LAPORANPRAKTIKUM REKAYASAGENETIKA

LAPORANVI
(BIOINFORMATIKA)

KHAIRULANAM P051090031/BTK
BIOTEKNOLOGI SEKOLAHPASCASARJANA INSTITUTPERTANIANBOGOR 2010
0

BIOINFORMATIKA
TUJUAN Tujuanpraktikuminiadalahuntuk: 1. Menentukan jenis fragmen DNA atau gen berdasarkan uruturutan nukleotida hasil sekuensing. 2. Membuat analisis situs restriksi, kesamaan, kemiripan dan filogenetik berdasarkan urut urutannukleotida. 3. MenentukanORFdanCDS(codingsequence)suatufragmenDNA. 4. Membuatdeduksiasamaminodanmembuatanalisiskesamaan,kemiripandanfilogenetik treeberdasakanpadadeduksiasamamino. 5. Menentukandomaindeduksiasamaminodanmenginterpretasikanperanmetabolismenya. 6. Menentukanjenisprotein/enzimberdasarkanpadanilaihidrofobisitasnya. TINJAUANPUSTAKA Bioinformatika,sesuaidenganasalkatanyayaitu"bio"dan"informatika",adalahgabungan antara ilmu biologi dan ilmu teknik informasi (TI). Pada umumnya, Bioinformatika didefenisikan sebagai aplikasi dari alat komputasi dan analisa untuk menangkap dan menginterpretasikan data data biologi. Ilmu ini merupakan ilmu baru yang yang merangkup berbagai disiplin ilmu termasuk ilmu komputer, matematika dan fisika, biologi, dan ilmu kedokteran, dimana kesemuanya saling menunjangdansalingbermanfaatsatusamalainnya.Ilmubioinformatikalahiratasinsiatifparaahli ilmukomputerberdasarkanartificialintelligence.Merekaberpikirbahwasemuagejalayangadadi alaminibisadibuatsecaraartificialmelaluisimulasidarigejalagejalatersebut.Untukmewujudkan hal ini diperlukan datadata yang yang menjadi kunci penentu tindaktanduk gejala alam tersebut, yaitugenyangmeliputiDNAatauRNA.Bioinformatikainipentinguntukmanajemendatadatadari dunia biologi dan kedokteran modern. Perangkat utama Bioinformatika adalah program software dandidukungolehkesediaaninternet(Utama,2002). Bioinformatika adalah organisasi dan analisis komplek data yang dihasilkan dari analisa molekuler dan teknik biokimia. Disamping itu bioinformatika merupakan teknologi untuk koleksi, peyimpanananalisis,interprestasi,pelepasandanaplikasiuntukinformasibiologi.Analisidilakukan dengan cara membandingkan data yang masuk dengan ribuan data lain yang tersedia di dalam pangkalandata(Nuswantara,2000). Seiring dengan perkembangan bioinformatika yang amat pesat, informasiinformasi baru dalambidanginiterusbermunculan.PangkalandataurutanDNA,RNAdanproteinsangatberperan untuk mendukung berbagai kegiatan penelitian bioteknologi termasuk menggali berbagai potensi biologisditengahberanekaragamnyaorganisme(Nuswantara,2000). SecararutinparapenelitimengirimkanurutanurutanDNA,RNAatauasamaminokepadabankdata dan diolah menurut kebutuhan. Hasil yang diperoleh umumnya berupa analisis kesamaan dan 1

