Sebuah prosedur yang dijelaskan untuk penentuan cepat INTRAERITROSITER yang konsentrasi 6-mercaptopurine (6-MP) dan metabolitnya, 6-thioguanine

nukleotida (6-TGN) dan 6-methylmercaptopurine (6-MMP). Eritrosit (8 x 108 sel) dalam 350 ml larutan Hanks yang mengandung 7,5 mg dithiothreitol diobati dengan 50 ml perklorat 70% asam. Endapan telah dihapus dengan sentrifugasi (13.000 g) dan yang dihidrolisis supernatan pada 100 C selama 45 menit.Setelah pendinginan, 100 ml dianalisis secara langsung dengan HPLC menggunakan Radialpack sebuah Putuskan C18 kolom dielusi dengan metanol-air (7.5:92.5, v / v) yang mengandung 100 mM trietilamin. 6-TG, 6-MP dan produk hidrolisis 6-MMP, 4-amino-5-(methylthio) karbonil imidazol, yang dimonitor di 342, 322 dan 303 nm menggunakan Shimadzu SPD-M10A UV diode array detektor. Para analit dielusi pada 5,3, 6,0 dan 10,2 menit, masing-masing. Kurva kalibrasi yang linier (r2> 0,998), dan analitis pemulihan adalah 73,2% untuk 6-TG, 119,1% untuk 6-MP dan 97,4% selama 6 MMP. Variasi intra dan inter assay yang tertinggi untuk 6-MP (9,6 dan 14,3%, masing-masing). Konsentrasi terdeteksi terendah adalah 3, 3 dan 25 pmol / 8 x 108 eritrosit untuk 6-TG, 6-MP dan 6-MMP, masing-masing. Batas-batas kuantifikasi (koefisien variasi <15%) adalah 8, 10 dan 70 pmol / 8 x 108 eritrosit untuk 6-TG, 6-MP dan 6 MMP, masing-masing. Metode ini diterapkan untuk analisis dari 183 sampel dari 36 anak di bawah kemoterapi untuk akut lymphoblastic leukemia. Konsentrasi metabolit dalam sel merah pasien berkisar 0-1934 pmol / 8 x 108 eritrosit selama 6 TGN, dan 0-105,8 dan 0-45,9 nmol / 8 x 108 eritrosit untuk 6-MP dan 6-MMP, masing-masing. Prosedur ini memberikan hasil yang dalam perjanjian dengan yang diperoleh dengan metode lain yang dirancang untuk mendeteksi kasus ketidakpatuhan terhadap pengobatan, termasuk pasien wawancara dan evaluasi medis, antara lain, menunjukkan nya penerapan untuk memantau pengobatan anak-anak leukemia. Dithiothreitol (DTT), 6-thioguanine (6 TG), 6-MP, dan 6-MMP dibeli dari Sigma; asam perklorat adalah dari Carlo Larutan garam seimbang Erba dan Hank adalah dari Gibco BRL; trietilamina, fosfat asam dan semua bahan kimia lainnya dibeli di kelas analitis dari Merck (Rio de Janeiro, RJ, Brazil). Grade I air diproduksi dari gelas air suling menggunakan MilliQ-UF Plus (Millipore, Molshein, Perancis) sistem. Semua gelas dirawat dengan 30% nitrat asam paling sedikit 12 jam dan kemudian dibilas bersih dengan air. Pasien seleksi Proyek ini disetujui oleh Etika

