TP Licence Biochimie

IBFA LICENCE 3 Physiologie Intgre (Bi514)

Travaux pratiques
MANIPULATION A ETUDE DES HEMICELLULOSES ET DETERMINATION DES ACTIVITES ENDO ET EXO - GLUCANASES ETUDE DE LACTIVITE PECTINE METHYLESTERASE MANIPULATION B DOSAGE DE L'AMIDON ET DU GLUCOSE ETUDE DES INVERTASES SOLUBLES DOSAGE DE L'ASCORBATE ET DU DEHYDROASCORBATE

Hordeum vulgare L. Enseignante: Annette BERTRAND, Unit Mixte de Recherche INRA-UCBN EVA Ecophysiologie Vgtale, Agronomie et nutrition N, C, S (Btiment IRBA, Campus 1) http://www.rennes.inra.fr/umreva/

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Prambule Lobjectif de ces deux sances de TP est de comparer deux types de tissus foliaires : des tissus jeunes en croissance, non (ou peu) photosynthtiquement actifs et des tissus adultes matures, photosynthtiquement trs actifs. Ces deux types de tissus sont respectivement des puits (importateurs nets de carbone) et des sources (exportateurs nets de carbone) pour le carbone. Cette comparaison se fera sur une poace, lorge (Hordeum vulgare). Chez les poaces, les feuilles sallongent presque exclusivement longitudinalement, le mristme foliaire est situ la base de la feuille. Les nouvelles feuilles apparaissent successivement entoures par les feuilles adultes. Lorsquune feuille atteint sa maturit, elle se dissocie en gaine foliaire (partie infrieure) et en limbe foliaire (partie suprieure) spares par la ligule (Figure 1). Lors de ces manipulations, le limbe des feuilles adultes (tissu mature, source de carbone) sera compar la base des feuilles en croissance (puits pour le carbone). Chez ces deux types de tissus seront compars : - Les activits endo- et exo--glucanases. Manip A - Lactivit pectine methylestrase - Les teneurs en protines - Les teneurs en amidon et en glucose Manip B - Les activits invertasiques solubles acides et alcalines. - Les teneurs en ascorbate et dehydroascorbate Un compte-rendu par binme sera demand lissu des deux sances de TP ( rendre pour le 9 novembre, dernier dlai) qui comprendra : - une introduction incluant les objectifs des manipulations effectues (quelques lignes) - Les principes succincts des mthodes utilises pour rpondre ces objectifs (2 pages maximum) - Les rsultats brut obtenus (2 pages maximum)

Les calculs dtaills (4 pages maximum) Un tableau rcapitulatif de lensemble des rsultats obtenus (voir modle page suivante) Une discussion des diffrents rsultats obtenus (2 pages maximum) Une conclusion (quelques lignes)

feuille en croissance limbe foliaire ligule feuille adulte

zone de croissance foliaire de la feuille en croissance

gaine foliaire

racines

Figure 1 : reprsentation schmatique dune talle de Poace.

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Limbes matures activits endo- et exo-glucanases. (mol.h-1.g MF-1) Endo Exo

Base des feuilles en croissance

Activit pectine methylestrase (mol.h-1.g MF-1) Teneur en protines (mg.g MF-1) Teneur en amidon (mg.g MF-1) Teneur en glucose (mg.g MF-1) Activits invertasiques Neutre solubles Acide (mol.h-1.g MF-1) Teneur en ascorbate (mg.g MF-1) Teneur en dehydroascorbate (mg.g MF-1) Rapport Ascorbate/Dehydroascorbate Ce tableau est un modle pour la rdaction du compte-rendu mais il peut galement vous servir cocher progressivement les diffrentes analyses au fur et mesure que vous les effectuez.

Manipulation A

Manipulation B

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MANIPULATION A

Etude des enzymes impliques dans la dgradation des hmicelluloses paritales.

A.I. DETERMINATION DES ACTIVITES ENDO ET EXO GLUCANASES. A.II. ETUDE DE LA PECTINE METHYLESTERASE A.III. DOSAGE DES PROTEINES

INTRODUCTION
La microscopie photonique a permis de distinguer plusieurs rgions dans la paroi. Vue perspective d'une paroi dissque montrant les diffrents niveaux - La lamelle moyenne est la formation la plus priphrique de la paroi, elle forme un ciment constitu de polysaccharides acides, les pectines. Cette enveloppe hydrophile polyanionique conditionne la cohsion intercellulaire. - Les niveaux plus internes de parois sont renforcs par une charpente cellulosique. Ces territoires paritaux apparaissent comme autant de coques concentriques et individuelles pour chaque cellule, dans lesquelles on distingue deux phases de composs polysaccharidiques : une phase cristalline discontinue : la cellulose. Celleci apparat chez les vgtaux suprieurs sous forme de microfibrilles lmentaires de diamtre compris entre 30 et 40 et agences en faisceaux. On distingue la paroi primaire; il s'agit d'un rseau hydrat (jusqu' 80% d'eau dont la matire sche renferme en majeure partie des polysaccharides (80-90%) associe des protines (10-15%) et des ions minraux notamment du calcium. Les hmicelluloses reprsentent un fort pourcentage des polysaccharides et la charpente fibrillaire est relativement lche. La paroi primaire est la seule enveloppe fibrillaire des cellules jeunes et en croissance. La proprit caractristique est donc la plasticit. Lorsque la croissance cesse, des assises nouvelles (appeles S1, S2, S3 dans le cas des cellules du bois du tilleul) sont labores: elles constituent la paroi secondaire inextensible. Cette paroi est peu hydrate (20 % ou moins d'eau). La charpente fibrillaire y est toujours compacte, la cellulose y est hautement cristalline. Signalons cependant que certaines parois secondaires ont une architecture fibrillaire non constitue de cellulose, mais d'hmicellulose. Le cas est frquent chez les algues et les champignons. Il se rencontre aussi chez les plantes suprieures, en particulier dans les cellules de l'albumen de graines qui stockent dans la paroi des polysaccharides de rserve (hmicelluloses).