 beberapa jenis statistik dari urutan basanya yang dilakukan secara cepat oleh komputer dengan membandingkandatayangdiinputdengandatayangdisimpanolehbankdata(Nuswantara,2000). Pada suatu proyek penelitian biology molekuler khususnya yang berkaitan dengan analisis urutan DNA,RNAatauasamamino,esensikeberadaanbankdataDNAsangatbesarsehinggakeberhasilan eksperiman sangat bergantung pada tersedianya pangkalanpangkalan data ini. Tanpa pangkalan dataurutanurutanDNAtidakdapatdisimpulkan(Lewitter,1987). Selain analisa kesamaan, bank data biasanya menyediakan pula fasilitas perangkat lunak yang dapat mengolah DNA, RNA atau protein menjadi bentuk dua dimensi hingga struktur tiga dimensiyangdapatdiputardandilihatdariberbagaisudut(Lewitter,1987). Analisis keragaman untuk asam nukleat dan protein dalam bentuk dendogram merupakan salahsatufasilitaslaindaribankdata.Perangkatanalisislainnyaadalahuntukpembuatanharrplot, peta restriksi, analisis hidrofobisitas suatu protein dan masih banyak fasilitas lain yang dapat mempermudahkerjaseorangpeneliti(Nuswantara,2000). Sekuensebagiandigunakanuntukmenemukanpotensihomologyangakandigunakanuntuk menduga fungsi dari query sekuen yang merupakan target sekuen yang dibutuhkan untuk menganalisisatauuntukmembantudalampermodelanpadastruktur3dimensi(RashidiandLukas, 2000). Setelahinformasiterkumpuldalamdatabase,langkahberikutnyaadalahmenganalisadata. Pencarian database umumnya berdasar hasil alignment/pensejajaran sekuen, baik sekuen DNA maupun protein. Metode ini digunakan berdasar kenyataan bahwa sekuen DNA/protein bisa berbedasedikittetapimemilikifungsiyangsama.Misalnyaproteinhemoglobindarimanusiahanya sedikit berbeda dengan yang berasal dari ikan paus. Kegunaan dari pencarian ini adalah ketika mendapatkan suatu sekuen DNA/protein yang belum diketahui fungsinya maka dengan membandingkannya dengan yang ada dalam database bisa diperkirakan fungsi daripadanya. Algoritma untuk pattern recognition seperti Neural Network, Genetic Algorithm dll telah dipakai dengan sukses untuk pencarian database ini. Salah satu perangkat lunak pencari database yang paling berhasil dan bisa dikatakan menjadi standar sekarang adalah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Perangkat lunak ini telah diadaptasi untuk melakukan alignment terhadap berbagai sekuen seperti DNA (blastn), protein (blastp), dsb. Barubaru versi yang fleksibel untuk dapat beradaptasi dengan database yang lebih variatif telah dikembangkan dan disebut Gapped BLAST serta PSI (Position Specific Iterated)BLAST. Sementara itu perangkat lunak yang digunakan untuk melakukanalignmentterhadapsekuenterbatasdiantaranyayanglazimdigunakanadalahCLUSTAL danCLUSTALW(Witarto,2002).

 BAHANDANMETODEKERJA Bahan UruturutanDNAhasilsekuens,dataurutanDNAdanproteindiGenBank,perangkatlunakdi GenBankdanbeberapawebsite,BioEditversi7.0.0danTreecon. Metode PenyiapanDataFormatFastA 1. NotepaddibukamelaluiStart AllProgram Accessories Notepad 2. DataurutanDNAhasilsekuensingdipindahkankeprogramNotepadtersebutdengancara mengkopidanpaste. 3. DatadiaturdalamformatfastAsebagaiberikut: >namaurutanDNA ATGC...dst(urutanhasilsekuensingDNA)

4. Filedisimpandandiberinama. PenyejajaranDNAdengandataDNAdiGenBank 1. Ketik http://www.ebi.ac.uk untuk untuk website website GenBank GenBank UniEropa Amerika (EMBL), Serikat,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

http://www.ddbj.nig.ac.jpuntukwebsiteGenBankJepang(DDBJ). 2. PadawebsiteEMBL,dikliktools kliksimilarityandhomology klikBlast2NCBI 3. PadaopsiDATABASEdiubahdariproteinmenjadinucleicacid. 4. Urutan DNA hasil sekuensing dimasukkan ke form dalam program tersebut dengan cara memblokdatasekuens(dalamformatfastA)dandicopypastepadaformyangtersedia,atau denganmenguploadfilesekuensDNA(dalamnotepadfile)denganmengklikchoose. 5. Setelahdataberhasildiupload,klikRUNBlastdanditungguhasilnya. 6. HasilmenunjukkankesejajaranDNAhasilsekuenskitadenganjenisataugenpadaGenBank. 7. Identitas hasil kesejajaran dicatat sebagai kata kunci (keyword) pada tahap analisis kekerabatanurutanDNAmaupunpembuatanpohonfilogenetik. AnalisisKekerabatanUrutanDNAdanPembuatanPohonFilogenetik 1. Ketikhttp://www.ebi.ac.uk/srsenter. 2. Kliklibrarypagedanpadawindowlibrarypageinidipilihdatabaseyangdiperlukan,contoh EMBL(codingsequence)ditandai()padamenunucleotidasequence 3. KlikQueryFormdantunggu. 3

