Anda di halaman 1dari 13

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA ISOLASI DAN ELEKTROFORESIS DNA

Kelompok A1:
1. Endah Puspitasari 2. Ditya Bayu Pangesta 3. Subulas Salam 4. Budiyawan 5. Rendra Nor Wijaya 6. Yunida Firmasari 7. Dyka Prameswara W 8. Intan N R 9. Bagus Brahmanto A (5721) (5723) (5724) (5725) (5726) (5727) (5728) (5729) (5730)

LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS GAJAH MADA YOGYAKARTA

ISOLASI DNA
I. TUJUAN

Untuk mengetahui prinsip dan cara isolasi DNA sel dari organ.

II.
A.

TINJAUAN PUSTAKA
ASAM NUKLEAT

Asam nukleat adalah senyawa yang selalu terdapat pada setiap sel hidup. Fungsinya tidak hanya bertanggung jawab pada masalah penyimpanan dan transmisi informasi genetic saja tetapi juga translasi dari informasi dalam proses sintesa protein. Senyawa ini dinamakan asam nukleat karena semula diperkirakan hanya terdapat dalam inti, tetapi ternyata senyawa tersebut terdapat juga di dalam sitoplasma, mitokondria dan kloroplas. Ada dua jenis asam nukleat yaitu DNA (deoksirybonucleic acid) atau asm deoksiribonukleat. DNA dan RNA merupakan anion dan biasanya terikat protein yang bersifat biasa. Senyawa gabungan antara asam nukleat dengan protein ini disebut nucleoprotein. Asam polimer merupakan polimer seperti protein yang hanya saja monomernya adalah nukleotida bukan asam amino. B.NUKLEOTIDA DAN NUKLEOSIDA Molekul nukleotida terdiri atas nukleosida atas nukleosida yang mengikat asam fosfat. Molekul nukleosida terdiri atas pentosa (deoksiribosa atau ribosa) yang mengikat suatu basa (deriva purin atau primidin), jadi apabila suatu nukleoprotein dihemolisis sempurna maka akan mengahsilkan protein, asam fosfat, pentosa dan basa purin atau primidin. Pentosa yang berasal dari DNA adalah deoksiribosa dan yang berasal dari RNA lain adalah ribosa. Adapun basa purin dan basa primidinyang berasal dari dna adalah adenin, guanin, sitosin dan timin. Pada RNA akan diperoleh adenin, guanin, sitosin dan urasil. Urasil terdapat dalam dua bentuk yaitu bentuk keto dan laktam dan enol atau laktim.

C.

DNA (ASAM DEOKSIRIBONUKLEAT)

DNA merupakan polimer yang terdiri atas molekul-molekul deoksiribosa yang terikat satu dengan lain, sehingga membentuk rantai polinukleotida yang panjang. Basa puri yang terdapat pada DNA adalah adenin dan guanin. Sitosin dan timin adalah basa pirimidin yang terdapat pada asam nukleat ini. Molekul DNA yang panjang ini terbentuk oleh ikatan antara atom C dan nomor 3 dengan atom C nomor 5 pada molekul deoksiribosa dengan perantaraan gugus phosphate. DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida yang terjalin dalam bentuk suatu spiral yang dimantapkan oleh ikatan hydrogen diantara pasangan basa yang tertentu. Umumnya molekul DNA adalah jenis helikel ganda kecuali beberapa virus yang mengandung DNA rantai tunggal dan DNA lengkung tertutup dalam mitokondrianya. Stabilitas strutur sekunder DNA terbentuk oleh adanya ikatan hydrogen antar basa yang komplementer. Pasangan C-G lebih stabil daripada pasangan A-T karena berisi 3 ikatan hydrogen dibandingkan dengan ikatan A-T yang berisi ikatan 2 hidrogen. Urutan dari Vander Waals yang terjadi antara pasangan basa dibagi dalam kompleks DNA memperkuat struktur sekunder tersebut. Peran biologis DNA : DNA terdapat di dalam inti sel , hanya sejumlah kecil ada di dalam mitokondria dan kloroplas. Fungsi DNA adalah sebagai gudang penyimpanan bahan-bahan informasi genetik dan dalam sintesa protein. Sebagai penyimpanan informasi genetika DNA akan mereplikasi sehingga sifat-sifat diturunkan dari suatu sel ke anak sel. Dalam sintesa protein, telah diketahui dari hasil percobaan bahwa susunan basa didalam DNA inti sel akan menentukan protein di dalam sitoplasma sel. DNA berbagai species memilki kompensasi basa yang sangat khas.Hasil penelitian dari Chargaff mengambil kesimpulan: 1. 2. 3. lingkungan. Potongan DNA yang diisolasi dari berbagai jaringan spesies yang sama Komposisi basa DNA bervariasi dari satu species ke species lain. Komposisi basa DNA pada species tertentu tidak berubah dengan memilki kompensasi yang sama pula.

