Anda di halaman 1dari 18

PRAKTIKUM BIOKIMIA 1 Rabu, 4 April 2012

I.

NOMOR PERCOBAAN

: VII (Tujuh)

II.

NAMA PERCOBAAN

: Kromatografi Lapis Tipis AsamAmino

III.

TUJUAN PERCOBAAN

: Mengetahui cara pemisahan asam amino dengan kromatografi lapis tipis dan

mengetahui harga Rf asam amino

IV.

LANDASAN TEORI Asam amino mempunyai sifat yaitu dapat dipisahkan. Pada umumnya, asam

amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh dengan campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masingmasing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, mikrobiologi, kromatografi, dan elektroferosis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi adalah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan

kromatografi penukar ion. Pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya penting dalam semua cabang ilmu kimia dan dalam ilmu-ilmu yang lain. Pemisahan dalam banyak keadaan dilakukan lebih cepat dan efektif daripada sebelumnya dan banyak pemisahan secara rutin dapat berhasil. Pendobrakan tiada bandingnya dalam biokimia, misalnya dalam mendapatkan pengertian tentang struktur dan fingsi enzim dan protein-protein lain, telah berasal secara langsung dari penggunaan kromatografi dalam penelitian biologik. Pada tahun 1906 oleh Michael Tsweet, seorang dosen botani pada University of Warsaw, memberikan uraian pertama dalam hampir istilah-istilah modern dari

SARINARULITA (06091410002) | 1

pemisahan kromatogtafik. Tsweet menguraikan pemisahan klorofil dari pigmenpigmen lain dalam sari tumbuhan sebagai berikut: Jika larutan dalam eter klorofil (kasar) disaring melalui sebuah kolom absorben (saya menggunakan terutama kalsium karbonat yang ditetalkan ke dalam pipa gelas yang kuat), maka pigmen-pgmen telah dipisahkan dari bagian atas sampai bagian bawah menjadi bermacam-macam zone berwarna menuruti urutan adopsi. Urutan ini ialah pigmen-pigmen yang terserap lebih lemah dan memaksanya turun lebih jauh ke bawah. Pemisahan ini menjadi praktis sempurna, jika dengan mengikuti larutan pigmennya, arus pelarut murni dilewatkan melalui kolomnya. Seperti spektrum sinar cahaya, unsur-unsur yang berbeda-beda dari campuran pigmen secara sistematik diuraikan pada kolom kalsium karbonat dan dapat diidentifikasi dan juga dapat ditentukan secara kuantitatif. Preparasi demikian saya namakan kromatogram dan cara yang bersangkutan cara kromatografik. Meskipun arti dari istilah kromatografi telah dimengerti, suatu batasan yang baik dari kromatografi adalah sukar untuk merumuskannya. Batasan Keulemans memenuhi sama baiknya seperti yang mana pun Kromatografi meruapakan suatu cara pemisahan fisik unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fase, satu dari fase-fase yang membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fase stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fase yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Untuk banyak keperluan, volume retensi dari solut VR lebih serasi daripada waktu retensi. Volume retensi adalah hasil perkalian waktu retensi dan laju arus gas pembawa; karena ada hubungan terbaik antara laju arus dan waktu retensi. Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada pH tertentu. Keuntungan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah noda yang ditimbulkan tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan

SARINARULITA (06091410002) | 2

noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja yang diperlukan, juga tidak memerlukan waktu yang banyak. Kromatografi jenis ini menggunakan alumunium oksida, serbuk selulosa atau silika gel sebagai adsorben yang berupa lapis tipis yang diletakkan di atas selmbar kaca. Seperti halnya kromatografi kertas, larutan yang mengandung beberapa asam amino diteteskan di atas adsorben dan dibiarkan bergerak. Penggunaan fase gerak pada kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan pelarut seperti : metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform. Sebagai persiapan untuk menggunakan kromatografi lapis tipis, bubk serbuk fasa diam diratakan terlebih dahulu pada lempeng kaca, ketebalan kaca tergantung pada tujuan pemisahan kromatografi. Untuk tujuan analisis, tebalnya kira0kira 0,25 mm sedangkan untuk praparatif 5 mm. Kecuali dipakai lapisan tipis gel maka setalah bubur merata maka lempeng dikeringkan. Kromatografi lapis tipis (KLT) seperti halnya kromatografi kertas tidak mahal dan sesederhan melakukannya, kromatografi ini memiliki keuntungan kecepatan diatas kromatografi kertas, prosesnya mungkin memerlukan waktu kirakira setengah jam. Kromatografi lapis taipis sangat terkenal dan digunakan secara rutin dalam banyak laboratorium. Teknik KLT ini dikembangkan pada tahun 1983 oleh Ismailoff dan Schraibar. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fasa diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan. Pemilihan sistem pelarut dan komposisi larutan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu mikro-syiringe (penyuntik berukuran mikro). Sampel diteteskan pada salah satu bagian tepi pelat kromatografi (sebanyak 0,01 10 g zat). Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap. Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertikal searah gerakan pelarut. Teknik ascending digunakan untuk melaksanakan pemisahan pada suhu kamar, sampai

SARINARULITA (06091410002) | 3

permukaan pelarut mencapai 15-18 cm. Waktu yang diperlukan antara 20-40 menit. Semua teknik yang digunakan untuk kromatografi kertas dapat juga digunakan dalam kromatografi lapis tipis. Zat-zat berwarna dapat dilihat langsung, tetapi juga dapat digunakan reagen penyemprot untuk melihat suatu bercak suatu zat. Asam kromat seringdigunakan sebagai pelarut organik. Untuk menempatkan posisi suatu zat, reagen dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja. Bagian yang dipeolrh lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagen dengan penegrokan setelah pemisahan selesai. Kromatografi lapis tipis memiliki keuntungan jika dibandingkan dengan kromatografi kertas, diantaranya : 1. Noda zat yang timbul sesudah kromatografi tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja senyawa yang diperlukan. 2. Tidak memerlukan waktu yang banyak 3. Senyawa-senyawa yang tidak menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT 4. Dapat memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut. Banyak senyawa-senyawa baik organik maupun anorganik yang dapat dipisahkan lewat kromatografi lapis tipis. Dengan menggunakan kromatografi lapis tipis maka akan didapatkan pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan cepat. Pada KLT terdapat adsorben yang bertindak sebagai fase stationer. Empat macam adsorben yang umum dipakai adalah silica gel (asam silikat), alumina (alumina oxide), kieselguhr (iatomeous earth), dan selulosa. Dari keempat macam adsroben di atas, yang sering dipakai adalah silika gel. Selain terdapat fasa stationer atau fasa diam, KLT juga memiliki fase gerak(eluen), yaitu pelarut dalam kromatografi lapis tipis. Sistem berair yang digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri pelarut miksotrop yang meliputi sifat hidrofob menaik seperti metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat,