 4. Pada kolom yang disediakan dimasukkan kata kunci hasil blast dan kata kunci lain seperti namatingkatantaksonomiyangakandibandingkandenganhasilsekuenskita.Kliksearch. 5. DitampilkandataurutanurutanDNAsesuaidengankatakunciyangkitamasukkan.Jumlah tampilanyangsesuaidengansekuensDNAkitaditunjukkandenganangkayangterlihatpada bagian atas hasil. Jumlah tampilan yang dapat dilihat dalam satu tampilan dapat dirubah denganmengubahjumlahangkashowpadaDisplayOption 6. Dipilihbeberapaaksesisesuaidengantujuananalisis.PadaDNAyangdipilihditandaidengan (). 7. Untuk menampilkan format FastA pada hasil, pada opsi Display Option diganti dari EMBLCDSSeqSimpleViewmenjadiFastaSeqskemudianklikApplyDisplayOption. 8. Semuaaksesiyangmunculdiblock,dicopidandipastedibawahurutanDNAkita. 9. Format fastA DNA kita dan sekuenssekuens DNA yang berkerabat dengannya diatur agar rapi,komunikatifdandapatdibacaolehprogramfilogenetiktree. PembuatanPohonFilogenetikdenganMAFFTversion6.0 1. Diketikwebsite:http://align.bmr.kyushuu.ac.jp/mafft/online/server/ 2. DataaksesiurutanDNAkitadankerabatnyadimasukkankedalamformyangtersediadalam formatfasta. 3. Dikliksubmitdanditunggu. 4. Diklikphylogenetictree 5. DiklikGO 6. Ditandai()padaNJ conservedsites(61nuc) 7. Diklik()ONpadaBootstrapdandiklikGO 8. FilogeneticTreetampiljikapadaPCataulaptoptelahdiinstaljava. AnalisisUrutanDNAdanEnzimRestriksiyangberperan 1. Diketikwebsite:http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php 2. DimasukkandatahasilsekuensDNAkitadengannamanya. 3. Dikliksubmitdanditunggu. 4. Ditampilkan peta situs enzim restriksi yang dapat digunakan untuk memotong urutan DNA kita. AnalisisDeduksiProteindariurutanDNA 1. Diketikwebsite:http://www.expasy.org/tools/ 4

 2. PadaopsiDNA ProteindiklikTranslate 3. Urutan DNA dalam format fastA dimasukkan ke dalam form dengan cara copi dan paste atauupload. 4. DiklikTranslate 5. Dimasukkan urutan DNA hasil sekuens kita (tanpa nomor dan nama urutan DNA) dan klik TranslateSequence 6. Terdapat beberapa frame hasil translasi (urutan asam amino). Dipilih hasil translasi yang mempunyai kesejajaran yang tinggi dengan database protein, biasanya yang mempunyai urutanasamaminopanjangdiawalidenganMetdandiakhiridenganStop. 7. Dilakukananalisiskekerabatandanpembuatanpohonfilogenetikpadaurutanasamamino sepertipadaasamnukleat. AnalisisDomainProteinpadaProgramProsite 1. Diketikwebsite:http://www.expasy.org/tools/ 2. DiklikPROSITEpadabagianataswebsite. 3. DimasukkanurutanasamaminoyangdiperolehdarihasiltranslateurutansekuensDNAkita dengancaracopidanpastekeformyangtersedia,dimulaidariMetdandiakhiridengan Stop. 4. Unklik()Excludesehinggatanda()hilang. 5. DiklikScandanditungguhasilnya. 6. Diperolehhasilyangsiapuntukdianalisis. AnalisisHidrofobisitasProteinMenggunakanMetodeKyteDoolittle 1. Diketikwebsite:http://gcat.davidson.edu/rakarnik/KD.html(KyteDoolittleHomepage) 2. DiklikperformaKyteDoolittleforhydropathyplotonyoursequence. 3. Dimasukkanurutanasamaminoyangkitamilikikedalamformyangtelahdisediakan. 4. DiklikSubmitdanditungguhasilnya. 5. Diperolehhasilyangsiapuntukdianalisis.