Figure 1 : Vue perspective d'une paroi dissque montrant les diffrents niveaux

TP Licence 3 (Bi514) - LA CELLULOSE ( - 1, 4 glucane) :

b-

La cellulose est un homoglucane homogne et linaire, elle est constitue de -

- glucanes : homopolysaccharide sucres : glucose liaison : - 1, 3 et - 1, 4 degrs de polymrisation <30 (laminarine) 40 - 350 (lichenan) - LES PECTINES Les substances pectiques sont des macromolcules de nature glucidique, d'origine exclusivement vgtale, composes essentiellement d'acides galacturoniques.

D-glucose lis par les carbones 1 et 4. Deux motifs de -D-glucose constituent le cellobiose qui se rpte le long des chanes sans ramification latrale. Figure 2 : Dtail d'une molcule de - 1, 4 glucane Le nombre d'units glucose dans une microfibrille de cellulose varie entre 15 et 15000, avec une valeur moyenne d'environ 3000. Les chanes de cellulose sont couples ensemble par des liaisons hydrognes tablies entre les fonctions hydroxyles libres d'un glucose et un atome d'oxygne d'un motif d'une chane voisine. - LES HEMICELLULOSES Certains auteurs englobent sous le terme d'hmicellulose tous les polysaccharides paritaux autres que la cellulose et que les composes pectiques prsents dans la paroi cellulaire des plantes terrestres. Il existe de nombreux types d'hmicellulose. La plupart sont des htropolymres, certains peuvent tre constitus de 5 6 sucres diffrents. Les hmicelluloses prsentent une structure ramifie l'exception du cas particulier des - glucanes (tableau ci-dessous). HEMICELLULOSES
a-

Le terme de substance pectique est le terme gnrique. Les composs pectiques sont constitus par des acides galacturoniques lis en - 1, 4. Cette chane forme l'acide polygalacturonique ou acide pectique ; elle possde une extrmit rductrice. Acide polyuronique (pectines) a) Chane d'units acides galacturoniques b) Fonction acide estrifie par un groupement mthyle.

type : htropolysaccharide type de chane : ramifi chane principale sucres : xylose, mannose, galactose liaison : - 1, 4 chane secondaire sucres : acide mthyl-glucuronique, arabinose, glucose, galactose liaison : - 1, 2 ; - 1, 3 ; - 1-4 ; - 1, 6 degrs de polymrisation : 150-200

Figure 3 : Dtail dune molcule dacide polygalacturonique On connat seulement quelques types de substances pectiques possdant une structure aussi simple. Elles prsentent, en gnral, une structure plus complexe rsultant de la substitution de certains groupes sur la chane principale. Les fonctions acides sont souvent neutralises : on note en effet la prsence d'ions monovalents ou divalents tels que K+, Na+, Ca2+. Ces fonctions peuvent aussi tre estrifies par du mthanol (CH3OH); le degr de mthylation (DM) est dfini comme le nombre de

TP Licence 3 (Bi514) fonctions carboxyliques estrifies par le mthanol pour 100 fonctions carboxyliques. Ce paramtre est la base d'une classification des substances pectiques : si leur DM est compris entre 5 et 45-50%, elles font partie des pectines faiblement mthyles (pectines FM), si leur DM est suprieur 50%, elles constituent les pectines hautement mthyles (pectines HM). Dans la nature, les pectines sont le plus souvent hautement mthyles. D'autres sucres, tel que le rhamnose, peuvent entrer dans la composition des substances pectiques. Ces enzymes interviennent dans de nombreux processus physiologiques: division cellulaire, embryognse, maturation des fruits, germination, mobilisation des rserves. Elles font galement partie des protines PR (Pathogenesis Related Protines) qui interviennent dans la dfense des plantes contre les pathognes de deux faon: - elles dgradent les parois cellulaires de pathognes. - elles librent, partir des parois de la plante, des oligosaccharides qui peuvent agir comme liciteurs pour les ractions de dfense. Les - 1, 3 glucanases sont lies la trame paritale par des liaisons ioniques faibles et la majorit est lue par des solutions salines (NaCl) . Leur activit est trs gnralement stimule en milieu acide (pH optimum compris entre 4 et 6). Ces enzymes hydrolysent en particulier la laminarine, homopolysaccharide de rserve constitu de molcules de glucose relis en - 1, 3. Chez les vgtaux suprieurs, le glucono lactone est inhibiteur des activits exo - 1, 3 glucanases. Cet inhibiteur comptitif sera utilis dans ce TP afin de distinguer les activits endo des activits exo - 1, 3 glucanases. 2 - dtermination des activits - 1, 3 glucanases de feuilles d'orge 2.1. - Extraction des -1,3 glucanases (Endo + Exo) 2 x 1 g de tissu foliaire frais (limbe mature et base de feuille en croissance) sont broys au mortier 4C en prsence de 4 ml de tampon actate de sodium 100 mM pH = 5,0 additionn de NaCl 600 mM (tampon dextraction). Les broyats sont recueillis directement dans le tube centrifuger et le mortier est rinc avec 4 mL du tampon dextraction. Les broyats sont centrifugs pendant 10 minutes 5000 RPM (centrifugeuse rfrigre). Les surnageants sont complts 10 ml avec le tampon d'extraction (dans une prouvette de 10 ml) et conservs dans la glace. 2.2.-Purification partielle de l'extrait enzymatique d'Orge par chromatographie sur colonne PD - 10 (Pharmacia) Le gel de Sephadex de la colonne PD-10 est constitu par un rseau de mailles base de dextranes dans lesquelles les molcules pntrent plus ou moins selon leur taille. Les grosses molcules (suprieures 5 000 D) sont lues en premier. Les autres molcules (dont le NaCl et le glucose) seront retardes car, rentrant dans les mailles du rseau, elles empruntent un chemin plus long.

