Anda di halaman 1dari 8

METODE PENGENDAPAN PROTEIN PLASMA

I.

TUJUAN Mengetahui berbagai metode denaturasi protein LANDASAN TEORI Percobaan ini dilakukan untuk mengedapkan protein pada sampel. Perlakuan ini

II.

harus dilakukan karena adanya protein dalam sampel akan mengganggu uji farmakokinetik yang dilakukan. Perlakuan ini juga dilakukan untuk mengisolasi atau memisahkan obat yang akan diteliti dari matriks sampel. Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi protein. Denaturasi dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperature, dan penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein yang umum digunakan adalah dengan penambahan precipitating agen t. Dalam praktikum ini precipitating agent yang digunakan adalah TCA 10 %, larutan jenuh (NH4)2SO4, ZnSO4 NaOH, Acetonitril, dan Etanol.

Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion.

Sifat ini membuat potein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga potein dapat mengendap. Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga potein mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifa lain yang berhubungan dengan presipitasi protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen.

Mekanisme TCA 10 % sebagai agen presipitasi yakni ion negatif dari TCA akan bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam yang dihasilkan tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk memisahkan protein dari larutan. Umumnya agen presipitasi akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa (membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein). TCA umumnya digunakan untuk protein-protein yang telah berada dalam keadaan bebas pada filtrat darah dan pada pemeriksaan awal materi biologis. Bila protein belum berada dalam kondisi yang bebas maka perlu penambahan asam tanin, dimana tanin akan bereaksi dengan protein kulit membentuk protein tanat yang tidak larut. Larutan (NH4)2SO4 merupakan garam dengan konsentrasi tinggi. Mekanisme (NH4)2SO4 sebagai anti presipitasi protein dikenal sebagai salting out, yakni penurunan kelarutan protein dengan adanya peningkatan konsentrasi garam. Hal ini terjadi karena interaksi antara air dengan gugus polar dari protein menurun. Peristiwa ini juga dapat dijelaskan melalui rumus : log S = Ks dimana : S : kelarutan protein dalam larutan garam : kekuatan ionic larutan garam : kelarutan protein dalam air Ks : konstanta salting out Kelarutan protein akan berkurang bila terdapat garam-garam anorganik dalam konsentrasi tinggi mengakibatkan pengendapan protein tersebut. Sifat ini terjadi karena kemampuan ion garam untuk terhidrasi dan terjadi kompetisi antara garam dengan molekul protein untuk mengikat air. Mekanisme ZnSO4 NaOH sebagai agen presipitasi adalah NaOH akan memberikan suasana basa pada larutan dan mengakibatkan protein berada dalam keadaan ion negatif atau anion. Anion protein ini akan berikatan dengan ion positif yang berasal

dari logam berat yakni Zn2+ membentuk logam protein yang tidak larut. Logam berat juga akan merusak struktur sekunder dan tersier dari protein. Ikatan dari ion logam bermuatan positif akan menurunkan kelarutan protein. Ion logam akan berkompetisi dengan proton-proton pada larutan untuk berikatan dengan asam amino. Semakin kuat ikatan ion-ion logam untuk menggantikan ikatan oleh proton-proton akan menurunkan pH larutan. Kombinasi dari perubahan pI, penurunan pH (baik akibat ion logam maupun NaOH) akan menyebabkan protein mengendap. Etanol dan Asetonitril merupakan pelarut organik yang dapat mengendapkan protein. Pengendapan ini berkaitan dengan pI protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin menurun. Penambahan larutan organik seperti metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurunkan Kd (Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan. Pada hasil percobaan diperoleh bahwa keefektifan pelarut organik asetonitril lebih besar dibandingkan dengan metanol. Dari data pada percobaan diperoleh bahwa semua agen presipitasi dapat mengendapkan protein pada sampel plasma. Dari gambar dapat dilihat bahwa yang paling efektif adalah TCA 10% dan larutan jenuh (NH4)2SO4. Sedangkan yang kurang efektif adalah ZnSO4 NaOH, dan pelarut organik. Dari literatur didapat bahwa sehatusnya ZnSO4 NaOH juga efektif dalam mengendapkan protein, perbedaan dengan hasil percobaan kemungkinan karena pengaruh pH yang masih terdapar oleh dapar dalam plasma. Keuntungan metoda presipitasi plasma protein menggunakan agen presipitsi adalah mudah dilakukan dan cepat namun kerugiannya yakni tidak dapat mengendapkan protein secara sempurna. Pada laboratorium yang lengkap, pemisahan protein dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu :

1. Salting out. Tiap-tiap protein berbeda sifat pengendapannya. 2. Ultra sentrifugasi. Protein dengan BM yang besar akan mengendap paling cepat. 3. Elektroforesis. Perbedaan kecepatan migrasi pada medan listrik berdasarkan IEP. 4. Kromatografi. Perbedaan kecepatan gerak pada media berdasarkan ukuran molekul. 5. Teknik immunokimia. Antibodi tertentu akan terikat dengan antigen yang sesuai. Denaturasi protein : Denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, ikatan garam atau bila susunan ruang atau rantai polipetida suatu molekul protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah terjadi kerusakan struktur sekunder, tertier dan kuartener, tetapi struktur primer (ikatan peptida yang masih utuh).

III. Alat -

ALAT DAN BAHAN

Vortex Sentrifuge Pipet mikro Tabung ependorf Tabung sentrifuge Spektrofotometer

Bahan Plasma Metanol Asetonitril TCA (Tricloroasetat)

IV.

PROSEDUR KERJA Presipitasi protein 1. Mengambil cairan plasma blanko menggunakan pipet mikro sebanyak 500 L lalu memasukkannya kedalam tabung ependorf.(dilakukan sebanyak 3kali) 2. Menambahkan zat pengendap protein yang berbeda-beda (metanol, asetonitril, TCA) pada masing-masing tabung sebanyak 0,5 ml.

3. Masing-masing tabung di vortex sampai campuran didalamnya homogen (+20 detik) 4. Memisahkan campuran dengan memasukkannya kedalam alat sentrifuse dengan kecepatan 10.000 g selama 5 menit. 5. Mengamati dan membandingkan supernatan yang dihasilkan oleh masing-masing zat pengendap protein yang berbeda-beda pada masing-masing tabung. Pengukuran kadar protein 1. Mengambil supernatan dari masing-masing tabung sebanyak 100 L lalu memisahkannya dalam tabung lain. 2. Mengatur alat spektrometer dan melakukan blanking terlebih dahulu. 3. Memasukkan supernatan yang telah dipisahkan kedalam kuvet. 4. Memasukkan kuvet kedalam spektrometer lalu dilakukan pengukuran kadar protein yang tersisa (tidak ikut memisah/mengendap) pada bagian supernatan. 5. Membandingkan kadar sisa protein pada masing-masing supernatan untuk mengetahui kwalitas zat pengendap protein yang digunakan.

V.

HASIL PENGAMATAN

VI.

PEMBAHASAN Pada praktikum BFFK kali ini dilakukan percobaan mengenai bagaimana dan jenis pengendap protein apa saja yang mampu mengendapkan protein plasma secara maksimal, yang pada pengaplikasiaanya diharapkan segmen-segmen protein plasma tidak mengganggu proses analisa obat yang terkandung dalam plasma. Telah diketahui bahwa jenis pengendap protein yang dibandingkan dalam praktikum ini adalah metanol, asetonitril dan asam trikloroasetat (TCA). Pengendapan protein plasma dilakukan dengan cara yang sangat sederhana. Plasma blanko diambil sebanyak 500 L kedalam 3 tabung ependorf, kemudian ditambahkan masing-masing pengendap protein kedalamnya. Sebelum di sentrifus plasma dan pengendap protein di vortex terlebih dahulu, setelah itu baru di lakukan sentrifus selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 g. Terbentuk endapan dan supernatan pada masing-masing tabung ependorf. Dihasilkan supernatan yang paling jernih adalah yang menggunakan zat pengendap plasma TCA, jernih kedua adalah yang menggunakan asetonitril dan yang terlihat agak keruh adalah yang menggunakan metanol. Pengamatan ini dilakukan secara organoleptis, artinya dapat dilihat dengan mata biasa. Sebenarnya telah dapat diketahui dari segi organoleptis bahwa zat pengendap protein yang paling baik adalah TCA karena supernatan yang terbentuk jauh lebih jernih dibandingkan zat pengendap metanol dan asetonitril. Supernatan yang dihasilkan dari masing-masing zat pengendap protein di ambil dan diuji masih adakah kadar atau konsentrasi protein yang terkandung dalam supernatan dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Alat spektrofotometer UV-VIS diset sedemikian rupa dilakukan pula blanking dengan masing-masing zat pengendap protein yang digunakan, kemudian 100 L supernatan di masukkan dalam kuvet yang telah berisi masing-masing zat pengendap. Di layar komputer akan tertera data-data dan kurva absorbansi kadar protein yang dianalisa. Kurva absorbansi yang terbentuk untuk zat pengendap TCA berupa kurva yang berada dibawah titik minus nol, yakni puncak kurva berada pada titik -0,38. Untuk metanol, puncak kurva absorbansi berada pada titik 1.5 dan asetonitril, puncak kurva absorbansi berada dititik 0,25. Hal ini menjadi bukti lagi bahwa zat pengendap protein yang paling baik adalah TCA karena segmen-segmen atau

