Anda di halaman 1dari 3

Pengembangan ELISA Untuk Pemeriksaan Filariasis Dengan Menggunakan Ekstrak Mikrofilaria Sebagai Antigen

Hastini, Indah YP, Liliana Kumiawan Pusat Penelitian Pen yakit Menular, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan R.I., Jakarta

ABSTRAK Di Sulawesi Tenggara terdapat suatu daerah endemis filariasis Brugia malayl Sebagian penduduk pada daerah ini berasal dari daerah non endemis, yang selanjutnya tinggal di daerah endemis tersebut. Untuk tindakan selanjutnya terhadap penduduk tersebut dalam rangka deteksi antibodi terhadap filaria, telah dikembangkan suatu tes ELISA. Pada pengambangan tes ELISA dapat ditentukan bahwa hasil optimal didapat dengan menggunakan ekstrak mikrofilaria Brugia malayi sebagai antigen dengan konsentrasi 2 pg/ ml untuk kelas IgG dan 1 pg untuk kelas IgM, sedangkan konsentrasi sera 1:200 dan konsentrasi conjugate alkaline phosphatase anti human IgH dan IgM (MILES YEDA LTD) 1:1000. Tes ELISA tersebut di atas diterapkan pada 10 orang mikrofilaremik, 8 orang amikrofilaremik dan tindak lanjut pada 10 orang dengan masa tinggal 8, 13, 26 dan 39 bulan. Sebagai kelompok kelola diambil 17 orang dari daerah non endemik. Deteksi antibodi terhadap mikrofilaria Brugia malayi dengan cara tersebut di atas ternyata tidak menunjukkan perbedaan antara orang yang mikrofilaremik dan amikrofilaremik. Pada tindak lanjut terhadap 10 orang yang datang dari daerah non endemik antibodi terhadap mikrofilaria B. malayi kelas IgM ditemukan lebih awal (8 bulan) daripada kelas IgG (39 bulan). PENDAHULUAN ELISA merupakan cara pemeriksaan untuk mendeteksi adanya antibodi atau antigen dengan menggunakan suatu enzim dan substrat sebaga indikator. Teknik ELISA ini pertama kali dikembangkann oleh Engvall dan Perlmanl, ELISA merupakan tes yang sangat sensitif dan dapat digunakan di lapangan karena tidak memerlukan peralatan yang rumit. Dbngan digunakan enzim maka penggunaan zat radio aktif seperti pada cara R.I.A. (Radio Immuno Assay) dapat dihindarkan. Pada cara ELISA ini pengukuran dapat dilakukan

dengan menggunakan spektrofotometer, sedangkan reagens yang dipakai mempunyai shelf life yang panjang. ELISA menunjukkan sensitifitas yang sama dengan Radio Immuno Assay 2 . Aplikasi klinik dengan cara ELISA dapat digunakan untuk diagnosis serologi penyakit infeksi, misalnya penetapan antibodi terhadap mikoorganisme, virus, parasit, maupun untuk menunjang diagnosis penyakit non infeksi3. Sebagai contoh mendeteksi antibodi terhadap filariasis dengan menggunakan ekstrak Brugia malayi sebagai antigen. Filariasis merupakan penyakit yang disebabkan oleh cacing Brugia malayi, tersebar di berbagai daerah di Indonesia, antara lain di daerah Sulawesi Tenggara. Penularan penyakit ini terjadi melalui gigitan nyamuk yang mengandung larva infektif. Penyakit filaria merupakan penyakit menahun, yang dapat mengakibatkan kesakitan dan juga cacit tubuh4. Penduduk yang tinggal di darah endemis filariasis dapat dikelompokkan menjadi beberapa kelompok. Kelompok pertama adalah penduduk yang amikrofilaremik, yang dapat disertai dengan gejala klinis seperti: limphangitis, limfadenitis. Sebagian dari kelompok amikrofilaremik dapat tidak disertai dengan gejala klinis sama sekali. Kelompok yang kedua adalah penduduk yang mikrofilaremik yang sebagian dapat disertai dengan gejala, sedangkan sebagian lagi tidak disertai dengan gejala klinis. Disamping kedua kelompok tersebut terdapat kelompok penduduk yang menunjukkan gejala klinis elefantiasis, dimana dalam fase kronis ini biasanya amikrofilaremik4 . Di Sulawesi Tenggara terdapat suatu daerah endemis filariasis Brugia malayi. Sebagian penduduk pada daerah berasal dari daerah non endemis yang selanjutnya tinggal di daerah endemis tersebut. Pendatang yang tinggal di daerah endemis ini mengalami pemaparan dengan antigen Brugia malayi, oleh karena tu penduduk pada daerah tersebut akan membentuk antibodi terhadap antigen Brugia malayi. Maka telah dikembangkan tes ELISA untuk mendeteksi adanya antibodi terhadap filaria pada penduduk tersebut.