A-I- DETERMINATION DES ACTIVITES ENDO ET EXO 1,3 GLUCANASES

L'analyse des parois primaires isoles montre la prsence de systmes enzymatiques varis, parmi lesquels certains interviennent dans les changes et la mobilisation des rserves (invertase), d'autres dans les processus d'oxydo-rduction (malate deshydrognase, acide ascorbique oxydase) et tout un ensemble de glucanases catalysant la rupture des polysaccharides au niveau des liaisons - 1, 3 et - 1, 4. Il existe galement des pectinases et des pectine-mthylestrases (manipulations 2 et 3). Au cours de ce TP, nous tudierons les activits endo et exo - 1, 3 glucanases. 1 - Caractristiques des -1, 3 glucanase (EC 3.2.1.6) Les - 1, 3 glucanases assurent l'hydrolyse de la liaison - 1, 3 des chanes de - 1, 3 glucanes. Certains sont des exoglucanases intervenant aux extrmits des chanes (ct non rducteur) qu'elles raccourcissent en librant du glucose, d'autres sont des endoglucanases qui agissent l'intrieur des chanes en librant des molcules de - 1, 3 glucane plus courtes que les molcules originelles. Figure 4 : Dtail d'une molcule de - 1, 3 glucane (laminarine)

TP Licence 3 (Bi514) 45 min 40C puis 5 min 100C 5 min 100C 45 min 40C puis 5 min 100C 5 min 100C

Prparation des colonnes : Il est indispensable de suivre scrupuleusement les instructions ci-dessous : - Enlever le bouchon suprieur et liminer l'excs de liquide de conservation. - Dboucher l'extrmit infrieure de la colonne - Equilibrer la colonne avec approximativement 25 ml de tampon actate 100 mM, pH = 5,0 (tampon dlution). Ne jamais laisser la partie suprieure du gel compltement sec. Chromatographie de l'extrait foliaire d'Orge : - Appliquer 2,5 ml de l'extrait de - 1, 3 glucanases au sommet de la colonne et jeter l'effluent. - Eluer les protines avec 3,5 ml de tampon actate 100 mM, pH = 5,0 (tampon dlution). Le facteur de dilution de l'extrait enzymatique initial est donc gal 1,4. - Rincer ensuite la colonne avec 25 mL deau distille. 2.3.-Mesure des activits endo et exo - 1, 3 glucanases Le substrat utilis est la laminarine et la mesure des activits enzymatique est ralise en dosant la quantit de fonctions rductrices libres. L'incubation est ralise en prsence ou en absence de gluconolactone qui est un inhibiteur des exo 1, 3 glucanases. En prsence de gluconolactone, la quantit de fonctions rductrices libres correspond l'activit des endo - 1, 3 glucanases. En l'absence de gluconolactone, la quantit de fonctions rductrices libres correspond l'activit des endo - 1, 3 glucanases et des exo - 1, 3 glucanases. Prparer 8 tubes hmolyse de la faon suivante: Activit endo-glucanase (4 tubes) Milieu d'incubation "endoglucanase" 0,6 mL (avec gluconolactone) Milieu d'incubation "exoglucanase" Extrait enzymatique 0,4 mL partiellement purifi Tmoins "essais enzymatiques" (2 tubes*) (2 tubes*) Activits endo+exoglucanases (4 tubes) 0,6 mL 0,4 mL "essais enzymatiques" (2 tubes*) Tmoins (2 tubes*)

*1 tube pour le lextrait de limbe mature et 1 tube pour lextrait de base de feuille en croissance.

Composition des milieux d'incubation: - Incubation endoglucanase: tampon actate de Na 100 mM, pH = 5,0 contenant 7,5 mM de glucono lactone et de la laminarine 0,666% (P/V). - Incubation exoglucanase: tampon actate de Na 100 mM, pH = 5,0 contenant de la laminarine 0,666% (P/V). Les tmoins permettent de connatre la quantit de fonctions rductrices initialement prsentes dans chacun des cas. Aprs, l'incubation, l'arrt de la raction enzymatique est assur par chauffage 100C (bain-marie bouillant) pendant 5 minutes. L'activit est dtermine par la mesure des fonctions rductrices libres. 2.4- Mesure des fonctions rductrices apparues par action des endo et des exo , 1-3 glucanases (Mthode de Nelson). Ce dosage est bas sur la rduction du sulfate de cuivre par les fonctions rductrices des sucres rducteurs. Le cuivre prcipit ragit avec l'arsnomolybdate en donnant une coloration bleue dont on mesure l'intensit 520 nm au spectrophotomtre. Prparation de la gamme d'talonnage: la courbe talon (concentrations 0, 20, 40, 60, 80 g.ml-1) est ralise par dilutions successives d'une solution mre de glucose 1 g.L-1 en utilisant des fioles jauges de 50 ml. Dosage: - Diluer 10 fois le contenu des tubes des essais enzymatiques et 4 fois le contenu des tubes tmoins. - Mlanger 50 ml de ractif A et 2 ml de ractif B. - Prlever 1 ml de la solution doser (essai enzymatique, tmoin ou solutions talons) et ajouter 1 ml du mlange A+B. - Porter 20 minutes au bain-marie bouillant. - Refroidir et ajouter dans chaque tube 1 ml de solution darsnomolybdate. - Ajouter 5 mL deau dustille - Faire la lecture de la densit optique (DO) au spectrophotomtre 520 nm (coloration stable).

