Anda di halaman 1dari 12

Nama : Shofia Mujahidah NRP : G34100011 Hari/ tgl pengumpulan: Senin, 26 Maret 2012

Asisten: Ragil Pratiwi Siti Sulfiah

Isolasi dan Pemurnian Cendawan


Pendahuluan Media merupakan suatu substrat untuk menumbuhkan cendawan. Media yang umum di gunakan di laboratorium berupa media biakan padat yang dipadatkan oleh agar-agar. Berdasarkan bahan yang digunakan dalam pembuatan media, ada tiga macam media biakan, yaitu media alam, media semi sintetik, dan media sintetik. Media alam memiliki komposisi nutrisi yang berubah-ubah karena bergantung pada bahan bakunya seperti kentang, merang, serangga, dan lain sebagainya. Dalam media semi-sintetik, bahan alam yang digunakan dicampur zat kimia yang komposisinya diketahui dengan tepat. Beberapa contoh media semisintetik yaitu agar-agar dekstrosa kentang (ADK) yang dikenal pula sebagai potato dextrose agar (PDA). Agar-agar yang umum digunakan dalam pembuatan media ADK adalah agar-agar murni berupa tepung yang dijual dalam kemasan dengan merk dagang Bacto dan Oxoid. Sedangkan padda media sintetik, semua kandungan nutrisinya diketahui secara tepat misalnya agar-agar Czapek. Tetapi media yang paling umum digunakan untuk membiakan cendawan adalah media alam dan semi-sintetik. Media yang umum digunakan untuk membuat biakan murni adalah agar-agar dekstrosa kentang, agar-agar ekstrak khamir dekstrosa, agar-agar ekstra malt, dan agar-agar lengkap (Gunawan 2008). Dalam pembuatan biakian cendawan, media dan semua peralatan harus steril sebelum digunakan. Jika tidak steril maka seluruh media akan tercemar oleh kontaminan baik itu bakteri maupun cendawan yang tidak diingankan sehingga dapat menggangu dan mematikan cendawan yang akan dibiakkan. Ada beberapa macam metode sterilisasi bergantung pada bahan atau alat yang akan disterilkan, yaitu sterilisasi pemanasan kering, sterilisasi dengan pemanasan lembab, sterilisasi dengan bahan kimia, sterilisasi dengan penyaringan, dan sterilisasi dengan bahan kimia, dan sterilisasi dengan radiasi (Yuliarti 2010). Sterilisasi dengan pemanasan kering dilakukan dengan menggunakan oven. Metode sterilisasi ini umumnya digunakan untuk mensterilkan perangkat

kaca. Dalam keadaan kering (bebas air), struktur protein lebih stabil dan tidak mudah rusak sehingga untuk mematikan organisme membutuhkan suhu panas kering yang jauh lebih tinggi dan membutuhkan waktu yang lebih lama dibandingkan dengansterilisai pemanasan lembab. Pada suhu 1700 C dibutuhkan waktu 1 jam, suhu 1600 C membutuhkan 2 jam, 1500 C membutuhkan 2,5 jam, dan suhu 1400 C membutuhkan waktu 3 jam. Sterilisasi dengan panas lembab dilakukan dalam bejana logam yang dinamakan autoklaf. Sterilisasi ini dilakukan dengan uap air jenuh bertekanan 15 lb/in2 selama 15 menit pada suhu 1210 C. Suhu tersebut adalah suhu sterilisasi terbaik untuk bahan-bahan yang akan disimpan dalam waktu yang cukup lama. Tetapi suhu dan tekanan tersebut hanya dapat diaplikasikan pada daerah dipermukaan laut. Semakin tinggi tempatnya membutuhkan tekanan yang lebih tinggi pula agar dapat mencapai suhu 1210 C. Benda yang dapat disterilkan dengan menggunakan autoklaf hanya bahan yang tidak menolak air tanpa merusaknya. Contoh bahan yang dapat disterilkan dengan autoklaf adalah media biakan, larutan, kapas, sumbat karet, dan peralatan laboratorium. Sterilisasi dengan perlakuan kimia dapat diaplikasikan pada bahanbahan yang terurai pada suhu tinggi. Sterilisasi menggunakan bahan kimia yang bersifat racun antara lain etilan oksida, formaldehida, dan glutaraldehida alkalin. Waktu yang dibutuhkan berkisar antara 2-18 jam tergantung bahan kimia ynag digunakan. Sterilisasi dengan penyaringan diterapkan pada bahan yang tidak tahan panas seperti ekstrak tanaman, media sintetik tertentu, dan antibiotik. Dasar metode ini ialah proses mekanis yang membersihkan larutan atau suspensi dari organisme hidup dengan melewatkannya pada suatu saringan, misalnya saringan seitz. Yang terakhir adalah sterilisai dengan radiasi. Cara ini biasanya digunakan untuk mensterilkan bahan tertentu (misal tanah gambut yang membawa bakteri bintil akar) pada ruangan khusus dengan menggunakan sinar gamma (Gunawan 2008). Dalam pembuatan biakan cendawan tahap yang harus dilakukan setelah pembuatan media dan sterilisasi media adalah isolasi cendawan. Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi adalah memisahkan satu jenis mikroorganisme dengan mikroorganisme lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroorganisme. Hal

ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroorganisme akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo 1996). Ada bermacam-macam metode isolasi yang dapat digunakan. Macam-macam metode isolasi tersebut antara lain, isolasi tunggal, isolasi gores, isolasi tebar, dan isolasi tuang (Dwidjoseputro 2003). Setelah isolasi maka dilakukan pemurnian pada biakan dengan tujuan untuk memisahkan cendawan yang diinginkan dari mikroorganisme lain agar tidak saling bercampur baur. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Sofa 2011). Biakan murni suatu cendawan tidak dapat digunakan terus menerus sebagai bibit karena lama kelamaan karakteristik atau sifat-sifat biakan lamakelamaan akan berubah. Oleh karena itu penting untuk melakukan peremajaan biakan. Peremajaan dilakukan dengan memindahkan sekelumit agar-agar yang telah ditumbuhi miselium cendawan ke dalam media miring secara aseptik. Umumnya miselium akan mengalami perubahn setelah biakan murini diremajakan beberapa kali. Untuk itu dianjurkan supaya peremajaan tidak dilakukan lebih dari tujuh kali (Gunawan 2008). Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari dan memperaktekkan pembuatan media cendawan, metode sterilisasi, teknik isolasi, teknik pemurnian, hingga teknik peremajaan. Metode Pembuatan Medium Agar Sukrosa Kentang yang mengandung Antibiotik
Pada panci 1, kentang sebanyak 200 g direbus dalam air mendidih 500ml selama 20 menit. Disaring dan diambil ekstraknya. Panci 2 di isi oleh agaragar Bacto 20 g, sukrosa 20 g, dan air 500 ml. Kemudian didihkan dan diaduk hingga bening. Dibuat campuran panci 1 dan panci 2. Bila belum mencapai 1L tambahkan aquades hingga mencapai 1L.

Tabung dimasukkan ke dalam autoklav dengan suhu 1210C 15-20 menit.

Dituang ke dalam labu erlenmeyer dan diberi sumbat kapas.

Dicampurkan antibiotik kloramfenikol 500 mg.

Buka autoklav setelah suhu 700C Tabung dikeluarkan, sebagian diletakkan dalam tabung dalam keadaan miring 300 sisanya dituang ke dalam cawan secara aseptik.

Langkah Metode Isolasi Cendawan Pada Cabai

Kuliat cabai yang nampak busuk diambil sedikit 5 potong.

Kulit cabai direndam dalam larutan kloroks 5,25% selama 30 detik.

Diencerkan, kulit cabai direndam dalam air steril selama 30 detik.

Inkubasi selama satu pekan.

Taruh di dalam medium yang telah dibuat pada praktikum sebelumnya secara aseptik.

