Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC

Resolucin de Problemas en HPLC:Troubleshooting

Tcnicas, Consejos , y Trucos

Agilent Technologies

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Pasos en la Resolucin de Problemas Una vez que has detectado que hay un problema! Cmo lo solucionas?
1st Fall el sistema o la calibracin de la muestra? Hacer Blancos 2nd R i 2 d Revisar el cumplimiento del mtodo l li i d l d Se ha seguido el procedimiento adecuadamente?
Son correctos los parmetros en el instrumento?

3rd Hgase ms preguntas! Cundo funcion correctamente el sistema por ltima vez?
Se ha cambiado alguna cosa?

4th Revise TODOS los parmetros!

Lo obvio no es siempre la causa Hubo ms de un cambio?
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Componentes del Sistema HPLC

Bomba Inyector /Automuestreador yecto / uto uest eado Columna Detector Sistema de datos/Integrador

Los problemas p p pueden estar relacionados con todos los componentes del sistema

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Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas Column Problem

Alta presin, fritas obstruidas Pobre reproducibilidad (formas de pico, retencin) Recuperacin de muestra Perdida de resolucin Inestabilidad Volumenes muertos Fugas, conexiones Rango de pH Bajo numero de platos Saturacin de la columna Cost Miscellaneous

Percentage of Respondents
24%
16% 14% 13% 11% 8.1% 4.8% 2.0% % 2.0% 2.0% 2 0% 1.7% 15%
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Tipos de problemas del Sistema y la Columna

A. Presin B. Forma del Pico C. Retencin

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Problemas de Presin
Sintomas de la columna Alta columna - Obstruccin en el empaquetamiento Baja presin - Fuga - Flujo incorrecto Posibles causas - Frita obstruida - Contaminacin de la

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Correccin de la sobrepresin
Determinacin de la causa y correccin de una presin alta
Muchos problemas de presin estn relacionados con obstrucciones en el sistema sistema. Comprobar la presin del sistema con y sin columna. Si la presin con columna es alta: Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro) Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)

Lavar la columna Eliminar la contaminacin en la column y limpiar el empaquetado bloqueado Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampn

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Obstruccin del empaquetado

Tamao de partcula 5.0 3.5 3.0 30 2.7 1.8 1.7 Area (um2) 2.7 1.3 1.0 10 0.7 0.4 04 0.3 Diam intersticial Porosidad de medio (um) la frita(um) 0.9 0.6 0.6 06 0.5 0.4 0.3 2.0 2.0 2.0 20 2.0 0.5 05 0.5

Cuidado C id d con las fases mviles tamponadas l f il t d Los tampones contienen material insoluble filtrar La solubilidad del tampn decrece con el aumento del % de orgnico* - evitar 100%B con tampones salinos *Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)
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Solubilidad del tampn

La Tabla I p ese ta u a est ac de la co ce t at o a ab a presenta una estimacin a concentration soluble del tampn menos soluble (fosfato potsico a pH 7.0) en tres solventes orgnicos
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Solubilidad de 5 tampones en mezclas con (a) metanol (b) acetonitrilo y (c) tetrahidrofurano metanol, acetonitrilo,

metanol
acetonitrilo

THF

El trazo representa acetato amnico a pH 5.0, representa fosfato amnico a pH 3 0 --- representa fosfato potsico a pH 3 0 representa fosfato 3.0, 3.0, amnico a pH 7.0, y representa fosfato potsico a pH 7.0.

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Cambiar la frita puede no ser buena idea

Puede que no sea posible con columnas de nueva generacin Puede daar columnas de alto rendimiento
Column Inlet Frit Compression Ferrule
Wear gloves Do not allow bed to dry y Do not touch the column body heat will extrude packing

Column Body

Do not overtighten

Female End Fitting Male End Fitting g

Consejo: Prevenir es mucho mejor!

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El Truco: Tecnicas de Prevencin- La mejor eleccin!

