FEBS Letters 452 (1999) 323-327

PCR Random mutagenesis into Eschericia coli serine acetyltransferase: isolation of the mutant enzymes that cause overproduction of L-cysteine and Lcystine due to the desensitization to feedback inhibition
Hiroshi Takagi, Chitose Kobayashi, Shin-ichiro Kobayashi, Shigeru Nakamori

1. Pendahuluan Adanya feedback inhibition oleh L-cystein dari serine acetyltransferase (SAT: EC 2.3.1.30), yang mengandung 273 residu asam amino yang mengkatalisis pembentukan o-acetyl-L-serine dari asetil-KoA dan L-serine dan merepresi enzim yang bertanggung jawab terhadap reduksi sulfida dari sulfat, sehingga produksi L-cystein dalam jumlah tinggi tinggi dari glukosa oleh mikroba tidak bisa didapat. L-cystein merupakan asam amino yang sangat penting bagi industri pangan, farmasi, dan kosmetik. Oleh sebab itu untuk bisa memproduksi L-cystein dalam jumlah tinggi dikonstruksi gen cysE pada Eschericia coli yang mengkode SAT yang sudah direkayasa, sehingga secara genetik tidak sensitive terhadap feedback inhibition oleh L-cystein. Caranya adalah dengan mengubah residu metionin pada posisi 256 dengan 19 residu asam amino lainnya dengan menggunakan site-directed mutagenesis. Didapatkan hasil bahwa galur rekombinan yang mengandung mutan gen cysE bisa meningkatkan produksi L-cystein dan L-cystine (790 mg/l untuk mutan SAT Met-256-Ala. Akan tetapi ketidaksensitifan SAT mutan baru bisa mencapai factor 15 kali bila dibandingkan dengan wild-type (konsentrasi untuk 50% inhibisi: 100 M untuk SAT mutan vs 6M untuk wild-type) oleh sebab itu diharapkan masih bisa dilakukan peningkatan untuk memproduksi L-cystein. Dalam penelitian ini, mutagenesis acak error-prone PCR dilakukan pada gen cysE yang mengkode SAT pada Eschericia coli sehingga bisa didapatkan enzim mutan yang bisa memproduksi L-cystein dan Lcystine dalam jumlah besar. Beberapa transforman yang memproduksi L-cystein dalam jumlah besar diseleksi dengan mendeteksi pembentukan halo dari L-cysteine auxothroph. Berdasarkan uji asam amino dan analisis sifat katalis ditemukan bahwa wilayah terminal karboksil menunjukkan level ketidaksensitifan terhadap feedback inhibition yang tinggi. 2. Material dan metode Material L-cysteine auxotroph E. coli dan galur non-utilizing JM39-8 digunakan sebagai host untuk transformasi dari plasmid dengan gen cysE yang sudah diubah dan juga sebagai indicator untuk menyaring transforman yang memproduksi L-cysteine. Vektor plasmid pUC19 digunakan untuk cloning dan ekspresi gen cysE. Plasmid pCE yang mengandung gen cysE wild-type digunakan sebagai template DNA untuk mutagenesis acak PCR. Digunakan juga enzim-enzim yang diperlukan untuk memanipulasi DNA. Mutagenesis acak oleh PCR Mutasi acak dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. Untuk mengintroduksi mutagenesis acak pada gen cysE wild-type yang mengandung wilayah promotor dan terminator, dilakukan error-prone PCR. Error-prone PCR (EP-PCR) adalah metode pilihan untuk mengintroduksi mutasi acak (random mutation)

pada segmen DNA yang sudah ditentukan yang terlalu panjang untuk bisa disintesis secara kimia sebagai sekuens yang terdegenerasi. Sehingga dimungkinkan untuk memutasi keseluruhan gen atau hanya sebagian kecil segmen dari gen. Plasmid pCE disiapkan, dan primer forward dan reverse didesain berdasarkan sekuens nukleotida di luar gen. Primer forward adalah adalah posisi 5-GGGAATTCATCGCTTCGGCGTTGAAA-3 pemotongan EcoRI) (bagian dan yang primer reverse digarisbawahi (bagian adalah adalah yang 5lokasi