SARINARULITA (06091410002) | 4

kloroform (kloroform yang distabilkan dengan etanol), ebnzen, sikloheksana, dan eter petroleum. Kromatografi Lapis Tipis (KLT), seperti halnya dengan kromatografi kertas tidak mahal dan sederhana melakukannya. Kromatografi ini mempunyai keuntungan kecepatan atas kromatografi kertas; prosesnya mungkin memerlukan hanya kira-kira setengah jam, atau 30 menit, sedangkan suatu pemisahan atas kertas yang khusus memerlukan waktu yang cukup lama, KLT sangat terkenal dan digunakan secara rutin dalam banyak kegiatan laboratorium. Medium pemisahan merupakan suatu lapisan barangkali setebal 0,1 hingga 0,3 mm dari suatu adsorbenpadat di atas lempengan gelas, plastik, atau alumunium. Lempengan khas berukuran 8 x 2 inci. Padatannya yang khas adalah alumina, silika gel, dan selulosa. Para peneliti biasanya mereka menggunakan lempengan yang mereka siapkan sendiri dengan melapisi kaca dengan suspensi dalam air dan padatan, yang biasanya mengandung bahan pengikat seperti plester paris dan kemudian menegringkan lempengan dalam tanur. Lempengan kaca yang sudah dilapisi sebelumnya dan lembaran plastik dan kertas alumunium, yang dapat dipotong menurut ukuran dengan gunting dapat dibeli dan barangkali kebanyakan peneliti menggunakannya pada waktu ini. Contoh yang biasanya suatu campuran senyawa organk, ditempatkan dekat salah satu ujung dari lempengan sebagai suatu volume larutan, biasanya beberapa mikroliter yang berisi jumlah-jumlah makrogram dari senyawa. Dasar dari pemisahan asam amino adalah karna pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasail hidrolisis protein, baik yang menggunakan enzim maupun asam amino. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukanjenis asam amino maupun kuantitas asam amino, maka perlu diadakan pemisahan anatra asam amino- asam amino tersebut. Dan setelah dilakukan penelitian, maka yang paling baik dilakukan adalah metode kromatografi. Menurut seorang ahli Keulemans seperti yang telah dikemukakan di atas tadi. Pda percobaan akan didapatkan harga Rf. Dimana harga Rf itu adalah b/a merupakan ciri khas sautu asam amino pada pelarut tertentu. Dengan menggunakan standar-standar asam amino yang telah diketahui macamnya, maka

SARINARULITA (06091410002) | 5

dapat diketahui macam asam amnio, kemudian dibandingkan dengan harga Rf asam amno yang terdapat pada table yang telah ada,

Jarak yang ditempuh senyawa terelarut Rf = Jarak yang ditempuh pelarut

Jarak yang ditempuh pelarut dapat diukur dengan mudah dan jarak yang ditempuh cuplikan diukur pada pusat bercak itu, atau pada titik kerapatan maksimum.

V.

ALAT DAN BAHAN 1. Alat : a. plat kromatografi b. selembar kaca c. penggiling d. beker gelas e. pengaduk magnetik f. gelas ukur g. pipet tetes h. penyemprot i. penggaris j. pensil

2. Bahan a. silika gel b. pelarut etanol c. larutan ninhidrin d. larutan Kuprinitrat e. larutan asam amino (tirosin, fenilalanin, glisin) f. aquades

SARINARULITA (06091410002) | 6

VI.

PROSEDUR PERCOBAAN 1. Pembuatan lapis tipis Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam. 2. Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda. Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering. 3. Ruang Kromatografi Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen. 4. Cara melakukan elusi Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah

SARINARULITA (06091410002) | 7

kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar. 5. Cara perwarnaan a) Dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerak yang dipakai bersifat alkali.Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose. b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cuninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. Walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifat irreversibel.

VII.

HASIL PENGAMATAN 1. Pada Pembuatan lapis tipis Pembuatan lapis tipis dengan silika gel pada lembar kaca menghasilkan lapisan berwarna putih, pembuatan ini diahruskan sangat hati-hati dan tipis serta harus rata (tidak bergelombang). Setelah didiamkan selama 1 minggu maka lapis tipis siap digunakan. 2. Pada Penetesan Larutan yang akan diperiksa Zat asam amino yang akan diperiksa terdiri dari larutan asam amino fenilalanin, glisin, tirosin. Tirosin digunakan juga sebagai perbandingan sampel. Asam amino diteteskan pada jarak sekitar 1 cm dari tepi bawah. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati agar permukaan lapisan tidak