50 Cermin Dunia Kedokteran No. 48, 1988

BAHAN DAN CARA KERJA Antigen: Merupakan larutan ekstrak mikrofilaria Brugia malayi yang dibiakkan pada gerbil. Cacing mikrofilaria digerus dengan menggunakan tissue grinder, kemudian disonikasi selama 3 detik (3 kali). Mikrofilaria yang telah hancur disuspensikan dengan PBS pH 7,2; kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1(1.000 RPM selama 5 menit, dan supernatannya dikumpulkan. Setelah itu diukur kadar protein dari larutan ekstrak tadi dengan menggunakan Spektrofotometer dengan panjang gelombang 280. Sera: Untuk tes pendahuluan kontrol positif berasal dari seseorang yang mikrofilaremik. Contoh dikumpulkan dari 17 orang dari daerah non endemik sebagai kelola negatip, 10 penduduk asli yang mikrofilaremik dan 8 orang amikrofilaremik. Dikumpulkan sera dari 10 pendatang pada masa tinggal 8, 13, 26 dan 39 bulan. Kesepuluh pendatang ini sampai saat masa tinggal 39 bulan belum menunjukkan adanya mikrofilaremik. Konjugasi: Alkalin fosfat anti human IgG dan IgM Miles Yeda LTD, dengan konsentrasi 1 : 1000. Substrasi: Dipakai substrat p-nitrofenil.alkalin fosfat. Buffers Coating buffer pH 9,6 untuk dilusi antigen. Phosphate Buffered Saline-Tween (PBS-T), pH 7,4 untuk peneucian dan dilusi sera serta konjugasi 0,5% Bovine Serum Albumin' (BSA) dilarutkan dalam coating buffer digunakan untuk Blokade. Diethanolamine (DEA) pH 9,8 untuk melarutkan substrat p-nitrofenil alkalin fosfat, (1 tablet substrat dalam 5ccDEA). Prinsip tes ELISA untuk tes pendahuluan digunakan ekstrak mikrofilaria Brugia malayi sebaga antigen ditempelkan pada lempeng.Mikro Elisa dengan konsentrasi 8, 4, 2 dan 1 mg/ml masing-masing sebanyak 50 p di inkubasi selama 24 jam pada suhu 4C kemudian dilakukan pencucian 3 x 5 menit. Masukan pada masing-masing sumur 200 pl 0,5% Bovine serum albumin, diamkan 'selama 30 menit pada suhu 37C dan cuci 3 x 5 menit. Tambahkan sera yang telah diifncerkan dengan PBST dalam konsentrasi 1/50, 1/100, 1/200 dan 1/400 masing-masing sebanyak 50 pl, diinkubasikan se-lama 1 jam pada suhu 37C. Setelah itu dilakukan pencucian 3 x 5 menit. Tambahkan konjugasi alkalin fosfat anti human IgG dan IgM (produksi MILES YEDA LTD) dengan konsentrasi 1 : 100 masing-masing sebanyak 50 p1, inlcubasikan selama 1 jam pada suhu 37C dan cuci 3 x 5 menit. Terakhir dimasukkan 50 pl substrate dan diinkubasikan selam 30 menit. Hasil dibaca pada Elisa reader dengan menggunakan panjang gelombang 405 nm. HASIL DAN PEMBAHASAN Sabelum dilakukan tes terhadap pasien, perlu diadakan tps pendahuluan untuk menentukan dilusi sera dan konsentrasi antigen_ yang optimal. Seperti tampak pada Tabel 1, didapatkan basil bahwa untuk IgG dilusi sera yang optimal adalah 1/200 sedangkan konsentrasi antigen yang optimal 2 g. Untuk Ig M dilusi sera yang optimal adalah 1/200 k onsentrasi antigen yang optimal 1 pg, sbperti tampak pada Tabel 2. Setelah mendapatkan konsentrasi yang optimal baik untuk antigen maupun sera maka dilakukan tes terhadap

Tabel 1 : Hasil tes pendahuluan untuk lg G. Konsentrasi antigen 8 g 4 g 2 g 1 g Dilusi sera 1/50 0,906 0,692 0,565 0,315 1/100 0,728 0,506 0,454 0,238 1/200 0,490 0,407 0,335 0,192 1/400 0,389 0,281 0,265 0,182

Tabel 2 : Hasil tes pendahuluan untuk ig M. Konsentrasi antigen 8 g 4 g 2 g 1 g Dilusi sera 1/50 0,826 0,555 0,710 0,677 1/100 0,711 0,634 0,421 0,405 1/200 0,579 0,411 0,388 0,332 1/400 0,359 0,345 0,306 0,269

