Bahan dan Metode Kultur sel dan perawatan obat.

CCRF-CEM dan sel HL-60 ditumbuhkan dalam RPMI-1640 medium dengan 10% (V / v) panas dilemahkan serum janin sapi, antibiotik (200 gmL-1 dari mM streptomisin dan 200 UML-1 penisilin G) dan 4 glutamin pada 37 C dalam suasana lembab yang mengandung 5% CO2. Analog nukleosida disintesis di IOCB menurut dengan protokol diterbitkan sebelumnya: 5-azacytidine (AC), 34 2'-deoksi-5-azacytidine (DAC) dan anomer alpha nya (-DAC), 35 5,6-dihidro-5-azacytidine (DHAC), 15 2'-deoksi-5 ,6-dihidro5-azacytidine (DHDAC) dan anomer nya (-DHDAC) .20 Zebularine itu dibeli secara komersial (Sigma). 10 mM saham solusi dalam H2O steril (5-azacytidine analog) atau DMSO (zebularine) yang baru disiapkan dan disimpan pada -80 C selama tidak lebih dari 3 hari. Larutan stok diencerkan dalam media kultur sel pada konsentrasi yang sesuai dengan IC50 mereka (50% pengurangan proliferasi sel setelah 3 hari pertumbuhan dalam suplemen obatmenengah). Sel-sel disubkultur pada hari ke 3 dan diberikan dengan segar media dan senyawa. Sel dipanen setelah lima hari budidaya. Proliferasi sel dan uji viabilitas sel. Penghambatan pertumbuhan IC50 ditentukan dengan menggunakan konsentrasi proliferasi XTT uji (Roche GmbH, Mannheim, Jerman) setelah 72 jam penanaman di media inhibitor ditambah. Setelah menerima perawatan berbagai eksperimen 50 uL suspensi sel adalah dicampur 1:1 dengan 0,4% larutan biru tripan, dicampur dengan baik dan dihitung menggunakan CountessTM your Kontra Otomatis (Invitrogen). Jumlah layak (terang) sel-sel yang tidak mengambil pewarna tercatat untuk setiap sampel. DNA isolasi. DNA genom (gDNA) diisolasi seperti sebelumnya dijelaskan dalam referensi 36, dengan inkubasi tambahan dengan RNase T1 sebelum DNA presipitasi. Hasil dari ekstraksi DNA diukur dengan menggunakan NanoDrop Spektrofotometer. Satu mikrogram gDNA per sampel menjadi sasaran elektroforesis pada gel agarosa 0,7% mengandung etidium bromida dan divisualisasikan di bawah sinar UV. Bisulfit modifikasi, metilasi khusus PCR (MSP) dan kuantitatif MSP (qMSP) amplifikasi. 1,5 ug gDNA itu bisulfit dimodifikasi menggunakan EpiTect bisulfit kit (Qiagen GmbH, Hilden, Jerman) menurut protokol pabrik. Konsentrasi dikonversi ssDNA dihitung menggunakan NanoDrop sebuah Spektrofotometri dan 50 ng digunakan untuk PCR amplifikasi. Primer-primer yang dirancang pada ekson-1 untuk membedakan antara DNA alkohol dan unmethylated dan dengan menghormati untuk modifikasi bisulfit sebagai berikut: CDKN2B alkohol rasa 5'-TCG CGG TTG CGT CGT TAG GCG T-3 '; alkohol antisense 5'-CGA CAA CCC GAA TAA TCC ACC G-3 '; unmethylated rasa 5'-GTT GTG TTT GAG TTG GTT TGT

