Anda di halaman 1dari 8

Laporan Praktikum Evaluasi Nilai Biologis Komponen Pangan ISOLASI DAN KULTUR SEL LIMFOSIT DARI LIMPA TIKUS

Dosen: Dr. Ir. Endang Prangdimurti, M.Sc Ir. Sutrisno Koswara, M.Si Asisten: Ni Nyoman Susi, S.P dan Dede Saputra, S.Pi Doddy Aryanto (F240800104), Efratia (F24080033), Eka Julianti (F24080100), Elva Hasna (F24080123), dan Euis Fujiarti (F24080064) Golongan/Kelompok: P1/2 Senin, 28 November 2011 ABSTRACT Lymphocytes are white blood cells which is associated with the immune system. The aims of this study is to know the number of lymphocyte proliferation from 4 treatment of rats. Lymphocyte proliferation was measured using the method tryphan blue. The results show that the highest number of lymphocyte proliferatiom was standard with secang 2.30x107 cells/ml, nonprotein 3.38x106 cells/ml, tempeh flour 1.53x106 cells/ml, and casein standard 1.21x106 cells/ mL. However, the results of study above can not be trusted because of the weaknesses of methods and condition of rats.

Key words: lymphocyte, tryphan blue

PENDAHULUAN Semua makhluk hidup membutuhkan zat-zat gizi maupun non gizi untuk dapat menjalankan fungsi normal kehidupannya. Zat-zat gizi yang dibutuhkan antara lain karbohidrat, protein, lemak, vitamin dan mineral. Zat non gizi seperti antioksidan juga diperlukan untuk melawan radikal bebas, baik yang masuk dari luar tubuh maupun yang terbentuk akibat metabolisme. Salah satu sumber antioksidan yang banyak diteliti adalah secang. Ekstrak kayu secang (Caesalpinia sappan L.) hasil penapisan mengandung lima senyawa aktif yang terkait dengan flavonoid baik sebagai antioksidan primer maupun antioksidan sekunder (Safitri, 2002). Telah diketahui ternyata flavonoid yang ter dapat dalam ekstrak kayu secang memiliki sejumlah kemampuan yaitu dapat meredam atau menghambat pembentukan radikal bebas hidroksil, anion superoksida, radikal peroksil, radikal alkoksil, singlet oksigen, hidrogen peroksida (Shahidi 1999; Miller 2002). Limfosit merupakan sel kunci dalam sitem imun. Limfosit adalah sel yang paling dominan di dalam organ dan jaringan sistem imun. Lokasi limfosit T adalah pada lien dan kelenjar limfa yaitu pada masing-masing daerah periarterioler, parakortikal dan perifolikuler. Jumlah 65%-85% dari total limfosit dalam darah. Limfosit berperan dalam sistem imun spesifik seluler (sel T) untuk pertahanan terhadap bakteri yang hidup intraseluler, virus, jamur, parasit dan keganasan. Kerusakan membran pada sel limfosit, yang antara lain dapat disebabkan oleh senyawa-senyawa radikal, berdampak pada penurunan responnya, antara lain penurunan proliferasi limfosit. Proliferasi limfosit merupakan penanda adanya fase aktivasi dari respon imun tubuh. Proliferasi limfosit ini berupa peningkatan produksi limfoblas yang kemudian akan menjadi limfosit di limpa. Secara makroskopis dapat terlihat dengan adanya pembesaran organ-organ limfoid. Limpa merupakan salah satu organ limfoid perifer dan bagian dari sistem imun (Khasanah 2009).

Aktivitas proliferasi limfosit merupakan salah satu parameter yang dapat digunakan untuk mengukur status imunitas karena proliferasi limfosit menunjukkan kemampuan dasar dari sistem imun (Roitt 1991). Untuk dapat berproliferasi dan menghasilkan sel efektor atau sel imunokompeten, membran sel limfosit harus berada dalam kondisi untuh. Hal ini disebabkan karena proliferasi sel bermula dari kontak antara membran sel dengan antigen atau dengan molekul aktivator lain. Keutuhan membran sel sangat dipengaruhi oleh adanya prooksidan dan antioksidan karena sifat komponen makromolekul pada membran yang mudah teroksidasi yaitu protein dan asam lemak tidak jenuh (Krinsky 1992, Meydani et al 1995). Banyak bahan pangan yang diteliti mengenai aktivitasnya sebagai imunostimulan, beberapa diantaranya dipercaya mampu menstimulasi proliferasi sel limfosit untuk meningkatkan sistem imunitas. Secang merupakan bahan pangan yang memiliki komponen fenolik yang dapat berfungsi sebagai antioksidan. Oleh karena itu, dalam percobaan ini akan dianalisis pengaruh pengkonsumsian secang terhadap proliferase sel limfosit pada tikus percobaan.