TP Licence 3 (Bi514) Peser 2 x 2 g de tissus foliaires (limbes matures et bases de feuilles en croissance) et dcouper en petits morceaux. Les chantillons foliaires sont broys dans un mortier plac dans la glace 4C, avec 1 ml de NaCl 0,2 M (toutes les oprations doivent tre ralises 4C). Ajouter 9 ml de NaCl 0,2 M en fin de broyage. Le broyat est vers dans un bcher de 50 ml, le mortier est rinc successivement deux fois avec 5 ml de NaCl 0,2 M, les liquides de rinage sont ajouts au broyat. Ce fin broyat constitue l'extrait enzymatique : il s'agit d'une suspension, l'enzyme fixe sur les parois n'tant pratiquement pas solubilis dans nos conditions d'extraction. Conserver cet extrait enzymatique 4C. 2. Incubation pH constant L'activit enzymatique est quantifie par une mesure du pH en fonction du temps. Dans un bcher de 150 ml, 50 ml d'une solution de pectine 0,25% (substrat) dans du NaCl 0,2 M, sont stabiliss 30C et le pH est ajust 7,60 avec de la soude 0,1 M puis 0,01 M. La mesure du pH doit tre faite en agitant doucement la solution. Puis le broyat est plac en agitation dans un bain thermostat 30C. Aprs quilibre thermique et sous agitation, le pH est amen une valeur de 7,60 avec de la soude 0,1 M puis 0,01 M. Au temps initial T0, toujours 30C, le broyat est vers dans le substrat sous agitation. A partir de ce moment, maintenir le pH la valeur 7,60 en versant de la soude 0,01M. Noter la quantit de soude consomme au bout de 15 minutes. N et N+n tant le nombre de fonctions acides non estrifies dans la pectine au dbut et la fin de la raction. L'enzyme s'attaque d'abord aux groupements mthyls voisins des groupements carboxyles libres puis l'hydrolyse se poursuit le long de la chane polysaccharidique en librant des molcules de mthanol. Il y a donc apparition de mthanol dans le milieu avec dmasquage de la fonction acide. Les mesures lectromtriques de pH se font avec rapidit et prcision, il est donc prfrable de dtecter les changements de pH dans le milieu ractionnel plutt que de tenter le dosage de faibles quantits de mthanol. 1. Extraction de l'enzyme partir du matriel vgtal Cette extraction est faire deux fois pour obtenir deux extraits enzymatiques qui serviront respectivement l'incubation pH variable et l'incubation pH constant. Expression des rsultats : - L'activit enzymatique est exprime en mol. de soude par heure pour 1 g de MF.

2.5. - Expression des activits enzymatiques Les activits enzymatiques endo- et exo-1,3glucanases sont calcules en mol de fonctions rductrices formes (exprime en mol h-1 g-1 MF). MMglucose = 180 g.mol-1 Remarque: ne pas oublier que la mesure porte sur 0,4 ml d'enzyme d'un extrait dilu 1,4 fois par chromatographie.

A-II. ETUDE D'UNE ENZYME DEMETHYLANTE : la pectine mthylestrase

Comme la polygalacturonase, la pectine mthylestrase intervient dans la maturation des fruits et la croissance cellulaire. La pectine mthylestrase permet la raction suivante :

A-III. EXTRACTION ET DOSAGE DES PROTEINES

Dans le cas particulier des protines paritales, insoluble dans nos conditions exprimentales, il est ncessaire d'utiliser une extraction la soude 1N avant un dosage colorimtrique par la mthode de Lowry. Cette extraction la soude permet dobtenir les protines solubles et les protines insolubles.

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a- Extraction : Peser 2 x 2 g de tissu foliaire (limbes matures et bases de feuilles en croissance), les broyer dans 1 ml de soude 1M. A la fin du broyage 3 ml de soude sont ajouts. Laisser en contact pendant 1h30 (au minimum) la temprature ambiante. Transvaser le broyat dans un tube centrifuger et rincer le mortier et le pilon soigneusement avec 2 x 1 mL de soude 1M. Le trs fin broyat obtenu est centrifug 10 minutes 4000 RPM, puis le surnageant recueilli est amen 10 ml dans une prouvette (avec NaOH 1M) Le dosage est ralis sur une partie aliquote aprs avoir dilu 10 fois et 20 fois l'extrait. b- Dosage colorimtrique : Les protines donnent en prsence des ractifs de Lowry et de Folin, une coloration bleue caractristique. La coloration finale rsulte : - de la raction du biuret qui se produit avec le ractif de Lowry (cuivre en milieu alcalin). - de la rduction des acides phosphotungstique et phosphomolybdique (ractif de Folin) par la tyrosine et le tryphophane des protines. Dans la gamme de concentrations donnes, l'intensit de la coloration est proportionnelle la quantit de protines prsentes dans la solution. La protine choisie comme rfrence est la srum-albumine. On l'utilise pour raliser la courbe talon. Prparation des solutions talons de srum-albumine : A partir d'une solution de srum-albumine 1 g.1-1, raliser des solutions 50 g.ml-1, 100 g.ml-1, 150 g.ml-1, 300 g.ml-1 dans des jaugs de 50 ml. Dosage (rpter deux fois chaque mesure): Dans un petit tube verser : - 0,6 ml de solution de srum-albumine ou 0,6 ml dchantillon - 3 ml de ractif C de Lowry Le ractif C de Lowry est obtenu en mlangeant 50 ml de ractif A et 1 ml de ractif B. Attendre 10 minutes. Faire un blanc en remplaant les 0,6 ml de srumalbumine par 0,6 ml deau. - Ajouter 0,3 ml de ractif de Folin - Mlanger par retournement et attendre 30 minutes - Faire la lecture au colorimtre 640 nm. Calculer la quantit de protines extraites en mg.gMF-1 PLAN DE TRAVAIL MANIPULATION A Binmes 1 et 2 : 1. Extraction et purification partielle des - 1, 3 glucanases par chromatographie. * Extraction des feuilles d'Orge * Conditionnement des colonnes de Sephadex G-25 * Purification partielle. 2. Mise en route simultane des incubations de l'extrait enzymatique destines la mesure des activits endo et exo glucanases (45min d'incubation) 3. Extraction des protines et de la pectine methylestrase. 4. Etude de lactivit pectine methylestrase pH constant (2 x 15 min). 5. Stopper les incubations pour les activits endo et exo - 1, 3 glucanases. 6. Prparer les solutions talons de glucose destines la mesure des fonctions rductrices apparues. 7. Prparation des solutions talons de albumine srique bovine. 8. Faire le dosage des fonctions rductrices (mthode de Nelson) (activits - 1, 3 glucanases) 9. Faire le dosage des protines (45 min) Binmes 3 et 4 : 1. Extraction des protines et de la pectine methylestrase. 2. Etude de lactivit pectine methylestrase pH constant (2 x 15 min). 3. Extraction et purification partielle des - 1, 3 glucanases par chromatographie. * Extraction des feuilles d'Orge * Conditionnement des colonnes de Sephadex G-25 * Purification partielle. 4. Mise en route simultane des incubations de l'extrait enzymatique destines la mesure des activits endo et exo glucanases (45min d'incubation) 5. Prparation des solutions talons de albumine srique bovine. 6. Stopper les incubations pour les activits endo et exo - 1, 3 glucanases. 7. Prparer les solutions talons de glucose destines la mesure des fonctions rductrices apparues. 8. Faire le dosage des fonctions rductrices (mthode de Nelson) (activits - 1, 3 glucanases) 9. Faire le dosage des protines (45 min)

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MANIPULATION B

Dosage de lamidon, du glucose et de lascorbate. Mesure des activits invertasiques solubles.

