7

spektrometri massa, PCR (Polymerase Chain Reaction), pengklonan, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metodemetode karakterisasi lebih lanjut (Wilson&Walker 2000). Prinsip teknik elektroforesis gel agarosa adalah molekul DNA yang bermuatan negatif di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya (Wilson&Walker 2000). Pemisahan DNA atau RNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Agarosa berasal dari ekstrak rumput laut yang dimurnikan berupa polimer linier yang mengandung residu D- dan L- galaktosa yang digabung dengan ikatan (1 3) dan (1 4) glikosidik. Residu L-galaktosa mempunyai jembatan anhidro antara posisi ketiga dan keenam. Rantai agarosa membentuk serat-serat helik yang bergabung menjadi struktur superkoil dengan jari-jari 2030 nm (Sambrook et al. 1989). Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam elektroforesis bervariasi antara 0.7%-1.5%. Konsentrasi gel 0.8%-1% sangat baik untuk memisahkan fragmen DNA atau RNA. Konsentrasi gel kurang dari 0.5% dapat meningkatkan daya pisah elektroforesis namun sangat rapuh dan sulit ditangani. Contoh sampel yang terdapat pada Gambar 1. Ethidium bromida dapat ditambahkan ke dalam suspensi DNA atau RNA untuk tujuan visualisasi hasil elektroforesis (Sambrook et al. 1989). Ethidium Bromida (EtBr) adalah molekul planar siklik yang berikatan antara pasangan basa RNA yang tertumpuk. EtBr mengikat RNA dengan sedikit atau tidak pada sekuens pilihan. Pada kejenuhan larutan berkekuatan ionik tinggi, kira-kira satu molekul ethidium disisipkan per 2.5 bp. Setelah penyisipan ke dalam heliks, pewarna terletak tegak lurus ke sumbu helikal dan membuat kontak van der waals dengan pasangan basa di atas dan di bawah (Sambrook et al. 1989). Ethidium bromida dapat digunakan untuk mendeteksi asam nukleat baik yang berikatan tunggal maupun ganda. Bufer yang dapat digunakan untuk elektroforesis adalah bufer Tris-Asetat EDTA (TAE). Jenis bufer lainnya yang dapat digunakan yaitu; TBE (Tris-Borat EDTA)

dan TPE (Tris-Fosfat EDTA). Bufer elektroforesis biasanya dibuat sebagai larutan berkonsentrasi dan disimpan pada suhu ruang. Tris-Acetate EDTA (TAE) memiliki kapasitas bufer paling rendah dari bufer elektroforesis lainnya dan akan menjadi habis jika elektroforesis dilakukan untuk periode waktu yang diperpanjang(Sambrook et al. 1989). Sampel sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel dihomogenisasi dengan gel-loading buffer. Gel-loading buffer dicampur dengan sampel sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel. Bufer ini memiliki tiga tujuan yaitu; untuk meningkatkan densitas sampel supaya memastikan bahwa RNA tenggelam ke dalam sumur gel, menambahkan warna pada sampel dengan demikian menyederhanakan proses pemasukkan, dan menahan pencelup (EtBr) dalam medan listrik sehingga bergerak ke arah anoda pada tingkat yang telah ditentukan (Sambrook et al. 1989).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri termofilik Geobacillus sp20k dari sumber air panas di Pegunungan Kerinci, vektor plasmid, enzim ligase, enzim lisozim, enzim restriksi, bufer restriksi, etanol absolut, etanol 75%, gel agarosa, bufer TAE 1X, EtBr, media heterotrof cair, es, kalsium klorida dan akuades. Alat-alat yang digunakan antara lain High Pure PCR Template Preparation Kit, alat-alat gelas, sudip, spatula, jarum ose, mikropipet, tip, autoklaf, inkubator, oven, neraca analitik, sentrifus Eppendorf 5415C dengan jari-jari rotor 4 cm, tabung Eppendorf, dan vorteks. Metode Produksi dan Peremajaan Bakteri Termofilik Pembuatan Media Tumbuh. Media heterotrof padat dibuat dengan komposisi 3.18 gram bacto peptone, 0.78 gram triptone, 1 gram NaCl, 0.5 gram K2HPO4, 3 gram agar, dan 0.02 gram selenium oksida. Campuran itu kemudian dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, ditambah akuades hingga tepat 200 mL kemudian diaduk dan dipanaskan sampai semua bahan larut. Larutan disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 15 atm dan suhu 121C selama 15 menit. Saat