G-3 '; unmethylated antisense 5'-TTA ATC CTC AAC AAC CAC CAA A-3 '; THBS-1 rasa alkohol 5'-GTT GCG TTC GAG TTG GTT TGC G-3 '; alkohol antisense 5'-TTA ATC CTC GAC GAC LKP CGA A-3 '; rasa unmethylated 5'-GTT GTG TTT GAG TTG GTT TGT G-3 '; antisense unmethylated 5'-TTA ATC CTC AAC AAC CAC CAA A-3 '. CpG kaya daerah yang terdeteksi menggunakan emboss CpGPlot / CpGReport / Isochore tersedia perangkat lunak secara gratis di www.ebi.ac.uk. MSP dilakukan dalam 25 ml mengandung 1x reaksi PCR penyangga (Promega), 0,125 mM dNTP masing-masing, 5,5 mM MgCl2, 200 nM primer masing-masing dan 1,3 U polimerase mulai panas (Promega). Dalam kasus qMSP 1x SYBR Hijau saya ditambahkan. Itu Program thermocycling termasuk: sebuah awal denaturasi pada 95 C selama 2 menit untuk memastikan reaktivasi lengkap dari DNA mulai panas polimerase, 40 siklus denaturasi pada 95 C selama 30 detik, annealing pada suhu yang ditunjukkan (THBS-1: M 69 C, U 62 C, CDKN2B: M 69 C, U 64 C) selama 30 detik dan pemanjangan pada 72 C selama 30 detik. Kekhasan dari produk diperkuat diperiksa oleh agarosa gel elektroforesis (standar MSP) dan analisis kurva leleh (QMSP). Kinerja tinggi analisis kromatografi cair alkohol 2'-5'-monophosphate deoxycytidine. 60 mg DNA itu resuspended dalam 50 ml H2O diredistilasi, panas-denaturated di 100 C selama 10 menit dan didinginkan dengan cepat pada es selama lebih 10 menit. DNA denaturated dicampur dengan nuklease P1 (Biomol, GmbH, Jerman) dan seng klorida untuk konsentrasi akhir 1,2 ug / ml dan 1 mM, masing-masing dan diinkubasi pada 42 C semalam. Untuk menghilangkan kotoran padat, sampel diekstraksi dengan metanol 70% pada -20 C selama 1 jam. Setelah sentrifugasi pada 15.000 xg pada suhu 5 C selama 5 menit supernatan yang diliofilisasi dan dilarutkan kembali dalam 70 ml H2O diredistilasi. Aliquot dari terhidrolisis DNA dianalisis menggunakan HPLC sistem Aliance Waters (996 Detektor PDA, PDA Memberdayakan Software Pro, versi 2) dilengkapi dengan 15 cm x 4,6 mm SUPELCOSILTM LC 18T, 3 reversephase pM kolom. Sebuah gradien non-linier asetonitril (0-30%) pada 50 fosfat kalium mM, pH 5,1, 3 tetrabutylammoniumbisulfate mM dengan laju alir 0,75 ml / menit digunakan untuk analisis. Puncak dari dCMP nukleotida yang sesuai, saya-dCMP, DGMP, dTMP dan lembab diidentifikasi (UV spektrum perpustakaan) dan dihitung dengan bantuan standar eksternal. Metilasi DNA profiling. Skrining untuk metilasi status 24 promotor gen dilakukan dengan menggunakan sebuah MethylprofilerTM Metilasi DNA PCR berbagai sistem (SABiosciences, Perusahaan Qiagen). Satu mikrogram gDNA yang dicerna dengan enzim restriksi menurut protokol pabrik. DNA sisa dihitung dengan real-time PCR di setiap enzim reaksi individu untuk mendeteksi status metilasi

gen. Data dianalisis dengan menggunakan Hierarchical Clustering metode (www.sabiosciences.com / dna_methylation_data_analysis. php, tersedia secara gratis) yang dikembangkan oleh produsen. Siklus sel analisis. 106 sel dicuci dua kali dengan PBS dan tetap dengan 70% etanol dingin selama 30 menit. Sel tetap adalah dicuci dalam PBS, dikerjakan dengan RNase A (500 mg mL-1) pada 37 C untuk 30 menit dan diinkubasi dengan larutan pewarnaan yang mengandung 0,1% Triton X -100 dan iodida propidium (100 mg mL-1) dalam PBS untuk 1 jam. Kandungan DNA selular ditentukan menggunakan cytometer aliran FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA). Mengalir penentuan cytometric apoptosis. Apoptosis adalah dihitung menggunakan ApoAlert Annexin V-FITC apoptosis kit (Clontech). Secara singkat, 106 sel dicuci dengan PBS danresuspended dalam 0,2 mL buffer +-mengandung Ca2 mengikat dilengkapi dengan 1 gmL-1 dari Annexin V-FITC conjugate dan diinkubasi dalam gelap selama 15 menit. Sel-sel dicuci dua kali dengan buffer mengikat, propidium iodida (5 GML-1) ditambahkan dan sel-sel segera dikenakan mengalir cytometric analisis. Kuantitatif RT-PCR. RNA total dari 3 x 106 sel adalah diekstraksi menggunakan kit isolasi RNeasy Mini (Qiagen GmbH, Hilden, Jerman) menurut protokol pabrik. itu kemurnian sampel RNA ditandai dengan mereka 260/280 dan 260/230 penyerapan rasio, yang setidaknya 1,8. cDNA adalah disintesis dari RNA 0,1 ug menggunakan superscript VILOTMcDNA Sintesis kit (Invitrogen) menurut protokol pabrik. Urutan primer adalah sebagai berikut: THBS-1 akal 5'-TGT AGA GAT CCC TCA TAA-3 '; antisense 5'-ATG CAA GCA CAG AAA AGA-3 '; CDKN2B rasa 5'-ATG ATG ATG GGC AGC GCC-3 '; antisense 5'-