bertambahnya umur organisme atau berubahnya tingkat nutrisi atau berubahnya

4.

Jumlah residu adenin pada semua DNA, tanpa bergatung pada species.

III.
A. MATERI Alat: -Waterbath - Sentrifuge - Pipet - Lemari es - Glass Lab Bahan: PBS : 8 gr NaCl 0,2 KCl 1,44 gr NaHPO4 ( H20)

MATERI DAN METODE

Proteinase K 1mg/ml dalam NTE, pH 7,4 SDS 20% Phenol CIAA Na asetat Etanol 70% Etanol absolute (96%)

Tambahkan H20 sampai 1 liter NTE pH =7,4 20 mL 5 mol NaCl 20 mL 1 mol Tris-Cl (pH 7,4) 2 mL 0,5 mol EDTA ( pH 7,5) 958 mL H20

Buffer:

B. METODE

Cuci lien dengan PBS

Masuk larut ke dalam tabung Diamkan 10

Ambil Supernatan

ke tabung

Sentrifuge 10

Ambil Pellet

Inkubasi proteinase K80 + 2ml NTE

+ SDS 2 ml

Inkubasi jam, 37 oC

+ Phenol 2 ml

Shaking 15 menit

Sentrifuge 10 menit diambil supernatant

Tambahkan Na asetat + etanol dingin (2 tetes)

Ada bentukan seperti kapas (ambil)

Tambahkan TL Buffer / Aquadest (secukupnya)

IV.
Sentrifuge 1 Sentrifuge 2 a. b. c.

HASIL PERCOBAAN

: Terbentuk Pellet dan Suprenatan : Ada 3 lapisan yang berwarna:

Jernih : DNA Protein teragulase Residu phenol dan lipid Setelah ditambahkan Na.Asetat dan ethanol dingin munculbentukan seperti kapas

melayang.

V.
Lien ayam adalah: 1. 2.

PEMBAHASAN

Pada praktikum ini, digunakn DNA yang diambil dari lien ayam. Alasan digunakan Lien ayam banyak mengandung Limfosit (di dalam limfosit terdapat nuklerus yang Lien ayam mempunyai enzim DNAse yang rendah. DNAse merupakan enzim yang

mengandung DNA. dapat memecah ikatan hydrogen pada DNA. Jika ikatan hydrogennya pecah, maka DNA tidak utuh sehingga digunakan lien yang mengandung sedikit DNAse.

