10

MCB 301 Lab manual tambahan

Musim semi 2008
Daftar Bakteri P ossible
Anda masing-masing akan diberikan satu organisme untuk menyuntik serangkaian tes
biokimia. Organisme yang telah genom mereka sepenuhnya diurutkan tercantum di
bawah ini dengan nomor id mereka genom. Dalam beberapa kasus, urutan genom tidak
tersedia bagi bakteri Anda akan tumbuh dan menguji Sebuah genom lternative
tercantum dalam tanda kurung.. Sebelum menjalankan tes biokimia, Anda akan
menjelajahi genom organisme tertentu dan t prediksi hasil biokimia fenotipe
berdasarkan genotipe.


10
MCB 301 Lab manual tambahan
Musim semi 2008
Gram positif Basil Tahan
Bacillus megaterium ( B. Clau s ii 66.692,3 )
Bacillus subtilis 224308.1
Lactobacillus plantarum 220668.1

Gram positif cocci
Enterococcus faecium (E. faecalis 226.185,1 )
Staphylococcus aureus (NP) str. NCTC 8325, 93061,3
Staphylococcus epidermidis str. RP62A, 176279,3

Gram Negatif Basil Tahan
Salmonella enterica subsp. rizonae sebuah (S. bongori)
Proteus vulgaris ( P. mirabilis 584,1 )
Serratia marcescens (NP) 615.1
Citrobacter freundi saya ( Klebsiella pneumoniae MGH 78578 (272.620,3 )
Hafnia alve i ( Yersinia pseudotuberculosis 273.123,1 )
Enterobacter cloacae ( Shigella flexneri 2a str. 301 198.214,1 ) ( Salmonella
typhimurium 99.287,1 )
Morganella morganii ( Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Ty2 209.261,1 )


10
MCB 301 Lab manual tambahan
Musim semi 2008
Bioinformatic Prediksi

Prediksi akan dibuat dari genom beranotasi tersedia di Sumber Daya Mikroba Patogen
Data Nasional, www.nmpdr.org . sekuens genom utuh yang tersedia melalui berbagai
database, tapi NMPDR memiliki alat yang berguna yang akan membuat lebih mudah
bagi Anda untuk memprediksi biokimia uji hasil. Yang paling penting, kurator NMPDR
telah mengorganisir penjelasan genom menjadi subsistem biologis. Subsistem adalah
kelompok protein dengan fungsi-fungsi terkait, seperti jalur metabolisme, struktur
kompleks, atau fenotipe. Pengumpulan subsistem dalam satu organisme merupakan
rekonstruksi parsial dari kapasitas fungsional, atau metabolisme, organisme.

Dalam daftar organisme yang tersedia di atas, genom id nomor link ke halaman Ikhtisar
organisme bersangkutan Organisme. Ikhtisar ini menunjukkan proporsi gen yang terkait
dengan subsistem, dan juga menunjukkan subsistem diklasifikasikan berdasarkan
fungsi subsistem terkait dikelompokkan bersama di bawah judul umum, untuk e exampl,
"Fag, Prophages, elemen transposabel" atau "Karbohidrat.". Klik pada tanda plus untuk
memperluas subpos yang lebih lanjut mengklasifikasikan subsistem terkait. Nama
subsistem dihubungkan ke halaman yang menggambarkan subsistem secara detail dan
akan terbuka untuk diagram subsistem jika tersedia. Diagram mungkin berwarna untuk
menunjukkan gen dalam jalur yang hadir dalam genom yang dipilih. Absen diagram,
halaman subsistem membuka ke tab menampilkan daftar peran yang membentuk
subsistem tab lain menunjukkan catatan yang menggambarkan subsistem dan penuh.
spreadsheet peran (dalam kolom) dan genom (dalam baris) menunjukkan gen (dalam
sel) yang telah dijelaskan oleh biocurator a.

Informasi yang disajikan subsistem grafis di daerah "Subsistem Statistik" pada halaman
Ikhtisar Organisme disajikan dalam tabel di bawah tab kedua, "Fitur di
Subsistem." Tabel ini memiliki header aktif yang diurutkan dan dicari. Protein individu
yang terkait dengan peran fungsional dalam subsistem disajikan dalam kolom terakhir
tabel. Ini terkait dengan halaman Ikhtisar Anotasi yang menyajikan informasi rinci
tentang masing-masing protein.

Ada atau tidak adanya gen individu atau kelompok gen yang membentuk jalur
metabolisme lengkap akan diselidiki menggunakan subsistem dan pencarian kata kunci
dari NMPDR. Genotip ini akan memprediksi fenotipe terlihat bahwa hasil dari setiap
tes. Jika Anda memiliki informasi yang cukup tentang genotipe untuk memprediksi
hasilnya dengan presisi, merekam prediksi anda menggunakan notasi hasilnya terdaftar
untuk setiap tes biokimia. Jika Anda hanya memiliki gagasan tentang positif atau
negatif, daftar nilai plus atau minus.


Pemanfaatan Karbohidrat, Metabolisme dan Motilitas

1. Gula fermentasi - Glukosa, Laktosa, rafinosa, sukrosa
2. Gula Alkohol Fermentasi - Manitol

C entral c arbohydrate saya tabolism, atau pemecahan gula menjadi senyawa yang
lebih kecil disertai dengan produksi ATP dan pengurangan koenzim, berikut salah satu
dari beberapa jalur glikolitik yang berbeda. Kebanyakan sel menggunakan jalur
Embden-Meyerhof untuk mengkonversi satu mol glukosa menjadi dua mol piruvat
dengan sintesis bersih dua mol ATP dan dua setara mengurangi sebagai NADH. Jalur
ini dimulai dengan fosforilasi glukosa baik oleh heksokinase atau oleh
phosphoenolpyruvate: sistem pengangkut phosphotransferase (PTS). Glukosa-6-fosfat
menjadi fruktosa isomerized-6-fosfat, maka terfosforilasi lagi oleh enzim rate-limiting,
fosfofruktokinase Fruktosa 1,6-bifosfat dipecah menjadi dua 3-karbon unit
Aldolase.. Konversi Setelah dua pyruvates menghasilkan dua ATP melalui tindakan
kinase phosphoglycerate dan piruvat kinase, bersama dengan dua NADH melalui aksi
gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH).