AGC GTG TCC Agg AAG CCC3 '. Kuantitatif RT-PCR dilakukan dalam 25 ml menggunakan reaksi RT2 Tes Primer qPCR (SABiosciences) sesuai dengan produsen protokol menggunakan DNA Mesin OPTICON 2 thermocycler (Biorad). Program thermocycling termasuk: sebuah awal denaturasi pada 95 C selama 10, 40 siklus denaturasi pada 95 C untuk 30 detik, annealing pada suhu yang ditunjukkan (THBS-1 pada 44 C, CDKN2B pada 65 C) selama 30 detik dan pemanjangan pada 72 C selama 30 detik. Referensi gen PLA dan TBP ke tingkat mRNA normalisasi antara sampel individu yang diukur. Ucapan Terima Kasih Karya ini didukung oleh Proyek 1M0508 oleh Kementerian Pendidikan, Pemuda dan Olahraga Republik Ceko. ini kerja adalah bagian dari proyek penelitian dari Z40550506 Institute. Kami mengucapkan terima kasih kepada Ibu K. Mllerov dan D.Prkov untuk

Tujuan Dari kerja metode Sedikit HPLC untuk penentuan kuantitatif Azacitidine dalam formulasi dilaporkan dalam literatur. Laporan-laporan ini termasuk penentuan aktivitas biologis azacitidine 160-164. Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk mengembangkan dan memvalidasi, metode cepat ekonomis dan sensitif HPLC untuk penentuan kuantitatif Azacitidine dalam sampel obat curah dan persiapan suntik. Dalam rangka meminimalkan batch-ke-batch variasi ada kebutuhan besar untuk mengembangkan metode analisis yang cepat, sensitif dan divalidasi untuk hari-hari analisis obat dalam bentuk sediaan farmasi. 272 12,2 EKSPERIMENTAL Bahan kimia dan reagen: Azacitidine massal obat (99,85% kemurnian) dan formulasi adalah semacam hadiah dari TherDose Pharma Pvt. Ltd, Hyderabd, India.Instrumentasi: Sistem HPLC terdiri dari modul LC-2010 Shimadzu AHT Dengan Detektor PDA. Pengambilan data dilakukan dengan perangkat lunak solusi LC dioperasikan pada mikroprosesor Pentium IV. Zorbax Bonus Rp 250 x 4,6, 5m pada suhu kamar, dengan elusi gradien 0,02 M Amonium asetat dalam air. Laju aliran ditetapkan 1,0 ml / menit dan analisis dilakukan pada panjang gelombang 242 nm menggunakan Diode Array Foto (PDA) detektor. Fase gerak yang degassed dan disaring melalui saringan membran 0,2 pM sebelum memompa ke dalam sistem HPLC.Persiapan solusi: Persiapan larutan obat saham: Secara akurat ditimbang 20,0 mg standar Azacitidine dan ditransfer ke labu ukur 25 ml. Terlarut dan dibawa ke volume dengan pengencer (DMSO) dan campuran. (Konsentrasi 0,80 mg / ml). 273 Metode validasi: kesesuaian Sistem: Kesesuaian sistem dinilai dengan analisis mereplikasi enam suntikan obat pada konsentrasi 0,80 mg / ml. Kriteria penerimaan tidak lebih dari 2% untuk deviasi persentase relatif standar (% RSD) untuk daerah puncak dan 1,5% untuk waktu retensi puncak Azacitidine. Jumlah pelat teoritis tidak kurang dari 2500. Penentuan Batas Deteksi dan Batas Penghitungan (Sensitivitas): Batas deteksi Batas deteksi ditentukan dengan menghitung sinyal untuk rasio kebisingan (3) dan dengan membandingkan hasil uji dari sampel dengan konsentrasi analit yang diketahui dengan yang kosong dan sampel menetapkan tingkat minimum di mana analit dapat diandalkan terdeteksi. Efek solusi untuk LOD / LOQ: Secara akurat ditimbang 10,13 mg standar Azacitidine dan dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL.Terlarut dan dibawa ke volume dengan pengencer dan campuran (Konsentrasi 0,1013 mg / ml)-Stock solusi-aku 274 1ml saham atas solusi-aku dibawa ke sebuah labu ukur 10 ml, dilarutkan dan dibawa ke volume dengan pengencer. Saham-solusi-II (Konsentrasi-0,01013 mg / ml) 1,3 ml saham atas solusi-II dibawa ke dalam labu ukur 100 ml dan volume dibuat dengan pengencer dan disuntikkan ke dalam kromatograf. (Konsentrasi-mgml 0,00013). Batas Penghitungan Batas kuantisasi ditentukan dengan menghitung sinyal untuk rasio kebisingan (10) dan dengan membandingkan hasil uji dari sampel dengan konsentrasi analit dikenal dengan orangsampel kosong dan menetapkan tingkat minimum di mana analit dapat diandalkan terdeteksi. Linearitas (kurva kalibrasi): Bursa solusi: Secara akurat ditimbang 100,15 mg azacitidine ke dalam labu ukur 25 ml. Terlarut dan volume dibuat dengan pengencer ke tanda dan campuran. (Konsentrasi 4,006 mg / ml) Tingkat solusi: Disiapkan serangkaian larutan uji (solusi tingkat) dijelaskan di bawah ini pada konsentrasi yang berbeda (100% atas dan di bawah konsentrasi target) menggunakan larutan stok di atas. Level 50%: Ditransfer 1.0ml larutan stok ke dalam labu ukur 10 ml dan dibesarkan untuk volume dengan pengencer.