Komite Riset Manusia dari Federal University of Minas Gerais (COEP-UFMG 007/97). Anak-anak dimasukkan dalam penelitian ini hanya setelah orang tua mereka atau wali telah sepenuhnya diberitahu dan telah menandatangani persyaratan persetujuan. Studi ini Populasi terdiri dari 36 pasien berusia kurang dari 18 tahun, yang telah didiagnosis pada UFMG dari Mei 1997 sampai Desember 2000 menjadi menderita SEMUA (sebagaimana dinilai oleh sumsum tulang Pap diwarnai dengan MeiGrnwald-Giemsa dan dikonfirmasi oleh Imunofenotipe) dan mulai pemeliharaan fase dari protokol terapi Brasil GBTLI-93. Dosis yang dianjurkan dari 6-MP untuk kelompok pasien adalah 50 mg m-2 hari-1 namun telah disesuaikan untuk setiap anak menurut jumlah leukosit dan adanya infeksi klinis yang relevan: retrospektif, dosis rata-rata yang ditentukan berkisar 24,6-66,9 (rata-rata 46,1) mg m-2 hari-1. Contoh darah untuk pemeriksaan 6 Metabolit MP dikumpulkan dari delapan minggu fase pemeliharaan pengobatan dan pada interval sekitar 8 minggu sesudahnya. Pasien seharusnya bawah pemerintahan terus menerus 6-MP untuk jangka waktu minimal 4 minggu dan harus tidak menerima dikemas transfusi sel darah merah dalam 6 minggu sebelum sampel darah koleksi. Dua sampai enam sampel ob
terjadi saat dari setiap pasien (memberikan total 183 sampel untuk seluruh penduduk) menurut sampai sebatas pemeliharaan fase pengobatan. Sampel diberi kode dan identitas para pasien tidak mengungkapkan sampai data kuantisasi dan jawaban yang diberikan dalam kuesioner pasien dianalisis pada saat yang sama. Persiapan sampel klinis Seluruh darah dikumpulkan dalam ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) sebagai antikoagulan, dan sel darah merah dipisahkan dengan sentrifugasi pada 160 g selama 10 menit pada 4 C. Plasma kaya trombosit supernatan dan buffy coat yang mengandung leukosit dan trombosit dibuang, dan pelet dicuci

dengan dua volume larutan Hanks dan disentrifugasi pada 160 g selama 10 menit pada 4 C. Sekali lagi, supernatan dibuang dan eritrosit dihentikan pada Hanks solusi dengan kepadatan 8 108 eritrosit x / 200 ml. Suspensi ini disimpan pada -20 C sampai diperlukan untuk diproses lebih lanjut (28). Pembuatan campuran standar Efek solusi dari 6-TG dan 6-MMP di konsentrasi 185,6 dan 242,4 mg / ml, masing-masing, disiapkan dengan melarutkan jumlah yang sesuai standar ditimbang dalam 1 ml NaOH 0,1 M, menipiskan dengan 21 ml air dan acidifying dengan 2,5 ml 0,1 M HCl. Sebuah solusi stok 208,0 pg / ml 6-MP disiapkan dengan melarutkan sesuai jumlah standar ditimbang dalam 1 ml 0,1 M NaOH dan menyelesaikan volume 25,0 ml dengan air. Solusi saham digunakan untuk mempersiapkan enam standar dengan campuran yang berbeda konsentrasi metabolit dengan pengenceran sebagai sesuai dengan 0,1 M HCl yang mengandung 154 mg / ml DTT. Aliquot (1 ml) dari standar campuran dialihkan kepada 1,5 ml microcentrifuge tabung dan disimpan pada -20 C. Persiapan sampel standar

Sebuah alikuot 50-ml dari masing-masing standar enam campuran (lihat Tabel 1) ditambahkan ke 200 ml larutan yang mengandung Hanks 8 x 108 eritrosit yang diperoleh dari sukarelawan yang sehat (yang sudah memakai tidak ada obat) dan diproses seperti yang dijelaskan untuk klinis sampel. Final konsentrasi dari metabolit dalam masing-masing dari enam standar sampel ditunjukkan pada Tabel 1. Contoh ekstraksi dan hidrolisis Sebuah prosedur berdasarkan protokol diterbitkan (27) dipekerjakan. Suspensi eritrosit (200 ml), bersama dengan DTT (100 ml dari larutan yang mengandung 75 mg / ml) dan air (50 ml) ditambahkan ke tabung Eppendorfdiselenggarakan dalam penangas es. Setelah homogenisasi, suspensi diperlakukan dengan 70% perklorat asam (50 ml), dicampur dengan pusaran mixer selama 30 detik, dan disentrifugasi pada 13.000 g selama 15 menit pada suhu kamar. supernatan (300 ml) dipindahkan ke botol 2-ml