Usar proteccin de la columna - Filtros en linea - Salva columnas Filtrar las muestras Filtrar fases mviles tamponadas Extraccin de la muestra(i.e. SPE) Lavado apropiado de la columna

Fcil

No tan fcil

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Limpieza de la columna Limpiar con solventes ms fuertes que la fase mvil

Opciones de Solventes de Fase Reversa
en orden de fuerza creciente

Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analticas Fase Mvil sin sales de tampn p 100% Metanol 100% Acetonitrilo 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol 100% Isopropanol 100% Cloruro de Metileno* 100% Hexano* Hexano

Esto lleva tiempo, amenudo se realiza Offline

Debe revertirse para Re-Equilibrar

*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con Isopropanol antes de volver a la fase mvil de fase reversa reversa.
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Limpieza de l columna f Li i d la l fase normal l

Use al menos 50mL o 20 30 volumenes de columna para las columnas analticas 2030 Opciones tpicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente:

Solvent
Methanol:Chloroform Ethyl Acetate

Composition
50:50% 100%

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Cules son los problemas ms comunes de la forma de pico?

1.

Picos dividos

2. Colas en los picos (simetra <1 ) 3. 3 Picos anchos (mala resolucin. Rs<2) resolucin
Muchos problemas de formas de pico son combinaciones- i e combinaciones i.e. ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retencin. Los Sntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el cromtograma. Cada uno d estos problemas pueden t C d de t bl d tener mltiples causas. lti l
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Picos dobles por perturbacion en el flujo

Perturbacin en el flujo por un volumen muerto La muestra fluye por diferentes vias a travs de L t fl dif t i t d la columna Pobre empaquetamiento de las partculas p q p El pH alto disuelva la Silice

Normal

Picos dobles

Picos dobles o partidos

Consejo: Un efecto similar se produce con una frita parcialmente obstruida

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Picos divididos por efectos del solvente

de inyeccin
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 m Fase mvil: 82% H2O : 18% ACN Volumen de inyeccin: 30 L Muestra: 1. Cafeina 2. Salicilamida
1

A. A Solvente de inyeccin 100% Acetonitrilo

2 2 1

B. B Solvente de inyeccin Fase Mvil

0 Time (min)

10

0 Time (min)

10

Consejo: Inyectar un solvente ms fuerte que la fase mvil puede provocar problemas en los picos tales como picos divididos o ensanchamiento Truco: Mantener la concentracin de orgnico en el solvente de muestra < Fase mvil

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Colas, ensanchamiento C l h i t y perdida de eficacia Pueden ser causadas por:

Interacciones secundarias en la Columna Contaminacin en la Columna E Envejecimiento d l columna j i i t de la l Saturacin de la columna Efectos extra columna

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Forma del pico: Colas en los picos

Simetra > 1.2

Causas Algunos picos con cola: Interacciones secundarias Efectos de Retencin Interacciones con silanoles residuales residuales. Pico pequeo eluyendo en la cola de un pico mayor.

Normal

Cola

Todos los picos con colas: Efectos extra-columna. Acumulacin de contaminacin en la entrada de la columna. Metales pesados. Mala columna.
Normal Colas

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Colas en los picos- Contaminacin en la Columna

Consejo: Test Rpido para Determinar si la Columna est Sucia o est Daada Truco: Revetir la columna y analizarSi hay mejora, una limpieza puede ayudar No ayudar-No hay mejora-Columna Daada y necesita ser reemplazada mejora Columna
Test QC despues lavado 100% IPA, 35C IPA 35 C
Platos
3

Test QC direccin correcta

Platos 1. 2. 2 3. 4 7629 12043 13727 13355 TF 2.08 1.64 1 64 1.69 1.32
3

Test QC direccin inversa Q

Platos 1. 2. 3. 4 7906 12443 17999 17098 TF 1.43 1.21 1.19 1.25

TF 1.06 1.21 1 21 1.11 1.17

1. 2. 2 3. 4

7448 12237 15366 19067

4 4 1 1 4

0.0

2.5 Time (min)

5.0

0.0

2.5 Time (min)

5.0

0.0

2.5 Time (min)

5.0

Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5m Fase Mvil: 20% H2O : 80% MeOH Flujo: 1.0 mL/min Temperatura: R.T. Deteccin: UV 254 nm Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno

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Forma de Picos: Picos con Frente (Fronting)

2000

mAU

1500

1000

500

0 0 5 10 15 Tiempo(min) Ti ( i ) 20 25

Normal Simetra < 0.9

Fronting

Causas: Saturacin de columna

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Colas en los picos/Ensanchamiento Efectos de carga de muestra

Columnas: 4.6 x 150 mm, 5m Fase Mvil: 40% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 60% ACN Flujo: 1.5 mL/min Temperatura: 40C T t M Muestra: 1 D i t 1. Desipramina 2 N t i tili i 2. Nortriptilina 3 D 3. Doxepina 4 I i i 4. Imipramina 5 A it i tili i 5. Amitriptilina 6 T i i 6. Trimipramina i

Factor de Cola Eclipse XDB-C8 USP TF (5%) i A 1.60 2.00 1.56 2.13 2.15 1.25 B 1.70 1.90 1.56 1.70 1.86 1.25

A.