Beberapa organisme yang hilang fosfofruktokinase, dan tidak dapat berkembang ke
jalur Embden-Meyerhof. Jalur alter glikolitik asli, yang disebut Entner-Doudo roff jalur,
menyediakan rute dari glukosa-6-fosfat untuk dua pyruvates dan dua setara
mengurangi tetapi hanya satu ATP Di jalan ini,. glukosa-1-fosfat dehidrogenase
menghasilkan biosintesis koenzim NADPH. Langkah-langkah berikutnya memproduksi
satu piruvat dan satu gliseraldehida-3-fosfat langsung dari 2 - keto-3-deoksi-6-
phosphogluconate (KDPG) oleh KDPG Aldolase. Tindakan GAPDH menyediakan satu
setara dengan energi yang menghasilkan koenzim NADH.

Lain jalur glikolisis yang menghasilkan piruvat adalah jalur methylglyoxal. Jalur ini
menghasilkan fosfat anorganik tetapi tidak ada ATP, dan t e nds untuk digunakan saat
availablility fosfat terbatas. Lima karbon intermediet dan r educed biosintesis koenzim
NADPH yang dihasilkan dari glukosa melalui jalur fosfat pentosa. Pentosa dapat
dipecah lebih lanjut untuk asetat dan piruvat.

Piruvat yang dihasilkan dari glikolisis dapat dikonversi menjadi asetil-KoA untuk mulai
respirasi ketika akseptor elektron eksogen seperti oksigen, sulfat atau nitrat yang
melimpah. Ketika eksogen elektron akseptor yang terbatas, jalur fermentasi yang
digunakan untuk menjaga sel dalam oksidasi-reduksi keseimbangan. Fermentasi
glukosa dimulai dengan glikolisis untuk ge nerate energi, mengurangi koenzim, dan
akseptor elektron. Regenerasi o XID ized koenzim yang dibutuhkan untuk produksi
energi berkelanjutan digabungkan dengan pengurangan produk break-down dari
glukosa.

Asam laktat fermentasi glukosa dimulai dengan piruvat yang dihasilkan oleh jalur umum
glikolisis (Embden-Meyerhof). Piruvat direduksi menjadi laktat ditambah dengan
reoksidasi NADH untuk NAD +. Dengan demikian, akseptor elektron, laktat, adalah
internal ke glukosa, donor elektron. Fermentasi asam laktat mungkin homolactic
(karakteristik dari Streptococcus dan Lactobacillus beberapa) atau heterofermentatif
(karakteristik dari beberapa Lactobacillus dan Leuconostoc). Fermentasi Homolactic
hanya menghasilkan piruvat menggunakan laktat yang dihasilkan dari glikolisis umum
(Embden-Meyerhof). Fermentasi heterofermentatif menghasilkan laktat, etanol dan
karbondioksida menggunakan piruvat dan asetat yang dihasilkan dari jalur fosfat
pentosa.

Hasil lainnya jalur fermentasi dalam berbagai produk akhir asam. Fermentasi asam
campuran, karakteristik dari Enterobacteriaceae, menggunakan piruvat dan
phosphoenolpyruvate dihasilkan dari glikolisis umum untuk menghasilkan laktat,
suksinat, acet makan, dan format. Enzim kunci untuk produksi piruvat adalah format-
format lyase. Format ini kemudian sepenuhnya teroksidasi menjadi karbon dioksida dan
gas hidrogen dengan aksi hydrogenlyase format.

Berbeda dengan jalur fermentasi asam di atas, fermentasi butanadiol menghasilkan
produk netral. Dua hal yruvate s dihasilkan dari glikolisis dikonversi ke acetolactate dan
karbon dioksida.Acetolactate adalah baik enzimatik dikonversi langsung ke acetoin,
atau secara spontan teroksidasi menjadi diacetyl sebelum pengurangan enzimatik
untuk acetoin. Acetoin mungkin akan berkurang menjadi butanadiol. Kedua
pengurangan regenerasi teroksidasi NAD +.

Langkah kunci dalam pemanfaatan gula selain glukosa termasuk pengangkutan oleh
PTS tertentu atau permease, dan kerusakan enzimatik gula kompleks menjadi gula
sederhana yang dapat memasukkan ytic glikol atau jalur pernapasan. PTS transportasi
menghasilkan gula terfosforilasi, sementara gula impor melalui permease harus
terfosforilasi oleh enzim terpisah Gula dapat diuraikan oleh reaksi hidrolitik atau
phosphorolytic.. The disakarida, l actose, adalah h ydrolyz ed menjadi glukosa dan
galaktosa oleh ucrose o| lactosidase. S h ydrolyz ed untuk glukosa dan fruktosa oleh
sukrase (invertase), sedangkan sukrosa ph o phorylase menghasilkan glukosa-1-fosfat
dan fruktosa. Para raffinose trisaccharide terdiri dari gal actose-glukosa-fruktosa yang
mungkin decomp o sed stepwi se menghasilkan galaktosa dan sukrosa, atau mel ibiose
dan fruktosa.

Karbohidrat pemanfaatan dan fermentasi akan dinilai oleh sel tumbuh tanpa gemetar
(aerasi) dalam media didefinisikan mengandung karbohidrat tunggal. Asam hasil
fermentasi gula akan menyebabkan perubahan warna nyata dalam indikator pH
termasuk dalam medium. Fermentasi gula tidak n ot menghasilkan produk alkali h
owever, non-fermentasi hidrolisis asam amino dalam pepton itu, hadir dalam media
fermentasi yang paling, dapat memberikan reaksi alkalin, yang juga akan menyebabkan
perubahan warna pada indikator pH. Produksi gas, H 2 khususnya, dapat ditentukan
dengan menempatkan, tabung kecil terbalik Durham dalam medium uji. Jika gas
tersebut dihasilkan, ia terjebak dalam tabung Durham dan dapat dilihat sebagai e bubbl.