Metode Isolasi Jamur Tiram


Badan buah jamur disemprot dengan alkohol 70% lalu dikeringkan dengan tissue. Ambil sedikit miselium dibagian dalam yang tidak terpapar udara dengan pinset. Taruh di dalam medium yang telah dibuat pada praktikum sebelumnya secara aseptik.

Inkubasi selama satu pekan.

Langkah Metode Pemurnian


Ambil bagian miselium yang tumbuh. Bila ada kontaminan ambil bagian yang paling jauh dari kontaminan secara aseptik.

Pindahkan pada cawan yang baru.

Inkubasi selama satu pekan.

Lakukan hingga tinggal satu spesies cendawan dalam media.

Langkah Peremajaan Biakan


Ambil bagian miselium yang tumbuh. Bila ada kontaminan ambil bagian yang paling jauh dari kontaminan secara aseptik.

Pindahkan pada media miring secara aseptik. baru.

Hasil Jenis dan Gambar Pengamatan Pembuatan media cawan dan media miring. Keterangan Pembuatan media cawan tidak seluruhnya berhasil karena dari empat media yang dibuat, dua media terkena kontaminan. Pembuatan media cawan miring seluruhnya berhasil.

Gambar 1 Media miring

Gambar 2 Media cawan

Isolasi cendawan pada cabai dan isolasi jamur tiram.

Isolasi

cendawan

pada

cabai

terkena

kontaminan sedangkan isolasi jamur tiram berhasil

Gambar 3 Isolasi cendawan pada cabai

Gambar 4 Isolasi jamur tiram Pemurnian cendawan pada cabai dan jamur tiram Hasil pemurnian seluruhnya terkena kontaminan.

Gambar 5 Hasil pemurnian cendawan pada cabai

Gambar 6 Hasil pemurnian jamur tiram

Peremajaan biakan.

Peremajaan biakan menggunakan biakan murni yang telah disediakan karena biakan murni yang telah dibuat sebelumnya terkena kontaminan. Hasil peremajaan seluruhnya berhasil.

Gambar 7 Peremajaan biakan cendawan pada cabai

Gambar 8 Peremajaan biakan jamur tiram Pembahasan Media yang paling umum digunakan untuk menumbuhkan cendawan adalah media PDA (Potato Dextrose Agar). Pembuatannya cukup mudah, namun gula dektrose memiliki harga yang cukup mahal. Oleh karena itu agar biaya yang dikeluarkan lebih murah sumber karbon yang semula berasal dari gula dekstrosa disubstitusikan menjadi gula sukrosa atau biasa kita sebut gula pasir. Karena menggunakan sukrosa, media ini pun diberi nama agar sukrosa kentang atau

potato sukrose agar. Bahan-bahan yang dibutuhkan dan cara pembuatannya tidak jauh berbeda dari media PDA. Bahan yang dibutuhkan adalah kentang 200 g, sukrosa 20 g, agar- agar Bacto 20 g (agar-agar bisa digantikan oleh agar-agar warung tetapi dengan bobot yang berbeda), air aquades 1L, dan antibiotik kloramfenikol 500 mg. Cara pembuatannya pertama-tama kentang dikupas dan dicuci bersih. Kemudian kentang dipotog dadu lalu direbus dalam air aquades mendidih 500 ml selama 20 menit atau hingga kentangnya masak. Setelah masak, saring airnya dan ambil ekstraknya. Selanjutnya campurkan agar-agar Bacto 20 gr, sukrosa 20 gr, dan aquades 500 ml. Aduk rata lalu didihkan hingga warnanya menjadi bening. Campurkan ekstrak kentang dan campuran agar-sukrosa (jika volume tidak mencapai 1L tambahkan aquades hingga menjadi 1L). Campurkan dengan antibiotik kloramfenikol 500 mg. Tuang kedalam labu erlenmeyer yang telah tersedia dan beri sumbat kapas untuk kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Setelah disterilisasi media dapat dituang kedalam cawan untuk membuat media cawan atau tuangkan ke dalam tabung untuk kemudian dibuat menjadi media miring (Isroi 2009). Saat pembuatan media ditambahkan pula antibiotik. Menurut Indriati et al. (2010) penambahan bahan-bahan selektif seperti antibiotik pada media dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang tidak diinginkan. Jenis antibiotik yang ditambahkan dalam media adalah kloramfenikol. Kloramfenikol secara alami dihasilkan dari kultur Streptomyces venezuelae tapi sekarang dapat dibuat secara sintetik. Kloramfenikol bekerja dengan menghambat sintesis protein

