Anda di halaman 1dari 11

Praktikum Biofarmasetik dan Farmakokinetik

Metode Pengendapan Protein Dalam Plasma

Bayyinah Dewanti Rosyana Fitri Ratna Dewi Hesty Priska Aprina Nur Ikhlas FARMASI IV A KELOMPOK 3 Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Jakarta

PERCOBAAN II METODE PENGENDAPAN PROTEIN PLASMA


I. TUJUAN PRAKTIKUM Mengetahui berbagai metode denaturasi protein Melakukan proses pengedapan protein dengan berbagai metode DASAR TEORI A. Parasetamol Parasetamol atau asetaminophen, N-asetil-4Aminofenol (C8H9NO2), dengan BM 151,16 dan mengandung tidak kurang dari 98% dan tidak lebih dari 101,0% C8H9NO2. Pemerian: hablur atau serbuk hablur berwarna putih tidak berbau dan rasa pahit. Kelarutan: Larut dalam 70 bagian air, dalam 7 bagian etanol (95%), dalam 13 bagian aseton, dalam 40 bagian gliserol dan dalam 9 bagian propilenglikol; larut dalam larutan alkalihidroksida. Khasiat dan kegunaan yaitu analgetikum, antipiretikum. (Farmakope Indonesia edisi ketiga tahun 1979)

II.

Asetaminofen adalah metabolit fenasetin yang bertanggung jawab atas efek analgesiknya. Obat ini menghambat prostaglandin yang lemah pada jaringan perifer dan tidak memiliki efek anti-implamasi yang bermakna. Absorpsi asetaminofen tergantung pada kecepatan pengosongan lambung, dan kadar puncak di dalam darah biasanya tercapai dalam waktu 30-60 menit. Asetaminofen sedikit terikat dengan protein plasma dan sebagian dimetabolisme oleh enzim mikrosom hati dan diubah menjadi asetaminofen sulfat dan glukuronida, yang secara farmakologi tidak aktif. Kurang dari 5% diekskresikan dalam bentuk tidak berubah.

Suatu metabolit minor tetapi sangat reaktif (N-asetil p-benzo kuinon), penting pada dosis besar, karena toksisitasnya yang besar terhadap hati dan ginjal. Waktu paruh asetaminofen 2-3 jam dan relative tidak dipengaruhi oleh fungsi ginjal. Pada jumlah toksik atau adanya penyakit hati, wktu paruhnya bisa meningkat dua kali lipat atau lebih. Pada pemakaian 15 gram asetaminofen bisa berakibat fatal; kematian disebabkan oleh hepatotoksisitas yang berat dengan nekrosis lobules sentral, kadang berhubungan dengan nekrosis tubulus ginjal akut. (Bertram G. Katzung; Farmakologi dasar dan klinik edisi VI) B. Plasma
http://otetatsuya.wordpress.com/2009/04/02/plasma-darah-penjelasansingkat/

Darah terdiri dari sel darah terdiri dari sel darah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping darah (trombosit), yang tersuspensi dalam plasma. Plasma merupakan komponen cairan dari darah yang mengandung fibrinogen terlarut. Setelah aktivasi oleh enzim plasmin, terbentuklah gumpalan fibrin. Sesudah gumpalan ini disingkirkan, sisa yang tertinggal disebut serum. Plasma terdiri untuk sebagian besar dari air dengan terlarut dalam zat-zat elektrolit dan beberapa protein, yakni globulin (alfa-, beta-, gamma-), albumin dan faktor pembekuan darah. Plasma darah merupakan bagian cair darah. Cairan ini didapat dengan membuat darah tidak beku dan sel darah tersentrifugasi. Plasma terdiri dari 90% air, 7-8% protein, dan di dalam plasma terkandung pula beberapa komponen lain seperti garam-garam, karbohidrat, lipid, dan asam amino. Karena dinding kapiler permiabel bagi air dan elektrolit maka plasma darah selalu ada dalam pertukaran zat dengan cairan interstisial. Dalam waktu 1 menit sekitar 70% cairan plasma bertukaran dengan cairan interstisial. Serum darah adalah cairan bening yang memisah setelah darah dibekukan. Plasma darah berbeda dengan serum darah terutama pada serum tidak terdapat faktor pembentukan fibrinogen. Protein dalam plasma memiliki konsentrasi sekitar 1 mmol/L. Dengan bantuan elektroforesis, protein plasma dapat dipisahkan menjadi fraksi albumin serta fraksi 1, 2, , dan -globulin. Sekitar 56% protein plasma merupakan fraksi albumin, 4% adalah 1-globulin, 2-globulin sebanyak 10%, -globulin 12%, dan 18% dari jumlah protein plasma merupakan globulin. Globulin diperlukan untuk berbagai fungsi biologik. Sejumlah globulin dan -globulin mempunyai fungsi transpor khusus. Kelompok 1-