SARINARULITA (06091410002) | 8

rusak. Tempat atau titik yang akan ditetesi terlebih dahulu dititik dengan ujung pensil yang runcing guna mengetahui letak titik-titik permulaan. Sebelum eluen dijalankan, tetesan itu harus dikeringkan terlebih dahulu. Zat yang diteteskan berupa larutan asam amino yang tidak berwarna. Setelah kering barulah lapis lipis pada kaca diletakkan dalam ruang kromatografi yang berisi eluen berupa etanol 60%. Panjangnya penyerapan eluen diatur hinggan 10 cm dari ruang titik permulaannya. 3. Setelah eluen berjalan sampai 10 cm, penyerapan eluen dihentikan lembar kaca diambil dari kemudian dikeringkan. Kemudian untuk mengidentifikasikan warna, lembar kaca tersebut disemprotkan dengan larutan ninhidrin yang berwarna kuning muda bening. Sehingga larutan asam amino yang diteteskan tadi menimbulkan noda berwarna merah muda. 4. Untuk menstabilkan warna yang dihasilkan agar tidak hilang maka lapis tipis disemprotkan dengan larutan kuprinitrat yang berwarna biru bening. Didapatkan warna dari noda warna merah muda itu menjadi warna biru. Kemudian dihitung jarak tempuh asam amino dari titik awal hingga akhirnya. Dik: Panjang eluen yang diamati adalah 10 cm (a) Jarak yang ditempuh oleh ketiga asam amino adalah (b) : Larutan Protein Histidin Alanin Glutamin Tirosin Rf praktek 3,6 cm 8 cm 10 cm 5,5 cm

VIII.

PENGELOLAHAN DATA Menghitung harga Rf, yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam

amino dengan jarak yang ditempauh pelarut dari awal hingga garis akhir.

SARINARULITA (06091410002) | 9

1. Pada Histidin, 2. Pada Alanin, 3. Pada Glutamin, 4. Pada Tirosin,

Rf = Rf = Rf = Rf =

3,6cm 0,36cm 10cm 8cm 0,8cm 10cm

10cm 1cm 10cm 5,5cm 0,55cm 10cm

SARINARULITA (06091410002) | 10

IX.

PERSAMAAN REAKSI

REAKSI ASAM AMINO DENGAN ETANOL O H3N


+

O O

C CH R

CH 3CH 2OH etanol

H3N

C CH R OCH 2CH 3

H2O

asam amino REAKSI ASAM AMINO DENGAN NINHIDRIN


O C C C O OH

H
OH

COOH

NH2

ninhidrin NH 3 CO 2
O C C C O H OH

asam amino H

C O

O C C C O OH OH

ninhidrin
O C C C O

O C

C C O

3H2O

berw arna merah muda

SARINARULITA (06091410002) | 11

REAKSI ASAM AMINO DENGAN KUPRINITRIT


O H2N CH R C OH O O O C Cu R NH 2 O
++

Cu(NO 3)2 kuprinitrit

C R

2NO 3-

NH 2

asam amino senyaw a kompleks ungu

X.

PEMBAHASAN Percobaan kromatografi lapis tipis pada asam amino bertujuan untuk

mengetahui cara pemisahan asam amino dengan menggunakan kromatografi lapis tipis dan menghitung harga Rf dari asam-asam amino yang diselidiki. Reaksi antara ninhidrin dengan asam amino membentuk produk berwarna ungu. Pada percobaan kali ini media pemisahan yang digunakan adalah silica gel pada lempeng kaca. Penggunaan fase gerak maupun diam adalah pelarut etanol dan silika gel. Sebagai zat pengikat silica gel digunakan isolaso, yang juga disebut sebagai fase diam hidrofilik. Kemudian plat silica gel dibiarkan kering di udara. Penggunaan lapis tipis ini sangat membantu dalam pengidentifikasian asam amino dibandingkan dengan penggunaan dengan kromatografi kertas, karena di sini kita hanya memerlukan asam amino hanya sedikit saja, memerlukan waktu yang sedikit, dan noda yang ditimbulkan pun tidak melebar. Hanya saja, kesulitan pada pembuatan silika gel pada lembar kacanya. Adapun zat zat asam amino yang diperiksa diantaranya alanin, histidin, glutamin, dan tirosin yang diteteskan pada plat kaca kira kira 2 cm dari tepi bawah plat. Lalu asam amino dimasukkan ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen. Eluen yang digunakan adalah 96 % alcohol dan air. Adapun pembuatan lapisan tipis dengan menambahkan 25 gr silika gel dengan 50 ml air yang dituangkan ke dalam plat kaca. Kemudian silikanya diratakan pada permukaan plat kaca yang telah diukur pinggir kanan-kirinya 2 cm dan diselotip. Perlu diperhatikan pada saat meratakan hanya dapat diratakan dengan satu perataan tidak boleh berulang-ulang agar didapatkan permukaan yang tidak bergelombang. Pembuatan lapisan silika gel pada plat kaca, harus secara