Kemungkinan Hasil
A / G: Kedua asam dan gas telah diproduksi. Media telah berubah
warna
dari hijau kebiruan menjadi kuning dan gelembung gas telah
terbentuk di Durham
tabung. Catatan: referensi ke gas adalah untuk tes glukosa
saja.
J: Asam telah diproduksi. Media telah berubah kuning.
(A): Sedikit asam telah diproduksi. Media telah berubah hijau
atau kekuningan di dasar tabung dan kehijauan di bagian atas.
0 +: Tidak ada asam atau gas telah diproduksi dan pertumbuhan
dicatat [mengguncang tabung untuk
mencari kekeruhan (kekeruhan) menunjukkan pertumbuhan
bakteri]. Media adalah
hijau.
0 + / B:. Tidak ada asam atau gas telah diproduksi dan pertumbuhan tercatat
Media
telah berubah biru karena reaksi alkali disebabkan oleh asam amino
pemanfaatan sebagai sumber karbon. Perubahan ini akan terjadi jika
jumlah
basa akhir produk yang terbuat dari pemanfaatan asam amino dalam
media melebihi jumlah produk akhir asam dari gula.


Control:
Klebsiella pneumoniae MGH 78578 (272.620,3) menggunakan karbohidrat tes
semua dan gas menghasilkan s melalui aksi hydrogenlyase format.

Kita bisa mengeksplorasi kapasitas metabolik dari organisme untuk menemukan gen
yang bertanggung jawab untuk metabolisme gula tersebut dan untuk memprediksi hasil
tes, atau fenotipe, dari genom tes dibandingkan dengan kontrol. Buka link di atas untuk
kontrol positif, dan juga membuka link di halaman 1 yang sesuai dengan organisme
yang ditugaskan (kontrol-klik pada dokumen ini) Subsistem menggambarkan
pemanfaatan gula atau fermentasi akan terdaftar di bawah judul utama,
"Karbohidrat.". Subpos dapat mencakup "metabolisme karbohidrat Tengah," "Di-dan
oligosakarida," "fermentasi" atau "Monosakarida."

Penyihir S untuk tab berlabel "Fitur di Subsistem" dan pilih kategori Karbohidrat di
header kolom pertama. Pilih di antara subpos, dan tabel akan menampilkan nama
subsistem serta peran dan gen (fitur) yang berperan dalam proses. S Croll melalui meja
untuk kontrol positif (Anda dapat meningkatkan jumlah atau baris ditampilkan
menggunakan kontrol atas tabel). Perhatikan yang subsistem dan peran Anda berpikir
terlibat dalam fermentasi dan penggunaan gula tersebut. Anda dapat mencari gen
tertentu dari tabel ini dengan mengetikkan nama fungsi ke dalam kotak teks di kolom
peran. Pertama pastikan bahwa filter konten dalam subkategori dan kolom
menampilkan semua kategori. Kemudian Anda dapat mencari, misalnya, untuk
"hydrogenlyase format" untuk menentukan apakah genom Anda mampu menghasilkan
gas selama fermentasi asam campuran glukosa (Hapus istilah pencarian Anda dari
judul kolom dan tekan enter untuk mengatur ulang isi tabel.).

Sekarang menelusuri rekonstruksi metabolik (fitur dalam subsistem) untuk genom yang
ditugaskan untuk melihat apakah fitur yang sama atau subsistem tersedia dalam
organisme pengujian Anda, dan memprediksi hasil dari tes fermentasi karbohidrat.
Catat prediksi Anda pada spreadsheet jawaban (halaman terakhir ), dan termasuk bukti
yang mendukung prediksi anda di kolom yang berlabel "Kenapa?" Misalnya, bukti bisa
"tidak adanya subsistem x" atau "kehadiran gen y."

PERTANYAAN TENTANG fermentasi

1. Dengan melihat hanya pada rekonstruksi metabolik, atau daftar subsistem
tersedia dan fitur dalam subsistem, apakah mungkin untuk memprediksi berbagai
hasil uji biokimia?



2. C menjilat Realisasi Penggunaan Manitol pos (atau klik sebelum h ) untuk
membuka halaman subsistem, kemudian pilih tab untuk spreadsheet subsistem,
yang menyajikan genom sebagai baris dan peran fungsional sebagai kolom. Gen
yang melakukan fungsi yang terdaftar akan diisi pada sel-sel dari
spreadsheet. Angka dengan warna latar belakang yang sama berada di dekat
dalam genom. Header kolom disingkat yang diterjemahkan dalam pop-up kotak jika
Anda menunjuk kepada mereka. Ketik "streptokokus" ke dalam kotak di kolom
pertama pos, "Organisme," lalu tekan enter Perhatikan bahwa ada dua "gen yang
hilang" dalam satu strain. Streptococcus pyogenes dibandingkan dengan yang lain.
Yang fungsi yang hilang? Apakah Anda memprediksi bahwa strain ini akan
memfermentasi manitol? Jelaskan. [Untuk petunjuk, lihat tabel peran fungsional
(tab kedua) dan klik pada reaksi terkait dengan fungsi yang hilang, atau membaca
catatan tentang subsistem.]
3. MacConkey Agar

Agar-agar MacConkey adalah medium kultur yang digunakan secara luas yang bersifat
selektif DAN diferensial. Sebuah media selektif memilih untuk pertumbuhan beberapa
organisme, sementara menghambat pertumbuhan orang lain. Dalam kasus agar-agar
MacConkey, keberadaan garam empedu dan ungu kristal menghambat pertumbuhan
bakteri Gram positif yang paling.Sebuah media diferensial tidak menghambat
pertumbuhan bakteri, tetapi membedakan mereka berdasarkan beberapa karakteristik
pertumbuhan terlihat seperti warna koloni. Agar-agar MacConkey mengandung laktosa,
karbohidrat yang difermentasi, dan indikator pH netral merah. Ketika laktosa
difermentasi, produk asam menurunkan pH di bawah 6,8 dengan pertumbuhan kolonial
dihasilkan balik merah muda-merah. Jika organisme tidak dapat memfermentasi
laktosa, koloni-koloni akan menjadi tidak berwarna atau kuning. Media dengan demikian
membedakan antara laktosa fermentasi bakteri dan laktosa non-fermentor, yang
meliputi patogen potensial.

Agar-agar MacConkey adalah media plating umum digunakan primer di banyak
laboratorium mikrobiologi klinis. Karena media ini begitu umum, dan karena dapat
memberikan petunjuk tepat waktu untuk identifikasi beberapa basil Gram-negatif, itu
behooves mikrobiologi untuk menjadi efisien dalam menafsirkan pertumbuhan
kolonial. Ini akan sangat membantu di laboratorium Identifikasi Tak Dikenal dalam
diferensiasi diketahui Gram positif dan Gram negatif Anda.