globulin yaitu transkobalamin yang mengangkut vitamin B12 dan transkortin yang mengangkut kortisol. -globulin bertanggung jawab untuk transpor besi bervalensi tiga dalam plasma. Sementara itu, globulin merupakan glikoprotein yang pada pemisahan elektroforesis bergerak paling lambat. Karena peran sertanya pada reaksi imun, maka -globulin disebut juga imunoglobin (IgG). Protein plasma juga mempunyai peran yang penting dalam pengaturan distribusi air antara plasma dan ruang interstisial, karena sebagai protein ia tidak dapat melewati dinding kapiler. Dengan demikian, tekanan osmotik koloidnya akan menahan air dalam sirkulasi darah. Peran yang terbesar dilakukan albumin (80%). Albumin juga mempunyai arti yang besar untuk ikatan protein obat. Tekanan osmosis plasma yaitu 7,3 atm dan dijaga dengan pengaturan osmosis yang berfungsi dengan baik. Pada tekanan ini, yang berperan sampai 96% elektrolit anorganik. Perbandingan ion yang satu terhadap ion yang lain dan pH plasma juga dijaga hampir tetap oleh proses pengaturan khusus. Kation dengan konsentrasi plasma tertinggi adalah natrium sedangkan anion plasma yang secara kuantitatif paling berarti adalah klorida.
http://ilmu-kedokteran.blogspot.com/2007/11/penetapan-kadarparasetamol.html

Pengukuran konsentrasi obat di dalam darah, serum atau plasma adalah pendekatan secara langsung yang paling baik untuk menilai farmakokinetik obat di dalam tubuh. Darah mengandung elemen seluler mencakup sel darah merah, sel darah putih, keeping darah, dan protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya serum atau plasma digunakan untuk pengukuran obat. Untuk mendapatkan serum, darah dibekukan dan serum serum diambil dari supernatant setelah disentrifugasi. Plasma diperoleh dari supernatant darah yang disentrifugasi dengan ditambahkan antikoagulan seperti heparin. Oleh karena itu, serum dan plasma tidak sama. Plasma mengalir ke seluruh jaringan tubuh termasuk semua elemen seluler dari darah. Dengan berasumsi bahwa obat di plasma dalam kesetimbangan equilibrium dengan jaringan, perubahan konsentrasi obat akan merefleksikan perubahan konsentrasi perubahan konsentrasi obat di jaringan (Shergel, 1999). Dalam sebuah analisis obat dalam cairan hayati, ada hal-hal penting dalam farmakokinetika yang digunakan sebagai parameterparameter, antara lain yaitu: Tetapan laju invasi atau tetapan absorpsi. Volume distribusi yang menghubungkan jumlah obat di dalam tubuh dengan konsentrasi obat (C) di dalam darah atau plasma.