TUJUAN Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian protein ransum terhadap jumlah proliferasi limfosit pada tikus percobaan.

METODOLOGI Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah tikus putih, alkohol 70%, kloroform, RPMI standar steril, RPMI lengkap steril, Fetal Bovine Serum, NH4Cl 0.85% steril, larutan mitogen steril, larutan H2O2 10M steril, media kultur PBS steril (Phosphate Buffer Saline), dan larutan pewarna Trypan Blue. Alat-alat yang digunakan terdiri dari peralatan bedah tikus (pisau, gunting, pinset), sarung tangan disposable, alas/media bedah, alumunium foil, kapas, tissue, botol semprot alkohol 70%, botol steril, toples, syringe 5 ml steril, cawan petri steril, transfer pipet disposable steril, tabung sentrifuse, pipet tetes, pipet volumetrik, alat sentrifuse, haemacytometer, gelas penutup, microwell plate, mikropipet, tip mikropipet, penggerus, cell counter, dan mikroskop.

Prosedur Percobaan

Terminasi tikus dengkloroform Setelah mati, basahi badannya dengan alkohol 70 %

3 ekor tikus diambil limpanya

3 ekor tikus sisanya, diambil hati, limpa, dan ginjalnya. Cuci dengan PBS

Masukkan ke botol berisi 5 ml PBS steril

Tiriskan di kertas saring Ambil limpa dan masukkan ke cawan petri berisi 5 ml RPMi Steril

Timbang

Gerus dengan ujung syringe

Hati dibungkus dengan aluminium foil dan di label

Pindahkan seluruhnya ke tabung sentrifuse steril dengan pipet transfer. Selaput jaringan tidak perlu dipindahkan

Simpan di freezer untuk analisis MDA

Sentrifus 1500 rpm 5 menit

Buang supernatan (hati-hati dan jangan sampai teraduk lagi)

Pelet/endapan sel dijentik-jentik dengan jari supaya tidak pekat

Hitung limfosit *

2 ml NH4Cl 0,85% ditambahkan untuk melisis eritrosit selama 2 menit tepat

Ambil 50 l suspensi sel ke dalam mikroplat

Tambahkan segera 5 ml RPMi

Tambahkan 150 l trifan blue (FP 4x)

Sentrifus sesegera mungkin pada 1500 rpm 5 menit

Aduk dengan mikropipet dan segera dibaca karena Trifan Blue toksik

Buang supernatan dengan hatihati

Teteskan ke hemasitometer yang sudah diberi cover glass

Pelet sel dijentik-jentikan

Tambahkan 5 ml RPMi

Baca pada pembesaran 400x. Hitung jumlah sel hidup (bening) pada 2 kuadran I & III

Sentrifus kembali pada 1500 rpm selama 5 menit

Limfosit/ml = Rata-rata sel hidup per kuadran x FP x 1

Keterangan: Volume 1 kuadran = 10-4 m Buang supernatan

Pelet sel dijentik-jentikan dan ditambahkan 5 ml RPMi

Aduk dengan pipet (disebut sebagai suspensi sel)


HASIL

Hitung jumlah limfosit hidup *

2.50E+07

2.30x107

2.00E+07

1.50E+07

1.00E+07

5.00E+06 1.21x106 0.00E+00 Standar Tempe 1.53x106

3.38x106

Non-Protein

Secang

Gambar 1. Rata-rata sel limfosit /mL limfa dari tiap sampel

Sampel Standar (P4) 1 3 6 Rata-rata Tempe (P3) 2 3 4 Rata-rata Non-Protein (P1) 1 4 5