Kemungkinan Hasil
J: Pertumbuhan terjadi dan semua koloni berwarna merah terlihat
merah muda. Asam memiliki
telah diproduksi.
(A): Pertumbuhan terjadi koloni Kebanyakan tidak berwarna,. Tetapi
beberapa terlihat sedikit
pink / merah.
0 +: Pertumbuhan terjadi dan koloni tidak berwarna. Tidak ada asam
telah diproduksi.
0 -: Pertumbuhan tidak terjadi. Garam empedu dan ungu kristal dalam
medium menghambat pertumbuhan organisme.

Controls:
Streptococcus mutans (210.007,1) adalah Gram positif dan laktosa
ferments. Escherichia coli str. K12 (83.333,1) adalah Gram negatif dan laktosa
ferments. Shigella flexneri str 2a. 301(198.214,1) adalah Gram negatif dan tidak
memfermentasi laktosa.

Memprediksi hasil plating MacConkey berdasarkan fermentasi laktosa dan karakteristik
dinding sel. Anda telah diprediksi fermentasi laktosa. Tugas Anda di sini adalah untuk
menemukan genotipe yang memprediksi fenotip pewarnaan Gram.

Bergulir melalui daftar panjang gen dikategorikan semakin membosankan. Anda juga
harus menyadari bahwa tidak adanya subsistem tertentu dalam daftar ini mungkin
hanya berarti bahwa kurator belum memeriksa genom Anda lihat. Bukti yang
menentukan diperlukan untuk memprediksi apakah organisme Anda akan tumbuh pada
agar MacConkey Anda harus menemukan sebuah gen yang hadir dalam Gram positif
tetapi negatif tidak Gram, dan lain dengan distribusi yang berlawanan. Anda mungkin
tahu gen kandidat dari membaca yo ur atau. kuliah kursus, atau y ou mungkin masih
perlu untuk mengeksplorasi subsistem untuk menemukan gen yang diagnostik tipe
dinding sel.
Di header halaman Ikhtisar Anda Organisme, gunakan menu pencarian dan pilih ini
menyajikan n "Subsistem." memperluas daftar ed dari semua subsistem yang tersedia.
Gulir (atau gunakan browser Anda "menemukan di halaman" fungsi) ke kategori untuk
"dinding Sel dan kapsul." Ada subkategori untuk Gram-positif dan-negatif dinding
sel. Klik pada subsistem "KDO2-Lipid A biosintesis" (buka di tab baru atau jendela), dan
juga klik untuk membuka "Teichoic dan lipoteichoic asam biosintesis" subsistem. Ini
mungkin memakan waktu untuk membuka karena mereka data dari semua genom
sedang loading ke spreadsheet.

Jelajahi kedua subsistem termasuk catatan, kemudian pilih salah satu gen dari setiap
subsistem yang anda anggap umumnya diagnostik tipe dinding sel dan prediksi hasil
pewarnaan Gram Dukungan prediksi tes Anda dengan "kehadiran x gen DAN tidak
adanya gen y.. "


PERTANYAAN TENTANG AGAR CONKEY Mac

1. Sebuah tes komersial untuk menggantikan staning Gram adalah alat tes Ric
colorimet untuk fungsi aminopeptidase alanin. Bakteri Gram-negatif cenderung
memiliki aktivitas lebih besar, sedangkan bakteri Gram-positif memiliki aktivitas
yang sangat rendah. Apakah ini fenotipe diagnostik aktivitas enzim dijelaskan
oleh genotipe? Artinya, jangan Gram-tive Nega bakteri memiliki gen untuk
aminopeptidase alanin yang abs ent dari Gram-positif genom?

Lakukan pencarian kata kunci untuk enzim ini dalam genom yang ditugaskan
maupun di th e tiga kontrol tercantum di atas. Untuk mencari lebih dari satu genom
pada suatu waktu, pilih "Gen"dari menu pencarian. Ini menyajikan anda dengan
kotak kata kunci serta menu genom untuk memilih dari. Organisasi genom sebagian
besar abjad, tetapi mereka yang NMPDR fokus es kurasi kami upaya terdaftar lebih
dulu, diikuti dengan Archaea, maka sisa dari Bakteri. Strep adalah organisme fokus,
sehingga terdaftar pada jenis (atas merah di merah muda), sedangkan bakteri lain
yang lebih bawah dalam jenis hitam pada merah muda Kontrol klik. untuk memilih
lebih dari satu.

Jadi, apakah ini fenotipe biokimia dijelaskan oleh genotipe? Jelaskan.
4. Pemanfaatan Asam Sitrat

Asam sitrat disintesis sebagai senyawa antara dalam asam trikarboksilat (TCA) siklus.
Dalam kondisi oksik dengan adanya siklus TCA fungsional, pertumbuhan pada sitrat
sebagai sumber karbon tunggal tergantung pada transportasi sitrat ke dalam sel.
Sebuah symporter sitrat-proton aerobik telah diidentifikasi dalam Klebsiella dengan
urutan berikut:

> Ara | 272620.3.peg.2289 Sitrat-proton symporter
MDAFITLISFPVLFQSSATGARQRVDNKLETCMHSTTSQMSTRDRIGAIL
RVTSGNFLEQFDFFLFGFYATYIAHTFFPASSEFASLMMTFAVFGAGFLM
RPIGAIVLGAYIDKVGRRKGLIVTLSIMATGTFLIVLIPSYQTIGLWAPL
LVLIGRLLQGFSAGAELGGVSVYLAEIATSGRKGFYTSWQSGSQQVAIMV
AAAMGFALNAVLEPSAISDWGWRIPFLFGCLIVPFIFILRRKLEETQEFT
ARRHHLAMRQVFATLLANWQVVIAGMMMVAMTTTAFYLITVYAPTFGKKV
LMLSASDSLLVTLLVAISNFFWLPVGGALSDRFGRRSVLIAMTLLALATA
WPALTMLANAPSFLMMLSVLLWLSFIYGMYNGAMIPALTEIMPAEVRVAG
FSLAYSLATAVFGGFTPVISTALIEYTGDKASPGYWMSFAAICGLLATCY
LYRRSAVALQTAR