275 (Konsentrasi 0.4006mg/ml). Ini solusi tingkat disiapkan dalam rangkap dua. Level 75%: Ditransfer 1.5ml larutan stok ke dalam labu ukur 10 ml dan dibesarkan untuk volume dengan pengencer.(Konsentrasi 0.6009mg/ml). Ini solusi tingkat disiapkan dalam rangkap dua. Level 100%: Ditransfer 2.0ml larutan stok ke dalam labu volumetrik 10ml dan dibesarkan untuk volume dengan pengencer) (konsentrasi 0.8012mg/ml).. Ini solusi tingkat disiapkan dalam rangkap dua. Tingkat 125%: Ditransfer 2.5ml larutan stok ke dalam labu ukur 10 ml dan dibesarkan untuk volume dengan pengencer (konsentrasi 1.0015mg/ml).. Ini solusi tingkat disiapkan dalam rangkap dua. Tingkat 150%: Ditransfer 3.0ml larutan stok ke dalam labu volumetrik a10ml dan dibesarkan untuk volume dengan pengencer (konsentrasi 1.2018mg/ml).. Ini solusi tingkat disiapkan dalam rangkap dua. l dari setiap solusi yang disiapkan di atas disuntikkan ke sistem kromatografi terhubung ke kolom Bonus Zorbax RP C18 (x 250mm 4,6, 5 ) dan menghitung luas rata-rata dalam setiap kasus.Sekitar 5 Evaluasi statistik: Sebuah grafik antara konsentrasi dan luas rata-rata telah diplot. Poin untuk linearitas diamati. Menggunakan 276 metode yang paling kotak garis yang paling cocok diambil dan dihitung Koefisien Korelasi, Lereng dan y-intercept. Akurasi dan presisi: Akurasi dihitung sehubungan dengan solusi yang disiapkan di atas pada tingkat 75%, 100% dan 125% dari konsentrasi normal atau target. Keakuratan metode ini ditunjukkan melalui percobaan pemulihan pada 3 sampel pada konsentrasi 75%, 100% dan 125% dari konsentrasi yang sebenarnya digunakan dalam prosedur biasa. Konsentrasi sebenarnya yang digunakan dalam penentuan adalah 0,8 mg / ml Azacitidine berisi eksipien yang digunakan dalam formulasi penemu dan pemulihan dihitung dalam setiap kasus menggunakan persamaan garis regresi. Perhitungan: Dihitung jumlah azacitidine ditemukan di masing-masing larutan uji dengan menggunakan kurva kalibrasi. Tabel di bawah merangkum jumlah menambahkan vs jumlah yang ditemukan dan dihitung menggunakan kurva kalibrasi dan pemulihan persentase.Demonstrasi presisi dilakukan dalam dua kategori injeksi presisi reproduktifitas dan metode. Reprodusibilitas injeksi dinilai dengan menyuntikkan enam suntikan ulangan dari larutan standar Azacitidine dan standar deviasi relatif dari suntikan ulangan dihitung. 277 Injeksi Reproducibility standar deviasi relatif dari RT dan Luas solusi kesesuaian sistem di atas dihitung untuk reproduktifitas injeksi. Presisi metode Ketepatan metode dilakukan dengan menganalisis solusi sampel Azacitidine pada konsentrasi bekerja enam kali (persiapan ulangan Enam sampel). Standar deviasi persentase relatif dihitung untuk nilainilai uji azacitidine. Aplikasi Metoda untuk Formulir Dosis persiapan Standar solusi: Secara akurat ditimbang 6.71mg standar Azacitidine kerja (Lot No 71107AR002) ke labu ukur 10 ml, dilarutkan dengan pengencer dan volume dibuat untuk menandai dengan pengencer (0.671mg/ml Konsentrasi ). Persiapan ujian solusi: terlarut dan akurat ditransfer isi Vidaza 100 mg / botol (Lot No.1577875) dengan pengencer ke labu ukur 200ml dan volume dibuat untuk menandai dengan pengencer (Konsentrasi 0.50mg/ml). Disuntikkan di atas solusi yang disiapkan ke sistem kromatografi dan menghitung% dari uji 278 STABILITAS: Preparasi Sampel: Tentang 20,18 mg Azacitidine ditimbang secara akurat dan ditransfer ke labu ukur 25 ml. Terlarut dan dibawa ke volume dengan baik pengencer dan campuran.(Konsentrasi 0.807mg/ml). Validitas solusi assay ditunjukkan untuk jangka waktu 48 jam pada 25 0 C dengan chromatographing solusi yang sama pada interval periodik.

