Departamento de Ciencias Biolgicas Laboratorio de Fisiologa Celular BIO-135

Simulacin de Potenciales de Accin y Corrientes Inicas

Fecha: 27-04-12 Seccin: 2 Integrantes: Fernanda Arredondo Tamara Bahamonde

Introduccin: Los potenciales de accin y la corrientes inicas son uno de los elementos fundamentales para la existencia de la vida, estn presentes en diversos tipos de organismos cumpliendo funciones tales como envo de seales desde una clula a otra, movimiento, coordinacin de la actividad en las plantas, etc. Pero Qu son? las corrientes inicas asen referencia a cualquier flujo inico a travs de la membrana, la cual tiende a cambiar el potencial. (1) y un potencial de accin se produce cuando por efecto de un estimulo apropiado se modifica la permeabilidad inica de la membrana de una clula excitable, este estimulo abre una seria de canales especficos para Na+, los cuales al quedar abiertos debido a la fuerte gradiente de concentracin generada por la bomba de Na+ provocan una entrada brusca de este ion, obteniendo como resultado un exceso de cargas positivas en el interior de la clula y no en el exterior generando que la diferencia de potencial entre ambas caras de la membrana cambie de signo. (2) En este prctico estudiaremos los mecanismos inicos asociados a la generacin de un potencial de accin mediante un modelo de simulacin computacional llamado potac. Este programa simula las principales caractersticas de la electrofisiologa. Fue creado por el Dr. Guillermo lvarez de Toledo Naranjo, de la universidad de Sevilla Espaa. Su programa tiene como fin poder estudiar el funcionamiento electrofisiolgico de un axn de calamar simulando potenciales de accin y corrientes inicas de acuerdo al modelo de Hodgking y Huxley. Gracias a este programa manejaremos las variaciones de tiempo de aplicacin del estimulo, concentracin extracelular de diferentes iones y la influencia de TTX y TEA en el potencial y las corrientes inicas.

Materiales y metodos Para llevar a cabo el estudio en distintas condiciones la generacion de potencial de accin a traves de un programa computacional, lo primero es dirigirse a la pagina que se encuentra indicada en el anexo y descargar el archivo Potac.zip y arrancar el programa. Al ejecutar el programa, aparece una pantalla de inicio, colocar comenzar y emergera una pantalla con las opciones experimentales *Fig.2 Anexo+, seleccionar realizacion de experimento sobre el potencial de accin, emergera una pantalla del montaje experimental utilizando un osciloscopio [Fig.1 Anexo]. Primero se debe generar un potencial de accin con los valores de la figura 4 que se encuentra en el anexo, los cuales corresponden a los valores iniciales y modificar la duracin a 0.2ms. Reinicie el programa y con los valores iniciales genere un potencial de accin, ahora modifique los valores de concentracion extracelular de Na+ a : 300, 200, 150 y 100mM y volver a estimular. Reinicie el programa, y volver a estimular con las condiciones iniciales, ahora se debe modificar las concentraciones extracelulares de K+ a: 2, 5, 50 y 100mM. Reinicie el sistema a la configuracion inicial y estimular. Utilizando las concentraciones de la tabla 1 en el anexo, estimule un segundo potencial de accin. Reinicie el sistema a la configuracion inicial[Fig.4 Anexo] y modificar la duracin a 0.5ms, estimular un potencial de accion. Ahora se deben modificar las concentraciones de TTX a : 5, 10, 20, y 50nM y estimular con cada una de ellas. Reinicie el sistema a la configuracion inicial y ahora con la duracion inicial de 0.1ms, estimular un potencial deaccin, luego modificar las concentraciones de TEA a 2, 5, 10 y 50nM, estimular con cada una de ellas. Reiniciar nuevamente el sistema a la configuracion inicial, registrar en la memoria e ir a la opcin analisis y dibujar el registro de corriente. Reiniciar el sistema a la configuracion inicial y modificar la escala del eje horizontal, ubicado en la barra de la derecha, a 5ms/div (con los signos + o -), luego modificar la duracion del pulso 1 a 0.5ms y configurar la amplitud y duracion del pulso 2 igual al pulso 1 y generar el estimulo. Con la barra de retraso buscar el tiempo necesario para que se genere un 2do impulso de igual duracion y amplitud.