kadar protein tidak ditemukan di dalamnya. Sedangkan pergerakan-pergerakan kurva terbentuk karena akibat adanya zat pengotor. Pada kurva yang terbentuk dari zat pengendap protein asetonitril dan metanol masih ditemukan absorbansi protein yang artinya masih terdapat kadar protein di dalam supernatan plasma yang terbentuk. Adanya protein yang belum mengendap sempurna pada plasma akan mempengaruhi proses analisa bilamana akan dilakukan pemeriksaan kadar obat dalam plasma itu sendiri. Perlakuan ini juga dilakukan untuk mengisolasi atau memisahkan obat yang akan diteliti dari matriks sampel. Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi protein. Denaturasi dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperature, dan penambahan senyawa kimia. Asam trikloroasetat (TCA), senyawa ini banyak digunakan dalam bidang biokimia, untuk pengendapan makromolekul seperti protein, DNA dan RNA. Pantas saja bila hasil pengamatan di dapat zat pengendap protein paling baik adalah TCA. Sebagian besar protein dapat diendapkan dari larutan air dengan penambahan asam tertentu, seperti misalnya asam triklorasetat dan juga asam perklorat. Penambahan asam ini menyebabkan terbentuknya garam protein yang tidak larut. Zat pengendap lainnya adalah asam tungstat, fosfotungstat dan metafosat. Protein juga dapat diendapkan dengan kation tertentu. Berbagai protein globular mempunyai daya kelarutan berbeda dalam air. variabel yang mempengaruhi kelarutan ini adalah pH, kekuatan ion, sifat dielektrik pelarut dan temperatur. Pada umumnya molekul protein mempunyai daya kelarutan minimum pada pH isoelektriknya. Pada pH isoelektriknya beberapa protein akan mengendap dari larutan.

VII.

KESIMPULAN 1. Zat pengendap protein yang dapat mengendapkan protein plasma secara maksimal dalam praktikum ini adalah asam trklorasetat (TCA) 2. Denaturasi protein plasma bertujuan untuk menonaktifkan aktivitas protein, sehingga dalam analisa obat diharapkan tidak dipengaruhi adanya aktivitas protein. 3. Metode pengendapan protein plasma sangat sederhana dan mudah dilakukan. Zat pengendap protein diberikan untuk membantu mempercepat pengendapan protein.

4. Masing-masing zat pengendap memiliki kemampuan tersendiri untuk mengendapkan protein, ada yang dapat mengendapkan secara sempurna, ada juga yang tidak dapat mengendapkan secara sempurna.

VIII.

DAFTAR PUSTAKA 1. http://farmasi07itb.wordpress.com/2010/03/13/presipitasi-plasma-proteinuntuk-uji-farmakokinetik/ 2. Syukri, S. 1999. Kimia dasar 3. Bandung : penerbit ITB 3. Wirakusumah, Muhammad. 2008. Biokimia : Protein, Enzim dan Asam Nukleat. Bandung : penerbit ITB.