ditutup dengan topi Teflon-berbaris sekrup, dan dipanaskan pada 100 C selama 45 menit untuk menghidrolisisyang nukleotida dan juga untuk menghasilkan AMTCI dari 6-MMP (25). Sampel adalah Hydrolyzed disimpan dalam penangas es, dan Aliquot (100 ml) disuntikkan ke dalam alat HPLC untuk analisis seperti dijelaskan dibawah. kromatografi uji Standar campuran, sampel standar dan sampel klinis dianalisis dengan HPLC (26) menggunakan sistem HPLC Shimadzu terdiri dari pompa pengiriman LC-10AD pelarut, tekanan FCV-10AL rendah pemilih pelarut katup dan SPD-M10A UV diode array detektor: a Waters Radial-Pak C18 Putuskan kolom (100 x 8 mm; 5-pM ukuran partikel) dipasang dalam RCM Waters 8 x 10 radial kompresor dan dilindungi oleh Waters PenjagaPak Putuskan C18 pra-kolom. elusi adalah dengan metanol-air (7.5:92.5, v / v) yang mengandung 100 mM trietilamina dan disesuaikan dengan pH 3,2 dengan asam fosfat 0,1 M: segera sebelum analisis, DTT telah ditambahkan ke eluen untuk menghasilkan suatu larutan 0,5-mM yang telah dibersihkan dengan helium dan dipompa pada kecepatan alir 1,4 ml / menit. Kolom efluen dipantau secara simultan pada 303 nm untuk AMTCI, pada 322 nm untuk 6-MP dan pada 342 nm untuk 6-TG. Kurva kalibrasi dan kuantifikasi didasarkan pada daerah puncak sebagai ditentukan dengan menggunakan perangkat lunak yang disediakanShimadzu (Kelas LC-10). Setelah setiap hari penggunaan, kolom analitik ini dicuci dengan 60 ml metanol dan penjaga-kolom adalah diganti setelah 300 suntikan. uji validasi Sampel standar digunakan untuk mencegahmenentukan
pemulihan analitis, akurasi dan ketepatan metode lebih konsentrasi seluruh jangkauan. Variasi intra-assay dihitung dari pengukuran rangkap tiga pada konsentrasi masing-masing, sedangkan uji antar variasi diperoleh dari percobaan diselesaikan pada 10 hari yang berbeda. para analitis

pemulihan dihitung dengan membandingkan daerah puncak HPLC standar diproses sampel dengan olahan dan belum diproses campuran standar. hasil HPLC kromatografi Gambar 2A menunjukkan kromatogram HPLC dari sampel darah olahan diperoleh dari relawan sehat tidak diobati: setelahmin 4,3 pertama elusi, tidak ada puncak bisaterdeteksi pada 303, 322 atau 342 nm. Gambar2B menggambarkan kromatogram HPLC dari olahanstandar campuran menunjukkan puncak da ri 6 - TG (dideteksi pada 342 nm), 6-MP (pada 322 nm) dan AMTCI (pada 303 nm; sesuai dengan 6 - MMP dalam campuran asli) eluting di 5,3, 6,0 dan 10,2 menit, masingmasing. Batas-batas deteksi (signal-to noise rasio dari 5) adalah 3 pmol untuk 6-TG dan 6MP, dan 25 pmol untuk AMTCI/6-MMP, sedangkan batas kuantifikasi (LOQ; koefisien variasi <15%) adalah 8 pmol untuk 6-TG, 10 pmol selama 6 - MP, dan 70 pmol untuk AMTCI/6MMP). Nilai bawah LOQ ditafsirkan sebagai menunjukkan tidak adanya metabolit. Agar menentukan umur simpan dari campuran standar, campuran disimpan pada -20 C selama periode penelitian (20 bulan) dan menunjukkan tidak berubah HPLC profil ketika kembali dianalisis setelah waktu ini. uji validasi Kalibrasi kurva dibangun menggunakan sampel standar yang linear dan korelasi koefisien (r2) adalah 0,9992, 0,9904 dan 0,9998 untuk 6TG, 6-MP dan AMTCI/6 MMP, masing-masing: persamaan yang khas, masing-masing, y = 146.4x, y = 210.2x + 3378,3 dan y = 115552x + 215.099, dimana y adalah area dibawah puncak dan x konsentrasi metabolit (pmol / 8 x 108 eritrosit). Intra-assay koefisien variasi berkisar 0,9-9,6% dan antar-assay koefisien variasi adalah 2,1 menjadi 14,3%. Bila dibandingkan dengan standar olahan campuran, maka pemulihan dari metabolit dalam sampel standar diproses adalah 73,2% untuk 6-TG, 119,1% untuk 6-MP dan 97,4% untuk AMTCI/6-MMP: pemulihan seperti itu diperoleh hanya setelah jumlah DTT direkomendasikan yang akan ditambahkan ke sampel di protokol diterbitkan (27) dua kali lipat. sebelumnya untuk analisis setiap batch klinis sampel, kurva standar divalidasi menggunakan sampel standar 2, 4 dan 5 (lihat Tabel 1) digunakan sebagai kontrol kualitas untuk metode. Kuantisasi metabolit dalam klinis sampel Intra-eritrosit konsentrasi 6-TGN ditentukan dalam sampel darah pasien bervariasi 0-1.934,0 (median 319,7; berarti 372,1) pmol / 8 x 108 eritrosit, 0-105,8 (median 2,9; berarti 13,9) pmol / 8 x 108 eritrosit untuk 6-MP,