Dalam kondisi anoksik, di mana 2-oxoglutarate dehidrogenase ditekan dan kios-kios
siklus TCA, beberapa fermentasi bakteri sitrat asetat memproduksi, format, dan
CO2. Jalur ini adalah natrium tergantung, dan oksaloasetat dekarboksilase, salah satu
enzim kunci dari jalur selain sitrat liase, adalah Na + pompa. Na + gradien didirikan oleh
oksaloasetat serapan drive dekarboksilase sitrat melalui CITS, dan pembentukan
NADH melalui transfer elektron terbalik melibatkan dehidrogenase format, kuinon, dan
Na +-tergantung NADH: oxidoreductase kuinon. . Semua enzim khusus diperlukan
untuk fermentasi sitrat yang diinduksi dalam kondisi anoksik di hadapan sitrat dan ion
Na + The natrium diinduksi, transporter anaerobik diidentifikasi dalam Klebsiella
memiliki urutan sebagai berikut:

> Ara | 272620.3.peg.32 Na (+) Sitrat OH (-) antiporter
MTNMSQAPATEKKGVSDLLGFKIFGMPLPLYAFALITLLLSHFYNALPTD
IVGGFAIMFIIGAIFGEIGKRLPIFNKYIGGAPVMIFLVAAYFVYAGIFT
QKEIDAISNVMDKSNFLNLFIAVLITGAILSVNRRLLLKSLLGYIPTILM
GIVGASIFGIAIGLVFGIPVDRIMMLYVLPIMGGGNGAGAVPLSEIYHSV
TGRSREEYYSTAIAILTIANIFAIVFAAVLDIIGKKHTWLSGEGELVRKA
SFKVEEDEKAGQITHRETAVGLVLSTTCFLLAYVVAKKILPSIGGVAIHY
FAWMVLIVAALNASGLCSPEIKAGAKRLSDFFSKQLLWVLMVGVGVCYTD
LQEIINAITFANVVIAAIIVIGAVLGAAIGGWLMGFFPIESAITAGLCMA
NRGGSGDLEVLSACNRMNLISYAQISSRLGGGIVLVIASIVFGMMI


Pemanfaatan sitrat membedakan Escherichia coli, organisme tinja yang tidak dapat
menggunakan e citrat sebagai sumber karbon tunggal,
dari Enterobacter aerogenes, organisme tanah sering ditemukan dalam air, yang
bisa. Sejak E. coli merupakan indikasi kontaminasi tinja dan E. aerogenes tidak,
pemanfaatan sitrat pernah tes rutin untuk memeriksa kualitas air.


Kemungkinan Hasil
+: pertumbuhan dan / atau perubahan warna biru dalam
medium
-: tidak ada pertumbuhan, tidak ada perubahan warna

Control:
Klebsiella pneumoniae MGH 78578 (272.620,3 ) adalah model klasik untuk
fermentasi sitrat.

Sitrat adalah karbon tunggal dan sumber energi hadir dalam medium sitrat Simmon, jadi
jika suatu organisme tidak mampu membawanya melintasi membran sel akan ada
pertumbuhan tidak Efisiensi pemanfaatan sitrat bergantung pada kegiatan sitrat liase
(aerobik) dan oksaloasetat. dekarboksilase (anaerob).

Lakukan dua kata kunci pencarian yang terpisah es untuk nomor id dari protein kontrol
tercantum di atas (ara | 272620.3.peg.2289 dan ara | 272620.3.peg.32). Dalam kontrol
untuk daerah membandingkan menampilkan, klik tombol maju. Pilih tombol radio untuk
runtuh genom dekat, dan meningkatkan jumlah daerah sampai 50. Klik tombol
imbang. Gulir ke bawah menampilkan untuk melihat genom s memiliki protein dan
daerah sama dengan yang di Klebsiella. Perhatikan bahwa protein Klebsiella tidak
termasuk dalam subsistem, yang berarti bahwa seorang kurator manusia belum
memeriksa ulang keakuratan fungsi yang ditugaskan secara otomatis berdasarkan
kesamaan urutan. Melihat tidak hanya pada urutan fokus (1, red) tetapi juga pada
identitas protein lain di kawasan untuk memutuskan apakah protein transporter sitrat
impor. Sebagai contoh, transporter anaerobik di Klebsiella terletak di wilayah dengan
subunit dari dekarboksilase oksaloasetat, yang juga diperlukan untuk fermentasi
anaerob sitrat. Mouse pada panah gen dan organisme nama untuk memunculkan nama
lengkap.

Jika Anda tidak puas dengan hasil alat membandingkan daerah, Anda dapat mencari
urutan dari transporter dalam organisme Anda menggunakan BLAST. Pilih BLAST atau
scan dari menu pencarian. Copy salah satu urutan atas dan paste ke kotak urutan form
pencarian. Mengatur alat untuk blastp untuk pencarian urutan protein. Pilih organisme
tes Anda sebagai genom yang akan dicari. Klik tombol BLAST hijau. Hasil pencarian
akan menampilkan pertandingan, atau keselarasan, antara urutan query (Klebsiella,
atas) dan subjek (genom Anda, bawah), dengan garis tengah yang menampilkan kode
huruf yang sama ketika asam amino sama persis, atau tanda tambah ketika asam
amino memiliki sifat kimia yang mirip. Pertandingan ini juga mencetak dengan nilai E-,
yang merupakan jumlah kali Anda harus berharap untuk melihat pertandingan yang
sama jika database dihuni oleh urutan acak (lebih dekat ke nol, lebih baik). Perlu
diketahui bahwa protein transporter berbagi fungsi sangat mirip dan sangat mirip secara
berurutan. Di antara substrat transporter ditentukan oleh proporsi yang relatif kecil dari
urutan total, dan sulit untuk memprediksi dengan akurasi berdasarkan kesamaan urutan
saja Konteks (fungsi gen di dekatnya). Dan sangat dekat pertandingan urutan (e-val
kecil dari 10e -100) bersama-sama adalah prediksi dari substrat yang diangkut.

Memprediksi hasil tes sitrat dari ada atau tidaknya gen encoding transporter sitrat
dalam organisme Anda.


