I.

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Seorang mikrobiologiwan apabila akan mendiagnosis suatu penyakit

haruslah memeriksa suatu mikroorganisme secara amat terperinci. Untuk
memerinci suatu mikroorganisme tersebut maka dapat dilakukan dengan
pengecatan bakteri. Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan
yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi
mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan
sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat
digunakan untuk identifikasi awal.
Supaya bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipalajari maka tingkat sel
kontras itu dapat ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Yang dimaksud dengan
pewarnaan disini adalah perlakuan dengan zat warna yang mengikat secara
selektif baik seluruh sel maupun komponen sel tertentu, sehingga dapat
menghasilkan penyerapan cahaya yang jauh lebih besar. Kebanyakan perlakuan
pewarnaan dapat membunuh sel oleh karena itu sebelum sel itu difiksasi dengan
perlakuan memakai zat kimia yang bertujuan untuk mengurangi perubahan
struktur sel yang telah mati. Zat untuk fiksasi yang biasa digunakan adalah asam
osmat dan aldehid, terutam glutar aldehid. Salah satu bakteri yang sering diamati
dengan menggunakan pewarnaan adalah bakteri gram. Warna yang terlihat di
mikroskop adalah menunjukkan jenis bakteri gram tersebut positif atau negative.

B. Tujuan
Untuk menentukan Gram positif dan Gram negatif
 II. TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan (Dwidjoseputro, 1994).
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri
dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat
struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,
menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat
warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar &
Chan, 1986).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana (Pelczar & Chan, 1986).
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau
bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan,
1986). . Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel
sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan
ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu
fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat
warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun
1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983).
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua,
yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp
Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-
bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial
(berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut
relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri
tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan
sederhana atau Gram ( Dwidjoseputro, 1994).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu
ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan
negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri
karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan
inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991).
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa.
Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna
basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh
zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain.
Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO?.
Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan
bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-
bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi,
peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup (Sutedjo, 1991). Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu
dan bakteri gram negatif berwarna merah.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
o Zat warna utama (violet kristal)
o Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan
untuk mengintensifkan warna utama.
o Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven
 organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna
utama.
o Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama
setelah perlakuan denga alcohol.
 III. METODE PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan

1) Alat
• Gelas obyek
• Jarum ose
• Lampu spiritus
• Mikroskop
2) Bahan
• Biakan murni Bacilus subtillis
• Biakan murni Escherichia coli
• Reagen :
a. Violet kristal
b. Larutan iodine
c. Etanol 95%
d. Safranin
 B. Prosedur Praktikum

0100090000037800000002001c00000000000400000003010800050000000b020
0000000050000000c0264094d06040000002e0118001c000000fb0210000700000
00000bc02000000000102022253797374656d00094d06000078c90000985c11000
4ee8339e03ca7010c020000040000002d01000004000000020101001c000000fb02
ceff0000000000009001000000000440001254696d6573204e657720526f6d616e0
000000000000000000000000000000000040000002d01010005000000090200000
0020d000000320a2d00000001000400000000004d06600920001600040000002d0
10000030000000000n