17 orang normal dari daerah non endemik. Hasil rata-rata antibodi spesifik untuk kelas Ig G adalah 0,103 dan untuk kelas IgM adalah 0,123. Hasil tes ELISA bagi penduduk ash yang mikrofilaremik untuk Ig G menunjukkan harga rata-rata 0,599 dan basil ratarata Ig M 0,639. Untuk penduduk asli yang amikrofilaremik basil rata-rata Ig G 0,480 dan basil rata-rata Ig M 0,727 (seperti tampak pada Tabel 3). Disini terlihat perbedaan yang bermakna antara penduduk asli dengan orang dari daerah non endemik. Dari basil perhitungan dengan tes T untuk 10 orang yang mikrofrlaremik dan 8 orang yang amikrofilaremik, untuk harga Ig G dan Ig M tidak tampak perbedaan yang nyata.
Tabel 3 : Hasil tes ELISA untuk 17 orang dari daerah non endemik dan 18 orang dari daerah endemik. Non endemik 17 orang 0,103 0,123 10 orang mikrofilaremik 0,599 0,639 Endemik 8 orang amikrofilaremik 0,480 0,727

antibodi Kelas Ig G Ig M

Pada tindak lanjut pendatang yang tinggal di daerah endemik, basil tes ELBA tampak pada Tabel 4. Untuk masa tinggal 8; 13; 26 dan 39 bulan harga rata-rata dari Ig G adalah 0,065; 0,049; 0,056 dan 0,445, sedangkan basil rata-rata dari Ig M adalah 0,312; 0,206; 0,196 dan 0,216. Dari basil ini tampak adanya respons antibodi terhadap filaria dan terlihat untuk Ig G ditemukan lebih lambat dibandingkan dengan Ig M.
Tabel 4 : Hasil tes ELISA untuk tindak lanjut terhadap 10 orang pen datang di daerah endemik pada masa tinggal 8; 13; 26 dan 39 bulan. Kelas antibodi Ig G IgM 8 bulan 10 org 0,065 0,312 13 bulan 10 org 0,049 0,206 26 bulan 10 org 0,056 0,196 39 bulan bulan 10 org 0,445 0,216

Seperti halnya semua reaksi antigen antibodi, reaksi

Cermin Dunia Kedokteran No. 48, 1988 51

pada cara ELISA juga harus berlangsung dalam keadaan optimal, baik konsentrasi reaktan, suhu, pH maupun wktu yang digunakan untuk inkubasi atau pencucian. Karena tehnik ELISA terdiri atas beberapa tahapan, maka untuk memperoleh hasil yang baik, setiap tahap harus dilakukan dengan seksama seperti pencucian harus sedemikian rupa sehingga reaktan yang tidak diperlukan tidak ikut serta dalam reaksi berikutnya. Juga perlu dilakukan blokade untuk menghindarkan terjadinya kesalahan positip dan contoh/sera lebih baik diencerkan dengan PBST untuk menghindarkan adanya absorbsi non spesifik yang menempel pada dinding lempeng. KESIMPULAN Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa untuk konsentrasi antigen dan dilusi sera yang optimal pada kelas IgM adalah 1 pg dengan dilusi sera 1/200; pada kelas IgG adalah 2 pg dengan dilusi sera 1/200. Pada pemeriksaan antibodi spesifik kelas IgM dan IgG dengan cara ELISA ternyata tidak ada perbedaan yang nyata antara penduduk yang mikrofilaremik dan amikrofilaremik. Pada pendatang di daerah endemik filariasis, terlihat adanya respons antibodi, balk kelas IgM maupun IgG, meskipun secara parasitologik belum menunjukkan mikrofilaremia. Antibodi

spesifik kelas Igm ditemukan pada masa tinggal 8 bulan, yaitu lebih awal dari ditemukannya antibodi di kelas IgG (39 bulan).

KEPUSTAKAAN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Engvall E, Perlmann P. Immunochemistry, 1971; 8 : 871. Engvall E, Perlmann P. J Immunol, 1972; 109 : 129. Voller A et all. Microplate Method of Enzyme Linked Immunosorbent Assay and Its Application to Malaria. Bull World Health Org, 1974; 51 : 209. Brown HW. Basic Clinical Prasitology, 236-248. 3-rd ed. copyright 1969 by Meredith corporation. Ottesen EA, Weller PF, Heck K. Specific Cellular Unrespinsiveness in Human Filariasis. Immunol, 1977; 33 : 413-421. Voller A. New Serologie Test for Malaria Antobodies. Br Med J, 1975; 1 : 659. Bartlett A, Bidwell DE, Voller A. Preliminary Studies on the Application of Enzyme Immunoassay in the Detection of Antibodies in Onchocerciasis. Tropenmedizin and Parasitologie, 1975; 26 : 370374. Bout D, Dugimont JC, Farag H, Capron A. Immunodiagnosis of Human Parasitic Diseases by the ELISA. Lille Medicale, 1975; 20 : 561-566. Voller A, Bidwell DE, Bartlett A. Enzyme Immunoassays in Diagnostic Medicine. Theory and Practice. Bulletin WHO, 1976; 53 : 55-65.

8. 9.

52 Cermin Dunia Kedokteran No. 48, 1988