dan 0-45,9 (rata-rata 6,3; berarti 8.3) nmol / 8 x 108 eritrosit untuk 6-MMP. Gambar 2C menggambarkan kromatogram HPLC dari sampel yang diperoleh dari pasien menggunakan 6 MP dengan dosis 47,8 mg m-2 hari-1. puncak sebesar 5,4 dan 10,4 menit sesuai dengan 331,8 pmol 6-TGN / 8 x 108 eritrosit dan menjadi 4,7 nmol 6-MMP / 8 x 108 eritrosit, masing-masing. Puncak intens pada 14,8 min adalah karena DTT ditambahkan ke sampel. Gambar 2D menunjukkan kromatogram HPLC yang sama pasien setelah gagal mengambil ditentukan dosis 58,1 mg 6-MP m-2 hari-1; puncak di 5,4 min sesuai dengan 73,4 pmol 6-TGN / 8 x 108 eritrosit sedangkan puncak sebesar 10,4 menit sesuai dengan 0,3 nmol 6-MMP / 8 x 108 eritrosit. Puncak di 6,2 menit, sesuai untuk 6-MP, tidak bisa diukur dalam sampel baik karena mereka di bawah LOQ. Non-kepatuhan pasien ini dengan perlakuan ditunjukkan oleh atas Hasil dikonfirmasi dengan wawancara danlaporan dari grafik medis (29). diskusi Beberapa metode telah dilaporkan untuk penentuan 6-MP dan metabolitnya dalam cairan biologis (30). Cita-cita metode harus memungkinkan penilaian pasien kepatuhan terhadap pengobatan, bersama-sama dengan pengukuran transportasi, penyerapan dan akumulasi metabolit sitotoksik (31). Studi tentang kuantifikasi yang dari 6-MP dan metabolitnya dalam urin pasien menunjukkan bahwa kelemahan utama dari jenis sampel adalah dapat mendeteksi kegagalan dalam kepatuhan terhadap pengobatan hanya ketika analisis dilakukan segera setelah acara terjawab (6). Di sisi lain, kuantisasi 6-MP dan metabolitnya dalam eritrosit lebih tepat untuk penilaian terhadap penggunaan rutin obat selama pengobatan jangka panjang sebagai negara yang stabil tercapai (32) dan kemudian harus dijaga. Dalam metode yang diusulkan oleh Lennard dan Singleton (26), nukleotida dalam sampel eritrosit yang terhidrolisis dan basis diekstraksi dengan merkuri asetat fenil (PMA) dan toluena. Metode hidrolisis mengubah non-HPLC kuantitatif metabolit