I. DETERMINATION DES TENEURS EN AMIDON ET GLUCOSE II. DETERMINATION DES ACTIVITES INVERTASIQUES
SOLUBLES III. DETERMINATION DES TENEURS EN ASCORBATE ET DEHYDROASCORBATE
B. I. DETERMINATION DES TENEURS EN AMIDON ET EN GLUCOSE L'amidon est la principale substance glucidique synthtise sous forme de rserve par les vgtaux suprieurs partir de l'nergie solaire. Il constitue une source nergtique indispensable l'alimentation des tres vivants. L'hydrolyse acide complte de l'amidon libre 98 99 % de D-glucose. C'est donc un polymre du D-glucose. Les units de glucoses sont relies entre elles principalement par des liaisons 1, 4 et par 4 5 % de liaisons 1, 6. L'amidon est htrogne, il est form de deux constituants principaux : l'amylose, macromolcule linaire et l'amylopectine, macromolcule ramifie. La solubilisation des grains d'amidon dans le DMSO prsente l'avantage d'liminer les lipides et les acides gras constituants mineurs du grain d'amidon.

Principe des dosages : Dans un premier temps, les glucides solubles sont spars de lamidon par extraction leau chaude. Aprs centrifugation, le surnageant est conserv pour le dosage du glucose et le culot est utilis pour lextraction de lamidon. Lamidon est ensuite solubilis grce au DMSO (dimthylsulfoxyde ; stock sous la hotte) puis hydrolys en D-glucose par l -amylase pH 7,0 et par lamyloglucosidase (AGS) pH 4,5. Le glucose form est oxyd par la glucose oxydase. LH2O2 produit par la raction sert oxyder le 4-aminoantipyrine (incolore) grce la peroxydase. Il se forme un produit color en rouge, le 4-aminoantipyrine oxyd, qui absorbe 510 nm. Amidon + (n-1) H2O n D-Glucose + 2 H2O + O2 H2O2+ 4-aminoantipyrine AGS + -amylase Glucose oxydase peroxydase n D-Glucose acide gluconique + 2 H2O2 4-aminoantipyrine oxyde + H2O

1- Prparation des chantillons : 1.1- Sparation de lamidon et des glucides solubles dans leau : Peser 2 x 2 g de tissus foliaires (limbes matures et bases de feuilles en croissance) et dcouper en petits morceaux. Broyer les chantillons dans un mortier en prsence de 4 mL deau distille. Transvaser le broyat dans un erlenmeyer et rincer le mortier avec quelques mL deau distille. Complter le volume de lextrait 20 mL environ dans lerlenmeyer. Placer les erlenmeyers sur une plaque chauffante et maintenir une douce bullition pendant 15 min en recouvrant les erlenmeyers avec du papier daluminium. Bien surveiller lbullition pour ne pas laisser dborder lextrait. Laisser refroidir et transvaser les extraits dans des tubes centrifuger. Centrifuger 5000 RPM pendant 10 min. Transvaser le surnageant dans une prouvette et ajuster le volume 20 mL avec de leau. Conserver prcieusement cet extrait soluble pour le dosage ultrieur du glucose. 1.2- Solubilisation et hydrolyse de lamidon - Transvaser le culot dans un tube essai muni dun bouchon vis laide dune spatule. Mouiller les culots avec 0,2 ml dthanol 80%, mlanger au vortex. Puis ajouter 2 ml de dimthyl sulfoxyde (DMSO), mlanger au vortex. Mettre les tubes au bain-marie bouillant pendant 5 minutes. - Dans chacun des tubes, ajouter 3 ml d -amylase rsistante la chaleur, prpare dans le tampon MOPS (50 mM, pH 7,0). Agiter vigoureusement au vortex.

Dtail d'une molcule d'amidon

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TP Licence 3 (Bi514) Incuber les tubes dans un bain-marie bouillant pendant 6 minutes : il est essentiel de mlanger vigoureusement le contenu des tubes toutes les deux minutes. - Ajouter 4 ml de tampon actate de sodium (200 mM, pH 4,5), puis 0,1 ml damyloglucosidase. Agiter les tubes au vortex et incuber 50C pendant 30 minutes. - Transfrer le contenu des tubes dans un tube centrifuger et centrifuger 5 min 3000 rpm. Transvaser le surnageant dans une prouvette et ajuster le volume 10 mL. Cette solution constitue lextrait damidon hydrolys. 1.3- Dosage du glucose dans lextrait soluble et dans lextrait damidon hydrolys - Effectuer deux fois chaque dosage pour chacun des extraits (4 extraits) et le standard de glucose (glucose 1 g.L-1), et une fois pour le blanc. - Prlever 0,1 ml de solution pour chaque chantillon, 0,1 ml de solution de glucose 1 g.l-1 pour le standard glucose et 0,1 ml deau pour le blanc. Transfrer dans un tube hmolyse. - Ajouter 3 ml de ractif GOPOD (glucose oxydase, proxydase et 4-aminoantipyrine) et incuber les tubes 50C pendant 15 minutes. - lire labsorbance 510 nm en utilisant le blanc pour faire le zro. - Si la DO est suprieur 1, diluer lextrait et recommencer le dosage. 3- Calculs : Calculer la concentration en glucose dans chaque tube, par comparaison avec le rsultat obtenu pour le standard de glucose. En dduire la quantit de glucose prsent dans chaque extrait soluble (volume 20 mL au total) et dans chaque extrait damidon hydrolys (volume 10 mL au total). Avec le rsultat obtenu pour lextrait damidon hydrolys, calculer la quantit damidon en mg contenue dans chaque culot en sachant que 180 mg de glucose libre correspond 162 mg de rsidu glucosyl prsent dans lamidon de dpart. Dterminer la teneur en glucose et la teneur en amidon en mg par g de matire frache pour chaque chantillon. B. II - MESURE DES ACTIVITES INVERTASIQUES SOLUBLES ACIDES ET ALCALINES. Le saccharose est le produit final majeur de la photosynthse et la forme principale de transport des glucides chez la plupart des vgtaux suprieurs. Le saccharose qui est import vers les tissus non photosynthtiques est dirig vers diffrentes voies mtaboliques selon les activits physiologiques et les diffrents besoins mtaboliques de ces tissus: glycolyse, synthse de mtabolites primaires et secondaires, synthse de polymres glucidiques (amidon, fructanes, cellulose), de lipides et de polypeptides. Beaucoup de ces processus peuvent avoir lieu au mme moment dans les mmes cellules, ce qui implique l'existence de mcanismes de contrle trs fin. Dans ces cellules, l'utilisation du saccharose comme source de carbone et d'nergie dpend de son clivage en hexoses. Deux catgories d'enzymes participent cette dgradation: la saccharose-synthase (SuSy) et les invertases. D'une faon trs gnrale, la dgradation du saccharose par les invertases est associe la croissance des cellules alors que l'action de la SuSy est relie aux processus de biosynthse (produits de stockage, parois,). - La saccharose synthase (SuSy): c'est une glycotransfrase cytosolique qui convertit, en prsence d'UDP, le saccharose en UDP-glucose et fructose:

