Agilent Technologies
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Pasos en la Resolucin de Problemas Una vez que has detectado que hay un problema! Cmo lo solucionas?
1st Fall el sistema o la calibracin de la muestra? Hacer Blancos 2nd R i 2 d Revisar el cumplimiento del mtodo l li i d l d Se ha seguido el procedimiento adecuadamente?
Son correctos los parmetros en el instrumento?
3rd Hgase ms preguntas! Cundo funcion correctamente el sistema por ltima vez?
Se ha cambiado alguna cosa?
Los problemas p p pueden estar relacionados con todos los componentes del sistema
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Percentage of Respondents
24%
16% 14% 13% 11% 8.1% 4.8% 2.0% % 2.0% 2.0% 2 0% 1.7% 15%
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Problemas de Presin
Sintomas de la columna Alta columna - Obstruccin en el empaquetamiento Baja presin - Fuga - Flujo incorrecto Posibles causas - Frita obstruida - Contaminacin de la
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Correccin de la sobrepresin
Determinacin de la causa y correccin de una presin alta
Muchos problemas de presin estn relacionados con obstrucciones en el sistema sistema. Comprobar la presin del sistema con y sin columna. Si la presin con columna es alta: Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro) Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)
Lavar la columna Eliminar la contaminacin en la column y limpiar el empaquetado bloqueado Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampn
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Cuidado C id d con las fases mviles tamponadas l f il t d Los tampones contienen material insoluble filtrar La solubilidad del tampn decrece con el aumento del % de orgnico* - evitar 100%B con tampones salinos *Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)
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La Tabla I p ese ta u a est ac de la co ce t at o a ab a presenta una estimacin a concentration soluble del tampn menos soluble (fosfato potsico a pH 7.0) en tres solventes orgnicos
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Solubilidad de 5 tampones en mezclas con (a) metanol (b) acetonitrilo y (c) tetrahidrofurano metanol, acetonitrilo,
metanol
acetonitrilo
THF
El trazo representa acetato amnico a pH 5.0, representa fosfato amnico a pH 3 0 --- representa fosfato potsico a pH 3 0 representa fosfato 3.0, 3.0, amnico a pH 7.0, y representa fosfato potsico a pH 7.0.
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Column Body
Do not overtighten
Fcil
No tan fcil
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Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analticas Fase Mvil sin sales de tampn p 100% Metanol 100% Acetonitrilo 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol 100% Isopropanol 100% Cloruro de Metileno* 100% Hexano* Hexano
*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con Isopropanol antes de volver a la fase mvil de fase reversa reversa.
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Solvent
Methanol:Chloroform Ethyl Acetate
Composition
50:50% 100%
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1.
Picos dividos
2. Colas en los picos (simetra <1 ) 3. 3 Picos anchos (mala resolucin. Rs<2) resolucin
Muchos problemas de formas de pico son combinaciones- i e combinaciones i.e. ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retencin. Los Sntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el cromtograma. Cada uno d estos problemas pueden t C d de t bl d tener mltiples causas. lti l
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Normal
Picos dobles
0 Time (min)
10
0 Time (min)
10
Consejo: Inyectar un solvente ms fuerte que la fase mvil puede provocar problemas en los picos tales como picos divididos o ensanchamiento Truco: Mantener la concentracin de orgnico en el solvente de muestra < Fase mvil
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Causas Algunos picos con cola: Interacciones secundarias Efectos de Retencin Interacciones con silanoles residuales residuales. Pico pequeo eluyendo en la cola de un pico mayor.
Normal
Cola
Todos los picos con colas: Efectos extra-columna. Acumulacin de contaminacin en la entrada de la columna. Metales pesados. Mala columna.
Normal Colas
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1. 2. 2 3. 4
4 4 1 1 4
0.0
5.0
0.0
5.0
0.0
5.0
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5m Fase Mvil: 20% H2O : 80% MeOH Flujo: 1.0 mL/min Temperatura: R.T. Deteccin: UV 254 nm Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno
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mAU
1500
1000
500
0 0 5 10 15 Tiempo(min) Ti ( i ) 20 25
Fronting
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Factor de Cola Eclipse XDB-C8 USP TF (5%) i A 1.60 2.00 1.56 2.13 2.15 1.25 B 1.70 1.90 1.56 1.70 1.86 1.25
A.
C. C
1. 2. 3. 4. 5. 6.
5 Time (min)
10
5 Time (min)
10
B. B
Baja Carga
D.
5 Time (min)
5 Time (min)
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Dispersin Extra-Columna
Use tubos cortos de pequeo dimetro interno entre el inyector y la columna y entre la columna y el detector. Asegrese de que todas las conexiones de los tubos estn hechas con los fittings adecuados. Use una celda de detector de bajo volumen. Inyecte pequeos volumenes de muestra.
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Los Sntomas parecen mostrar que todava hay demasiado Volumen Extra-Columna Qu est mal? Q t l? ha hecho las conexiones adecuadamente?
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Swagelok g
0.090 in.
Waters
0.130 in.
Parker
0.090 in.
Rheodyne
0.170 in.
Valco
0.080 in.
Uptight
0.090 in.