larutan masih hangat, dituangkan ke cawan Petri yang telah steril. Proses penuangan tersebut dilakukan di ruang laminar. Setelah larutan memadat, media tersebut siap digunakan. Penumbuhan Bakteri. Pertama-tama isolat bakteri termofilik ditumbuhkan ke dalam media heterotrof padat lalu diinkubasi pada suhu 60 C selama 1 hari. Isolat yang tumbuh akan digunakan sesuai kebutuhan. Selanjutnya, dilakukan penyuburan isolat bakteri dengan memindahkan dua ose biakan dari biakan peremajaan ke media heterotrof cair dan diinkubasi selama 5 hari pada suhu 60 C. Pemanenan Bakteri. Setelah sel bakteri dalam medium cair tumbuh maka kultur sel bakteri termofilik diperoleh dengan metode sentrifugasi 8000 g selama 10 menit. Pelet dan supernatan yang didapat dipisahkan. Supernatan lalu dibuang, pelet diambil. Isolasi DNA Kromosom Geobacillus sp Isolasi DNA kromosom dilakukan dengan High Pure PCR Template Preparation Kit dari Roche secara in vitro (Lampiran 2). Pengamatan DNA dilakukan menggunakan elektroforesis gel agarosa dengan konsentrasi gel 1%. Pemotongan DNA Kromosom dan DNA Plasmid. Enzim restriksi yang dipergunakan adalah enzim EcoRI untuk memotong DNA plasmid dan DNA asing (Lampiran 3). Pemotongan DNA dengan enzim restriksi dilakukan dengan cara mencampurkan 7 L DNA dengan 2 L enzim restriksi, 2 L buffer restriksi lalu ditambahkan akuades steril hingga 20 L . Setelah DNA dicampur dengan enzim dalam larutan buffer,lalu campuran diinkubasi pada suhu 37 C. Setelah proses restriksi selesai perlu dilakukan inaktivasi enzim dengan pemanasan pada suhu 70 C. Hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi diamati dengan elektroforesis gel agarosa. Kloning Kandidat Gen Resistensi Selenium Ligasi DNA Kromosom ke Dalam DNA Vektor (pGEM3zf). Ligasi fragmen DNA asing sebanyak 4 L ke dalam 1 L vektor plasmid pGEM3zf dilakukan menggunakan 1 unit enzim T4 ligase sebanyak 1 L. Campuran diinkubasi pada suhu 15 C selama 24 jam. Hasil ligasi ini merupakan DNA

plasmid rekombinan yang siap untuk ditransformasikan ke dalam E coli (Lampiran 4) . Transformasi ke E.coli dengan DNA Rekombinan. Transformasi sel kompeten dilakukan dengan cara mencampurkan DNA plasmid yang telah diligasi dengan 100 L sel kompeten, lalu campuran diinkubasi di dalam es. Selanjutnya, campuran diberi kejut panas dengan cara diinkubasi pada suhu 42 C. Sel yang telah ditransformasi selanjutnya diinkubasikan dalam medium Luria Bertani(LB) pada suhu 37 C untuk memberi kesempatan bagi sel dalam mengekspresikan gen marka pada plasmid. Setelah itu, sel ditebarkan dalam medium selektif. Seleksi & Identifikasi Sel Rekombinan. Seleksi transforman dilakukan melalui pengamatan terhadap koloni yang terbentuk. Koloni yang terbentuk adalah sel E. coli yang berhasil ditransformasi. Koloni yang tidak berhasil ditransformasi akan berwarna biru akibat adanya penambahan IPTG-X gal dan mati akibat penambahan antibiotik. Dua jenis koloni kemungkinan terbentuk pada cawan Petri. Koloni yang berwarna putih menunjukkan sel yang mengandung plasmid yang berhasil disisipi gen resistensi selenium namun koloni yang berwarna biru mengandung plasmid yang tidak berhasil disisipi gen resistensi selenium. Setiap koloni putih yang terbentuk diberi nomor dan ditandai. Identifikasi sel rekombinan dilakukan dengan mengisolasi koloni yang berwarna putih dan ditumbuhkan kembali dalam media yang mengandung selenium. Koloni yang resisten terhadap selenium akan tumbuh menjadi koloni berwarna merah. Koloni yang berwarna merah diambil agar dapat diisolasi DNA plasmidnya kembali dengan metode lisis alkali (Lampiran 3) kemudian dilanjutkan dengan pengamatan pada gel elektroforesis agarosa.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Produksi dan Peremajaan Bakteri Termofilik Bakteri termofilik merupakan mikroorganisme prokariotik uniseluler yang hidup dalam sumber air panas di daerah Pegunungan Rinjani, Kerinci, dan Tana Toraja. Bakteri termofilik yang digunakan dalam penelitian ini adalah Geobacillus sp 20k. Bakteri ini hanya diketahui nama