 HASILDANPEMBAHASAN Hasil Dari hasil praktikum yang telah diacarkan maka kami diberikan tugas untuk mencari salah satujenissekuendanmembuatprimernya.Berdasarkanhaltersebutdiatasmakapadalaporanini saya menggunakan sekuen dari enzim hydrogenase yang diambil dari Eschercia coli sejumlah 1740 bp dan membandingkannya dengan 3 jenis enzim hydrogenase pada E. coli dengan strain yang berbedayangdatasekuennyaterdapatdibankdatadenganmaksuduntuktujuantersebutdiatas. Dengan memasukkan kata kunci hydrogenase pada http://www.ebi.ac.uk maka akan didapatkan14.435sekuenyangberkenaandenganhydrogenase.Kemudiandipilihsalahsatuuntuk diakses sekuensnya. Pada praktikum ini dipilih M28369: E. coli. sebagai unknown sequence, tampilanhttp://www.ebi.ac.ukdapatdilihatpadagambar1. >ENA|M28369|M28369 Escherichia coli hydHG operon regulating labile hydrogenase activity. : Location:1..1000 ggtaagtcaggatgcaaacagccgggagatccagttacgctttaccgccaacgacacatt accggaaattcaggccgacccggacaggctgactcaggtcgtgttgaatctctatctcaa tgctattcaggcgattggtcagcatggcgtgattagcgtgacggccacgaaagccggcgg ggtaaaaatcagcgttaccgacagcggtaagggaattgcggcagatcagcttgatgccat cttcactccgtacttcaccactaaagccgaaggcaccggattggggctggcggtcgtgca taatattgttgaacaacacggtggtacaattcaggtcgcaagccaggagggaaaaggctc aacgttcaccctctggcttccggtcaatattacgcgtaaggacccacaaggatgacgcac gataatatcgatattctggtggtggatgatgacattagccactgcactattttgcaggct ttactgcgcggctggggctataacgtcgcgctggcgaacagcgggcgacaggcgttggag caggtgcgggaacaggtttttgatcttgtgctttgcgatgtgcgaatggcggagatggac ggcatcgccacgctgaaagagatcaaagcgttaaacccggcaattccggtgctgattatg actgcgtactccagcgtcgagacggcggtagaggcactgaaaactggggcgctggattat ctcatcaagccgctggatttcgataacctacaggcgacgtggaaaaagcgctcgcatacg cacagtattgatgctgaaacacctgcggtgactgccagccagttcggtatggtcggtaaa agcccggcgatgcaacacctgctcagtgaaatcgccctcgtcgcgccatgcgaagccacg gtactgatccacggcgattcggcacgtaaagagctggtcgccaggggacttcacgccagt agcgcacgtagcgaaaaaccgctggtaacgctcaactgtg Gambar1.SekuensdaridipilihM28369sebagaiunknownsequenceyangakandibandingkan Kemudiansekueninidikopidarihttp://www.ebi.ac.ukkenotepad.Laludicarisekuenlainnya dengan memanfaatkan NCBI blast. Dari situs tersebut diperoleh kodekode sekuen yang memiliki kemiripandenganM28369yangjugaberasaldariE.coli.Makadipilihlahtigakodeyangsamasama berasaldariE.coli. 6