Resultados Potencial de accin Al generar el estimulo para generar un potencial de accion en condiciones iniciales y otro con una duracion de 0.2ms, se observa distinta velocidad en la generacion del potencial de accin [Fig.3 Anexo]. [Fig.5 Anexo] A: Generacin de un potencial de accion en condiciones iniciales 440mM Na+ extracelular. B:Generacion de potencial de accion a 300mM Na+ extracelular. C: Generacion de un potencial de accin a 200mM Na+ extracelular. D: Generacion de un potencia de accion a 150mM Na+ extracelular. E: estimulacion para un potencial de accion a 100mM Na+ extracelular. [Fig.6 Anexo]A: Estimulo de un potencial de accion en condiciones iniciales 10mM K + extracelular. B: Estimulacion de potencial de accion a una concentracion 2mM de potasio extracelular. C: Estimulacion de potencial de accion a 5mM K+ extracelular. D: Estimulacion de un potencial de accion a 50mM K+ extratraceluar. E: Estimulacion de un potencial de accion a 100mM K+ extracelular. [Fig. 7 Anexo] A: Estimulo para generar un potencial de accion a concentraciones ionicas iniciales correspondientes a las de un calamar[Fig.4 Anexo] y B corresponde a las concentraciones ionicas de intracelular y extracelular de un mamifero [Tabla 1 Anexo]. [Fig.8 Anexo]Potenciales de accin generados a distintas concentrasciones de tetrodoxina y a 0.5 de duracion, donde A corresponde al potencia de accion en condiciones iniciales, B es el potencial generado con la presencia de 5nM(TTX), C es el potencial de accion generado con 10nM(TTX), D es el potencial de accion generado a 20nM(TTX) y E es el estimulo del potencial de accion con una presencia de 50nM(TTX). [Fig.9 Anexo] Potencial de accion generado por un estimulo con distintas concentraciones de TEA, donde A corresponde al potencial de accion en condiciones iniciales, B tiene una concentracion de 2mM(TEA), C es un potencial con una concentracion de 5mM (TEA), D y E corresponde a un potencial de accin con una concentracion de 10mM y 50mM respectivamente, estos tienen un mismo potencial. Analizando un potencial de accion en condiciones iniciales, se encuentran las corrientes ionicas [uA/cm2] donde, 1: Corriente ionica de K+, 2: primer pic de la corriente ionica de Na+, 3: segundo pic de la corriente ionica de Na+ Al aplicar dos impulsos simultaneos, el segundo impulso no se genera, por lo que se aplica un retraso minimo para que este se genere, el cual corresponde a 10.8ms [Fig. 11 Anexo]. Corrientes Ionicas Para representar las corrientes ionicas en distintas condiciones y amplitudes, se utilizaron graficos, los cuales se encuentran en el anexo. Grafico 1 y 2, Corrientes de K+ y Na+, respectivamente, bajo codiciones normales, en funcion del voltaje (mV). Grafico 3 y 4, Corrientes de K+ y Na+, respectivamente, bajo concentraciones de 100mM TEA, en funciones del voltaje (mV). Grafico 5 y 6, corrientes de K+ y Na+, respectivamente, bajo concentraciones de 50nM TTX, en funcion del voltaje (mV).