G-F
(saccharose)

UDP

(1) (2)

UDP-glucose

fructose

L'action de cette enzyme est rversible mais elle fonctionne gnralement dans le sens 1. - Les invertases: ce sont des hydrolases qui clivent le saccharose en deux monosaccharides:

G-F

H2O

glucose

+ fructose

Il existe deux catgories d'invertases: - les invertases insolubles: ce sont les invertases paritales acides (pH optimal compris entre 4,5 et 5) qui sont lies aux parois par des liaisons ioniques. - les invertases solubles: ce sont des invertases intracellulaires, on distingue: - Les invertases cytosoliques, alcalines (pH opt 7,5 - 8). - Les invertases vacuolaires, acides (pH opt 4,5-5).

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TP Licence 3 (Bi514) Dans ce TP, nous nous intressons la mesure des activits invertasiques solubles, cytosoliques (alcalines) et vacuolaire (acides) dans les jeunes feuilles d'orge. Remarque : Invertase et inversion Comme toutes les molcules chirales, les sucres en solution ont l'aptitude de faire tourner d'un angle le plan de polarisation de la lumire, soit vers la droite (molcule dextrogyre +), soit vers la gauche, molcule lvogyre -). Le fructose est beaucoup plus lvogyre (=-91) que le glucose n'est dextrogyre (+52,5). Le mlange de fructose et glucose en quantits gales est donc lvogyre (-38,5). Puisque le saccharose est dextrogyre (+66), l'hydrolyse d'une solution de saccharose provoque l'inversion de l'activit optique de cette solution: c'est l'origine du nom invertase pour ces enzymes qui hydrolysent le saccharose. 1- Extraction des invertases solubles des feuilles dorge Lextraction est ralise sur 2 x 2 g de tissus foliaires (limbes matures et bases de feuilles en croissance). Broyer 2 g de matire frache dans un mortier 5C (sur de la glace) en prsence de quartz et de 3 mL de tampon HEPES-NaOH pH 7 (tampon d'extraction contenant 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 2,6 mM DTT et 10% d'thylne glycol). Le broyat est transvas dans un tube centrifuger et le mortier est rinc avec 1 mL de tampon. Le broyat est centrifug 10 min 5000 RPM (centrifugeuse rfrigre). Le surnageant est transvas dans une prouvette et le volume est complt 5 mL avec le tampon d'extraction. 2-Purification partielle des extraits enzymatiques chromatographie sur colonne PD - 10 (Pharmacia) d'Orge par Chromatographie de l'extrait foliaire d'Orge : - Appliquer 2,5 ml de l'extrait enzymatique au sommet de la colonne et jeter l'effluent. - Eluer les protines avec 3,5 ml de tampon d'extraction HEPES-NaOH pH 7 (le facteur de dilution de l'extrait enzymatique initial est donc gal 1,4). - Rincer la colonne avec 15 mL de tampon dextraction. - Appliquer 2,5 ml du 2me extrait enzymatique au sommet de la colonne et jeter l'effluent. - Eluer les protines avec 3,5 ml de tampon d'extraction HEPES-NaOH pH - Rincer la colonne avec 25 mL deau distille. 3- Incubations enzymatiques: 10 tubes hmolyses sont prpars de la faon suivante (5 tubes pour chaque type dextrait, base ou sommet de feuilles) : Tmoin Invertase acide Invertase alcaline (1 tube) (2 tubes*) (2 tubes*) Extrait 200L 200L 200L Tampon pH7 (1) 800L Tampon pH4,8 (2) 800L Tampon pH 8 (3) 800L 5 min 100C 30 min 30C Puis 5 min 100C
*1 tube pour le lextrait de limbes matures et 1 tube pour lextrait de bases de feuille en croissance.

Le gel de Sephadex de la colonne PD-10 est constitu par un rseau de mailles base de dextranes dans lesquelles les molcules pntrent plus ou moins selon leur taille. Les grosses molcules (suprieures 5 000 D) sont lues en premier. Les autres molcules (dont le NaCl et le glucose) seront retardes car, rentrant dans les mailles du rseau, elles empruntent un chemin plus long. Prparation de la colonne : Il est indispensable de suivre scrupuleusement les instructions ci-dessous : - Enlever le bouchon suprieur et liminer l'excs de liquide de conservation. - Dboucher l'extrmit infrieure de la colonne - Equilibrer la colonne avec approximativement 25 ml de tampon d'extraction HEPES-NaOH pH 7 (ne jamais laisser la partie suprieure du gel compltement sec).