 Darikodekodetersebut,dimasukkankedalamsistempencaridihttp://www.ebi.ac.ukmaka diperoleh sekuensekuen yang dibutuhkan. Sekuensekuen tersebut dikopi lalu dipasta di notepad. Dengan program bioedit maka diperoleh bahwa data tersebut tidaklah conserve terhadap sesamanya.Olehkarenaituperludilakukandesainprimerdenganmemperhatikanhalhalberikut: Tmnya %GClebihbaikkalosekitar50%,karenakalauterlalubanyakATmakaTmakanturun/rendah Dimer,antaraprimerFdanRtidakbolehkomplemen,bisasalingmenempel,sehingga primertidak efektif.Selainitu,didalamprimernyasendiritidakbolehadadimer Komplemenantarprimerdanintraprimer Apabila dipilih sekuen berikut sebagai primer Forward yaitu GCWATTSCGGTGCTGAYTAT, sekuen yang berasal dari daerah bp 600an, maka dari sekuen tersebut akan dihasilkan mRNA.sedangkan untuk sekuen reversenya merupakan komplemen dari mRNA, sehingga dibuat komplemennya agar diperoleh sekuen sebagai mRNA. Maka urutanya dari urutan (daerah bp 800 an) TTTCACTGAGCAGGTGTTGC diperoleh primer reversenya adalah AAWGTGACTSGTCCACWACG. Primerprimer ini didesain karena daerah dalam gen antara organism yang satu dengan yang lain tidakconserve. Pembahasan Maka untuk mengisolasi gen hydrogenase dari E. Oli dapat digunakan primer sebagai berikut, dimana primer F adalah GCWATTSCGGTGCTGAYTAT dan primer R adalah AAWGTGACTSGTCCACWACG.Apabiladianalisa%GCnyamakaakandiperolehTm=2(A+T)+4(G+C) =2(4+7)+4(5+4)=22+36=58sedangkanuntukreversenyadiperolehTm=2(7+3)+4(4+6)=20 +40=60.Makadiperolehsuhuannealingdariprimerprimertersebutadalahantara5860C. Ketika akan melakukan isolasi gen hydrogenase yang berasal dari E. coli, maka bahan dan kondisi PCR nya dapat dilakukan sebagai berikut: Komposisi PCR terdiri dari 1 ul dNTP, 0,5 ul taq polymerase, 1 ul buffer mix, 0,4 ul DMSO, 1,5 ul cDNA, 0,5 ul primer hyd F GCWATTSCGGTGCTGAYTAT, 0,5 ul primer hyd R AAWGTGACTSGTCCACWACG dan ddH2O hingga volume10ul.PCRdilakukanpadakondisiPraPCR(predenaturasi)padasuhu94oCselama5menit, denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing (penempelan) pada suhu 58oC selama 30 detik,pemanjangan72oCselama1menit,pascaPCR72oCselama5menit,pendinginanpadasuhu 15oCselama15menit.Semuaprosesdiatasdilakukansebanyak30siklus. 7

 SIMPULAN 1. Denganmemahamibagaimanamendesainprimermakadapatdiketahuibagaimanacara untukmengisolasisebuahgendarisuatuorganismeyangsekuennyabelumkitaketahui denganmemanfaatkanbankdatayangsudahadadiinternet. 2. Setelah mengetahui primer yang dibutuhkan, maka dicari pula suhu annealing yang tepatuntukprosespenempelanprimerpadagentarget. 3. Untuk sekuen yang informasinya masih kurang pada suatu organism, maka untuk mengisolasinyaperlumenggunakanprimeryangtidakterlaluspesifik. DAFTARACUAN LewitterF11987OnlineuseoftheGenBankGenetikSeguenceDataBank.DevelopmentinIndustrial Microbiology.Vol.27JournalofIndustrialMicrobiologySuppl.No.1

NuswantaraS.2000.Internetuntukbiologimolekuler.WartaBiotekVol.14No2Juni2000.

Rashidi, H.H. & L.K. Buehler. 2000. Bioinformatics Basics. Applications in Biological Science and Medicine.CRCPress.London.pp173.

Utama,A.2003.PeranBioinformatikadalamDuniaKedokteran.IlmuKomputer.Jakarta.

Witarto, AB. 2003. Bioinformatika Mengawinkan Teknologi Informasi dengan Bioteknologi. Ilmu Komputer,Jakarta.

 LAMPIRAN

10

11

12

13

14

15