Jlh limfosit/bid pdg

Sel limfosit/mL

48 22 22

37 10 42

1.70x106 6.40x105 1.28x106 1.21x106

68 21 28

47 32 34

2.30x106 1.06x106 1.24x106 1.53x106

26

31

1.14x106 5.38x106 3.62x106

139 130 83 98

Rata-rata Secang (P2) 3 5 6 Rata-rata 715 119 1393 0 710 506

3.38x106

1.67x107 2.79x107 2.43x107 2.30x107

Tabel 1. Rekapitulasi jumlah limfosit dari tiap sampel Contoh perhitungan (tikus standar no.1): Sel limfosit/mL = Rata2 jumlah limfosit/bid pdg x FP*104 = ((48+37)/2) x 4 x 104 = 1.70x106 sel/mL PEMBAHASAN Jumlah sel limfosit pada tubuh dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain keberadaan antioksidan dan kandungan gizi lain yang terkandung dalam pangan. Melalui mikroskop dapat terlihat bahwa sel limfosit yang hidup berwarna bening, sedangkan sel limfosit yang mati akan berwarna biru. Perhitungan dilakukan dalam waktu kurang dari tiga menit untuk mencegah terjadinya penyerapan warna oleh suspensi sel hidup karena adanya afinitas yang kuat dari tryphan blue pada DNA. Selain itu, tryphan blue bersifat toksik terhadap sel sehingga kontak antara sel dan pewarna tryphan blue tersebut harus dibuat sesingkat mungkin. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa jumlah sel limfosit paling banyak dimiliki oleh tikus dengan perlakuan pemberian ransum standar yang diberi minum secang yakni sebesar 2,3 x 107 sel/ml. Urutan selanjutnya yaitu tikus dengan ransum non-protein yakni sebesar 3,38 x 106 sel/ml, tikus dengan perlakuan pemberian ransum tempe sebesar 1,53 x 10 6 sel/ml dan yang terakhir yaitu tikus yang diberi perlakuan ransum standar dengan air putih sebesar 1,21 x 106sel/ml. Hasil tersebut ada beberapa yang sesuai dengan teori, ada pula yang tidak sesuai. Kadar limfosit tertinggi memang benar dimiliki oleh kelompok ransum standar dengan minuman ekstrak kayu secang. Namun, kelompok tertinggi kedua seharusnya dimiliki oleh kelompok tikus perlakuan ransum standar dengan minum air putih, diikuti oleh kelompok ransum tepung tempe dan terakhir dengan ransum nonprotein. Kelompok ransum non-protein memang seharusnya berada di tingkatan paling bawah kadar limfositnya. Suatu aktivitas pembentukan limfosit memang memerlukan protein karena tidak lepas dari pembentukan antigen dan antibodi yang penyusunnya didominasi rantai polipeptida yang dapat diutilisasi dari protein sehingga tanpa kehadiran protein memang akan sulit untuk membentuk sel limfosit yang cukup banyak. Permasalahan yang mungkin terjadi sehingga tikus kelompok non-protein ini berada di peringkat kedua sel limfosit terbanyak dapat berasal dari kesalahan analisis saat menghitung di bawah mikroskop pada tikus kelompok lain sehingga seharusnya kelompok lain memiliki sel limfosit lebih banyak, tetapi tercatat lebih sedikit karena kontak waktu yang melebihi tiga menit sehingga sel banyak yang mati. Kemungkinan lain adalah limfosit alami dan utilisasi dari protein jaringan tubuh banyak terjadi di kelompok ransum ini dan juga dapat pula diduga tikus dalam kedaan kurang sehat sehingga tubuhnya memaksa memproduksi banyak limfosit untuk pertahanan diri. Ransum standar pada praktikum ini merupakan protein jenis kasein. Jenis tersebut telah banyak disebutkan sebagai salah satu immunomodulator, dimana tripeptida dari kappa-kasein terbukti mampu meningkatkan proliferasi dari sel limfosit manusia secara in vivo dan C-terminal dari beta-kasein yang mengandung beta-casokinin-10 juga membuktikan hal yang sama pada tikus (Sofia et.al 2007). Pada