Composition des tampons: - (1) Tampon pH 7: c'est le tampon d'extraction HEPES-NaOH, pH7. - (2) Tampon pH 4,8: tampon actate de sodium 0,2 M contenant du saccharose 50 mM. - (3) Tampon pH 8: tampon HEPES-NaOH 50 mM contenant du saccharose 50 mM. - Les tubes "tmoin" sont placs immdiatement pendant 5 min dans un bain-marie bouillant pour arrter les ractions enzymatiques. - Les tubes correspondant aux essais enzymatiques sont placs pendant 30 min au bain-marie 30C. Aprs 30 min, les ractions enzymatiques sont stoppes en plaant les tubes pendant 5 min au bain-marie bouillant.

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TP Licence 3 (Bi514) B. III- EXTRACTION ET DOSAGE DE L'ASCORBATE DEHYDROASCORBATE DANS LES FEUILLES D'ORGE. ET DU

4- Dosage du glucose libr (mthode de Trinder la glucose oxydase): Principe La dtermination enzymatique, colorimtrique du glucose est base sur le couple de ractions enzymatiques suivant : glucose oxydase

Glucose + H2O + O2

acide gluconique + H2O2

peroxydase

H2O2 + 4-aminoantipyrine (incolore) + p-hydroxybenzne sulfonate quinoimine (rose) + H2O

L'intensit de la coloration rose, mesure au spectrophotomtre 505 nm, est proportionnelle la concentration en glucose initiale. Mthode : - Prlever 50 l de la solution doser (tmoins, essais enzymatiques, solutions talons*) et les placer directement dans une cuve pour spectrophotomtre volume rduit. - Ajouter 1 mL de ractif de Trinder (mlange de glucose oxydase, peroxydase, 4 aminoantipyridine et p-hydroxybenzne sulfonate). - Mlanger en retournant doucement (en bouchant avec un morceau de parafilm). - Aprs 15 minutes d'incubation temprature ambiante, la D.O. des chantillons est mesure au spectrophotomtre 505 nm. - Refaire certains dosages aprs dilution si ncessaire. *La courbe talon est ralise par dilutions de la solution mre de glucose 1g L-1 : prparer des solutions de 100; 200; 400 et 600 mg.L-1. La droite dtalonnage passe par zro. 5- Expression des activits enzymatiques L'activit invertasique est calcule dans chaque cas en mg de glucose form par h-1 g-1 MF (Ne pas oublier que la mesure porte sur 0,2 ml d'enzyme d'un extrait dilu 1,4 fois par chromatographie). Calculer galement lactivit invertasique en mole.h-1.g-1MF (MMglucose = 180 g.mol-1). Comparer et discuter les rsultats obtenus dans la base et le sommet des feuilles.

L'acide L-ascorbique (Vitamine C) est une vitamine importante pour l'alimentation humaine. Elle est abondante dans les tissus vgtaux et est un produit majeur driv du mtabolisme glucidique: les feuilles vertes peuvent contenir la mme quantit d'ascorbate que de chlorophylle. Chez les vgtaux, l'ascorbate a un rle essentiel dans plusieurs processus physiologiques. Il intervient comme rducteur pour de nombreux radicaux libres. Il participe la protection contre les stress oxydants: il intervient au niveau cellulaire dans la rduction de l'H2O2 en H2O via l'ascorbate peroxydase. L'ascorbate participe galement l'action des dioxygnases qui interviennent dans la biosynthse de plusieurs hormones vgtales et de nombreux mtabolites secondaires. Il intervient aussi dans le contrle du cycle cellulaire. La voie de synthse de l'ascorbate n'est pas totalement tablie mais il est maintenant admis que, chez les vgtaux, cette synthse drive du glucose-6phosphate selon la voie suivante : DGDP-D-mannose L-galacto 1,4 lactone L-ascorbate

La dernire tape fait intervenir la L-galacto 1,4 lactone deshydrognase qui est une enzyme mitochondriale. En tant qu'antioxydant, l'ascorbate ragit directement avec les radicaux libres (ions superoxydes, H2O2, radical tocopheroxyl,) pour former du monodehydroascorbate (instable) et/ou du dehydroascorbate, sans catalyse enzymatique: CH2-OH CH-OH O C C HO C OH C O OH O CH CH H2C O C HO C C O O OH O CH CH H2C O C HO C C O OH

OH

Ascorbate

Monodehydroascorbate (forme instable)

Dhydroascorbate

Les formes oxydes de l'ascorbate (monodehydroascorbate et dehydroascorbate) sont recycles en ascorbate par la monodehydroascorbate-reductase et la dhydroascorbate-reductase qui utilisent respectivement le NAD(P)H ou le glutathion