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X
Si la distancia X es demasiado corta, se generar un volumen muerto o cmara de mezcla
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Los cambio en Retencin puedes ser Qumicos o Fsicos Pueden t P d estar causados por: d
Envejecimiento de la columna j Contaminacin de la columna Equilibracin insuficiente Pobre combinacin columna/fase mvil Cambio en la fase mvil Cambio en el flujo. Diferentes volumenes de retraso del gradiente
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5 9 Time (min)
12
15
5 9 Time (min)
12
15
El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase movil/ acondicionamiento de la co u a o / aco d c o a e to a columna La forma de pico fue un asunto secundario (compuesto quelante de metal) resuelto por des-activacin de la contaminacin activa del metal
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: : : :
H + M +2
O O H
M +2
OH
Salicilaldehido
N:
M +2
C C
: : :
O N
M +2 OH
: :
OH
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1.
2.
OH
M+2
HO
OH
OH
1.
2.
OH
Columnas: ZORBAX SB-Phenyl 4.6 x 150 mm Fase Mvil: 75% 25 mM tampn fosfato amnico / 25% CAN Flujo: Temperatura: Tamao muestra: 1.0 mL/min. RT 5 mL
Tf: 3.7
Tf: 1.2
Se us una solucin del 1% H3PO4 en columnas SB; en columnas desactivadas puede usarse un 0.5 % .
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Tampones
Resisten Cambios de pH y Mantienen la Retencin Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables
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RCOOH
COOH
RCOO- +
_
H+ H+
[[RCOO-][H+]
Ka = [RCOOH]
COO
A pH 4.2 la muestra contiene cido benzoico e in benzoato en proporcin de 1:1. La forma de Pico puede ser pobre A pH 5.2 el 91% de la muestra es in benzoato. La retencion RP disminuye. A pH 3.2 el 91% de la muestra es cido benzoico. La retencion RP aumenta.
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pH 4 4 4.4
pH 3 0 3.0
CH2CH(CH3)2
4 5 6 Time (min)
10
4 5 6 Time (min)
10
Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto
debe evitarse. evitarse
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R3NH+
CHOCH CH N
2 2
R3N
CH CHOCH CH N
2 2
+
CH
H+
Ka =
[R3N][H+] [R3NH+]
+ H
CH
CH
+
3
H+
9 Ka = 1 x 10-9 pKa = 9
A pH 9 la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadas en relacin 1:1. La forma de pico puede ser pobre A pH 10 91% de la muestra es difenhidramina desprotonada. H d l t dif hid i d t d A pH 8 91% de la muestra es difenhidramina protonada.
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SCD
Columna: mBondapak-C18 Fase Mvil: 60% 25 mM tampn fostato 40% Metanol 5 1. 1 cido Saliclico 2. Fenobarbital 3. Fenacetin 4. Nicotina 5. Metamfetamina
1.0
30
0.5
5 4 SOC 3 C 2 + 12-OC + 1
UDC
log k g
Retentio on
20
7,12 - OC
+ + +
10
4 3 1 2
0.0
J.C. 268(1983) 1
-0.5
8 pH
10 3 5
ELUENT pH
Por qu la Muestra impone las condiciones de uso Qu pasa cuando el tampn se usa con efectividad Qu pasa cuando se i Q d ignora el t l tampn o se usa inadecuadamente
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La capacidad de tamponamiento ptima se d a un pH igual al pKa del tampon. La mayora de los l tampones tienen una capacidad adecuada de tamponamiento para controlar el pH d l f i id d d d d i l l H de la fase movil solo en 1 unidades de su pKa
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3 4
Columna: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Mvil: 45% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 (1.1-3.1) 3 0 (1 1-3 1) 55% MeOH Flujo: 2.0 mL/min. Temperatura: 35C Deteccin: UV 254 nm Muestra: Frmacos Cardacos 1. Diltiazem 2. Dipyridamol 3. Nifedipina 4. 4 Lidoflazina 5. Flunarizina 5
6 7 Time (min)
10
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Incluso a muy alto % MeOH La mayra de y y componentes fuertemente retenidos muestran pobre forma de pico debido al IEX en la superficie
10 Time (min)
15
20
25
Los Tampones son crticos para una buena retencin y forma de pico en muchas separaciones separaciones.
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Forma de Pico
StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Mvil: A: 30% 25 mM NaH2PO4, pH 4.8 no tamponado B: 70% MeOH Flujo: 1.0 mL/min. 1 0 mL/min Temperatura: 35C Deteccin UV:254 nm Muestra: Frmacos Cardacos 1. 1 Diltiazem 2. Dipyridamol 3. Nifedipina Inadecuada 4. Lidoflazina 5. Flunarizina
5
Columna:
10 Time (min)
15
20
25
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No olvidar- Elegir la columna adecuada al pH de la Fase Mvil para el Mximo Tiempo de Vida
pH Alto y Temperatura Ambiente (pH 11 RT)
Fase Mvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA (~ pH 11, disolucin de la slica) Inicial
Despus de 30 inyecciones
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Agilent 1100 DAD Agilent 1100 WPS with ADVR Columna: Poroshell 300SB-C18 2.1 2 1 x 75 mm 5 um mm,
Fase Mvil: A: 95% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA B: 5% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA Flujo: Detector: 2 mL/min UV 215 nm 20 3. Lisozima 4. Mioglobina Temperatura: 70C Embolada de Piston :
0.9 1.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
0.7
0.8
Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor deteccin de picos.
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Conclusiones
Los problemas en Columnas HPLC ms comunes son:
Alta Presin (Prevenir mejor q curar) ( j que ) Malas Formas de Pico Cambio en la Retencin/Selectividad
A menudo estos problemas no estn asociados con la columna y pueden ser causados por el instrumento o por problemas qumicos:
pH de la Fase Mvil Conexiones del Instrumento Parmetros del Detector Contaminacin por Metales
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