percobaan melalui tikus diketahui bahwa semakin tinggi bioavailibilitas protein dalam saluran pencernaan maka semakin tinggi pula potensi kemampuan mendukung respon proliferasi sel limfosit dalam limpa. Ransum standar kasein yang merupakan protein hewani, memiliki bioavailibilitas mendekati 100%, karena terdiri dari kasein murni, sedangkan tepung tempe hanya memiliki bioavailibilitas sekitar 86% (Marsinah 2004). Hal tersebut menjelaskan seharusnya ransum standar menghasilkan kemampuan proliferasi sel limfosit lebih tinggi dibanding protein tepung tempe. Namun, hal yang terjadi sebaliknya, beberapa faktor seperti terdapatnya antioksidan dalam tepung tempe, kondisi kesehatan tikus ransum standar sangat baik sehingga limfosit tidak ditemukan banyak, kesalahan pembacaan atau sensitivitas metode menentukan hasil menyimpang tersebut. Salah satu komponen aktif lain dalam pangan yang mampu memicu proliferasi limfosit adalah komponen antioksidan (Holinesti 2009). Antioksidan mampu melindungi membran sel limfosit agar tidak mudah rusak oleh radikal bebas atau serangan bakteri (Batubara et.al 2009). Salah satu antioksidan yang terdapat pada praktikum ini adalah brazilein dari kayu secang, yang terdapat sekitar 70,1 113 mg/L ekstrak kayu secang (Holinesti 2009). Hal tersebut menguatkan posisi ransum standar ditambah minum ekstrak kayu secang dapat meningkatkan kemampuan proliferasi sel limfosit. Antioksidan lainnya adalah jenis isoflavon yang terdapat pada tepung tempe, meskipun terdapat namun jumlahnya sedikit sekali hanya 0,04 0,08 mg/g tepung tempe sehingga aktivitasnya tidak begitu signifikan (Marsinah 2004). Namun, seharusnya tikus dengan ransum tempe lebih tinggi dibandingkan ransum nonprotein karena memiliki kadar protein dan antioksidan lebih tinggi dan lebih rendah dibandingkan perlakuan ransum standar ditambah minum ekstrak kayu secang serta ransum standar dengan minum air putih.

KESIMPULAN Urutan jumlah sel limfosit/ml dari uji proliferasi limfosit dari limpa tikus dengan metode tryphan blue yaitu ransum standar 1.21x106 sel/ml, ransum tepung tempe 1.53x106 sel/ml, ransum nonprotein 3.38x106 sel/ml, dan ransum standar dengan minuman secang 2.30x107 sel/ml. Namun, hasil percobaan tidak sepenuhnya sesuai teori karena alasan kelemahan-kelemahan metode dan kondisi tikus percobaan.

DAFTAR PUSTAKA Batubara I et.al. 2009. Screening anti-acne potency of Indonesian medical plants: anti-bacterial, lipase inhibition and antioxidant capacity. J. Wood Sci. 55: 230-235. Holinesti R. 2009. Studi pemanfaatan pigmen brazilein kayu secang sebagai pewarna alami serta stabilitasnya pada model pangan. J. Pend. dan Keluarga UNP 1(2): 11-22. Khasanah N. 2009. Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella Sativa) Terhadap Respon Proliferasi Limfosit Limpa Mencit Balb/C Yang Diinfeksi Salmonella Typhimurium. Laporan Akhir Penelitian Karya Tulis Ilmiah. Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Krineky, I. 1992. Mechanism of Action of Biologi Antioxidants. The Society for Experimental Biology an Medicine. Boston, Massachussets. Marsinah W. 2004. Pembuatan cookies berbahan dasar tepung tempe. [Skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Meydani, S.N., Wu D, Santos, M.S., Hoyek, M.G. 1995. Antioxidant and immune response in aged person overview of present avidience. Am. J. Clin. Nutr. 62, 1462 S- 1476 S Miller, A. L. 2002. Antioxidant Flavonoid Structure Function and Clinical Usage. Puspaningrum R. 2003. Pengaruh Ekstrak Kayu Secang Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Limpa Tikus dan Sel Kanker K-562 Secara In Vitro. [skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Roitt, I. 1991. Essential Immunology. London: Blockwell Scientific Publication. Safitri, R. 2002. Karakterisasi Sifat Antioksidan In Vitro Beberapa Senyawa Yang Terkandung Dalam Tumbuhan Secang (Caesalpinia sappan L.). Disertasi. Program Pasca Sarjana Universitas Padjadjaran. Bandung.

Shahidi, F. 1996. Natural Antioxidants. Chemistry, Health Effects, and Applicatins. AOCS Press. Champaign. Illionis. Sofia V et.al. 2007. Caseins as Source of Bioactive Peptides. Universadide Catolica de Portuguesa, Porto.