Anda di halaman 1dari 5

Biosi. Biotechnol. Biochem.

68 (3), 656-662, 2004

Adenine Auxotrophic mutants of Aspergillus oryzae: Development of a Novel Transformation System with Triple Auxotrophic Hosts2
2Feng

Jie Jin, Jun-Ichi Maruyama, Praveen Rao Juvvadi, Manabu Arioka, dan Katsuhiko Kitamoto

a. Pendahuluan Aspergillus oryzae merupakan kapang koji yang penting bagi industri, terutama dalam industri fermentasi seperti untuk pembuatan sake, kecap, miso, dan produksi enzim. Aplikasi metodologi rekombinan DNA pada A. oryzae bisa meningkatkan perkembangan analisis genetik molecular dan potensial sebagai host untuk memproduksi protein heterologous. Produksi protein heterologous bergantung pada penggunaan host yang ideal yang tidak mengandung protease dan mempunyai karakteristik morfologi/metabolisme yang bisa bertahan melalui berbagai tahap transformasi. Oleh sebab itu perlu dibuat sistem transformasi dengan berbagai macam marker, sehingga bisa dibentuk host yang ideal. Gen mutan adeA dan adeB dari adenine auxotrophic mutant A. oryzae bisa mengkomplemen mutan adenine auxotrophic. Gen adeA dan gen adeB sendiri homolog dengan gen ADE1 dan gen ADE2 pada ragi. Oleh sebab itu dikembangkan suatu sistem host-vector dengan tiga (triple) adenine auxotrophic pada A. oryzae, sehingga bisa diperoleh metode screening dari transforman host yang lebih mudah.

b. Strain dan Media Strain yang digunakan adalah sbb: 1. A. oryzae RIB40 dan NS4 untuk mengamplifikasi gen adeA dan adeB dan menscreening mutan adenine auxotroph. Media yang digunakan adalah sbb: 1. Medium DPY: 2% dekstrin, 1% polipepton, 0.5% ekstrak ragi, 0.5% KH 2PO4, 0.05% MgSO4.7H2O

2Feng

Abdul Haleem Shah, Abdul Hameed and Gul Majid Khan Jie Jin, Jun-Ichi Maruyama, Praveen Rao Juvvadi, Manabu Arioka, dan Katsuhiko Kitamoto

2. Medium M: 0.2% NH4Cl, 0.1% (NH4)2SO4, 0.05% KCl, 0.05% NaCl, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4.7H2O, 0.002% FeSO4.7H2O, 2% glukosa yang disuplementasi dengan 0.15% metionin dan 0.01% adenine

c. Adenine auxotroph mutant Adenine auxotroph mutan yang mempunyai gen mutan adeA dan adeB mengkode enzim (fosforibosilaminoimidazolesuccinokarboksiamida sintase; EC6.3.2.6 dan fosforibosilaminoimidazol karboksilase; EC4.1.1.21) pada jalur biosintesis purin yang membentuk koloni berwarna merah. Warna merah disebabkan oleh polimerisasi dan oksidasi pada intermediate yang terakumulasi, yaitu 4-aminoimidazol ribotida yang menyebabkan penghambatan pada jalur biosintesis adenine. Sehingga screening koloni berdasarkan warna bisa dieksploitasi. Prekursor ini terakumulasi di dalam vakuola yang bisa menyala bila dieksitasi dengan sinar UV sehingga bisa diamati dengan mikroskop fluoresens.

Gambar 1. Jalur Biosintesis Adenin


2

c. Kloning gen adeA dan adeB Didesain primer, adeA-Forward (5-CCGTCATGTCCAGGAAGATAGGTCAG-3) dan adeA-Reverse (5-CTGCCAACAGCATACGAGTCCACAG-3) untuk gen adeA dan adeB-Forward (5-TGGGTATCGAATTGGGCTCTTG-3) dan adeB-Reverse (5CCGGTAACTTGTAATCATGGGTTG-3) untuk gen adeB. Fragmen adeA dan adeB

diamplifikasi dengan Pfx polymerase dan ditambahkan pada ujungnya dengan dATP pada ujung 3 dengan Ex Taq DNA polymerase. Selanjutnya difasilitasi cloning ke pT7Blue(R) sehingga dihasilkan generasi pAdeA dan pAdeB.