Ikatan protein. Laju eliminasi dan waktu paruh dalam plasma (t1/2). Bersihan (Clearence) renal, ekstrarenal dan total. Luas di bawah kurva dalam plasma (AUC). Ketersediaan hayati

Standard Protein
http://nurulliahappy.wordpress.com/

Pemilihan standard protein merupakan penentu keberhasilan analisis kuantitatif. Bovine Serum Albumin (BSA) adalah protein yang umum digunakan sebagai standard dalam penetapan kadar protein. BSA banyak dipilih karena tingkat kemurniannya yang tinggi dan harganya relatif murah. Standard protein lain yang bisa digunakan adalah Bovine Gamma Globulin (BCG), terutama untuk keperluan kuantifikasi antibodi karena BCG menghasilkan warna yang sangat mirip dengan immunoglobulin G (IgG). Larutan induk (stok) standard protein biasanya dibuat dalam konsentrasi 1 5 mg/mL, namun tidak menutup kemungkinan dibuat larutan stok dengan konsentrasi yang lebih besar. Pada laboratorium yang lengkap, pemisahan protein dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu : 1. Salting out. Tiap-tiap protein berbeda sifat pengendapannya. 2. Ultra sentrifugasi. Protein dengan BM yang besar akan mengendap paling cepat. 3. Elektroforesis. Perbedaan kecepatan migrasi pada medan listrik berdasarkan IEP. 4. Kromatografi. Perbedaan kecepatan gerak pada media berdasarkan ukuran molekul. 5. Teknik immunokimia. Antibodi tertentu akan terikat dengan antigen yang sesuai. C. Ekstraksi cair-cair pakai etil asetat (jelasin) Merupakan proses pemisahan dimana suatu zat terbagi dalam 2 pelarut yang tidak bercampur. Ekstraksi cair-cair terdiri dari: 1. Ekstraksi dengan pelarut bercampur (dialysis, osmosis) 2. Ekstraksi dengan pelarut tak bercampur : partisi dalam dua pelarut

III. ALAT DAN BAHAN BAHAN NaOH Parasetamol AsetonNitril Plasma Metanol TCA Aquades

0,1 M 4 gram

ALAT Becker glass Labu ukur 100ml Pipet tetes Vortex Sentrifuse Pipet Bold 1ml IV. CARA KERJA KALIBRASI PARASETAMOL 1. Menyiapkan alat dan bahan, 2. Membuat larutan induk dari parasetamol sebanyak 1mg/ml parasetamol = 1000ppm 3. Diencerkan dengan NaOH dan dimasukkan kedalam labu ukur 100ml PROSES PENGENDAPAN PROTEIN DALAM PLASMA 1. Diambil 500l (0,5ml) plasma ditambah 500l (0,5ml) Parasetamol 1000ppm 2. Dimasukkan ke dalam tabung ependrof (sebanyak 3 buah) dalam jumlah yang sama 3. Masing-masing tabung dtambah pengendap protein sebanyak 1ml (Acetonitril, TCA, Metanol) Ditutup masing-masing tabung dengan rapat 4. Kemudian divortex selama 15detik 5. Dimasukkan ke sentrifugasi dengan kecepatan 15000rpm selama 5menit

6. Diamati endapan yang terjadi bagian atas pengendap protein (Asetonnitril, TCA dan Metanol) dan bagan bawah protein yang mengendap 7. Diambil dengan pipet bagian atas (supernatan) Ekstraksi Cair-Cair 1. Dari ketiga pengendap protein tersebut (Acetonitril, TCA, Metanol) pilih yang paling baik untk mengendapkan protein (diambil sebanyak 1ml) 2. Ditambahkan etil asetat sebanyak 1ml 3. Kemudian divortex selama 15detik 4. Dimasukkan ke sentrifugasi dengan kecepatan 15000rpm selama 5menit 5. Diamati endapan yang terjadi bagian atas pengendap protein (Asetonnitril, TCA dan Metanol) dan bagan bawah protein yang mengendap 6. Diambil dengan pipet bagian atas (supernatan) 7. Dimasukan kedalam kulkas untuk pengamatan lebih lanjut V. HASIL PENGAMATAN