SARINARULITA (06091410002) | 12

hati-hati dan juga harus menggunakan plat kaca yang benar-benar bersih dan terbebas dari lemak. Kemudian, siilika gel yang telah dibuat pada plat kaca terlebih dahulu dikeringkan baru bisa digunakan. Pada penetesan asam amino perlu dilakukan secara hati-hati agar lapis tipis silika gelnya tidak rusak. Penetesan asam amino yang kami lakukan dengan jarak 1 cm dari tepi bawah bila lembar kaca diletakkan ke dalam ruang kromatografi. Eluen yang akan dijalankan diukur sepanjang 10 cm. Setelah dilakukan penetesan asam amino maka eluen siap dijalankan. Eluen pun berjalan tergantung dengan lapis silikan gel yang dibuat. Bila lapisan silika gel yang kita buat terlalu tebal maka eluen pun akan berjalan lambat, dan juga sebaliknya. Oleh karena itu, pembuatan lapisan silikanya diusahakan setipis mungkin dan merata. Dan bila sudah sampai 10 cm, maka eluen yang berjalan dihentikan. Kemudian dikeringkan. Untuk melihat bercak zat asam amino digunakan larutan penyemprot ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan pada larutan penyemprot ninhidrin dimaksudkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apabila eluen yang digunakan bersifat alkali. Setelah disemprot, pada silica gel muncul bercak bercak atau noda. Harga Rf praktek dari asam asam amino ini berbeda yang bisa disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu : - Kesalahan pada pembuatan larutan asam amino - Kesalahan pada pembuatan lapisan silica gel - Asam amino tidak dibiarkan kering dahulu saat eluen dijalankan - Suhunya tidak dibuat tetap atau dijaga pada saat kromatografi dilakukan - Penetesan sampel pada plat yang tidak merata serta dengan jarak yang terlalu dekat.

XI. 1.

KESIMPULAN Kromatografi merupakan salah satu cara untuk melakukan

pengidentifikasikan suatu asam amino. Kromatografi Lapis Tipis merupakan salah satunya. Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam serta eluen (fase gerak)nya adalah etanol.

SARINARULITA (06091410002) | 13

2.

Pengidentifikasian asam amino dengan melihat noda atau bintik yang dihasilkan, sehingga kita dapat menghitung Rf dari asam amino dengan cara membnadingkan jarak yang ditempuh oleh asam amino dengan jarak yang ditempuh oleh eluen pada plat.

3.

Untuk memberikan warna pada noda atau bintik yang dihasilkan kita dapat menggunakan larutan ninhidrin.

4.

Pada Pembuatan lapis tipis, plat kacanya yag digunakan harus benar-benar terbebas dari lemak, karena bila ada dapat mengganggu jalannya kromatografi.

5.

Pada kromatografi terdapat dua fase yaitu fase diam dan fase bergerak, dalam percobaan ini yang digunakan sebagai fase diam adalah silica gel sedangakan fase geraknya adalah zat yang diuji, yaitu tyrosin, glysin dan fenilalanin.

XII. DAFTAR PUSTAKA Khopkar, S.M, 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press

Lehninger, 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: ERLANGGA

Poedjadi, Anna, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI

XII. 1.

JAWABAN PERTANYAAN Menganalisa secara kualitatif dengan cara kromatografi lapis tipis satu dimensi. Sautu larutan asam amino yang bersedia. Dan hitung berapa harga Rfnya? Jawab: 25 gram silika gel dalam 50 ml air diaduk sampai homogen, kemudian dituangkan ke atas lempeng kaca yang telah diukur pinggir kanannya 2 cm dan ditempeli dengan kertas dengan plester. Setelah itu larutan silika gel dituangkan dan diratakan. Diamkan selama semalam. Setelah kering silica gel tersebut dikur dari bawah sepanjang 2,5 cm dan diberikan tanda atau garis. Pada garis itu ditotolkan dengan asam amnio,

