que as codifica;

-so purificadas a partir da bactria infectada pelo fago ou so protenas recombinantes, Ex:
Nome da polimerase RNA polimerase T7 RNA polimerase T3 RNA polimerase SP6 Hospedeiro do fago E. coli E. coli Salmonella typhimurium Sequncia do promotor
TAATACGACTCACTATAGGG AATTAACCCTCACTAAAGGG AATTTAGGTGACACTATAGAA
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Ligao de molculas de DNA
Ligar fragmentos juntar fragmentos de DNA por ligaes covalentes
envolve a formao de uma ligao fosfodister entre o grupo 3 OH de um nuclotdeo e o grupo 5P de outro.
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Ligao de molculas de DNA

H trs modos de ligar, in vitro, fragmentos de DNA : 1- Com DNA ligase de E.coli - estabelece ligaes covalentes em extremidades coesivas emparelhadas; 2- Com DNA ligase do fago T4- catalisa ligaes fosfodister entre extremidades abruptas ou coesivas compatveis; 3- Com a transferase terminal- sintetiza caudas homopolimricas 3 em cadeia simples, na extremidade dos fragmentos.
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DNA Ligase de E. coli

- Sela nicks (quebras) em cadeia simples, entre nucleotdeos adjacentes numa cadeia dupla de DNA;
- Requer NAD+ como cofactor; forma-se uma ligao covalente na cadeia fosfodister, entre 5P e 3OH; - Temperatura ptima de ligao = 37C mas, a esta temperatura, as pontes de H entre as extremidades coesivas so instveis para extremidades coesivas, usa-se a temperatura de ligao entre 4-16C. 52
DNA Ligase de T4
- Estabelece ligaes covalentes fosfodister, entre extremidades 5P e 3OH e usa ATP como co-factor;
Extremidades coesivas complementares ( = a reparar nicks do DNA em c.d)
- Liga extremidades coesivas
e abruptas;
Extremidades abruptas (menor eficincia)
- temperatura ptima = 16C.
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DNA Ligase de T4
- Muito utilizada para ligar fragmentos com extremidades abrutas atravs de Linkers (adaptadores):
Linkers: molculas que contm stios de reconhecimento para uma ou mais enzimas de restrio.
Ex: Linker EcoRI

5 CCGAATTCGG3 3 GGCTTAAGCC5
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Transferase Terminal
- Catalisa a adio de nucleotdeos extremidade 3 do DNA;
- substrato: DNA em cadeia simples e extremidades coesivas 3, de DNA em cadeia dupla;
- consegue adicionar homopolmeros de ribonucleotdeos a extremidades 3 de DNA.
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Transferase Terminal - Aplicaes
Marcao de extremidades 3 de DNA:
3 3
* ** * * * *
* * * * * *
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Transferase Terminal - Aplicaes

Adio de caudas complementares homopolimricas a DNA (um dos mtodos para ligar molculas de DNA):
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Polinucleotdeo quinase (PNK)

- Catalisa a transferncia de um grupo fosfato do ATP para a extremidade 5 de DNA ou RNA;
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Polinucleotdeo quinase (PNK)

- Pode ser usada em 2 tipos de reaco:
A molcula alvo no tem grupo 5 P, ou porque foi desfosforilada ou porque foi sintetizada quimicamente
A eficincia de fosforilao atravs desta reaco menor que a da r. ao lado
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Polinucleotdeo quinase (PNK)- Aplicaes

Fosforilao de linkers ou fragmentos de DNA a ligar posteriormente, os quais requerem o grupo 5 P (incluindo produtos de PCR, que so normalmente sintetizados com primers no fosforilados);
Marcao radioactiva de oligonucleotdeos, normalmente com 32P, para usar como sondas de hibridao.
Notas: - PNK inibida por pequenas quantidades de ies amnio o acetato de amnio no deve ser utilizado para precipitar cidos nucleicos antes da fosforilao;
- Baixas [ ]s de ies fosfato, ou [ ]s de NaCl maiores que 50mM tambm inibem a PNK.
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Transcritase reversa
- Polimerase que actua em DNA ou RNA; - codificada por retro-vrus, onde copiam o genoma viral, de RNA, em DNA antes da sua integrao no genoma do hospedeiro; - consegue fazer DNA a partir de um molde de RNA:
- catalisa a polimerizao de dNTPs, na direco 53, tendo como molde DNA ou RNA em cadeia simples; - necessita de um primer com uma extremidade 3OH livre.
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Transcritases reversas comerciais

As 2 transcritases disponveis comercialmente so:
AMV- Transcritase reversa do vrus da mieloblastose aviria. MMLV- Transcritase reversa do vrus da leucemia murina.
-Ambas tm as mesmas funes;
-diferem nalgumas caractersticas como pH e temperatura ptimos.
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Transcritase reversa - Aplicaes

Usada para copiar RNA em DNA:
- Para clonar cDNA - cpias de DNAs, geradas de mRNAs maduros; - Usam-se oligos de timidina como primers (12-18 bases, oligo-dT) que hibridam na cauda poli-A para fabricar cpias de DNA (cDNA) a partir de um mRNA poliadenilado:
cDNA
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Fosfatases
Fosfatases
hidrolisam ligaes fosfodister, a partir de extremidades de cidos nucleicos = removem grupos P.
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Fosfatases
Fosfatase alcalina bacteriana (BAP)- catalisa a remoo de grupos 5-P dos substratos: DNA, RNA, NTPs, e dNTPs.
Fosfatase alcalina do intestino de vitela (CAP)catalisa a remoo de grupos 5 ou 3-P de DNA, RNA, NTPs, e dNTPs.
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Fosfatases - Aplicaes
Remoo de fosfatos 5 de plasmdeos e de outros vectores, previamente cortados com enzimas de restrio:
-Tratamento que evita re-ligao do vector, facilitando a ligao de fragmentos de DNA exgenos ao vector:
P OH OH P
Ligase
Re-circulariza
Fosfatase alcalina OH OH OH OH Ligase
No actua
no re-circulariza
Ligase
Transformao
Hospedeiro repara os nicks 66
Fosfatases
Remoo de fosfatos 5 de fragmentos de DNA, antes da sua marcao com fosfato radioactivo: A PNK mais eficiente a fosforilar DNA se o P- 5 tiver sido previamente removido:
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-Devem ser desenhados para:

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Second round PCR

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Ferramentas para analisar o DNA e o RNA:

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Enzimas para analisar o DNA e o RNA

- as que hidrolisam ligaes fosfodister (nucleases: exo e endonucleases);

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Enzimas que hidrolisam ligaes fosfodister :

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Hidrolisam o DNA dentro da cadeia; activas em DNA circular ou linear Ex.:

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Nucleases: DNase e RNase

Mas, as desoxirribonucleases (DNases) e as ribonucleases (RNases) tm alguns papis fundamentais!

-As DNases e RNases diferem: especificidade do substrato

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altas concentraes promovem cortes no especficos

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-os produtos tm extremidades 5 fosfato e 3OH.

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- corta RNA em cadeia simples, a 3 de uma pirimidina (U, C);

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Corte Extremidades coesivas

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