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TP Licence 3 (Bi514) comme rducteurs, dans le cadre du cycle Asada. Enfin, il est important de souligner que l'oxalate est un compos important issu du catabolisme de l'ascorbate. Dans ce TP, l'ascorbate et le dehydroascorbate seront doss dans de jeunes feuilles d'orge. Le rapport ascorbate/(ascorbate + dehydroascorbate) renseigne sur le degr d'oxydation cellulaire et sur la capacit de rgnration des formes oxydes des antioxydants solubles du tissu tudi. Lascorbate total est en quantit importante et le rapport ascorbate/(ascorbate + dehydroascorbate) est lev dans les tissus ayant une bonne capacit se protger contre les stress oxydants. 1- Extraction de l'ascorbate et du dhydroascorbate 2 x 2 g de matire vgtale frache (2 g de limbes matures et 2 g de base de feuilles en croissance) sont broys 5C (sur de la glace) en prsence de quartz dans un mortier contenant 3 mL d'acide mtaphosphorique 5%. Le broyat est transvas dans un tube centrifuger et le mortier est rinc avec 1 mL d'acide mtaphosphorique. Le broyat est centrifug 10 min 5000 RPM. Le surnageant est transvas dans une prouvette et le volume est complt 5 mL avec de l'acide mtaphosphorique. 2- Dosage de l'ascorbate et du dehydroascorbate. Principe du dosage: L'ascorbate rduit le Fe3+ en Fe2+ qui se complexe alors avec le 2,2'-dipyridyl. Le compos ainsi form absorbe 525 nm. Le dhydroascorbate est rduit en ascorbate par le DTT. L'ascorbate ainsi produit est dos comme prcdemment dcrit. Protocole (voir tableau page suivante pourle rsum du protocole): 1) Rduction du dhydroascorbate en ascorbate: - placer dans deux tubes hmolyse, 0,2 mL d'extrait foliaire, 0,2 mL de DTT 10 mM et 0,4 mL de tampon phosphate de potassium pH 8,5. -mlanger au vortex et laisser incuber 15 min temprature ambiante. 2) Prparation des solutions talons: Les solutions talon sont prpares partir d'une solution mre d'ascorbate 1 g/L de la faon suivante: Flacon 1 (0,200 g.L-1): 0,5 mL de solution mre + 2,5 mL d'acide mtaphosphorique. Flacon 2 (0,125 g.L-1): 0,5 mL de solution mre + 3,5 mL d'acide mtaphosphorique. Flacon 3 (0,100 g.L-1): 0,5 mL de solution mre + 4,5 mL d'acide mtaphosphorique. Flacon 4 (0,050 g.L-1): 0,5 mL de solution mre + 9,5 mL d'acide mtaphosphorique. Mlanger chaque solution talon. 3) dosage de l'ascorbate: Prparer 9 tubes de la faon suivante (le protocole est rappel dans la tableau page suivante) : Dans les deux tubes prcdement prpars (rduction du dhydroascorbate), ajouter, dans l'ordre: - 0,2 mL de N- thyl-malimide (NEM 0,5 %) sont ajouts pour neutraliser le DTT. Mlanger, laisser reposer 1 min, puis ajouter: - 1 mL de TCA. - 1 mL d'acide phosphorique 42 %. - 0,8 mL de 2,2'-dipyridyl. - 0,4 mL de FeCl3. !!!Attention!!!: au moment de l'ajout de FeCl3, le tube doit tre en train dtre vortex vigoureusement. Dposer le FeCl3 dans le tourbillon. Dans les 7 autres tubes hmolyse, ajouter, dans l'ordre: - 0,2 mL de solution doser : extrait foliaire (2 tubes), solutions talons (4 tubes), ou blanc* (1 tube). - 0,6 mL de tampon phosphate de potassium 0,75 M pH 8.5. - 0,2 mL d'eau distille. - 1 mL de TCA. - 1 mL d'acide phosphorique 42 %. - 0,8 mL de 2,2'-dipyridyl. - 0,4 mL de FeCl3. !!!Attention!!!: au moment de l'ajout de FeCl3, le tube doit tre en train dtre vortex vigoureusement. Dposer le FeCl3 dans le tourbillon. *Le blanc est ralis en remplaant les 0,2 mL de solution doser par 0,2 mL d'acide mtaphosphorique. Placer les 9 tubes 20 min 40C. Lire l'absorbance 525 nm. Calculer les teneurs en ascorbate et en dehydroascorbate dans chaque type de tissus foliaires (sommet et base de feuilles) en mg.g-1MF et dterminer le rapport ascorbate/(ascorbate + dehydroascorbate). Discuter les rsultats.

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TP Licence 3 (Bi514)

Extraits 1 Rduction du dhydroascorbate en ascorbate Volume dextrait (mL) DTT 10 M (mL) Tampon KP, pH 8,5 (mL) 2 tubes* 0 ,2 0,2 0,4 15 min dincubation temprature ambiante 0,2 mL puis 1 min dattente 1 1 0,8 0,4

Extraits 2 2 tubes* 0,2 0,6

Etalons blanc 5 tubes 0,2 0,6

et

PLAN DE TRAVAIL MANIPULATION B Binmes 5 et 6 : 1- Prparer les chantillons pour le dosage de lamidon et des sucres solubles. (extraction des glucides solubles et solubilisation de lamidon). 2- Raliser lextraction et lhydrolyse enzymatique de l'amidon. 3- Extraction des protines pour la mesure des activits invertasiques. 4- Faire le dosage du glucose dans les extraits solubles et dans les extraits damidon hydrolys 5- Purification partielle des protines pour les activits invertasiques. 6- Dmarrer les incubations enzymatiques pour les activits invertasiques (30min). 7- Extraction de l'ascorbate et du dehydroascorbate. 8- Arrt des incubations enzymatiques (invertases). 9- Dosage de l'ascorbate et du dhydroascorbate. 10- Prparer la gamme d'talonnage pour le dosage du glucose libr (activits invertases). 11- Dosage du glucose (activits invertases). Binmes 7 et 8 : 1- Extraction des protines pour la mesure des activits invertasiques. 2- Purification partielle des protines pour les activits invertasiques. 3- Dmarrer les incubations enzymatiques pour les activits invertasiques (30min). 4- Prparer les chantillons pour le dosage de lamidon et des sucres solubles. (extraction des glucides solubles et solubilisation de lamidon). 5- Raliser lextraction et lhydrolyse enzymatique de l'amidon. 6- Arrt des incubations enzymatiques (invertases). 7- Faire le dosage du glucose dans les extraits solubles et dans les extraits damidon hydrolys 8- Extraction de l'ascorbate et du dehydroascorbate. 9- Dosage de l'ascorbate et du dhydroascorbate. 10- Prparer la gamme d'talonnage pour le dosage du glucose libr(activits invertases). 11- Dosage du glucose (activits invertases).

Neutralisation DTT Dosage lascorbate

du

de

0,4 0,4 20 min 40C Lire la DO 525 nm et 2 Etalons Extraits 1 Extraits et blanc sommet et base sommet base de de feuille feuilles *1 tube pour le lextrait de limbes matures et 1 tube pour lextrait de bases de feuilles en croissance.

NEM 0,5 % (mL) Eau distille (mL) TCA (mL) Acide phosphorique 42 % (mL) 2,2 dipyridil (mL) FeCl3 (mL)

0,2 1 1 0,8

0,2 1 1 0,8

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