e. Teknik Mutasi Konidia yang diisolasi dari kultur A. oryzae NS4 ditumbuhkan pada medium agar DPY yang disuspensi dengan 10 ml 0.01% larutan Tween 80. Suspensi konidial kemudian difilter dengan Miracloth, dicuci dua kali dengan larutan Tween 80 dan direndam dalam air distilata. Suspensi konidial sebanyak 2 ml yang mengandung 8x106 konidia dipindahkan ke cawan petri steril dan diaduk secara perlahan dengana menggunakan pengaduk magnetik sambil diiradiasi dengan lampu UV 15 W selama 6 menit.

f. Teknik Seleksi Mutan Setelah diinkubasi selama 1 jam dalam gelap, konidia yang sudah terkena iradiasi sinar UV kemudia disebar di atas medium agar DPY yang mengandung 0.25% Triton X-100 sehingga bisa didapat koloni yang kompak (400 koloni per cawan). Sebanyak 21.6% bisa bertahan, dan dari 43.163 koloni yang terbentuk, koloni yang berwarna merah diseleksi dan auxotroph adeninnya diseleksi pada medium M yang disuplemen dengan 0.15% metionin dalam keberadaan atau absennya 0.01% adenine. Galur adenine auxotrophic mutan lalu ditumbuhkan pada medium agar DPY pada 30oC selama 3 hari. Selanjutnya dilakukan observasi mikroskopis vakuola dan miselia dengan menggunakan mikroskop fluoresen.
3

g. Eksperimen Transforman Transformasi pada A. oryzae dilakukan berdasarkan yang didekripsikan oleh van den Hondel dengan modifikasi. Protoplas disiapkan dari kultur miselia yang berumur satu hari dengan pemberian Yatalase selama 3 jam pada 30oC.

h. Hasil dan Pembahasan

Gambar 2. Screening dan pertumbuhan adenine auxotroph mutan. (A) panah mengindikasikan koloni merah diantara koloni lainnya pada medium agar DPY. (B) Pertumbuhan adenine auxotroph mutan dan fenotipenya yang direstorasi.

Setelah diinkubasi selama 3 hari pada medium agar DPY ditemukan 19 koloni (NSR1-NSR19) yang berwarna merah (Gambar 2). Selanjutnya diperiksa 12 galur untuk menguji adenine auxotroph. Mutan adenine auxotroph tidak bisa tumbuh pada media yang tidak mengandung adenine, dan minimal media yang mengandung sedikit adenine bisa menumbuhkan selnya kembali. Pada mutan flurosens warna hijau bisa terlihat setelah dieksitasi oleh UV, sedangkan pada wild-type tidak terdeteksi.
4

Ditemukan bahwa mutasi adeB (3.0 kb) terjadi lebih sering daripada mutasi adeA (2.0 kb) mungkin disebabkan oleh ukuran adeB yang lebih besar. Hasil sekuens menunjukkan bahwa gen adeA dan adeB pada A. oryzae merupakan homolog dengan gen ADE1 dan ADE2 pada ragi sehingga bisa diperkirakan bahwa ada kesamaan jalur biosintesis purin pada ragi dan kapang. Selanjutnya dilakukan analisis transformasi dengan mengintroduksi plasmid yang mengandung gen adeA (pAdeA) atau adeB (pAdeB) pada mutan. Adenin auxotroph mutan bisa direstorasi dengan gen adeA atau adeB dan warna koloni berubah dari merah menjadi putih kembali (Gambar 2). Galur dengan transformasi yang paling tinggi, fragmen DNAnya diklon dan disekuens. Pada gen adeA (NSR13) mutasi terjadi karena adanya delesi pada basa ketiga (T) pada kodon valin 226. Pada gen adeB (NSR1) terjadi transversi (GT) mensubstitusi valin 406 dengan fenilalanin. Penelitian ini mengindikasikan bahwa seleksi koloni berdasarkan warna merah efektif untuk menseleksi adenine auxotroph mutan pada A. oryzae. Penggunaan seleksi berdasarkan warna bisa mempunyai kelebihan daripada teknik seleksi transforman yang lainnya.