llarutan standar disuntikkan pada jam 0, 24 dan 48 ke kolom dari sistem kromatografi dan mencatat luas puncak dalam kromatogram.Prosedur: Sekitar 5 Perincian:

Perincian: Kekhasan metode ini ditunjukkan dengan cekinterferensi dengan menyuntikkan pengencer (DMSO) fase kosongdan mobile untuk menentukan apakah ada puncak pada pengencerdan puncak plasebo adalah coeluting dengan puncak azacitidine.kromatogram Sekitar 5 l dari sulfoksida dimetil dan solusi fase gerak disuntikkan ke dalam kolom. Tidak ada gangguan puncakdielusi dalam pengencer (DMSO), dan fase gerak dengan puncakazacitidine diamati. 279 12,3 HASIL DAN PEMBAHASAN Metode dan pengembanganoptimasi: Azacitidine secara bebas larut dalam obat DMSO.Thedapat dipisahkan pada SB Zorbax - kolom C18 dalam mode faseterbalik. Optimalisasi pengembangan metode dilakukan dengan mengubah komposisi mobile dengan elusi gradien. Bentuk puncak dan simetri yang baik dengan Amonium asetat dari 0,02 M dalamair dan puncak Azacitidine diselesaikan dengan resolusi lebih besar dari 1,0 dengan laju aliran 1,0 ml / menit. Metode Validasi:Kesesuaian Sistem: Resolusi tidak kurang dari 1,0, jumlah pelatteoritis tidak kurang dari 2500, dan persentase simpangan bakurelatif (% RSD) untuk RT tidak lebih dari 1,5% dan KawasanPuncak tidak lebih dari 2,0% untuk Azacitidine puncak. Para%RSD puncak daerah dan RT untuk obat berada dalam 2% menunjukkan kesesuaian sistem (Tabel 12.2). Efisiensi kolomseperti yang diungkapkan oleh jumlah pelat teoritis untuk 6 suntikanulangan adalah 4974 dan faktor tailing adalah 1,10. TABLE 12.2: Acceptance Result SYSTEM criteria SUITABILITY STUDY OF AZACITIDINE System suitability parameter Theoretical >2000 4974 plates Tailing factor <2 1.10 Releatative <2 0.27 Standard deviation of area Relatative standard deviation of RT Determination of Limit of Detection and Limit of Quantitation (Sensitivity): The result obtained for Azacitidine is listed in Table 12.3. The Signal to Noise ratio should be around 3 for LOD Table -12.3: Concentratio Signal to LOD data for n (mg/ml) noise Azacitidine Component Azacitidine 0.00013 3.4 : 1

Table 12.5: Linearity of Azacitidine Level 50 75 100 125 150

% of Azacitidine w.r.t. working strength 50.1 75.1 100.2 125.2 150.2

Concentratio n (mg/ml)

Peak Area

0.4006 0.6009 0.8012 1.0015 1.2018

3331480 5200048 6703999 8393753 10246133