mikroorganisme. Kloramfenikol menghambat ikatan asam amino baru pada rantai peptida yang memanjang, karena kloramfenikol menghambat enzim peptidil transferase (Hanifah 2011). Dalam keadaan kering, antibiotik ini stabil pada temperatur kamar. Dalam larutan, stabilitasnya masih lebih besar dari stabilitas larutan streptomisin atau larutan penisilin pada suhu yang sama (Sumardjo 2006). Antibiotik lain yang biasa digunakan selain kloramfenikol adalah penisilin dan streptomisisn (Ariyani 2006). Setelah peracikan media maka langkah yang harus dilakukan selanjutnya adalah sterilisasi. Sterilisasi yang dilakukan adalah metode sterilisasi panas lembab dengan menggunakan autoklaf. Menurut Gunawan (2009) prinsip kerja

atoklaf adalah sterilisasi dengan menggunakan uap jenuh pada suhu 1210 C selama 15 menit. Pada daerah diatas permukaan laut, untuk mencapai suhu tersebut membutuhkan tekanan 15 lb/nm2. Semakin tinggi daerahnya semakin tinggi pula tekanan yang dibutuhkan untuk mencapai suhu yang sama. Hasil dari praktek pembuatan media ASK yang telah dilakukan menunjukan tanda-tanda kontam pada dua media cawan dari empat media yang telah dibuat. Sedangkan pada media miring keempat-empatnya berhasil tidak terkena kontaminan. Untuk media yang terkena kontaminan, ada kemungkinan karena proses aseptik tidak sempurna, misalnya meja yang belum bersih, jarum inokulum yang tidak dipanaskan dengan sempurna, dan proses penuangan dari labu erlenmeyer ke cawan petri yang terlalu jauh dari sumber api. Prinsip dari isolasi mikroorganisme adalah memisahkan suatu jenis mikroorganisme dengan mikroorganisme lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikrorganisme. Hal ini dapat dilakukan dengan

menumbuhkannya dalam media padat, karena dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Media yang digunakan dalam isolasi ini harus sesuai dengan mikroorganisme yang akan kita ketahui populasinya (Sutedjo 1996). Isolasi cendawan dari bagian tanaman yang terserang dilakukan dengan cara mengambil sedikit bagian tanaman yang terinfeksi dan bagian yang sehat dengan ukuran kira-kira 0,5 cm x 0,5 cm. Hal ini dilakukan agar cendawan dapat tumbuh di bagian daun yang sehat dan ada agen penyebab penyakitnya. Bagian tanaman yang telah dipotong tersebut kemudian dibersihkan dengan alkohol 70% selama dua menit. Setelah itu teruh dalam media cawan secara aseptik sdan diinkubasi selama satu pekan. Setelah satu pekan akan muncul hifa cendawan yang berasal dari tanaman yang telah terinfeksi cendawan tersebut. Kemudian hifa tersebut diambil sedikit pada bagian ujungnya untuk kemudian dipindahkan pada media cewan yang baru. Keseluruhan proses dilakukan secara aseptik. Apabila setelah inkubasi terdapat koloni lain diluar daerah bagian tanaman terinfeksi atau hifa yang telah kita taruh, maka biakan tersebut telah terkena kontaminasi cendawan lain atau bakteri. Hasil isolasi cendawan dari tanaman cabai pada kedua media yang telah dibuat, keseluruhannya menunjukan adanya kontaminan. Sedangkan hasil isolasi