digarisbawahi

GGCTCTAGAAGCGGTATTGAGAGAGATTA-3

pemotongan oleh XbaI). DNA pCE ditambahkan sebanyak 10 ng sebagai template terhadap larutan yang mengandung 10mM Tris-HCl, 550 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 10 mM -merkaptoetanol, 10 l DMSO, 1 mM dGTP, dCTP, dan dATP, 0,2 mM dATP, 0,5 M dari dua primer dan 1 l Taq DNA polymerase dan air distilasi untuk mengencerkan larutan sampai 100 l. PCR dilakukan sebanyak 25 siklus (94oC selama 1 menit, 55oC selama 1 menit, dan 72oC selama 3 menit). Band 1117 bp yang teramplifikasi dipotong dengan EcoRI dan XbaI dan kemudian diligasi ke wilayah EcoRI dan XbaI pada pUC19. Isolasi transforman yang memproduksi L-cysteine DNA terligasi digunakan untuk mentransform E. coli JM39-8 pada medium padat LB yang mengandung 50 g/ml ampisilin. Setelah itu koloni yang resisten terhadap ampisilin dipindahkan pada agar M9 yang disuplemen dengan 50 g/ml ampisilin dan ditambahkan dengan indicator auxotroph L-cystein galur E. coli JM39-8 yang mengandung pUC19 dengan jumlah 1x107 sel/ml. Setelah itu cawan diinkubasi semalaman pada suhu 37oC. Transforman yang menghasilkan L-cystein diisolasi dari cawan dengan mendeteksi pembentukan halo dari sel E. coli JM39-8. DNA plasmid dipurifikasi dari tiap transforman dan sekuens nukleotida dari gen cysE dikonfirmasi dengan DNA sekuenser dengan menggunakan metode pemutusan rantai dideoksi. Produksi L-cysteine dan L-cystine Untuk memproduksi asam amino, sekumpulan sel diambil dan dikultur selama 24 jam pada medium padat LB yang mengandung ampisilin pada 30oC dan diinokulasi ke medium CI dalam 500 ml flask dan diinkubasi pada 30oC selama 72 jam pada shaker dengan kecepatan 120 strokes per menit. Determinasi L-cysteine dan L-cystine Jumlah L-cysteine dan L-cystine diukur dengan mikrobioassay menggunakan Pediococcus acidilactici. Galurnya sudah dikonfirmasi untuk merespon L-cysteine dan L-cystine secara sama. Selain itu larutan kultur diassay setelah mengencerkan L-cysteine dengan 0,5 N HCl karena L-cysteine dalam kultur cair sangat mudah teroksidasi menjadi L-cystine.

Pengukuran aktivitas SAT Untuk mengukur aktivitas SAT, sel ditumbuhkan pada medium CI selama 72 jam pada 30 oC pada fase stationer, dan kemudian dicuci dengan 50 mM buffer Tris-HCl dan direndam dalam 4 ml buffer yang sama yang mengandung 2 mM dithiothreitol. Setelah itu dilakukan ultrasonikasi dan sentrifugasi pada 30 000 x g selama 30 menit untuk menghancurkan sel sehingga bisa didapatkan supernatant sebagai sumber enzim. Aktivitas SAT diassay dengan mengikuti penurunan A232 pada reaksi campuran dalam volum akhir yang mengandung 50 mol Tris-HCl, 1 mol L-serine, 0,1 mol asetil-KoA dan larutan enzim pada 30oC. Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan Bio-Rad Protein Assay Kit dan serum albumin sapi digunakan sebagai standar. 3. Hasil Penelitian Untuk membuat mutagenesis acak pada gen cysE wild-type, error-Prone PCR digunakan dengan menggunakan pCE sebagai template dan dengan dua primer seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Dari sekitar 400 transforman yang tahan terhadap ampisilin, 280 koloni bisa tumbuh pada agar M9, dan di antara mereka ada 37 koloni yang membentuk halo karena terekskresinya L-cysteine ke medium karena diisolasi pada cawan yang sama yang mengandung indikator L-cysteine auxothrop. Sel yang mengandung gen cysE wild-type tidak membentuk halo. Setelah itu hasil DNA sekuens dari koloni pembentuk halo adalah didapatkan 25 tipe substitusi asam amino. Selain itu ditemukan juga substitusi asam amino berlipat. Ukuran halo yang terbentuk diperkirakkan berhubungan dengan kemampuan sel untuk memproduksi Lcysteine, karena L-cysteine terakumulasi dalam jumlah besar di dalam sel, sehingga akhirnya terekskresi ke luar sel. Didapatkan tujuh transforman yang diseleksi sebagai galur yang memproduksi L-cystein berlebih, yaitu Asn-51-Lys/Arg-91-His/His-233-Tyr, Glu-166-Gly/Met-201-Val, Thr-167-Lys, Met-201Thr, Pro-252-Arg dan Ser-253-Leu mutan SAT. Diantara ketujuh tipe mutan tersebut, Met-201-Arg, Met-201-Thr, dan Ser-253-Leu mutan SAT mempunyai jumlah produksi L-cystein dan L-cystine yang paling tinggi, yaitu sebesar 990 mg/l, 740 mg/l, dan 960 mg/l.