Discusion Un potencial de accin bajo las condiciones normales del inicio del programa Potac, corresponde al axn de un calamar. Al crear un primer estimulo bajo condiciones iniciales y un segundo estimulo con una duracion de 0.2 ms, se observa que el estimulo B impulso un potencial de accin ms rapido que el estimulo A, pero de misma intensidad y duracion [Fig.3Anexo]. La intensidad y velocidad de un potencial de accin va a depender de cuanto demore en abrirse los canales de Na+.[6] Al modificar las concentraciones extracelulares de Na+, los potenciales de accin se hacen cada vez ms lentos y de menor intensidad y si es de muy baja concentracin como 100mM el potencial no se genera, esto se debe a que hay menos disponibilidad de Na+ en el medio extracelular, lo que conlleva a que cada vez menos Na+ entre a la celular y la entrada de Na+ es la que inicia y determina el potencial de accin[Fig.5 anexo]. Al ser modificadas las concentraciones extracelular de K+, se puede observar que comparando con el impulso normal, los estimulos dados con concentraciones bajas de 2mM y 5mM no generan un potencial de accin, ya que al haber un carencia de ion K+ existe un aumento de electronegatividad del potencial de reposo y por lo tanto hiperpolariza la celular, no alcanzando asi el umbral para propagar un potencial de accin[7]. En cambio en las concentraciones de 50mM y 100mM se observa que este alcanza el umbral para desencadenar un potencial de accin pero este al tener un exceso en la concentracion de K +, los canales se saturan haciendo que la repolarizacin sea muy lenta[Fig.6 Anexo]. El potencial de accin va a ser distinto para un mamifero que para un calamar, por lo que comparando esto, es notorio que el potencial de accin del mamifero es ms rpido y de mayor intensidad que el de calamar, adems que el potencial de reposo es completamente distinto, siendo el del mamifero antes que el de calamar. Los potenciales de equilibrios se vieron modificados para cada ion, para Na+ fue una diferencia de 7.8mV, para K+ 4.6mV y para Cl- fue de 24.0mV. La tetrodotoxina (TTX) bloquea los canales de Na+ de las celulas sin afectar a las corrientes de K+, produciendo inestabilidad nerviosa y paralisis, al aplicar distintas dosis de TTX se generan potenciales cada vez de menor intensidad y ligeramente menos rapidos hasta llegar a la no generacion del potencial, esto es porque la TTX bloquea los canales de Na+, impidiendo asi la entrada de Na+ al medio intracelular, el cual determina el inicio del potencial de accin. El tetraetilamonio (TEA) bloquea los canales de K+ sin afectar las de Na+, al aplicar distintas dosis de TEA se generan potenciales con distinta duracin y con una repolarizacin cada vez ms tarda, esto es porque los flujos de K+ son los que vuelven a la normalidad a la celula y si hay menos canales disponibles, la reentrada de potasio ser ms lenta y en algunos casos la celula queda inexitable ya que como se observa en D-E [Fig.9 Anexo] queda en el periodo refractorio relativo por mucho tiempo[8]. Al analizar un potencial de accin bajo condiciones iniciales del programa es posible identificar las corrientes de Na+ y K+[Fig.10 Anexo], donde el primer pic de la corriente de Na+ (1) corresponde a la apertura de canales por la desporalizacion de la membrana, mientras que el segundo pic de Na+ (2) corresponde al proceso de repolarizacin en donde los canales de Na+ se cierran y se abren los de K+ (3) y por ultimo ambos canales estan cerrados a espera de otro estimulo en el potencial de reposo (4).Al aplicar dos estimulos simultaneos estos no se generan ya que la celula necesita cierto minimo de tiempo para que los iones vuelvan a un estado de reposo. Segundo trabajo experimental: Corrientes inicas tem n1: En el grafico 1 y 2 del anexo de corrientes inicas podemos apreciar como circula la corriente normalmente teniendo en cuenta las concentraciones de sodio y potasio de la tabla 1. obteniendo una curva en donde a medida que aumentan la corriente aumenta el voltaje en el caso del potasio y en el sodio. tem n2: En el grafico 3 y 4 del anexo de corrientes observamos que al agregar 100 mM de TEA la corriente inica en caso del potasio es 0, fenmeno que podemos atribuir a que la droga provoca el cierre total de los canales de potasio a diferencia del grafico de las concentraciones de sodio donde la corriente se mantiene constante. tem n3: En el grafico 5 y 6 del anexo podemos apreciar que al agregar una concentracin de TTX de 50Nm, los valores de sodio disminuyen considerablemente, ya que este compuesto provoca una inhibicin importante en los canales de sodio a diferencia del potasio que se mantiene normal y no se ve afectado por TTX.Por ltimo en el tem numero 4 podemos darnos cuenta de que no existen corrientes ni de sodio ni de potasio ya que al agregar ambas drogas al mismo tiempo provoca la inhibicin total de los canales para ambos iones.

Conclusion De todo esto se puede rescatar que el tiempo que demore los canales de Na+ en abrirse va a depender de la intensidad y la duracin del estimulo para la generacion de potencial de accion, es decir, mientras ms dure un estimulo, hasta cierto limite, ms rapido ser la propagacion del potencial de accin, al llegar al limite la velocidad se mantendra constante. Esto lleva de la mano la concentracin de Na+ en la cual se encuentra la celula, la intensidad y velocidad de propagacion de la celula tambie va a depeder de la entrada de Na+, impulsada por el estimulo, por lo que si hay bajas concentraciones en el medio extracelular, el potencial tardar ms y ser menos intenso o simplemente no se propagar. Por otro lado el potencial de reposo va a depender del equilibrio de K+, por lo que si hay mucho K+ en el medio, tardar ms en la repolarizacin y tardar ms en llegar al potencial de reposo. Las corrientes inicas son principalmente el flujo de iones a traves de los canales de las membranas en donde la apertura y cierre de estos puede ser modificado por agentes qumicos externos

Anexo Enlace del archivo: http://www.seccff.org/ampliadocencia.php?cod=VkZaRk9WQlJQVDA9

Fig.1 A: Amplitud del estimulo [A]. B duracin del estimulo [ms]. C: Aplicacin de estimulo al axn. D: Con esto se aade sustancias bloqueadoras de canales inicos. E: Para modificar la composicin inica de las soluciones en registro. F: corresponde al osciloscopio, este registra como va cambiando el potencial de membrana con respecto al tiempo. G: Velocidad de barrido, indica la rapidez con la que la traza puede barrer la pantalla del osciloscopio.