jamur tiram kedua-duanya berhasil dilakukan tanpa adanya kontaminan. Seperti yang telah terjadi pada pembuatan media sebelumnya, munculnya kontaminan diakibatkan proses aseptik yang tidak sempurna sehingga menyababkan munculnya kontaminan di dalam isolasi biakan yang telah dibuat. Pemurnian merupakan pemisahan suatu mikroorganisme dari

mikroorganisme lain sehingga didapatkan suatu populasi biakan yang terdiri dari spesies tunggal. Tujuannya untuk mendapatkan populasi murni yang hanya terdiri dari satu spesies saja (Sofa 2011). Hasil dari pemurnian isolasi cabai semuanya terkena kontaminan begitu pula dengan pemurnian dari isolasi jamur tiram. Hasil pemurnian isolasi jamur tiram terkena kontaminasi bakteri sehingga tampak berlendir. Kontaminasi terjadi karena proses aseptik yang tidak sempurna. Biakan murni suatu cendawan tidak dapat digunakan terus menerus sebagai bibit karena lama kelamaan karakteristik atau sifat-sifat biakan lamakelamaan akan berubah. Oleh karena itu penting untuk melakukan peremajaan biakan. Peremajaan dilakukan dengan memindahkan sekelumit agar-agar yang telah ditumbuhi miselium cendawan ke dalam media miring secara aseptik. Umumnya miselium akan mengalami perubahan setelah biakan murni diremajakan beberapa kali. Untuk itu dianjurkan supaya peremajaan tidak dilakukan lebih dari tujuh kali (Gunawan 2008). Fungsi agar miring untuk menyimpan biakan murni untuk kelanjutan penelitian. Apabila disimpan di lemari es pada suhu 40 C dapat bertahan bertahun-tahun. Tapi jika disimpan di suhu ruangan hanya bertahan beberapa bulan. Hasil dari peremajaan baik itu cendawan dari cabai maupun jarum tiram berhasil dilakukan tanpa ditumbuhi kontaminan. Namun sumber biakan murni yang digunakan berasl dari biakan yang telah disediakan bukan dari biakan murni yang telah dibuat sebelumnya. Hal terjadi karena biakan murni yang telah dibuat sebelumnya terkena kontaminan sehingga tidak layak untuk digunakan. Simpulan Proses membuat biakan cendawan diawali dengan membuat media biakan. Media yang digunakan adalah media agar-agar sukrosa kentang. Selanjutnya mengisolasi cendawan dari cabai yang telah terinfeksi cendawan dan mengisolasi jamur tiram. Agar didapatkan biakan murni dilakukan isolasi dari kedua biakan yang telah dibuat. Biakan murni yang telah dibuat dapat

diremajakan agar sifat-sifat biakan baik secara fisik maupun genetik tidak berubah. Peremajaan disimpan dalam media agar miring agar dapat disimpan dalam waktu yang lama. Daftar Pustaka Ariyani H. 2006. Peran unit biakan jaringan untuk pertumbuhan virus avian influenza. [prosiding] Temu teknis nasional tenaga fungsional pertanian Dwidjoseputro D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan Gunawan AW. 2008. Usaha Pembibitan Jamur. Depok: Penebar Swadaya Hanifah R. 2011. Kloramfenikol, tetrasiklin, sulfametoksasol-trimethroprim. [terhubung berkala] http://www.berbagimanfaat.com/2011/09/kloramfenikol-tetrasiklin.html. (24 Maret 2012) Indriati N. et al. 2010. Penggunaan Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) sebagai media tumbuh kapang pada produk perikanan. Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan (Vol 5) Isroi. 2009. Media untuk pertumbuhan jamur: media kentang. [terhubung berkala] http://isroi.com/2009/12/14/media-untuk-pertumbuhan-jamurmedia-kentang/. (23 Maret 2012) Sofa. 2011. Sejarah perkembangan mikrobiologi. [terhubung berkala] http://fppb.ubb.ac.id/?Page=artikel_ubb&&id=216. (24 Maret 2012) Sumardjo D. 2006. Pengantar Kimia: Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC Sutedjo M. 1996. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta Yuliarti N. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Yogyakarta: Lily Publisher