Alta Carga g x10

C. C

Ensanchamiento Platos de una C8

C 1. 2. 3. 4. 5. 6. 850 815 2776 2539 2735 5189

D 5941 7842 6231 8359 10022 10725

1. 2. 3. 4. 5. 6.

5 Time (min)

10

5 Time (min)

10

B. B

Baja Carga

D.

5 Time (min)

5 Time (min)

Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada

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Forma de Picos: Picos Anchos

Todos los picos ensanchan:
Prdida de Eficacia de la columna. Volumen muerto. Gran Volumen de Inyeccin. Inyeccin

Algunos picos ensanchan:

Elucin tarda de una muestra previa (Pico fantasma) fantasma). Alto Peso Molecular. Muestra - Proteina o Polmero.

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Dispersin Extra-Columna

Aumentando el Volumen Extra-Columna

Use tubos cortos de pequeo dimetro interno entre el inyector y la columna y entre la columna y el detector. Asegrese de que todas las conexiones de los tubos estn hechas con los fittings adecuados. Use una celda de detector de bajo volumen. Inyecte pequeos volumenes de muestra.

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Consejo: Malas Conexiones en el HPLC pueden Causar Ensanchamiento de Picos d C E h i t d Pi

El Sistema se ha optimizado y :
Todas las longitudes de los Tubos son Mnimas S us el di Se l diametro ms pequeo d t b t de tubo Una celda de flujo de volumen adecuado

Los Sntomas parecen mostrar que todava hay demasiado Volumen Extra-Columna Qu est mal? Q t l? ha hecho las conexiones adecuadamente?

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Conectores de Columna Usados en HPLC

Troubleshooting LC Fittings Part II J W Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6:788 (1988) Fittings, II. J. W. P Upchurch

Swagelok g
0.090 in.

Waters
0.130 in.

Parker
0.090 in.

Rheodyne
0.170 in.

Valco
0.080 in.

Uptight
0.090 in.

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Qu Ocurre si las conexiones no son correctas?

Incorrecto demasiado largo
La Frrula no asienta adecuadamente

Incorrecto demasiado corto

X
Si la distancia X es muy larga, habr fuga Cmara de mezcla

X
Si la distancia X es demasiado corta, se generar un volumen muerto o cmara de mezcla

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Los cambio en Retencin puedes ser Qumicos o Fsicos Pueden t P d estar causados por: d
Envejecimiento de la columna j Contaminacin de la columna Equilibracin insuficiente Pobre combinacin columna/fase mvil Cambio en la fase mvil Cambio en el flujo. Diferentes volumenes de retraso del gradiente

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Envejecimiento de la fase mvil/Equilibracin j q Causan Cambios en la Retencin/Selectividad

Columna 1 - Inicial Columna 1 Di siguiente C l Dia i i t Columna 1 Tras lavado con 1% H3PO4 /Equilibracin

5 9 Time (min)

12

15

5 9 Time (min)

12

15

El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase movil/ acondicionamiento de la co u a o / aco d c o a e to a columna La forma de pico fue un asunto secundario (compuesto quelante de metal) resuelto por des-activacin de la contaminacin activa del metal
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Los compuestos sensibles a los metales pueden Quelarse d Q l

Pista: Busca un par solitario de Electrones en
:O: o N que pueda formar anillos de 5 or 6 miembros con un Metal
H

: : : :

H + M +2

O O H

M +2

OH

Salicilaldehido

Complejo Anillo de 6-miembros

N:

M +2

C C

: : :
O N

M +2 OH

8-hidroxiquinolina Complejo Anillo de 5miembros

: :

OH

a-benzoinoxomina Complejo Anillo de 5miembros

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Un lavado Acido puede mejorar la forma de pico i

Antes del lavado acido id
HO OH OH

Despus del lavado cido 50 100 mLs 1% H3PO4 L

1.