VI. PEMBAHASAN Pada praktikum uji analisis parasetamol dalam plasma. Menggunakan larutan parasetamol dengan konsentrasi larutan induk 1000ppm. Konsentrasi

yang telah dibuat dipipet sebanyak 0,5ml dicampur dengan 0,5ml plasma dan 1ml pengendap protein (TCA, acetonitril atau metanol) kemudian campuran tadi divortex agar dapat bercampur secara merata dan terbentuk ikatan antara obat dengan protein plasma. Kemudian dilakukan proses sentrifugasi. TCA, acetonitril dan metanol berfungsi untuk mengendapkan protein dalam plasma darah, sehingga yang tersisa dibagian atas atau yang dikenal dengan supernatan hanyalah ikat obat dengan plasma. Percobaan ini dilakukan untuk mengedapkan protein pada sampel. Hal ini dilakukan ketika akan melakukan uji farmakokinetik berikutnya. Perlakuan ini harus dilakukan karena adanya protein dalam sampel akan mengganggu uji farmakokinetik yang dilakukan. Perlakuan ini juga dilakukan untuk mengisolasi atau memisahkan obat yang akan diteliti dari matriks sampel. Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi protein. Denaturasi dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperature, yang dan penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein umum

digunakan adalah dengan penambahan precipitating agen t. Dalam praktikum ini precipitating agent yang digunakan adalah TCA , Acetonitril, dan Metanol. Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat potein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga potein dapat mengendap. Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga potein mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifa lain yang berhubungan dengan

presipitasi protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen. Mekanisme TCA sebagai agen presipitasi yakni ion negatif dari TCA akan bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam yang dihasilkan tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk memisahkan protein dari larutan. Umumnya agen presipitasi akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa (membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein). TCA umumnya digunakan untuk protein-protein yang telah berada dalam keadaan bebas pada filtrat darah dan pada pemeriksaan awal materi biologis. Bila protein belum berada dalam kondisi yang bebas maka perlu penambahan asam tanin, dimana tanin akan bereaksi dengan protein kulit membentuk protein tanat yang tidak larut. Metanol dan Asetonitril merupakan pelarut organik yang dapat

mengendapkan protein. Pengendapan ini berkaitan dengan protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin menurun. Penambahan larutan organik seperti metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurunkan Kd (Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan. Pada hasil percobaan diperoleh bahwa keefektifan pelarut organik asetonitril lebih besar dibandingkan dengan metanol. Dari hasil praktikum diperoleh bahwa semua agen presipitasi dapat mengendapkan protein pada sampel plasma. Dari gambar dapat dilihat

bahwa yang paling efektif adalah TCA. Sedangkan yang kurang efektif adalah Metanol. VII. KESIMPULAN Denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, ikatan garam atau bila susunan ruang atau rantai polipetida suatu molekul protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah terjadi kerusakan struktur sekunder, tertier dan kuartener, tetapi struktur primer (ikatan peptida)masih utuh.

Presipitasi Agent protein yang paling efektif untuk parasetamol adalah

TCA.

Tujuan ekstraksi cair-cair dengan etil asetat yaitu untuk memisahkan

supernatant dengan TCA, sehingga supernatant yang didapat bisa lebih murni. Keuntungan metoda presipitasi plasma protein menggunakan agen presipitsi adalah mudah dilakukan dan cepat namun kerugiannya yakni tidak dapat mengendapkan protein secara sempurna. VIII.DAFTAR PUSTAKA

Shargel, Leon. 2005. Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan Edisi II. Surabaya: Airlangga University Press. Shergel, L., Yu, B.C. Andrew., 1999, Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, edisi 4, hal 30-32, Appleton & Lange, USA
Nurmeilis, M.Si, Apt,dkk. 2009. Penuntun Praktikum Farmakologi. Program studi farmasi FKIK UIN SYAHID Jakarta Katzung, BG. 1997. Farmakologi Dasar dan Klinik, edisi 6. Jakarta: EGC

Anonim. 1979. Farmakope Indonesia edisi ketiga. Jakarta: Depkes RI

http://farmasi07itb.wordpress.com/?s=presipitasi+plasma+protein http://otetatsuya.wordpress.com/2009/04/02/plasma-darah-penjelasansingkat/ http://ilmu-kedokteran.blogspot.com/2007/11/penetapan-kadarparasetamol.html

http://nurulliahappy.wordpress.com/