PERTANYAAN TENTANG ASAM sitrat

1. Apakah ada atau tidak adanya gen untuk liase sitrat menjadi prediksi hasil tes
sitrat? Menjelaskan



5. Metil Merah / Voges-Proskauer (MR / VP) Uji

Tes ini memungkinkan mikrobiologi untuk menentukan jalur yang digunakan untuk
fermentasi glukosa, dan dalam proses membantu untuk menentukan spesies bakteri
yang hadir paling mungkin.MR / VP sebenarnya adalah dua tes: metil merah (MR) tes
menentukan apakah jumlah besar asam telah dihasilkan dari fermentasi asam
campuran glukosa. End dari jalur ini termasuk laktat, asetat, asam format dan
suksinat. Para Voges-Proskauer (VP) tes menentukan apakah metabolik netral spesifik
menengah, acetoin, telah diproduksi bukan asam dari glukosa. Acetoin adalah
menengah terakhir di jalur butanadiol, yang merupakan jalur fermentasi umum
dalam Bacillus (lihat Gambar 1). Tes saling melengkapi dalam arti bahwa sering bakteri
akan memberikan reaksi positif untuk satu tes dan reaksi negatif untuk yang lain. Tiga
pola kemungkinan hasilnya:

Metil Merah Voges-Proskauer
(Asam yang dihasilkan dari glukosa) (Acetoin dihasilkan dari glukosa)
- -
+ -
- +

Kadang-kadang, Anda mungkin melihat hasil yang positif untuk kedua tes, tetapi sangat
jarang.

Dalam jalur fermentasi acetoin, terdeteksi oleh tes VP, dua molekul piruvat mengembun
dan dua molekul CO 2 yang dilepaskan. The 4-karbon menengah yang terbentuk,
acetoin, berisi gugus karbonil. Acetoin bertindak sebagai akseptor elektron terminal
dengan gugus karbonil yang dikurangi menjadi gugus hidroksil. Produk berkurang,
butanadiol, diekskresikan oleh bakteri (lihat informasi latar belakang pada endospora
bakteri pembentuk). Dalam prosedur ini, diuraikan di bawah, acetoin dioksidasi menjadi
diacetyl oleh basa vo|to,o yang membentuk kompleks merah dengan kreatinin.


Metil merah uji:
+: Medium segera mengembangkan warna merah.
minggu: medium mengembangkan warna oranye.
-: Medium tetap kuning.
Voges-Proskauer uji:
+: Warna merah muda-merah mengembangkan
-: Tidak ada perubahan warna atau berubah warna, coklat kuning atau
hitam

Controls:
MR
-
/
+
VP: Bacillus subtilis 224308.1
MR
+
/ VP
-:
Salmonella enterica subsp. enterica ser. Choleraesuis 321314.4

Tes MR akan positif bagi organisme yang memiliki jalur lengkap untuk fermentasi asam
campuran. OPE n diagram untuk fermentasi:. subsistem Asam Campuran Klik tombol
untuk mewarnai diagram, maka s memilih genom kontrol positif dari daftar drop-down
. C menjilat tombol "melakukan pewarnaan" untuk benar-benar mewarnai
diagram. Sekarang mewarnai diagram untuk menunjukkan gen hadir dalam organisme
pengujian Anda untuk mendapatkan ide dari berapa banyak asam yang berbeda dapat
diproduksi.

Uji VP akan positif bagi organisme yang memiliki jalur lengkap ke cetoin, senyawa III
dalam diagram. Klik untuk membuka diagram untuk Acetoin itu, subsistem Metabolisme
butanadiol Klik tombol untuk mewarnai diagram,. kemudian pilih genom kontrol positif
dari daftar drop-down. Klik tombol "melakukan pewarnaan" tombol untuk benar-benar
mewarnai diagram. Sekarang mewarnai diagram untuk menunjukkan gen hadir dalam
organisme pengujian Anda.

Memprediksi hasil tes dan daftar bukti prediksi Anda.



6. Esculin Hidrolisis

Esculin adalah glukosida (turunan gula). Ini adalah turunan asetal D-glukosa, yang
dihidrolisis menjadi glukosa dan esculetin (sebuah bagian asetal) dengan adanya asam.


ESCULIN ESCULETIN -
D-Glukosa|
6, Iu_ooioo7qoo_ouoiv| 6,7-dihydroxycoumarin

Beberapa bakteri mampu melakukan hidrolisis ini dengan enzim beta-glukosidase,
menghasilkan glukosa, yang dapat digunakan sebagai sumber karbon / energi, dan
esculetin yang bereaksi dengan garam besi di media untuk menghasilkan kompleks
besi fenolik (ditampilkan di bawah) . Kompleks ini muncul sebagai endapan hitam dan
menunjukkan tes esculin positif.


Control:
esculin
+:
Enterococcus faecalis 226185.1

Sebuah endapan hitam harus hadir hanya jika organisme mampu hidrolisis esculin. Tes
ini dirancang untuk membedakan enterococci (cocci asli usus besar),
seperti E. faecium dan E. faecalis,yang sebelumnya dianggap sebagai subkelompok
dari streptokokus. Garam-garam empedu, yang hadir dalam medium esculin empedu,
akan menghambat pertumbuhan o f beberapa bakteri Gram positif.

Cari "glukosidase beta" dalam genom kontrol atas. Klik pada nomor id gen untuk
membuka halaman protein. Klik link untuk membuka halaman urutan. Pilih urutan
protein dan klik tombol untuk menunjukkan Fasta. Salin urutan termasuk baris header
(> id nama gen protein).

Pilih BLAST atau scan dari menu pencarian. Copy salah satu urutan atas dan paste ke
kotak urutan form pencarian. Mengatur alat untuk blastp untuk pencarian urutan
protein. Pilih organisme tes Anda sebagai genom yang akan dicari. Ingat bahwa
patogen inti NMPDR terdaftar pertama dalam urutan abjad, diikuti dengan daftar abjad
dari Archaea, Bakteri lain, maka eukariota. Untuk menghindari bergulir, Anda dapat
mengetikkan nomor id atau bagian dari nama genom tes Anda di kolom teks kecil dan
klik tombol yang berlabel "pergi." Klik tombol BLAST hijau.

Gulir ke kanan untuk memeriksa kecocokan antara permintaan dan urutan
subjek. Mempertimbangkan kualitas pertandingan berurutan, kesamaan nama
fungsional, dimasukkan dalam subsistem, dan konteks genetik ketika memutuskan
apakah genom pengujian Anda memiliki kapasitas untuk menghidrolisis esculin.