2.

OH

M+2

HO

OH

OH

1.

2.

OH

Columnas: ZORBAX SB-Phenyl 4.6 x 150 mm Fase Mvil: 75% 25 mM tampn fosfato amnico / 25% CAN Flujo: Temperatura: Tamao muestra: 1.0 mL/min. RT 5 mL

Tf: 3.7

Tf: 1.2

Se us una solucin del 1% H3PO4 en columnas SB; en columnas desactivadas puede usarse un 0.5 % .
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pH de la Fase Mvil y pH de tampones Porqu son tan importantes en HPLC?

El pH afecta la Ionizacin
Superficie de la Silica de la Columna Componentes de Inters de Muestra

Tampones
Resisten Cambios de pH y Mantienen la Retencin Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables

Efectos en el tiempo de Vida de la Columna

pHs bajos liberan las cade as a qu cas de la Fase es ac o a a p s be a as cadenas alquilicas a ase estacionaria pHs altos Disuelven la Silica
Los cambios de pH tienen un gran efecto en la forma de pico, la retencin y la reproducibilidad lote a lote

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Porqu preocuparse del pH?

pH, pH pKa y cidos Dbiles

RCOOH
COOH

RCOO- +
_

H+ H+

[[RCOO-][H+]
Ka = [RCOOH]

COO

Ka = 6.4 x 10-5 pKa = 4.2

A pH 4.2 la muestra contiene cido benzoico e in benzoato en proporcin de 1:1. La forma de Pico puede ser pobre A pH 5.2 el 91% de la muestra es in benzoato. La retencion RP disminuye. A pH 3.2 el 91% de la muestra es cido benzoico. La retencion RP aumenta.

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Efecto del pH en la Forma de Pico a o cerca del pKa de la Muestra

Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Mvil: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN Flujo: 1.0 mL/min. Temperatura: RT /
CH3CHCOOH

pH 4 4 4.4

pH 3 0 3.0
CH2CH(CH3)2

Ibuprofeno pKa = 4.4

4 5 6 Time (min)

10

4 5 6 Time (min)

10

Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto
debe evitarse. evitarse

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Porqu preocuparse del pH?

pH, pKa y Bases Dbiles

R3NH+
CHOCH CH N
2 2

R3N
CH CHOCH CH N
2 2

+
CH

H+
Ka =

[R3N][H+] [R3NH+]

+ H

CH

CH

+
3

H+

9 Ka = 1 x 10-9 pKa = 9

A pH 9 la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadas en relacin 1:1. La forma de pico puede ser pobre A pH 10 91% de la muestra es difenhidramina desprotonada. H d l t dif hid i d t d A pH 8 91% de la muestra es difenhidramina protonada.

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pH vs. Selectivdad para Acidos y Bases

Columna: Nucleosil-C18 Fase Mvil: 45% ACN/55% tampn fostato Muestra: Acidos Biliares
40 1.5

SCD

Columna: mBondapak-C18 Fase Mvil: 60% 25 mM tampn fostato 40% Metanol 5 1. 1 cido Saliclico 2. Fenobarbital 3. Fenacetin 4. Nicotina 5. Metamfetamina

1.0

30

0.5

5 4 SOC 3 C 2 + 12-OC + 1

UDC

log k g

Retentio on

20

J.C. 111(1975) 149

7,12 - OC

+ + +
10

4 3 1 2

0.0

J.C. 268(1983) 1

-0.5

8 pH

10 3 5

ELUENT pH

La Retencin y la selectividad puede cambiar dramticamente cuando se cambia el pH. pH

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Importancia del pH y los Tampones Un Ejemplo Prctico

Por qu la Muestra impone las condiciones de uso Qu pasa cuando el tampn se usa con efectividad Qu pasa cuando se i Q d ignora el t l tampn o se usa inadecuadamente

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Tampones ms usados en Fase Reversa HPLC

pKa Buffer Range 2.1 1.1-3.1 7.2 6.2-8.2 12.3 11.3-13.3 Formic acid* 3.8 2.8-4.8 Acetic acid* 4.8 3.8-5.8 Citrate 3.1 2.1-4.1 4.7 3.7-5.7 5.4 4.4-6.4 Tris 8.3 7.3-9.3 Triethylamine* 11.0 10.0-12.0 Pyrrolidine 11.3 10.3-12.3 * Volatile buffers for LC/MS applications Buffer Phosphate UV Cutoff (nm) 200