Pertama-tama Lien ayam diinjeksi dengan PBS. Fungsi PBS (Phosphat Buffer Salina) adalah melisiskan eritrosit dan menjaga pH supaya stabil (agar keadaan fisiologinya sama dengan penyangga). Pada saat diinjeksi PBS melisiskan eritrosit dalam lien sehingga leukosit dapat terpisah dari eritrositnya dan leukositnya keluar. Kemudian cairan yang dipeleh dimasukkan ke dalam tabung ependorf dan didiamkan selama10 menit.Kemudian, disentrifuge selama 10 menit. Sentrifuge berfungsi untuk memisahkan substrat berdasarkan berat jenisnya. Terbentuk 2 lapisan: lapisan atas sebagai supernatant dan lapisan bawah sebagai pellet. Pellett tersebut mengandung leukosit, protein dan lemak.Lalu ditambahkan proteinase K80 dan 2 mL NTE. NTE berfungsi sebagai media proteinase K untuk melemahkan nuclease dan memecah ikatan Phospodiester. Sedangkan proteinase K berfunsi untuk melisiskan membrane lipid ekstra sel. Kemudian menambahkan SDS 20% sebanyak 2mL. SDS ini berfungsi untuk melisiskan lemak agar nucleus yang diperoleh lebih murni. Kemudian diinkubasis selama 30 menit pada suhu 37o C. Suhu 37o C karena suhu tersebut merupakan suhu yang tepat untuk enzim berkerja. Setelah itu ditambahkan Fenol CIAA ( Chloroforn Isoamil Alcohol) yang befungsi untuk denaturasi dan koagulasi protein. Kemudian shaking kurang lebih 15 menit, membentuk angka 8 agar reaksi berlangsung sempurna. Lalu disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan penuh. Setelah disentrifuge selama 10 menit, akan terbentuk 3 lapisan, yaitu: 1. Lapisan atas adalah DNA (jernih) 2. Lapisan tengah adalah protein terkoagulasi. 3. Lapisan bawah adalah residu phenol dan lipid. Kemudian lapisan atas diambil dan ditambahkan Na asetat dan etanol dingin 2 tetes. Na asetat berfungsi untuk mepresipitasikan DNA sehingga muncul bentukan seperti kapas melayang. Sedangkan etanol dingin berfungsi untuk menjaga agar DNA tidak rusak dan mencegah kontaminasi dari luar. Kemudian mengambil bentukan seperti kapas dan ditambah TE buffer secukupnya. TE buffer berfungsi untuk melindungi ppenyimpanan DNA, melarutkan DNA terkoagulasi.

ELEKTROFORESA DNA I. TUJUAN


Untuk mengetahui DNA sample hasil isolasi dengan metode elektroforesis.

II. TINJAUAN PUSTAKA


Suatu polipeptida mempunyai muatan positif dan negative. Muatan positif terletak pada gugusan ammonium pada salah satu ujung dan muatan negative pada gugusan karboksilat ujung yang lain. Polipeptida bersifat amfotir (dapat berreaksi dengan asam atau basa). Disamping itu polipeptida juga memiliki titik iso elektrik. Pada titik iso elektri, polipeptida paling sukar larut dan cenderung membentuk gumpalan. Setiap protein mempunyai titik iso elektriknya sendiri. Gugusan samping masing-masing protein berbeda, maka perilaku tittrasinya juga berbeda. Dengan demikian campuran protein di dalam suatu larutan sering dapat dipisahkan satu sama lain dengan elektroforesis ( terjadinya perpindahan molekul pada suatu medan listrik. Dengan kata lain elektroforesis merupakan metode pemisahan partikel (molekul) bermuatan didalam larutan yang diberi arus atau medan listrik. Dengan tenik ini prtikel bermuatan Alsan bergerak menuju elektroda yang berlawanan muatannya.)

III. MATERI DAN METODE


A. MATERI ALAT: 1. Unit elektroforesis dengan asesorinya (Gradien, former, galls plate, clamp, peristaltic, elektroda, tendon buffer, dll.) 2. Power supply.

3. Pipet mikro. 4. Yellow tip. 5. Penangas air. 6. Ependop dan alat gelas lain. BAHAN: 7. Gradient gel 10% 8. Stacking gel 3% 9. Buffer elektroda 10. Sample protein 11. Sample buffer 12. Pengecatan dengan pewarna coomasie blue 0,1% 13. Larutan destaining 14. Butnol 15. Temed 16. SDS B. METODE Siapkan seperangkat alat elektroforesa Bersihkan plate kaca dengan metanol lalu pasang klem pada stem Masukkan gradient gel 10%, bagian atas tutup dengan butanol, biarkan kurang lebih 30 menit hingga terjadi polimerisasi gel Buang butanol, bersihkan dengan aquades, pasang sisir untuk sumuran Masukkan stacking gel diatas gel 10% selama 30 menit Angkat sisir, masukkan gel ke dalam tangki yang telah berisi buffer elektroda