7. Motilitas Uji

Motilitas memungkinkan mikroba untuk "mencari makan" di berbagai wilayah
lingkungan mereka untuk menemukan senyawa penting yang dibutuhkan untuk
kelangsungan hidup dan pertumbuhan. Dengan demikian, mikroba yang ditemukan di
alam cukup sering motil untuk memungkinkan mereka untuk menjauh dari senyawa
berbahaya (repellents) dan terhadap nutrisi (atraktan) Gerakan dalam menanggapi
senyawa kimia yang disebut sebagai "chemotaxis.". Meskipun ada yang berbeda
sarana penggerak mikroba, metode yang paling umum adalah untuk bergerak melalui
suatu struktur khusus yang disebut flagela a. Flagela bakteri pelengkap panjang yang
mendorong sel ke depan dengan gerak rotasi serupa dengan baling-baling. Jika "baling-
baling" diputar dalam satu arah, sel bergerak dalam arah maju (renang
halus). Switching rotasi flagel menyebabkan sel untuk menghentikan gerakan lateral
dan "jatuh" sementara itu mengorientasikan ulang itu sendiri. Meskipun gerakan ini
bermanfaat untuk sel, motor ini adalah "babi energi," nyata membutuhkan pemompaan
proton sekitar 1000 untuk satu rotasi flagel tersebut. Clearly, i fa bacterium is adapted to
live in a fixed environment it would not require such an apparatus and could better use
its energy supplies in more beneficial ways. Since there are clear differences in motility,
this becomes another type of differential test to distinguish between species.

Motility test medium is a semisolid agar that permits the movement of motile bacteria .
This is a rich medium that supports the growth of most non-fastidious organisms. An
inoculum of the bacterium is stabbed into the agar. As the cells use up the nutrients in
the area of the initial stab line, they must either cease growth (non-motile) or move to
areas of the medium that still contain nutrients (motile). The test medium also contains a
redox indicator, triphenyltetrazolium chloride (TTC), which turns pink ish-red when
reduced . A motile bacterium will move th roughout the medium, oxidizing the carbon
compounds and reducing the indicator to pr oduce a pink color wherever it goes. A non-
motile organism will be unable to move so that the pink color will be evident only along
the stab line.

Do a keyword search or browse subsystems to determine whether you r test genome is
motile. Remember that you can start from the Organism Overview page with the
metbolic reconstruction for your organism, which is linked in the beginning of this
document. You may also use the keyword search on the NMPDR home page, or select
subsystems from the search menu to browse or search the subsystems tree. To search
the tree, click the radio button for "Motility and Chemotasis," then input your test
genome id number as a search word in the form at the bottom of the page , and click
Go.



Experiment 10 b: Organic Nitrogen Metabolism
(individual experiments)

Amino acids and proteins can be used by bacteria as nitrogen and energy/carbon
sources. They are degraded to a variety of end products. The presence of amino groups
in these products causes an alkaline reaction that, like the acidic reactions in
fermentation, are readily detectable and useful for identification.

1. Lysine Decarboxylase

Some sugar-fermenting bacteria also produce decarboxylases , which remove the
carboxyl group from specific amino acids. Lysine decarboxylase removes the carboxyl
group from the amino acid lysine producing carbon dioxide and cadaverine. Cadaverine
is a foul-smelling polyamine produced by protein hydrolysis during putrefaction of
animal tissue. Cadaverine is a toxic diamine, which is similar to putrescine -- a
compound produced by ornithine decarboxylation. Cadaverine is alkaline and its
accumulation causes a pH increase in the medium. The indicator brom cresol purple
(BCP) that is used in this test is purple at alkaline pH and yellow at acidic pH. Initially,
BCP turns the medium yellow in response to fermentation of glucose to acidic end
products. This change usually occurs in the first 10 to 12 hours of incubation. As the pH
of the medium drops, synthesis of lysine decarboxylase is turned on and utilization of
lysine begins. The BCP eventually turns the medium purple in response to the
accumulation of cadaverine. A positive test, then, is a return to the original purple color.

Perform a keyword search in your organism for lysine decarboxylase to determine
whether the enzyme is present. You can enter the enzyme name and the name of your
organism in the search box in the banner, or select Gene from the search menu to
select your organism from the genomes list.




2. Indole Production from Tryptophan

Hydrolysis of the amino acid tryptophan by tryptophanase , also known as L-tryptophan
indole-lyase, results in the production of indole (a putrefactive compound), pyruvic acid
and ammonia. The indole may accumulate as an end product.






Not all bacteria are capable of hydrolyzing tryptophan, so this test is useful in identifying
bacteria. One specific use of the indole test is to aid in distinguishing
between Shigella and Salmonella , two genera that contain human pathogenic species.

Controls:
indole
+
: Shigella flexneri 2a str. 301 198214.1
indole
-
: Staphylococcus aureus (NP) str. NCTC 8325 , 93061.3

Use a combination of keyword searching and subsystems browsing to determine the
pattern for your test organism. Use the controls to make sure you are looking for the
right thing, and use the control sequence to blast against the test genome if necessary.

QUESTIONS ON INDOLE

1. What subsystem does tryptophanase belong to in the positive control genome?





3. Hydrogen Sulfide Production (Kligler's Test)

Hydrogen sulfide (H 2 S) is produced by bacterial anaerobic degradation of the two
sulfur-containing amino acids, cysteine and methionine. Hydrogen sulfide is released as
a by-product when carbon and nitrogen atoms in the amino acids are consumed as
nutrients by the cells. Under anaerobic conditions the sulfhydryl (-SH) group on cystei
ne is reduced by c ysteine desulfurase .

The Kligler's Iron test is used to detect liberation of H 2 S gas by bacteria growing on an
excess of these sulfur-containing amino acids. The agar contains high levels of
peptones (sources of cysteine and methionine) and ferrous sulfate as an indicator.
When H 2 S is produced, the ferrous ion reacts with it to give ferrous sulfide, an insoluble
black precipitate.

Use your previous investigation of carbohydrate utilization along with a search for
thiosulfate reductase and another for cysteine desulfhydrase to predict the color and
presence of precipitate.


4. Urease

Urea is a nitrogenous waste product of animals. Some bacteria can cleave it to produce
carbon dioxide and ammonia. The ammonia is a nitrogen source for amino acid
biosynthesis as well as for synthesis of other nitrogen-containing molecules in the cell.