210 210 230

205 200 200

La capacidad de tamponamiento ptima se d a un pH igual al pKa del tampon. La mayora de los l tampones tienen una capacidad adecuada de tamponamiento para controlar el pH d l f i id d d d d i l l H de la fase movil solo en 1 unidades de su pKa

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Importancia del pH y Tampones - Un Ejemplo Prctico

Condiciones Isocrticas Optimizadas para Frmacos Cardacos

3 4

Columna: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Mvil: 45% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 (1.1-3.1) 3 0 (1 1-3 1) 55% MeOH Flujo: 2.0 mL/min. Temperatura: 35C Deteccin: UV 254 nm Muestra: Frmacos Cardacos 1. Diltiazem 2. Dipyridamol 3. Nifedipina 4. 4 Lidoflazina 5. Flunarizina 5

6 7 Time (min)

10

11

12

13

14

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No Tengo Tiempo de Hacer Tampones o Ajustar el pH

Columna: StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Mvil: A: 20% H2O B: 80% MeOH Flujo: 1.0 mL/min. Temperatura: 35C Deteccin UV:254 nm Muestra: Frmacos Cardacos

Fuertes interacciones secundarias de la d l muestra t (aminas) con la superficie de la columna

Incluso a muy alto % MeOH La mayra de y y componentes fuertemente retenidos muestran pobre forma de pico debido al IEX en la superficie

10 Time (min)

15

20

25

Los Tampones son crticos para una buena retencin y forma de pico en muchas separaciones separaciones.
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Qu pasa si trabajas fuera del rango del tampn?

2

Se aadi tampn, t pero no controla el pH a 4.8

Forma de Pico

StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Mvil: A: 30% 25 mM NaH2PO4, pH 4.8 no tamponado B: 70% MeOH Flujo: 1.0 mL/min. 1 0 mL/min Temperatura: 35C Deteccin UV:254 nm Muestra: Frmacos Cardacos 1. 1 Diltiazem 2. Dipyridamol 3. Nifedipina Inadecuada 4. Lidoflazina 5. Flunarizina
5

Columna:

10 Time (min)

15

20

25

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No olvidar- Elegir la columna adecuada al pH de la Fase Mvil para el Mximo Tiempo de Vida
pH Alto y Temperatura Ambiente (pH 11 RT)
Fase Mvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA (~ pH 11, disolucin de la slica) Inicial

Despus de 30 inyecciones

Consejo: Usar las columnas diseadas para el pH elegido

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Efecto del Tiempo de Respuesta del Detector

El Sistema est operando bien- los ajustes se hicieron mal! Bajas Velocidades de Adquisicin Pueden Dificultar la Deteccin de Impurezas y Reducir la Sensibilidad Tiempo de Respuesta 0.1 seg
1er pico = 1.2 seg A 20 pts/seg = 24 pts

0.2 seg 0.5 seg

Agilent 1100 DAD Agilent 1100 WPS with ADVR Columna: Poroshell 300SB-C18 2.1 2 1 x 75 mm 5 um mm,

Fase Mvil: A: 95% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA B: 5% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA Flujo: Detector: 2 mL/min UV 215 nm 20 3. Lisozima 4. Mioglobina Temperatura: 70C Embolada de Piston :
0.9 1.0

1er pico = 1.2 seg p g A 5 pts/seg = 6 pts

1.0 1 0 seg 2.0 seg

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5 Time (min)

0.6

0.7

0.8

Muestra: 1. Neurotensina 2. RNasaA

Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor deteccin de picos.
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Conclusiones
Los problemas en Columnas HPLC ms comunes son:
Alta Presin (Prevenir mejor q curar) ( j que ) Malas Formas de Pico Cambio en la Retencin/Selectividad

A menudo estos problemas no estn asociados con la columna y pueden ser causados por el instrumento o por problemas qumicos:
pH de la Fase Mvil Conexiones del Instrumento Parmetros del Detector Contaminacin por Metales

Comenzar con las pregunta correctas

Encontrar las resp esta respuesta Las respuestas conducirn a soluciones

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