Masukkan sample (sample : sample buffer 1:4) Hubungkan dengan power supply (Beri arus listrik 125 volt selama 2 jam) Ambil gel, tempatkan dalam cawan berisi larutan pewarna coomasie blue 0,1% Cuci gel/destaining dengan larutan yang terdiri dari metanol, asam asetat dan air

IV. HASIL PRAKTIKUM

(-)

(+)
Hasil berupa DNA smear

V. PEMBAHASAN
Elektroforesis adalah suatu metode pemisahan makromolekul (partikel) terutama protein dan asam nukleat berdasarkan pada ukuran muata dan konformitasnya didalam

larutan yang diberi arus listrik. Tujuan elektroforesi adalah untuk mengetahui DNA sample hasil isolasi dengan metode elektroforesis. Saat persiapan sample, perbandingan DNA sample dan blue juice adalah 4:1 yaitu 8 L DNA dan 2L blue juice. Kemudian di vortex mixer hingga tercampur sempurna. Blue juice terdiri dari Brom ethanolit, gliserin dan merkat ethanol. Fungsi gliserin untuk pemberat, dan market ethanol berfungsi untuk memutuskan ikatan hydrogen, brom etanolat sebagai pemberi warna biru ysng berfungsi untuk menunjukkan proses elektroforesa sedang berjalan sampai dimana. Pencampuran DNA sample dan blue juice dapat dilakukan di udara terbuka karena DNA sample bersifat stabil dalam suhu kamar. Sample DNA berasal dari lien ayam. Pada saat persiapan gel agarose 1%, 1 gram agarosa dilarutkan dengan 100mL TBE. Agarosa terbuat dari rumput laut sehingga berbentuk bubuk putih. Agarosa berfungsi sebagai media elektroforesa dan larut dalam pelarut pada suhu tinggi (soluble) dan akan memadat pada suhu rendah (terjadi reaksi polimerisasi). TBE berfungsi sebagai penghantar arus listrik dan menjaga pH. TBE terdiri dari tris, asam borat dan EDTA. Kemudian panaskan pada suhu 100 oC kemudian dinginkan. Pada suhu ini Ethidium bromide (3 gram. 15 mL=berfungsi untuk mewarnai DNA orange) tidak rusak, tidak terlalu panas. Keadan cair sehingga mudah dituang. Konsentrasi gel 1%, makin besar konsentrasi gel agarose, makin kecil pori-pori gel, sehingga panjang rantai DNA yang masuk semakin pendek. Penggunaan TBE dapat juag digantikan TAE yang terdiri dari trus, asam borat, EDTA. Ethidium bromide yang digunnakan pada campuran gel agaroa bersifat carsinogenik, yang dapat menyebabkan penyakit kanker. Pada saat persiapan plate dan elektroforesis, ketika memasang sisir diata plate harus menggunakan sarung tangan agar terlindung dari bahan-bahan kimia yang bersifat carsinogenik (dapat memacu pembelahan sel sehingga menyebabkan kanker) dan berbahaya bagi tubuh. Kemudian tuang gel agarose 1% yang bersuhu 55 oC yang telah dicampur rata dengan ethidium bromide. Biarkan 15-30 menit pada suhu kamar sehingga memadat. Lalu sisir dicabut dan terbentuk sumuran. Hubungkan tangki dengan power supply , setelah beberapa saat, lihat gel dibawah sinar ultraviolet. Pada saat penyinaran, jangan sampai sinar UV mengenai mata secara langsung, karena ssinar UV sangat berbahaya jika dilihat langsung.

Blue juice bergerak ke kutub positif karena didalamnya mengandung Brom yang bermuatan -1 (gol VII A). DNA sample setelah disinari UV tampak berwarna orange (berfluoresens) karena ethidium bromide yang tercampur dengan gel agarosa memberi warna orange pada DNA. DNA yang dicampur blue juice yang mengandung Brom bermuatan -1 (gol VII A) sehingga berjalan menuju kutub positif karena DNA yang mengandung gugus phosphate tersebut juga bermuatan negatif.

DAFTAR PUSTAKA

Poedjiadi,

Anna

dan

Supriyanti,

Titin.2005.Dasar-dasar

biokimia.Jakarta:

Universitas Indonesia (UI-Press). www.wikipedia-indonesia.com/isolasi DNA