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

No Nama bakteri Perbesaran Hasil pengamatan Keterangan

(gambar)
1 E. coli Gram
negative

2 B. subtilis Warnanya
ada yang
merah, hijau,
dan kuning
 B. Pembahasan
Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3
µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral
(Pelczar & Chan, 1986). Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai
dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas
dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran
(Fardiaz, 1992).
Pada praktikum kali ini, kita akan membahas pewarnaan pada bakteri.
Pewarnaan gram merupakan salah satu tekhnik pewarnaan diferensial yang
penting dan yang paling luas digunakan. Pewarnaan ini digunakan untuk
mengidentifikasi bakteri gram positif dan gram negative berdasarkan warna akhir
yang terbentuk yaitu gram positif berwarna ungu dan gram negative berwarna
merah.
Pada praktikum ini proses pewarnaan gram, mula-mula gelas obyek
dibersihkan menggunakan alkohol. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek
bebas lemak dan debu. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada
permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni (Bacilus subtilis dan Escherichia
coli) diambil sebanyak satu ose dan diratakan diatas kaca obyek yang bersih
sampai kira-kira seluas 1 cm2. dalam pengambilan kultur bakteri ini tidak diambil
terlalu banyak karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur
bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan
mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas. Apabila
sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses
fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga
olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga
agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan
kristal violet dan dibiarkan selama satu menit. Kemudian dicuci dengan air
mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian
dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal.
Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan
dibiarkan selama satu menit sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet
kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir.
Kemudian dicuci dengan etanol selama ± 15 detik dan dicuci kembali dengan air
mengalir. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan
selama 2 menit. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering anginkan.kaca
obyek ditutup setelah olesan kering kemudian diamati dibawah mikroskop. Pada
gelas obyek yang berisi biakan murni bacillus subtillis ternyata warna tetap tidak
luntur dan tetap berwarna ungu ( biru-hitam) dan setelah ditambah pewarna
safranin warna tetap biru hitam( ungu ) sedangkan pada biakan murni Escherichia
Coli wran menjadi luntur dan hilang sama sekali tetapi setelah ditambah pewarna
safranin menjadi berwaran merah. Berdasarkan hasil pengamatan tersebut
Bacillus Subtillis merupakan bakteri gram positif sedangkan Escherichia Coli
merupakan bakteri gram negatif. Pemberian kristal violet pada bakteri gram
positif akan meninggalkan warna ungu muda.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
menurut Pelczar & Chan (1986) adalah didasarkan pada struktur dan komposisi
dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif
mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri,
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding
selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu (Pelczar & Chan ,1986).
Tjitrosomo (1982) memberikan pendapat tentang pewarnaan gram
positif dan gram negatif:

Larutan dengan urutan Reaksi dan tampang pada bakteri

penggunaan
Gram positif Gram negatif
Ungu kristal Sel berwarna ungu Sel berwarna ungu
kompleks
Larutan iodin Komplek UK/ iodium Ungu kristal/ iodium
terbentuk di dalam sel. terbentuk di dalam sel.
 Sel tetap berwarna ungu Sel tetap berwarna
Alkohol Dinding sel mengalami ungu.
dehidrasi, pori menciut, Lipid terekstrasi dari
daya membran menurun, dinding sel, pori
UK-I tak dapat keluar mengembang, kompleks
dari sel. Sel tetap ungu UK- I keluar dari sel
menjadi tak berwarna.
Safranin Sel tak terpengaruh, tetap Sel menyerap zat
ungu pewarna menjadi merah

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel
dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat
lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol
memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal
yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif
lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat Gram positif Gram negative

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap Lebih sensitive Lebih tahan
penisilin
Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat
basa
Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif sederhana

Ketahanan terhadap Lebih tahan Kurang tahan

perlakuan fisik
 V. PENUTUP

A. Kesimpulan

1. Bakteri E. Coli merupakan bakteri gram negatif

dan B. Subtilis adalah bakteri gram positif
2. bakteri gram positif mampu menahan zat warna
meskipun telah dicuci dengan alkohol, berbeda
 dengan gram negatif yang berubah warnanya.

B. Saran

1. Untuk pengambilan kultur bakteri untuk

dilihat,lebih baik tipis saja sehingga dapat
dibaca sel bakteri yang ada.
2. pada saat pengamatan mikroskop lebih baik
dalam keadaan tenang sehingga pratikan lebih
konsetrasi.

DAFTAR PUSTAKA

Dwijoseputro. 1981. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan, Surabaya.

Cappuccino, J. G. & Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual.
 Addison-Wesley Publishing Company, New York.
Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka. Jakarta
Pelczar Jr, M. J dan E. C. S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI-Press,
Jakarta.
Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.
Tjitrosomo. 1982. Dunia Mikroba. Bharata Karya, Jakarta

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI
ACARA III
 PENGECATAN GRAM

OLEH:

WAHYUNINGSIH
NIM A1D00608

DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS PERTANIAN
TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
PURWOKERTO
2008