Fig. 2 Opciones experimentales de Potac

Fig.3 Generacion de dos potenciales de accion: A corresponde al potencial generado en condiciones iniciales. B es el potencial de accion con una duracin de 0,2ms.

Fig. 4 Composiciones ionicas iniciales correspondientes a las de un calamar

Fig.5 Estimulacion del potencial de accin a distintas concentraciones de Na+ en el medio extracelular.

Fig.6 Estimulacion de un potencial de accin con distintas concentraciones de K+ en el medio extracelular

Fig.7 Estimulos de un potencial de accion a distintas concentraciones ionicas para distintos organismos

Tabla 1. Concentraciones ionicas de un mamifero Na+ 120 K+ 4 120 -89.9 Cl120 10 -62.1

Concentracion extracelular (mM) Concentracion 10 intracelular (mM) Potencial de equilibrio 62.1 (mV)

Fig.8 Generacion de un potencial de accin con un estimulo de 0.5ms de duracion y a distintas concentraciones de tetrodotoxina (TTX).

Fig.9 Potenciales de accion generados a distintas concentraciones de tetraetilamonio (TEA)

Fig. 10 Analisis de las corrientes ionicas a concentraciones iniciales de iones.

1 2

Fig. 11 Dos potenciales de accin generados con una misma amplitud y duracin

Grafico 1. Corriente de K+ bajo condiciones normales

Axon normal Corriente K+

100 80 60 40 20 0 -20 0 -40 -60 -80 -100 -120

Axon normal Corriente K+ 200 400 600 800 1000 Linear (Axon normal Corriente K+)

Grafico 2: Corriente de Na+ en condiciones normales

Axon normal corriente de Na+

100 80 60 40 20 0 -400 -200 -20 0 -40 -60 -80 -100 200 Axon normal corriente de Na+ Linear (Axon normal corriente de Na+)

Grafico 3: Corriente de K+ en concentraciones de 100mM TEA

TEA 100mM Corriente de K+

100 80 60 40 20 0 -20 0 -40 -60 -80 -100 0.2 0.4 0.6 0.8 1 TEA 100mM Corriente de K+ Linear (TEA 100mM Corriente de K+)

Grafico 4: Corriente de Na+ en concentraciones de 100mM TEA

TEA 100mM Corriente de Na+

100 80 60 40 20 0 -400 -200 -20 0 -40 -60 -80 -100 200 TEA 100mM Corriente de Na+ Linear (TEA 100mM Corriente de Na+)

Grafico 5: Corriente de K+ en una concentracin 50nM TTX

TTX 50nM Corriente de K+

100 80 60 40 20 0 -20 0 -40 -60 -80 -100 -120

TTX 50mM Corriente de K+ 200 400 600 800 1000 Linear (TTX 50mM Corriente de K+)

Grafico 6: Corriente de Na+ en concentraciones de 50nM TTX

TTX 50nM Corriente de Na+

100 80 60 40 20 -2.5 -2 -1.5 -1 0 -0.5 -20 0 -40 -60 -80 -100 0.5 TTX 50mM Corriente de Na+ Linear (TTX 50mM Corriente de Na+)

Bibliografia

1. http://books.google.cl/books?id=HZaC45m9lMMC&pg=PA346&dq=corriente+ionica&hl=es419&sa=X&ei=nNmZTH5N4Xq8wTa4bSYBg&ved=0CC8Q6AEwAA#v=onepage&q=corriente%20ionica&f=false 2. http://books.google.cl/books?id=4h_IosytGvkC&pg=PA461&dq=que+es+el+potencial+de+accion&hl=es419&ei=3s2YT7nuEdLjggfbn-zLBg&sa=X&oi=book_result&ct=bookthumbnail&resnum=3&sqi=2&ved=0CEUQ6wEwAg#v=onepage&q=que%20es%20el%20potencial%20de%20 accion&f=false 3. http://mural.uv.es/monavi/disco/primero/fisio/Tema17.pdf 4. http://www.scribd.com/doc/50785531/2/Potencial-de-accion 5. http://www.seccff.org/ampliadocencia.php?cod=VkZaRk9WQlJQVDA9 6. http://www.braincampaign.org/Common/Docs/Files/2786/spchap2.pdf 7. http://147.83.15.91/Doc/cols_new/contenidos/data/072804502093.2.Alteraciones_Metabolismo_potasio. pdf 8. http://www.google.cl/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&ved=0CDUQFjAB&url=http%3A%2F% 2Fwww.idap.com.mx%2Fapuntes%2FFisiologia%2FSistema%2520Nervioso%2520Periferico(3).doc&ei=6aua T5rXA4KutwfXoWnBA&usg=AFQjCNHwUAYpDsswEgUaa1WCc2J9JyEfuQ&sig2=OdnsbJSMHLEhY7hMMwpIzw