The production of ammonia raises the pH of the medium. The indicator phenol red is
present in the broth. Phenol red is orange-yellow at pH <6.8, and turns bright pinkish-
red at pH >8.1. Hence, a positive urea test is denoted by the change of medium color
from yellow to pinkish-red (cerise).

Controls:
urease
+
: Proteus vulgaris ( P. mirabilis 584.1 )
urease
-
: Serratia marcescens (NP) 615.1

The urease test was devised to distinguish Proteus species from other enterics. The
medium described here is buffered enough so that weak urease producers appear
negative.

Do a keyword search for urease to predict the result for your test organism. Use the
control genomes to make sure you are looking for the right thing, and use the control
sequence to blast against the test genome if necessary.

Experiment 10 c: Electron Transport
(individual experiments)

In this section, we shall use two tests that detect activities involved in the transport of
electrons generated by respiration. D uring the process of aerobic respiration, coupled
oxidation-reduction reactions and electron carriers are often part of what is called an
electron transport chain, a series of electron carriers that eventually transfers electrons
from NADH and FADH 2 to oxygen. The diffusible electron carriers NADH and
FADH 2 carry hydrogen atoms (protons and electrons) from substrates in exergonic
catabolic pathways such as glycolysis and the citric acid cycle to other electron carriers
that are embedded in membranes. These membrane-associated electron carriers
include flavoproteins, iron-sulfur proteins, quinones, and cytochromes. The last electron
carrier in the electron transport chain, cytochrome oxidase, transfers the electrons to the
terminal electron acceptor, oxygen. In the case of anaerobic respiration, the last
electron carrier (eg, nitrate reductase) transfers electrons to an oxygen-containing
compound other than O 2 , eg, nitrate (NO 3
-
).

1. Catalase Activity

One of the by-products of oxidation-reduction in the presence of O 2 during aerobic
respiration is hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). This compound is highly reactive and must
be degraded in the cytoplasm of the cell producing it. It can be especially damaging to
molecules of DNA. Most aerobes synthesize the enzyme catalase , which breaks down
H 2 O 2 into water and oxygen (see background information on aerobic spore-formers).


2 H 2 O 2 2 H
2
O +
O
2
|


The O 2 gas is identified by the production of bubbles from a concentrated cell
suspension.

The test for catalase is simple and usually very reliable. It is a major method of
distinguishing between Staphylococcus (catalase positive), Streptococcus (catalase
negative), and Enterococcus(catalase negative), although some strains
of Enterococcus faecalis may be positive. Catalase production is generally associated
with aerobic organisms, since H 2 O 2 is a toxic by-product of aerobic growth, but not
always. Some anaerobes, particularly Bacteroides , a gut organism, produce catalase,
especially if they are exposed to air. All of the Gram negative bacteria we use in this lab
are catalase positive.

A variation of the test is used in identification of the plague bacillus Yersinia pestis ,
which is a very infectious organism causing a deadly disease. It can be spread by
inhalation (referred to as pneumonic plague), so the catalase test, which forms bubbles,
is dangerous. The catalase test can be done in such a way that the bubbles produced
do not make an aerosol.

Controls:
+: Staphylococcus epidermidis str. RP62A, 176279.3
- : Enterococcus faecalis 226185.1

Do a keyword search for catalase to predict the result for your test organism. Use the
control genomes to make sure you are looking for the right thing, and use the control
sequence to blast against the test genome if necessary.


2. Nitrate Reduction

Under anaerobic conditions, some bacteria are able to use nitrate (NO
3

-
) as an
external terminal electron acceptor. This kind of metabolism is analogous to the use of
oxygen as a terminal electron acceptor by aerobic organisms and is called anaerobic
respiration . Nitrate is an oxidized compound and there are several steps possible in its
reduction. The initial step is the reduction of nitrate (NO
3

-
) to nitrite (NO
2

-
). The
Trommsdorf test is used to detect nitrite.

Several possible products can be made from further reduction of nitrite . Possible
reduced end products include the following: N
2
(molecular nitrogen, a gas),
NH
3
(ammonia), N 2 O (nitrous oxide). Bacteria vary in their ability to perform these
reactions, a useful characteristic for identification.

A medium that will support growth must be used and the cells must be grown
anaerobically (no shaking). Growth in the presence of oxygen will decrease or eliminate
nitrate reduction.
Summary of Nitrate test results and interpretations

HASIL INTERPRETASI SYMBOL
Inky Blue after addition of
Trommsdorf I & II
Nitrate was reduced to nitrite
+1
No color after addition of zinc
dust
Nitrate was reduced to nitrite
and then further reduced to
another compound such as
NH 3

+2
Blue color after addition of
zinc dust
Nitrate is still present. The
bacteria being tested
did notreduce the nitrate

_

There are many possible end products of nitrate reduction such as nitrite, nitrogen gas
(N 2 ), nitrous oxides, ammonia, and hydroxylamine. One could either assay for
disappearance of nitrate or the appearance of the end products. The standard test
assays for the appearance of one of the products, nitrite. The test we use relies on the
production of nitrous acid from the nitrite. This, in turn, reacts with the iodide in the
reagent to produce iodine. The iodine then reacts with the starch in the reagent to
produce a blue color. Since some of the possible products of NO 3
-
reduction are
gaseous, a Durham tube is sometimes inverted in the culture tube to trap gases. This
being the case, it is important to pre-test the medium to ensure no detectable nitrite is
present at the beginning, and, in the case of a negative test, to reduce any nitrate to
nitrite to determine whether the nitrite was also reduced.

An interesting variation of this test is the use of blood agar containing nitrate. If nitrite is
produced, it reacts with hemoglobin to give a bright red color, instead of the dark red
color of hemoglobin. It is this reaction that is responsible for the color of meats, such as
hot dogs, which are preserved with sodium nitrite. The blood agar test has the
advantage of no color change occurring if the nitrite is further reduced.

Do a keyword search for nitrate reductase to predict the result for your test organism.
Use the control genomes to make sure you are looking for the right thing, and use the
control sequence to blast against the test genome if necessary.

Experiment 10 : Phenotype prediction Worksheet
20 points total, due February 11/12

Student's Name: __________________________________


Name of Test
Predicted
Result
Mengapa? provide evidence