SARINARULITA (06091410002) | 14

masing-masing adalah Alanin, Histidin, Glutamin dan Tirosin. Lalu masukkan plat tersebut ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen (etanol : air 100 : 39 b/v). Setelah itu dikeringkan dalam oven dengan suhu 110 C selama 10 menit. Kemudian disemprotkan dengan ninhidrin dan dikeringkan kembali selama 30 menit. Kemudian disemprotkan kembali dengan kuprinitrat. Setelah itu diukur jarak asam amino tersebut adalah sebagai berikut serta harga Rf nya : Dari hasil pengamatan diketahui jarak yang ditempuh oleh pelarut untuk plat adalah 10 cm. sedangkan untuk asam amino adalah :

Maka: 1. Pada Histidin, 2. Pada Alanin, 3. Pada Glutamin, 4. Pada Tirosin, Rf = Rf = Rf = Rf =


3,6cm 0,36cm 10cm

8cm 0,8cm 10cm


10cm 1cm 10cm 5,5cm 0,55cm 10cm

SARINARULITA (06091410002) | 15

2.

Tuliskan reaksi antara ninhidrin dengan asam amino!


REAKSI ASAM AMINO DENGAN NINHIDRIN
O C C C O OH

H
OH

COOH

NH2

ninhidrin NH 3 CO 2
O C C C O H OH

asam amino H

C O

O C C C O OH OH

ninhidrin
O C C C O

O C

C C O

3H2O

pigmen berw arna ungu

REAKSI ASAM AMINO DENGAN KUPRINITRIT


O H2N CH R C OH O O O C Cu R NH 2 O
++

Cu(NO 3)2 kuprinitrit

C R

2NO 3-

NH 2

asam amino senyaw a kompleks ungu

SARINARULITA (06091410002) | 16

3.

Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi Rf pada KLT? Jawab: Kepolaran senyawa, jenis pelarut, jarak penetesan, dan fasa diam (adsorbennya).

4.

Terangkan bagaimana orang melakukan analisa kuantitatif suatu zat tertentu dengan cara kromatografi lapis tipis? Jawab: Dengan menyemprotkan lempeng dengan asam sulfat 50% atau 25% dalam etanol kemudian dipanaskan sehingga semua bahan organic akan terbakar dan tampak sebagai noda-noda coklat. Mengamati lempeng dengansinar UV sehingga noda-noda yang menyerap sinar UV atau sebaliknya dengan memancarkannya. Bahan sampel ditotolkan pada salah satu sudut lempeng sebagai suatu titik dan pemisahahn dilakukan setelah lmepeng kering. Kemudian dipisahkan lagi dengan satu system solven yang lain dengan arah tegak lurus dari arah semula.

5.

Terangkan bagaimana cara melakukan kromatografi lapis tipis dua dimensi dan bilakah orang terpaksa melakukan cara itu? Jawab: Dengan mengamati kepekatan warna yang diperoleh. Untuk cara ini, sample diteteskan dipojok kanan bawah dari plat TLC yang berukuran 20 x 20 cm, kira-kira 2 cm dari tepi kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan pertama selesai, plat dikeringkan. Untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa yang dipisahkan selama pengeringan sebaiknya dilakukan dengan aliran gas N2. setelah dikeringkan, plat dikembangkan dengan menggunakan system pelarut yang kedua dengan memutar arah plat 90o. menggunakan cara ini mendapatkan hasil pengembangan yang lebih baik dengan penggunaan dua macam system pelarut, dan apabila pengembangan satu dimensi mendapatkan hasil yang kurang sempurna.

SARINARULITA (06091410002) | 17

XIII. GAMBAR ALAT Beker gelas Gelas ukur Pipet tetes

Penggaris

Pensil

Batang pengaduk

Erlenmeyer

Penyemprot

Kaca

SARINARULITA (06091410002) | 18