6-MMP untuk turunan kuantitatif AMTCI (25). Namun, PMA berbasis prosedur memiliki beberapa kelemahan dalam itu adalah sulit, menggunakan reagen sangat beracun, dan tidak cukup kuat untuk digunakan dalam banyak laboratorium (27,33). Disimpulkan (34) bahwa kompleksitas teknik ini menimbulkan serius kesulitan penggunaannya dalam skala besar penyelidikan. Sebuah prosedur alternatif (27) untuk hidrolisis dan ekstraksi didasarkan pada penggunaan asam perklorat 70% baik sebagai deproteinizing dan agen hidrolisis, diikuti melalui suntikan langsung ke dalam suatu alat HPLC dan selanjutnya analisis. Namun, kromatografi yang digunakan dalam kondisi PMA berbasis prosedur (26) lebih unggul mereka yang bekerja dalam metodologi terakhir dalam bahwa mereka memungkinkan penentuan simultan dari 6-MP, 6-TG dan AMTCI/6-MMP di eritrosit. Dalam penelitian ini, kami menggabungkan ekstraksi dan prosedur hidrolitik dikembangkan oleh Dervieux dan Boulieu (27) dengan protokol HPLC diterbitkan awal (26). Prosedur dimodifikasi diizinkan analisis simultan dari 6-MP dan yang metabolit 6-TGN dan 6-MMP di smallvolume darah sampel yang dikumpulkan dari anak-anak dengan SEMUA menjalani kemoterapi. Sampel dapat diproses dan dianalisis dengan HPLC dengan elusi isokratik hanya dalam 15 menit, sehingga membuat prosedur yang sesuai untuk meneliti sejumlah besar sampel. Kemungkinan lain, tidak diperiksa dalam penelitian ini, adalah kesesuaian metode untuk otomatisasi dengan tujuan meningkatkan reproduktifitas dan throughput dari pengujian tersebut. Kurva kalibrasi untuk 6-MP, 6-TG dan AMTCI/6-MMP adalah linier, dengan korelasi lebih besar dari 0,998 koefisien. Itu intra-assay koefisien variasi yang <10% selama rentang konsentrasi seluruh untuk semua senyawa dianalisis, sedangkan antar-uji variasi adalah <15% untuk 6-MP dan AMTCI/6-MMP dan di bawah 7,5% selama 6 TG. Laporan sebelumnya (26,27) mengutip intra dan antar-uji variasi di bawah 10% untuk kedua 6 TG dan 6-MMP pada dua konsentrasi

dievaluasi; nilai untuk 6-MP, bagaimanapun, adalah tidak disediakan (26). Dalam penelitian sebelumnya (35), sebuah intra-assay variasi lebih dari 10% adalah dilaporkan untuk setidaknya satu titik pada kalibrasi kurva untuk kedua 6-MP dan 6-MMP. Dalam hal 6-TG, variasi kurang dari 10% di semua titik pada kurva sementara interassay yang variasi lebih besar dari 10% pada satu dari tiga konsentrasi dipantau. Para analisis pemulihan ditentukan penyelidikan ini adalah 73,2% selama 6 TG dan 97,4% untuk 6-MMP, nilai-nilai yang mirip dengan nilai-nilai yang dilaporkan sebelumnya dari 73,1 dan 84% (27), 68,6 dan 45% (26) dan 74 dan 38% (35), masing-masing. Itu LOQ nilai pmol 8, 10 dan 70 di 8 x 108 erythrocytes/200 ml masing-masing ditentukan untuk 6-TG, 6-MP dan 6-MMP dalam penelitian ini, yang sedikit lebih baik dari yang diperoleh sebelumnya (26) dan yang dilaporkan pada pustaka. 35 (30 pmol untuk pmol 6-TG dan 120 untuk 6-MMP). Lain pekerja (34) telah mampu mencapai LOQ nilai 18 pmol untuk kedua 6-TG dan 6 MMP. Hasil penelitian kami menunjukkan perbedaan besar dalam intra-eritrosit konsentrasi 6-TG dan 6-MMP dalam sampel dianalisis. Namun, ini intra dan antar-individu variasi mirip dengan yang dilaporkan oleh orang lain (8,9,26,36). Antar-perbedaan individu tampaknya mencerminkan perbedaan individu dalam 6 MP penyerapan dan metabolisme (karena sebagian dengan polimorfisme genetik TPMT) yang dihasilkan dalam bioavailabilitas yang berbeda dan distribusi dari metabolit aktif pada pasien menerima dosis yang sama. Variasi diamati atas nilai yang diperoleh untuk hal yang sama pasien selama masa pengobatan menunjukkan penjelasan alternatif, di antaranya tidak memadai penggunaan obat resep (7) dan ketidakpatuhan terhadap pengobatan. Memang, aspek ketidakpatuhan juga dideteksi melalui kuesioner, wawancara, dan rekam medis (29), menguatkan diamati rendah tingkat obat dan metabolit dalam eritrosit pasien tertentu, dan memperkuat kegunaan metode ini dalam pemantauan pengobatan anak-anak dengan ALL.

Ucapan Terima Kasih Penulis mengucapkan terima kasih kepada Rosana O. Alves untuk bantuan teknis dan Marcelo E. de Lima Souza (Kepala Hematologi yang Pasalnya, Laboratorio Tengah do Hospital das Clinicas, UFMG) untuk pelatihan satu dari kita (B.M. de Oliveira) dalam penyusunan eritrosit dari sampel darah.